JP2002534356A - 乳疾患の検出に有用な試薬及び方法 - Google Patents

乳疾患の検出に有用な試薬及び方法

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JP2002534356A JP2000588206A JP2000588206A JP2002534356A JP 2002534356 A JP2002534356 A JP 2002534356A JP 2000588206 A JP2000588206 A JP 2000588206A JP 2000588206 A JP2000588206 A JP 2000588206A JP 2002534356 A JP2002534356 A JP 2002534356A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は一般に、乳癌のような乳疾患の検出または診断に使用し得る多量体ポリペプチド複合体／抗原に関する。本発明は更に、例えば該抗原または該抗原に対する抗体を使用する方法及びキットに関する。複合体自体は、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドとを含む。複合体は更に、ＢＵ１０１ポリペプチドのアミノ酸配列、乳グロビンポリペプチドのアミノ酸配列及びそのフラグメントに少なくとも２０％の一致を有している少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 本発明は一般的には乳疾患の検出に関する。更に、本発明はまた、乳疾患を検
出する試薬及び方法に関する。より特定的には本発明は、ポリペプチド配列のよ
うな試薬、及び、これらの配列を使用する方法に関する。ポリペプチド配列は、
乳癌のような乳疾患または異常の検出、診断、病期判定（ステージング）、経過
追跡（モニリング）、予後判定、ｉｎ ｖｉｖｏ造影、予防または治療または病
因素質の判定に有用である。
【０００２】 米国女性の癌で最も多い形態が乳癌である。米国の乳癌発生率については、１
９９８年の診断症例は１８０，３００であり、乳癌関連の死亡数は４３，９００
であると報告されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）。世界的にも乳癌発生率は１９８５年の７００，０００
人から１９９０年には約９００，０００人に増加している。Ｇ．Ｎ．Ｈｏｒｔｏ
ｂａｇｙｉら，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ４５：１９９−２２６（１
９９５）。
【０００３】 乳癌のような乳疾患または異常の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定
、ｉｎ ｖｉｖｏ造影、予防または治療または疾病素質の判定に使用される手順
は患者の運命に極めて重要である。例えば、初期乳癌と診断された患者の５年生
存率が９０％を上回るのに比べて、乳癌の遠隔転移が診断された患者の生存率は
約２０％である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｓｔａｔ
ｉｓｔｉｃｓ）。現在、初期乳癌の最良の初期指標は、乳房の身体検査及びマン
モグラフィー（乳房撮影）によって得られる。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら：Ｃａｎ ｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌ ｏｇｙ ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１２６４−１３３２，Ｐｈｉｌ
ａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．（１９９３）
。マンモグラフィーは身体検査によって未だ検出できない段階の乳腫瘍を検出で
きるが制約もある。例えば、マンモグラフィーの予測値は検査技師の技量及びマ
ンモグラムの品質に依存する。更に、疑わしいマンモグラムの８０−９３％は疑
陽性であり、また、乳癌女性の１０−１５％ではマンモグラムが誤った陰性を示
す。Ｃ．Ｊ．Ｗｒｉｇｈｔら，Ｌａｎｃｅｔ ３４６：２９−３２（１９９５）
。初期乳癌を検出するためのより高感度で特異的な新しい診断方法が明らかに必
要である。
【０００４】 初期治療後及び補助治療中の乳癌患者は、治療に対する応答を判断するため、
また、病気の持続もしくは再発または初期遠隔転移を検出するために厳密にモニ
ターされる。乳癌をモニターする現行の診断手段としては、マンモグラフィー、
骨スキャン、胸部Ｘ線撮影写真、肝機能検査及び血清マーカー検査がある。患者
をモニターするために使用される最も普及した血清腫瘍マーカーは癌胎児性抗原
（ＣＥＡ）及びＣＡ１５−３である。ＣＥＡの限界は、転移性疾患を有している
女性の約４０％で血清レベルの上昇が見られないことである。更に、補助治療中
のＣＥＡの上昇は、再発関連でなく、臨床的に重要でない別の要因に関連するこ
とがある。ＣＡ１５−３もまた、進行性疾患を有しているかなりの数の患者で陰
性になり、転移を予測できない。ＣＥＡ及びＣＡ１５−３の双方とも、悪性でな
い良性異常の場合に上昇して疑陽性の結果を与えることがある。従って、より高
感度で特異的に癌再発を検出する乳関連マーカーを見出すことは臨床的に有益で
あろう。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら，前出。Ｍ．Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ：Ｃａｎｃ ｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏ ｇｙ ，Ｖｏｌ．１，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．５３１−５４２，Ｐ
ｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．１９９
３。
【０００５】 別の重要な乳癌管理段階は、患者の疾患の病期を決定することである。病期決
定は潜在的予後値を有し、最適治療を計画するための基準を提供する。現在では
、より正確な予後情報を与えるという理由で乳癌の病期を病理学的に決定するほ
うが臨床的に決定するよりも望ましいと考えられている。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓ
ら，前出。他方で、臨床的な病期決定は病理検査組織を得るための侵入性手順に
依存しないので病理学的な病期判定と少なくとも同程度に正確であるならば、臨
床的な病期判定が好ましい。乳癌の病期決定は、複数の異なる浸潤期を識別でき
る新しいマーカーを血清または尿から検出することによって改良されるであろう
。このようなマーカーは、原発性乳腫瘍を起原としているが血液、骨髄またはリ
ンパ節に存在する細胞によって発現されたタンパク質マーカーであり、これらの
遠位器官への転移に関する高感度指標として役立つであろう。例えば、乳上皮細
胞に関連する特異的タンパク質抗原は、免疫組織化学的技術によって乳癌患者の
骨髄、リンパ節及び血液中で検出された転移を示唆する。Ｋ．Ｐａｎｔｅｌら， Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ １８：３９４−４０１（１９９５）。
【０００６】 このような診断手順はまた、侵入性が最も少ない手順によって得られる血液、
血漿、血清または尿のような被検サンプル中の免疫学的方法によって検出可能な
種々の疾病マーカーの出現に基づく免疫学的アッセイを含む。これらの診断手順
は、患者の負担を最小にして乳疾患患者を医師が管理できるような支援情報を提
供するであろう。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（
ｈＣＧ）のようなマーカーが存在しており、それぞれ前立腺癌及び精巣癌の患者
をスクリーニングするために臨床使用されている。例えばＰＳＡは通常は前立腺
から高レベルで精液に分泌されるが、前立腺が正常である男性の血液中には極め
て低レベルで存在する。血清中のＰＳＡタンパク質レベルの上昇は、無症状の男
性の前立腺癌または前立腺疾患の早期検出に使用される。例えば、Ｇ．Ｅ．Ｈａ
ｎｋｓら：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．
１０７３−１１１３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎ
ｃｏｔｔ Ｃｏ．１９９３。Ｍ．Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．１，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．５３１−５４２，Ｐｈｉｌａｄ
ｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．１９９３参照。乳
疾患の管理も同様にして、乳組織では正常に発現されているが乳疾患の結果とし
て不適正な体内区画に増加量で見出される新規なマーカーの使用によって改善さ
れるであろう。
【０００７】 更に、初期乳癌の生物学的挙動を予測し得る新規なマーカーは有意な価値を有
するであろう。患者の生命を脅かしているまたは脅かすであろう初期乳癌は、生
命に脅威のないまたは脅威にならない癌よりも臨床的に重大である。Ｇ．Ｅ．Ｈ
ａｎｋｓ，前出。このようなマーカーには、リンパ節が組織学的に陰性の患者で
癌再発の危険性を予測できること、及び、乳腺癌腫のどの症例が浸潤性乳癌に発
達するかをｉｎ ｓｉｔｕで予測できることが要求される。より正確な予後判定
マーカーがあれば医師医は、乳組織に局在するが侵襲的に治療しなければ進行し
転移するであろう初期癌を正確に同定し得るであろう。更に、患者の体内に侵襲
性癌のマーカーが存在しないときは、患者が高価で無益な治療を受けなくても済
む。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら，前出。Ｅ．Ｒ．Ｆｒｙｋｂｅｒｇら，Ｃａｎｃｅ
ｒ ７４：３５０−３６１（１９９４）。
【０００８】 従って、乳疾患または異常の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ造影、予防または治療、または、疾病素質の判定、を行うための特
異的方法及び試薬を提供することは有益であろう。このような方法は、癌などの
乳関連疾患及び異常の際に超発現される遺伝子産物を被検サンプル中で検定する
アッセイを含む。このような方法は更に、癌のような乳関連疾患または異常によ
って体内の種々の組織及び区画における分布が変化した遺伝子産物を被検サンプ
ル中で検定するアッセイを含む。このような方法は、被検サンプル中のｍＲＮＡ
からｃＤＮＡを作製し、必要ならば遺伝子またはそのフラグメントに対応するｃ
ＤＮＡの部分を増幅し、ｃＤＮＡ産物を癌などの疾患または異常の存在の指標と
して検出するか、あるいは、遺伝子配列を含むｍＲＮＡの翻訳産物を疾患の存在
の指標として検出する段階から成る。有用な試薬は、生検組織、血液またはその
他の被検サンプルから抽出されたｍＲＮＡの逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応
（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイのような診断
方法で使用され得る（１つまたは複数の）ポリヌクレオチド、またはその（１つ
または複数の）フラグメント；または、このようなｍＲＮＡの翻訳産物であるタ
ンパク質；または、これらのタンパク質に対する抗体である。このようなアッセ
イは、遺伝子の（１つまたは複数の）産物をサンプル中で検定し、（１つまたは
複数の）産物を乳疾患の指標として検出する方法を含むであろう。例えばこれら
のアッセイは、体内に発生し得る可能な翻訳後修飾に基づいて遺伝子産物（タン
パク質）を検出する方法を含むであろう。このような翻訳後修飾は、タンパク質
分解プロセシング、連鎖末端の変更、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、ガンマ
−カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化、ジスルフ
ィド結合形成、及び、補因子、インヒビター（小分子及びタンパク質の双方）、
アクチベーター（小分子及びタンパク質の双方）、多重サブユニット複合体を形
成しているその他のタンパク質のような分子との多重非共有結合的相互作用を含
み得る。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｃｏ
ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．７８−１０２，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗ．Ｈ
．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．１９９３。幾つかの修飾は配列特異的であり
、従って予測可能であるが、別の修飾は配列特異的でなく実験データから観察で
きるだけである。
【０００９】 ウテログロビンファミリーのタンパク質は、その機能が未確認であるが、乳疾
患または異常の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ ｖｉｖｏ造
影、予防または治療、あるいは疾病素質の判定に役立つと考えられる少数の配列
を含んでいる。Ｌ．Ｍｉｅｌｅら，Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．
１７：６７９−６９２（１９９４）。実験的には、ウテログロビンは単独で別の
分子と複合体を形成し、ホモダイマー型のマルチサブユニット複合体を形成する
ことが知見された。Ｒ．Ｂａｌｌｙら，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０６：１５３
−１７０（１９８９）；Ｉ．Ｍｏｒｉｚｅら，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９４：
７２５−７３９（１９８７）；Ｔ．Ｃ．Ｕｍｌａｎｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：５３８−５４５（１９９４）；Ｔ．Ｃ．
Ｕｍｌａｎｄら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４４１−４４８（１９９２）
。ウテログロビンに遠縁であると考えられる別の配列は、ラットのステロイド結
合タンパク質及びネコの主要アレルゲンである。ウテログロビンと同様に、これ
らのタンパク質はマルチサブユニット複合体として存在することが判明した。ウ
テログロビンと違って、これらのサブユニットはヘテロダイマー型、即ち、異な
る配列から成るダイマーである。更に、これらのヘテロダイマー型複合体は、ネ
コの主要アレルゲンのようにそれ自体の別のコピーと共にαβ／αβヘテロダイ
マーを形成するか〔Ｏ．Ａ．Ｄｕｆｆｏｒｔら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ ２８：３０１−３０９（１９９１）；Ｋ．Ｌｅｉｔｅｒｍａｎｎ
ら，Ｊ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ ７４：１４７−１５３（１９９１）〕、または、αβ／α’βサブユニッ
ト構造（α及びα’は相同であるが同一ではない）を有するラットのステロイド
結合タンパク質のように異なるヘテロダイマーと共に複合体を形成する。ネコの
主要アレルゲンの場合、αはウテログロビンファミリーに相同であるが、βは相
同でない。Ｊ．Ｐ．Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら，ＰＮＡＳ ８８：９６９０−９
６９４（１９９１）。ラットのステロイド結合タンパク質の場合、α、α’及び
βは、ウテログロビンファミリーのタンパク質に対して種々の程度の相同性を有
している。
【００１０】 ウテログロビンファミリーに加えて、遠縁の要素ではあるが乳グロビンが新し
く発見されたことが最近になって記載された。ノーザンブロット及びＲＴ／ＰＣ
Ｒ分析によればその発現は乳上皮に限定されることが報告されている。Ｍ．Ａ．
Ｗａｔｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒａｃｈ ５６：８６０−８６５（
１９９６）。遺伝子は染色体１１ｑ１３に局在し、幾つかの潜在的な転写コント
ロール要素が同定された。Ｍ．Ａ．Ｗａｔｓｏｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６：
８１７−８２４（１９９８）。更に、ポリヌクレオチド配列は米国特許第５，６
６８，２６７号に記載されている。しかしながら、タンパク質産物の性質を記載
する報告は全く存在しない。
【００１１】 ＢＵ１０１は最初は子宮内膜特異的ウテログロビンとして記載された（国際特
許ＷＯ９７／３４９９７）。対照的に、本発明者らは最近になってＢＵ１０１を
乳特異的ウテログロビンとして記載した（８／１５／９７出願の一部継続米国特
許出願０８／９１２，２７６を選択するために放棄した８／１９／９６出願の米
国特許出願０８／６９７，１０５参照）。臨床乳標本中のＢＵ１０１の検出はこ
れらの３つの先行出願によって示されていた。乳グロビン及びＢＵ１０１タンパ
ク質産物の性質は本出願に新しく記載した。
【００１２】 癌のような乳疾患及び異常の薬物治療または遺伝子治療は、同定されたこれら
の遺伝子配列またはその発現タンパク質に基づいて行うことができ、また、任意
の特定治療の効果をモニターすることができる。癌のような乳疾患を早期検出す
るために使用し得る代替的非外科診断方法はいっそう有益であろう。
【００１３】 本文中に引用した全部の米国特許及び刊行物の記載内容はすべて参照によって
本発明に含まれるものとする。
【００１４】 （発明の概要） 本発明は、少なくとも１コピーのＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）と少なく
とも１コピーの乳グロビンポリペプチド（配列５）とが存在し、更に１つまたは
複数の未知のポリペプチドが存在する新規な統一体、より詳細には多重体ポリペ
プチド複合体を提供する。乳グロビンポリペプチドは、５３位及び／または６８
位のアスパラギン残基に糖が付着しているかまたは付着していない糖タンパク質
として存在する。更に、乳グロビンポリペプチドは、ジスルフィド結合を介して
ＢＵ１０１ポリペプチドに共有結合し得る。双方の配列が成熟形態で３個のシス
テイン残基を含む。このジスルフィド結合したヘテロダイマーが複合体の１つの
サブユニットを構成し、同一組成のもう１つのサブユニットと相互作用して、α
β／αβヘテロダイマーを形成し得る。または、異なる組成のサブユニットと相
互作用してαβ／α’βまたはαβ／αβ’またはαβ／α’β’ヘテロダイマ
ーを形成し得る。ここに、αはＢＵ１０１ポリペプチドを表し、βは乳グロビン
ポリペプチドを表し、α’はＢＵ１０１ポリペプチドに相同であるが同一ではな
いポリペプチドを表し、β’は乳グロビンポリペプチドに相同であるが同一では
ないポリペプチドを表す。ＢＵ１０１ポリペプチドをコードする遺伝子は、ポリ
ペプチドのアミノ酸５３にプロリン残基（ＣＣＧによってコードされる）または
ロイシン残基（ＣＴＧによってコードされる）を生じる単一塩基のＴ／Ｃ多形性
を含み得る。多量体ポリペプチド複合体は、組換え技術によって産生されるか、
天然ソースから単離されるか、または、合成技術によって産生され得る。
【００１５】 多量体ポリペプチド複合体の少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチド
またはポリペプチド複合体の産生方法が提供される。該方法は、１つまたは複数
の発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞をインキュベートする段階から
成る。（１つまたは複数の）ベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列を含む。（１つまたは複数の）このポリペプチドは
、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）、乳グロビンポリペプチド（配列５）また
は未知のα’もしくはβ’ポリペプチド及びそのフラグメントから成るグループ
から選択されたアミノ酸配列に少なくとも５０％の一致を有しているアミノ酸配
列から成る。
【００１６】 本発明は、多量体ポリペプチド抗原の少なくとも１つの構成ポリペプチド配列
またはそのフラグメントをコードしている核酸配列をコトランスフェクトした細
胞を提供する。核酸配列は、ＢＵ１０１（配列２）、乳グロビン（配列１）、α
’もしくはβ’及びそのフラグメントまたはその相補配列から成るグループから
選択される。
【００１７】 また、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）、乳グロビンポリペプチド（配列５
）、未知のα’もしくはβ’ポリペプチド、または多量体ポリペプチド複合体、
またはそのフラグメントから成る抗原に対する抗体の産生方法が提供される。該
方法は、単離された免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド複合体またはそのフラ
グメントを個体に投与する段階から成る。単離された免疫原性ポリペプチドは多
量体ポリペプチド複合体の少なくとも１つのエピトープを含み、少なくとも１つ
のＭＰＡエピトープは配列５、配列６及びそのフラグメントから成るグループか
ら選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有している。
【００１８】 免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド複合体またはそのフラグメントを免疫応
答が生じる十分な量で投与する。単離された免疫原性ポリペプチド、ポリペプチ
ド複合体またはそのフラグメントは、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）、乳グ
ロビンポリペプチド（配列５）、未知のα’もしくはβ’ポリペプチド配列及び
そのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１９】 また、多量体ポリペプチド複合体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結
合する抗体が提供される。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体で
もよい。エピトープは、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）、乳グロビンポリペ
プチド（配列５）、未知のα’もしくはβ’ポリペプチド配列またはその任意の
組合せから成るグループから選択されたアミノ酸配列に由来する。即ち、エピト
ープはこれらのポリペプチド配列に共通である。
【００２０】 また、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）の少なくとも１つのエピトープに特
異的に結合する抗体が提供される。抗体は多量体ポリペプチド複合体に結合して
も結合しなくてもよい。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも
よい。エピトープはＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）及びそのフラグメントか
ら成るグループから選択されたアミノ酸配列に由来する。
【００２１】 また、乳グロビンポリペプチド（配列５）の少なくとも１つのエピトープに特
異的に結合する抗体が提供される。抗体は乳グロビンポリペプチド複合体に結合
しても結合しなくてもよい。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体
でもよい。エピトープは乳グロビンポリペプチド（配列５）及びそのフラグメン
トから成るグループから選択されたアミノ酸配列に由来する。
【００２２】 また、未知のα’ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合
する抗体が提供される。抗体は多量体ポリペプチド複合体に結合しても結合しな
くてもよい。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
【００２３】 また、未知のβ’ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合
する抗体が提供される。抗体は多量体ポリペプチド複合体に結合しても結合しな
くてもよい。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
【００２４】 また、多量体ポリペプチド抗原を含有する疑いのある被検サンプル中の多量体
ポリペプチド抗原を検出する方法が提供される。方法は、被検サンプルを、多量
体ポリペプチド抗原の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体また
はそのフラグメントに、抗体／抗原複合体が形成され得る十分な条件下で十分な
時間接触させる段階と、このような抗体含有複合体を、被検サンプル中の多量体
ポリペプチド抗原の存在の指標として検出する段階とから成る。抗体は固相に付
着させてもよく、モノクローナル抗体でもまたはポリクローナル抗体でもよい。
【００２５】 また、被検サンプル中の多量体ポリペプチド抗原の存在を判定するアッセイキ
ットが提供される。１つの実施態様では、アッセイキットが多量体ポリペプチド
抗原に特異的に結合する抗体を収容した容器を含む。該抗原は、ＢＵ１０１遺伝
子、乳グロビン遺伝子、α’遺伝子またはβ’遺伝子によってコードされる少な
くとも１つのエピトープを含む。これらの検査キットは更に、被検サンプル（例
えば、血液、尿、唾液及び糞便）の収集に使用されるツールの付いた容器を含む
。このようなツールは、採血用ランセット及び血液を収集し安定させる吸取り紙
または布；唾液を収集し安定させるスワブ；尿または便のサンプルを収集し安定
させるコップである。紙、布、スワブ、コップなどのような収集材料は、サンプ
ルの変質または不可逆的吸着を防止するために任意に処理し得る。これらの収集
材料はまた、標本の完全性を維持する補助剤となる保存剤、安定剤または抗菌剤
によって処理されてもよくまたはこれらを含有してもよい。抗体を固相に付着さ
せてもよい。
【００２６】 多量体ポリペプチド抗原に特異的に結合する抗体を含有する疑いのある被検サ
ンプル中の該抗体を検出する方法が提供される。方法は、被検サンプルを、多量
体ポリペプチド複合体の少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドに接触
させる段階を含む。接触は、抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分
な時間行われる。方法は更に、ポリペプチドを含む複合体を検出する段階を含む
。ポリペプチド複合体を固相に付着させてもよい。また、ポリペプチド複合体は
、組換え的もしくは合成的に産生されてもよくまたは天然ソースから精製されて
もよい。
【００２７】 また、被検サンプル中の抗−多量体ポリペプチド複合体抗体またはＭＰＡ自体
の存在を判定するアッセイキットが提供される。１つの実施態様では、アッセイ
キットが、多量体ポリペプチド複合体の少なくとも１つのポリペプチドまたは完
全複合体自体を収容した容器を含む。更に、検査キットは、被検サンプル（血液
、組織、尿、唾液及び糞便）を収集するために有用なツールを備えた容器を含み
得る。このようなツールは、採血用ランセット及び血液を収集し安定させる吸取
り紙または布；唾液を収集し安定させるスワブ；尿または便のサンプルを収集し
安定させるコップである。紙、布、スワブ、コップなどのような収集材料は、サ
ンプルの変質または不可逆的吸着を防止するために任意に処理し得る。これらの
収集材料はまた、標本の完全性を維持する補助剤となる保存剤、安定剤または抗
菌剤によって処理されてもよくまたはこれらを含有してもよい。ポリペプチドを
固相に付着させてもよい。抗原自体を検出するときは、抗体をキットの容器に存
在させる。抗原の検出を計画するときは更に、キットに界面活性剤及び／または
還元剤を存在させてもよい。
【００２８】 本発明の別の実施態様によれば、疾患または異常の検出または診断目的で患者
の抗原の所在を検出または造影するために多量体ポリペプチド抗原に対する抗体
またはそのフラグメントを使用し得る。このような抗体はポリクローナルでもモ
ノクローナルでもよく、または、分子生物学の技術によって作製されてもよく、
放射性同位体及び常磁性金属を非限定例とする種々の検出可能なラベルによって
標識され得る。更に、抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル、ポリク
ローナル、または分子生物学の技術によって作製されたもののいずれであっても
、多量体ポリペプチド抗原の発現を特徴とする疾患を治療する治療薬として使用
できる。治療用途の場合、抗体を誘導体化しないで使用してもよく、または、放
射性同位体、酵素、毒素、薬物、プロドラッグなどのような細胞障害性物質で誘
導体化してもよい。
【００２９】 本発明はまた、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有する疑いのある被検
サンプル中の該ＭＰＡの存在を検出する付加的な方法を包含する。ＭＰＡは少な
くとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの乳グロビンポリペプチ
ドとを含む。この方法は、（ａ）被検サンプルを、ＭＰＡの少なくとも１つのエ
ピトープに特異的な少なくとも１つの抗体に、ＭＰＡ／抗体複合体が形成される
十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、（ｂ）得られたＭＰＡ／抗体複合
体に、検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着させた抗体を
含むコンジュゲートを添加し、該コンジュゲートが結合抗原に結合し得る十分な
条件下で十分な時間維持する段階と、（ｃ）シグナル発生化合物によって発生さ
れたシグナルを検出することによって被検サンプル中に存在するならばＭＰＡの
存在を検出する段階とから成る。この方法及び本文中に記載の別の方法で検出さ
れた多量体ペプチド抗原は更に、配列５、配列６及びそのフラグメントから成る
グループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有する少なく
とも１つのポリペプチドを含み得る。段階（ａ）の方法で使用される抗体はＭＰ
Ａを対象とする抗体であり、このＭＰＡは、ＨＥＫ−２９３ＭＢ８細胞によって
産生されるか、または、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする
少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも１つの乳グロビンポリペプチド
をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含む構築物を含むベクター
をトランスフェクトした宿主細胞によって産生される。本発明のすべてのアッセ
イの診断段階（またはキット）で使用される抗体は、必要に応じてこのようにし
て産生され得る。更に、産生される抗体の対象となる上記方法の段階（ａ）（及
び本文中に記載の別の方法の同等の段階（ａ））のエピトープは、２つのベクタ
ーを含む宿主細胞によって産生されたＭＰＡに由来してもよい。２つのベクター
の一方は、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１
つのヌクレオチド配列を含む構築物から成り、２つのベクターの他方は、少なく
とも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド
配列を含む構築物から成る。本発明のすべてのＭＰＡ検出方法において、ＭＰＡ
の存在は乳癌または別の乳異常の指標となり得る。
【００３０】 更に、本発明はまた、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも
１つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含
有する疑いのある被検サンプル中の該ＭＰＡの存在を検出する方法を提供する。
方法は、（ａ）被検サンプルを、ＭＰＡの少なくとも１つのエピトープに特異的
な少なくとも１つの抗体に、ＭＰＡ／抗体複合体が形成される十分な条件下で十
分な時間接触させる段階と、（ｂ）得られたＭＰＡ／抗体複合体に、検出可能な
シグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着させたステロイドまたは抗体を
含むコンジュゲートを添加し、コンジュゲートが結合抗原に結合し得る十分な条
件下で十分な時間維持する段階と、（ｃ）シグナル発生化合物によって発生され
たシグナルを検出することによって被検サンプル中に存在するならばＭＰＡの存
在を検出する段階とから成る。ステロイドは例えば、プロゲステロン、アルドス
テロン、アンドロステンジオン、コルチコステロン、コルチゾル、デヒドロエピ
アンドロステロン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストリオー
ル、エストロン、ヒドロキシプロゲステロン及びテストステロンである。抗体は
上記の方法で産生されたＭＰＡを使用して産生され得る。
【００３１】 本発明はまた、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの
乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的な
抗体を含有する疑いのある被検サンプル中の該抗体の存在を検出する方法を提供
する。方法は、（ａ）被検サンプルを、配列５、配列６及びそのフラグメントか
ら成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有する
アミノ酸配列またはそのフラグメントに由来の少なくとも１つのＭＰＡエピトー
プに、ＭＰＡ／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段
階と、（ｂ）得られたＭＰＡ／抗体複合体に、（２）被検サンプル中の抗体に結
合する抗体とこの抗体に付着させた検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発
生化合物とから成るコンジュゲートを添加し、コンジュゲートが結合抗体に結合
し得る十分な条件下で十分な時間維持する段階と、（ｃ）シグナル発生化合物に
よって発生されたシグナルを検出することによって被検サンプル中に存在するな
らば抗体の存在を検出する段階とから成る。
【００３２】 本発明はまた、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの
乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原から成る物質組成物を
包含する。また、抗原が更に、配列５、配列６及びそのフラグメントから成るグ
ループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有する少なくと
も１つのポリペプチドを含む。組成物は更に、多量体ポリペプチド抗原に結合し
た少なくとも１つの抗体を含み、該抗体は、ＢＵ１０１ポリペプチドと、乳グロ
ビンポリペプチドと、配列５、配列６及びそのフラグメントから成るグループか
ら選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有する１つのポリペプチ
ドとから成るグループから選択された少なくとも１つのポリペプチドに特異的で
ある。特定的には、２つの抗体が存在してもよく、各抗体は配列５、配列６及び
それらのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくと
も２０％の一致を有するアミノ酸配列をもつ個別のポリペプチドに結合するであ
ろう。より特定的には、２つの抗体の各々がＢＵ１０１ポリペプチドまたはその
フラグメントに結合してもよく、あるいは、２つの抗体の各々が乳グロビンポリ
ペプチドまたはそのフラグメントに結合してもよい。あるいは、２つの抗体の一
方がＢＵ１０１ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合し、２つの抗体の他
方が乳グロビンポリペプチドまたはそのフラグメントに結合してもよい。２つの
抗体の一方がＢＵ１０１ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合するとき、
２つの抗体の他方は配列５、配列６及びそれらのフラグメントから成るグループ
から選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有するアミノ酸配列を
もつポリペプチドに結合し得る。２つの抗体の一方が乳グロビンポリペプチドま
たはそのフラグメントに結合するとき、２つの抗体の他方は配列５、配列６及び
それらのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくと
も２０％の一致を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドに結合し得る。
【００３３】 本発明は更に、乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の検出方法を包含する。方
法は、（ａ）少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの乳グ
ロビンポリペプチドとを含む多量体タンパク質抗原（ＭＰＡ）に特異的な標識抗
体を患者に投与する段階と、（ｂ）ラベルの存在を検出する段階とから成り、ラ
ベルの存在を患者体内のＭＰＡ及び乳癌の存在の指標とする。
【００３４】 本発明はまた、上記のような乳癌の治療方法を包含する。このような方法の１
つは、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの乳グロビン
ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的な抗体を患者
に投与する段階から成る。
【００３５】 本発明は更に、乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の診断方法を包含する。方
法は、（ａ）患者から摘出した腫瘍に由来の組織切片または細胞培養物を調製す
る段階と、（ｂ）ＢＵ１０１ポリペプチドと、乳グロビンポリペプチドと、配列
５、配列６及びそれらのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸
配列に少なくとも２０％の一致を有するポリペプチドとから成るグループから多
量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）の少なくとも１つのポリペプチドを選択し、該
選択されたポリペプチドに特異的な抗体を、組織切片または細胞培養物に、抗原
／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間作用させる段階と、（ｃ）
組織切片または細胞培養物中の複合体の存在を検出する段階とから成り、複合体
の存在を患者体内のＭＰＡ及び乳癌の存在の指標とする。
【００３６】 本発明は、乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の別の診断方法を包含する。方
法は、ＢＵ１０１ポリペプチドと、乳グロビンポリペプチドと、配列５、配列６
及びそれらのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少な
くとも２０％の一致を有するポリペプチドとから成るグループから多量体ポリペ
プチド抗原（ＭＰＡ）の少なくとも１つのポリペプチドを選択し、患者から採取
した生物サンプル中で、該少なくとも１つのポリペプチドの存在または非存在を
検出する段階から成り、該少なくとも１つのポリペプチドの存在を患者体内のＭ
ＰＡ及び乳癌の存在の指標とする。生物サンプルは例えば組織、尿、唾液、糞便
、骨髄または血液である。
【００３７】 本発明は、乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の別の診断方法を包含する。方
法は、患者体内の細胞外ＢＵ１０１ポリペプチドの有無を検出する段階から成り
、細胞外ＢＵ１０１の存在が、患者体内の乳癌の存在、及び、多量体ポリペプチ
ド抗原（ＭＰＡ）中の乳グロビンによるＢＵ１０１の細胞外輸送の指標となり、
ＭＰＡは少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの乳グロビ
ンポリペプチドとを含む。
【００３８】 本発明はまた、乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の別の検出方法を包含する
。方法は、（ａ）患者から生物サンプルを採取する段階と、（ｂ）生物サンプル
中の遊離ＢＵ１０１ポリペプチドの量を測定する段階と、（ｃ）生物サンプル中
に存在し乳グロビンポリペプチドと複合体を形成しているＢＵ１０１ポリペプチ
ドの量を測定する段階と、（ｄ）複合体を形成しているＢＵ１０１ポリペプチド
に対する遊離ＢＵ１０１ポリペプチドの比を比較する段階とから成り、１よりも
大きい比を患者体内の乳癌の存在の指標とする。
【００３９】 本発明はまた、乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の検出方法を包含する。方
法は、（ａ）患者から生物サンプルを採取する段階と、（ｂ）生物サンプル中の
遊離乳グロビンポリペプチドの量を測定する段階と、（ｃ）生物サンプル中に存
在しＢＵ１０１ポリペプチドと複合体を形成している乳グロビンポリペプチドの
量を測定する段階と、（ｄ）複合体を形成している乳グロビンポリペプチドに対
する遊離乳グロビンポリペプチドの比を比較する段階とから成り、１よりも大き
い比を患者体内の乳癌の存在の指標とする。
【００４０】 本発明は更に、ＭＰＡのイムノアッセイにおけるＭＰＡの認識増強方法を包含
する。方法は、疑わしいＭＰＡを抗体または化合物に接触させる前に、還元剤及
び界面活性剤から成るグループから選択された少なくとも１つの要素をＭＰＡに
作用させる段階を含む。疑わしいＭＰＡに熱を作用させてもよい。ＭＰＡを抗体
または化合物に接触させる前に還元剤及び／または界面活性剤を被検サンプルま
たはＭＰＡに作用させるという処理がＭＰＡの検出に関する上記及び下記の全て
の方法に使用できることに注目されたい。熱の使用は任意である。
【００４１】 本発明は更に、還元剤及び界面活性剤から成るグループから選択された少なく
とも１つの要素をＭＰＡに作用させる段階を含むＭＰＡの解離方法を包含する。
熱の使用を付加してもよい。
【００４２】 本発明はまた、ＭＢ８細胞によって産生されるか、または、少なくとも１つの
ＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と少な
くとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチ
ド配列とを含む構築物を含むベクターをトランスフェクトした宿主細胞によって
産生される診断用試薬を包含する。この試薬は例えばＭＰＡであり得る。
【００４３】 本発明は更に、ベクターの一方が少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドを
コードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含み、ベクターの
他方が少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つの
ヌクレオチド配列を含む構築物を含む２つのベクターをトランスフェクトした宿
主細胞によって産生される診断用試薬を包含する。
【００４４】 本発明はまた、ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系から単離された細胞及び産生され
た細胞系自体を包含する。
【００４５】 本発明は更に、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの
乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有する
疑いのある被検サンプル中で該ＭＰＡの存在を検出する方法を包含する。該方法
は、（ａ）被検サンプルを、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド、それらのフラグメ
ントから成るグループから選択された標識抗原に接触させる段階と、（ｂ）被検
サンプル及び段階（ａ）の標識抗原を、抗ＭＰＡ抗体に、ＭＰＡ／抗−ＭＰＡ抗
体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、（ｃ）標識
抗原中のラベルによって発生されたシグナルを検出することによって被検サンプ
ル中に存在するならばＭＰＡの存在を検出する段階とから成る。
【００４６】 本発明はまた、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの
乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有する
疑いのある被検サンプル中で該ＭＰＡの存在を検出する方法を包含する。該方法
は、（ａ）被検サンプルを、ＭＰＡに結合する標識抗体に、被検サンプルＭＰＡ
／標識抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、（
ｂ）段階（ａ）の複合体を、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド、ＭＰＡのフラグメ
ント及びＭＰＡのポリペプチドのフラグメントから成るグループから選択された
抗原に、抗原／標識抗体複合体が形成され得る十分な条件下で十分な時間接触さ
せる段階と、（ｃ）標識抗体によって発生したシグナルの存在を検出する段階と
から成り、シグナルを被検サンプル中のＭＰＡの存在の指標とする。
【００４７】 本発明は更に、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの
乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有する
疑いのある被検サンプル中で該ＭＰＡの存在を検出する方法を包含する。該方法
は、（ａ）被検サンプルを、ＭＰＡに結合する標識ステロイドに、ＭＰＡ／標識
ステロイド複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、（
ｂ）段階（ａ）のＭＰＡ／標識ステロイド複合体を、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプ
チド、ＭＰＡのフラグメント及びＭＰＡのポリペプチドのフラグメントから成る
グループから選択された抗原に、抗原／標識ステロイド複合体が形成される十分
な条件下で十分な時間接触させる段階と、（ｃ）標識ステロイドのラベルによっ
て発生されたシグナルを検出することによって被検サンプル中に存在するならば
ＭＰＡの存在を検出する段階とから成る。
【００４８】 本発明はまた、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの
乳グロビンポリペプチドとを含むＭＰＡを含有する疑いのある被検サンプル中で
該ＭＰＡの存在を検出する方法を包含する。該方法は、（ａ）被検サンプルを、
ステロイドに、ＭＰＡ／ステロイド複合体が形成される十分な条件下で十分な時
間接触させる段階と、（ｂ）得られたＭＰＡ／ステロイド複合体に、検出可能な
シグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着させた抗体から成るコンジュゲ
ートを添加し、コンジュゲートが結合ＭＰＡに結合し得る十分な条件下で十分な
時間維持する段階と、（ｃ）シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを
検出することによって被検サンプル中に存在するならばＭＰＡの存在を検出する
段階とから成る。
【００４９】 本発明は更に、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的な抗体を含有する
疑いのある被検サンプル中の該抗体の存在を検出する方法を包含する。該方法は
、（ａ）被検サンプルを、抗体特異的な抗−抗体に、抗体／抗−抗体複合体が形
成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、（ｂ）得られた抗体／抗
−抗体複合体に、検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着さ
せたＭＰＡから成るコンジュゲートを添加し、コンジュゲートが結合抗体に結合
し得る十分な条件下で十分な時間維持する段階と、（ｃ）シグナル発生化合物に
よって発生されたシグナルを検出することによって被検サンプル中に存在するな
らば抗体の存在を検出する段階とから成る。
【００５０】 更に、本発明はまた、ＭＰＡに特異的な抗体を含有する疑いのある被検サンプ
ル中の該抗体の存在を検出する方法を包含する。該方法は、（ａ）被検サンプル
を、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド、ＭＰＡのフラグメント及びＭＰＡのポリペ
プチドのフラグメントから成るグループから選択された標識抗原に、抗体／標識
抗原複合体が形成され得る十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、（ｂ）
段階（ａ）で得られた複合体を、ＭＰＡに結合する抗体に、未結合の標識抗原全
部がＭＰＡに結合する抗体に結合し得る十分な条件下で十分な時間接触させる段
階と、（ｃ）標識抗原によって発生されたシグナルを検出することによって被検
サンプル中に存在するならば抗体の存在を検出する段階とから成る。
【００５１】 本発明はまた、ＭＰＡに特異的な抗体を含有する疑いのある被検サンプル中の
該抗体の存在を検出する方法を包含する。該方法は、（ａ）被検サンプルを、ス
テロイドとＭＰＡとの複合体に、抗体／ＭＰＡ／ステロイド複合体が形成される
十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、（ｂ）で得られた抗体／ＭＰＡ／
ステロイド複合体に、被検サンプル中の抗体に反応性の抗体であって検出可能な
シグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着させた抗体から成るコンジュゲ
ートを添加し、コンジュゲートが結合抗体に結合し得る十分な条件下で十分な時
間維持する段階と、（ｃ）シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検
出することによって被検サンプル中に存在するならば抗体の存在を検出する段階
とから成る。
【００５２】 （図面の簡単な説明） 図１は、実施例７Ｃに従って産生された組換えポリペプチド複合体を認識した
３つのモノクローナル抗体の結合曲線を示す。
【００５３】 図２は、２つの悪性乳切片、１つの健康な乳切片及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細
胞系をモノクローナル抗体Ｈ９Ｃ６５で免疫組織化学的に染色した結果を示す。
【００５４】 図３は、２つの悪性乳切片、１つの健康な乳切片及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細
胞系をモノクローナル抗体Ｊ９３Ｃ３０で免疫組織化学的に染色した結果を示す
。
【００５５】 図４は、ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞の増殖後に採取した３つの上清を示す３つ
のウェスタンブロットのスキャンである。ブロット１は抗−ｍｙｃモノクローナ
ル抗体で可視化（ｄｅｖｅｌｏｐ）した。ブロット２は抗−ＢＵ１０１ポリクロ
ーナル抗血清で可視化した。ブロット３は抗−Ｍａｍポリクローナル抗血清で可
視化した。
【００５６】 図５は、抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示す２つのド
ットブロットのスキャンである。上部のブロットはニッケルキレート化カラムか
ら溶出するＭＢ８細胞の上清から得られた画分を示す。下部のブロットは、ニッ
ケルキレート化カラムから溶出するＨＥＫ２９３細胞のＭａｍ Ｍ／Ｈ一過性ト
ランスフェクション上清から得られた画分を示す。
【００５７】 図６は、１６パネルから成る４つのウェスタンブロットのスキャンである。Ｍ
Ｂ８細胞、及び、Ｍａｍ Ｍ／Ｈプラスミドで一過性トランスフェクションした
ＨＥＫ２９３細胞から得られた上清を抗−ＢＵ１０１、抗−Ｍａｍ及び抗−ｍｙ
ｃポリクローナル抗体によって分析する。
【００５８】 図７は、等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３−１０）から得られたウェスタンブロッ
トのスキャンである。
【００５９】 図８は、抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示す２つのド
ットブロットのスキャンである。上部のブロットはＭｏｎｏ Ｑ５／５カラムか
ら溶出するＭＢ８細胞の上清から得られた画分を示す。下部のブロットはＭｏｎ
ｏ Ｑ５／５カラムから溶出するＨＥＫ２９３細胞のＭａｍ Ｍ／Ｈ一過性トラ
ンスフェクションの上清から得られた画分を示す。
【００６０】 図９は、タンパク質標準の溶出量（ｖｏｌｕｍｅ）と分子量（ｗｅｉｇｈｔ）
との関係を示すＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムの標準曲線である。
【００６１】 図１０は、抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示すドット
ブロットのスキャンである。ブロットは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムから溶
出するＭＢ８細胞の上清から得られた画分を示す。
【００６２】 図１１は、２つの組織抽出物及び２つの上清を、ｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いた
組換えＭａｍ及びＢＵ１０１で分析した２つのウェスタンブロットのスキャンで
ある。上部のブロットは抗−ＢＵ１０１モノクローナル抗体で可視化し、下部ブ
ロットは抗−Ｍａｍポリクローナル抗体で可視化した。
【００６３】 図１２は、抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上部ブロット）または抗−Ｍ
ａｍポリクローナル抗体（下部ブロット）による物質の免疫認識を示す２つのド
ットブロットのスキャンである。双方のブロットがＭｏｎｏ Ｑ５／５カラムか
ら溶出する乳癌組織抽出物から得られた画分を示す。
【００６４】 図１３は、抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上部ブロット）または抗−Ｍ
ａｍポリクローナル抗体（下部ブロット）による物質の免疫認識を示す２つのド
ットブロットのスキャンである。双方のブロットがＭｏｎｏ Ｑ５／５カラムか
ら溶出する乳癌組織抽出物から得られた画分を示す。
【００６５】 図１４は、抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上部ブロット）または抗−Ｍ
ａｍポリクローナル抗体（下部ブロット）による物質の免疫認識を示す２つのド
ットブロットのスキャンである。双方のブロットがＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラ
ムから溶出する乳癌組織抽出物から得られた画分を示す。
【００６６】 図１５は、前処置プロトコルの使用によるｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いたポリペ
プチドの免疫認識の増強を示すドットブロットのスキャンである。
【００６７】 （詳細な説明） 本発明は、新規な統一体、より詳細には、少なくとも１コピーのＢＵ１０１ポ
リペプチド（配列６）と少なくとも１コピーの乳グロビンポリペプチド（配列５
）とが存在する多量体ポリペプチド複合体を提供する。該複合体は更に、１つま
たは複数の未知のポリペプチドを含有し得る。乳グロビンは、５３位及び／また
は６８位のアスパラギン残基に糖が付加されるかまたは付加されていない糖タン
パク質の形態で存在し得る。乳グロビンは更に、ジスルフィド結合を介してＢＵ
１０１に結合し得る。双方のポリペプチドは成熟形態で３個のシステイン残基を
含む。このジスルフィド結合したヘテロダイマーが複合体の１つのサブユニット
を構成し、該サブユニットは等しい組成のもう１つのサブユニットと相互作用し
て、αβ／αβヘテロテトラマーを形成するか、または、異なる組成の別のサブ
ユニットと相互作用して、αβ／α’β、αβ／αβ’またαβ／α’β’ヘテ
ロテトラマーを形成し得る。ここに、αはＢＵ１０１を表し、βは乳グロビンを
表し、α’はＢＵ１０１に相同であるが同一でない配列を表し、β’は乳グロビ
ンに相同であるが同一でない配列を表す。ＢＵ１０１遺伝子は、ＢＵ１０１ポリ
ヌクレオチド配列（配列２）の２５４位にＴ／Ｃ多形性を含み得る。この多形性
の結果として、この位置のアミノ酸はプロリン（ＣＣＧ）になったりまたはロイ
シン（ＣＴＧ）になったりする。本発明に記載したいかなる実験においても、Ｂ
Ｕ１０１ヌクレオチドの２つの変異体またはそれぞれによって発現されたポリペ
プチドの差異は全く観察されなかった。多量体ポリペプチド複合体は、組換え技
術によって産生されてもよく、天然ソースから単離されてもよく、または、合成
技術によって産生されてもよい。
【００６８】 本発明はまた、被検サンプル中のこの多量体ポリペプチド複合体を検定するア
ッセイ方法を提供する。方法は、多量体ポリペプチド複合体の構成ポリペプチド
鎖の全配列または部分配列を非限定例とするポリペプチド及びこれらの抗原に対
する抗体のような試薬を製造する段階から成る。本発明で提供される方法によっ
て検定され得る被検サンプルは、組織、細胞、尿のような体液及び分泌物である
。
【００６９】 ポリペプチド配列の部分は、診断用イムノアッセイの標準または試薬としても
、医薬スクリーニングアッセイのターゲットとしても、及び／または、種々の治
療のための成分もしくはターゲット部位としても有用である。これらのポリペプ
チドに含まれている少なくとも１つのエピトープに対するモノクローナル抗体及
びポリクローナル抗体は、多量体ポリペプチド複合体に関連する疾患または異常
、特に乳癌の治療薬のデリバリー物質として有用であり、また、診断試験及びス
クリーニングに有用である。
【００７０】 アミノ酸配列の“類似”を決定する技術は当業界で公知である。一般に、“類
似”は、２つまたはそれ以上のポリペプチドの適当な位置の正確なアミノ酸対ア
ミノ酸比較において、アミノ酸が等しいかまたは類似の化学的及び／または物理
的特性例えば電荷もしくは疎水性を有していることを意味する。いわゆる“パー
セント類似”は、比較されたポリペプチド配列間で決定され得る。アミノ酸配列
の一致を決定する技術も当業界で公知であり、アミノ酸配列を決定し、これを第
二のアミノ酸配列に比較する段階から成る。一般に、“一致”なる用語は、２つ
のポリペプチド配列のアミノ酸が正確な１：１対応を示すことを意味する。２つ
以上のアミノ酸配列は、それらの“パーセント一致”を決定することによって比
較し得る。２つの配列、例えば２つのペプチド配列のパーセント一致は、位置合
せした２つの配列間の正確な適合の数をもっと短い配列の長さによって除算し１
００を乗算することによって算出する。配列の適正な位置合せは、Ｓｍｉｔｈ
ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔ
ｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）のローカルホモロジーアル
ゴリズムによって与えられる。このアルゴリズムを拡張し、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａ
ｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５
８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，によって開発され、Ｇ
ｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７
６３（１９８６）によって正規化されたスコアリングマトリックスを使用してペ
プチド配列に使用できる。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＢｅｓｔＦｉｔユーティリティアアプリケーションに
よってこのアルゴリズムをペプチド配列に実行できる。この方法のデフォルトパ
ラメーターはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａ
ｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）
（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩか
ら入手可能）に記載されている。配列間のパーセント一致または類似を計算する
同等に適当な別のプログラムは当業界で普遍的に知られている。
【００７１】 本発明に記載の組成物及び方法によって乳組織の疾患または異常の指標となる
幾つかのマーカーを同定することが可能であろう。そこから得られた情報は、多
量体ポリペプチド複合体に関連する疾患または異常、特に乳癌の検出、診断、病
期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ ｖｉｖｏ造影、予防または治療または判定
に役立つ。試験方法としては例えば、本発明で提供される多量体ポリペプチド複
合体を利用するイムノアッセイがある。
【００７２】 この多量体ポリペプチド複合体は、免疫原性であると知見され得る固有エピト
ープを含む。これらのエピトープは、多量体ポリペプチド複合体に関連する疾患
状態または異常に固有であると考えられる。また、多量体ポリペプチド複合体は
マーカーとして有用であると考えられる。このマーカーは、乳癌のような疾患で
は増加し、乳癌のような疾患では変質しているかまたは正常なタンパク質複合体
として存在するが不適正な体内区画に出現する。（１つまたは複数の）エピトー
プの固有性を決定する要因は、（ｉ）ＢＵ１０１遺伝子（配列２）、乳グロビン
遺伝子（配列１）、α’遺伝子またはβ’遺伝子によってコードされたタンパク
質及びポリペプチドを対象とする抗体に対する該エピトープの免疫反応性及び特
異性、（ｉｉ）他の任意の組織マーカーとの交差反応性の欠如、である。免疫反
応性の判定方法は公知であり、その非限定例は例えば、ラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ）、エンザイムリンクトイムノアプソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、
血球凝集反応（ＨＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノ
アッセイ（ＣＬＩＡ）などである。適当な方法の幾つかの例が本文中に記載され
ている。
【００７３】 更に、細胞内部における多量体ポリペプチド複合体の生物学的合成及び組立は
健康な状態では高度に調節されている。疾患状態では、多量体ポリペプチド複合
体の合成及び組立の脱調節（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が生じる。転写活性化
の脱調節の結果として、この遺伝子産物の正の調節または負の調節が生じる。構
成ポリペプチド鎖の唯１つの鎖の遺伝子が正の調節を受けると、この遺伝子産物
は増加レベルでポリペプチドに転写及び翻訳される。この結果として、１つのポ
リペプチドが多量体ポリペプチド複合体の残りの構成成分とは無関係に蓄積され
る。多量体ポリペプチド複合体に対して、その構成ポリペプチドの遊離量または
全量を測定することによって、上記のような脱調節の指標を得ることができ、乳
癌のような疾患を知ることができる。
【００７４】 更に、多量体ポリペプチド複合体の合成及び組立の脱調節の結果として、この
複合体の構成ポリペプチド鎖のいずれか１つが過産生／蓄積される。正常な状態
では、多量体ポリペプチド複合体は原哺乳類細胞から分泌される。しかしながら
、個々の構成ポリペプチド鎖が、多量体ポリペプチド複合体の残りの構成ポリペ
プチド鎖と無関係に、同じプロセシングを受けないこともあり得る。例えば、Ｂ
Ｕ１０１ポリペプチドの発現は、多量体ポリペプチド複合体の残りのポリペプチ
ドと無関係に、細胞内部に維持される非分泌形態のポリペプチドを産生する。遊
離状態のＢＵ１０１またはその他の構成ポリペプチド鎖の細胞内蓄積は、癌のよ
うな疾患の場合に見られる転写及び／または翻訳の異常の結果として生じる。
【００７５】 更に、細胞の損傷または破壊の結果として、対合ポリペプチド鎖のない多量体
のＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）が細胞の内部から遊離されるであろう。こ
の結果、細胞を包囲する間質流体中にＢＵ１０１ポリペプチドまたは別の構成ポ
リペプチド鎖が蓄積する。組織の損傷及び破壊の結果としてまた、それぞれの対
合ポリペプチド鎖のないＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）または別の構成ポリ
ペプチド鎖が組織から遊離されるであろう。細胞及び組織の損傷／破壊はいずれ
も乳癌のような疾患の場合に見られる。
【００７６】 別の注釈がない限り、以下の用語は以下の意味で使用されている。
【００７７】 “によってコードされた”という用語は、ポリペプチド配列をコードする核酸
配列を意味する。ポリペプチド配列またはその一部分は、核酸配列によってコー
ドされたポリペプチドから選択された少なくとも３−５個のアミノ酸、より好ま
しくは少なくとも８−１０個のアミノ酸、もっと好ましくは少なくとも１５−２
０個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を含む。また、該核酸配列によってコード
されたポリペプチドによって免疫学的に同定可能なポリペプチド配列も意味する
。従って、“ポリペプチド”、“タンパク質”または“アミノ酸”配列は、乳グ
ロビン遺伝子（配列１）、ＢＵ１０１遺伝子（配列２）、α’遺伝子またはβ’
遺伝子（即ち、多量体ポリペプチド複合体を形成するポリペプチドをコードする
遺伝子）に少なくとも約５０％の一致、好ましくは約６０％の一致、より好まし
くは約７５−８５％の一致、最も好ましくは約９０−９５％以上の一致を有して
いる。更に、乳グロビン遺伝子（配列１）、ＢＵ１０１遺伝子（配列２）、α’
遺伝子またはβ’遺伝子（即ち、多量体ポリペプチド複合体を形成するポリペプ
チドをコードする遺伝子）によってコードされた“ポリペプチド”、“タンパク
質”または“アミノ酸”配列は、乳グロビン遺伝子（配列１）、ＢＵ１０１遺伝
子（配列２）、α’遺伝子またはβ’遺伝子のポリペプチドまたはアミノ酸配列
に少なくとも約６０％の類似、好ましくは少なくとも約７５％の類似、より好ま
しくは約８５％の類似、最も好ましくは約９５％以上の類似を有し得る。
【００７８】 “組換えポリペプチド”、“組換えタンパク質”または“組換え技術によって
産生されたポリペプチド”なる用語は本文中で互換的に使用されており、その起
原または操作が原因で、天然に結合するポリペプチドの全部または一部に結合し
ていないか及び／または天然に結合するポリペプチド以外のポリペプチドに結合
しているポリペプチドを意味する。組換えられたまたはコードされたポリペプチ
ドまたはタンパク質は必ずしも指定の核酸配列から翻訳されない。また、化学合
成または組換え発現系の発現を含む任意の手段で作製され得る。本文中で使用さ
れた“合成ペプチド”なる用語は、当業者に公知の方法によって化学的に合成さ
れ得る任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味する。これらの合成ペプチドは種
々の用途に有用である。
【００７９】 “精製ポリペプチド”または“精製タンパク質”は、問題のポリペプチドが天
然に結合する細胞成分を本質的に含まないかまたは約５０％未満、好ましくは約
７０％未満、より好ましくは約９０％未満で含むポリペプチドまたそのフラグメ
ントを意味する。問題のポリペプチドの精製方法は当業界で公知である。
【００８０】 “単離された”という用語は、物質が本来の環境（例えば、天然産生物質の場
合には自然環境）から取出されることを意味する。例えば、生存動物体内に存在
する天然産生ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然
の系に共存する物質の幾つかまたは全部から分離されている同じポリヌクレオチ
ドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオ
チドはベクターの一部でもよく、及び／または、このようなポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは組成物の一部でもよく、ベクターまたは組成物が天然環境の
一部でないときは、やはり単離されている。
【００８１】 “ポリペプチド”及び“タンパク質”は本文中で互換的に使用されており、後
述するすべてのポリペプチドを包含する。ポリペプチドの基本構造は当業界で公
知であり、当業界の多数の専門書及びその他の刊行物に記載されている。基本構
造に関して本文中に使用されたこの用語は、ペプチド結合によって互いに直鎖状
に結合された２つ以上のアミノ酸から成る任意のペプチドまたはタンパク質を意
味する。本文中に使用されたこの用語は、当業界で一般にペプチド、オリゴペプ
チド及びオリゴマーと呼ばれている短い鎖、及び、当業界で普遍的にタンパク質
と呼ばれている長い鎖の双方を意味する。タンパク質には多くの種類がある。
【００８２】 ポリペプチドが、一般に２０個の天然産生アミノ酸と呼ばれている２０個のア
ミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含むこと、及び、所与のポリペプチドの末端ア
ミノ酸を含む多くのアミノ酸がプロセシング及びその他の翻訳後修飾のような天
然プロセスまたは当業界に公知の化学的修飾技術によって修飾され得ることは理
解されよう。ポリペプチド中で天然に生じたよく見られる修飾はその数が余りに
も多いのでその全てをここに網羅することはできないが、基本的な参考書、より
詳細な専攻論文、膨大な研究論文に記載されており、当業者に公知である。本発
明のポリペプチド中に存在し得る公知の修飾の代表例を幾つか挙げると、例えば
、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合
、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂
質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋
、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの
形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコ
シル化、ＧＰ１アンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリソイ
ル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、
セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡが介在する
タンパク質のアミノ酸付加、遍在化がある。
【００８３】 このような修飾は当業者に公知であり、科学文献に極めて詳細に記載されてい
る。特によく見られる幾つかの修飾、例えば、グリコシル化、脂質付着、硫酸化
、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リ
ボシル化は例えばＰｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏ
ｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９９３）のようなより基本的な参考書に記載されている。この問題を検討した多
くの詳細な論文が入手可能であり、例えば、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓ
ｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇ．１−１２ ｉｎ Ｐｏ
ｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ
ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８
２：６２６−６４６（１９９０）及びＲａｔｔａｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．６６３：４８−
６２（１９９２）などがある。
【００８４】 公知のごとくまたは上記に指摘したように、ポリペプチドが必ずしも完全に直
鎖状でないことは理解されよう。例えば、遍在化の結果としてポリペプチドが分
枝状でもよく、または、ポリペプチドが分枝含有または非含有の環状でもよい。
環状ポリペプチドは一般には、天然のプロセシングイベントもしくは天然には生
じない人為操作によって生じたイベントのような翻訳後イベントの結果として生
じる。環状、分枝状及び分枝含有環状ポリペプチドは、非翻訳的天然プロセス及
び完全に合成的方法によって合成され得る。
【００８５】 修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ末端またはカルボキシ末端な
どのポリペプチド中の任意の場所で生じ得る。実際、共有結合修飾によるポリペ
プチド中のアミノ基またはカルボキシル基または双方の阻止は天然産生ポリペプ
チドにも合成ポリペプチドにも共通に存在する。例えば、タンパク質分解プロセ
シングの前に大腸菌中で形成されるポリペプチドのアミノ末端残基はほぼ必ずＮ
−ホルミルメチオニンであろう。
【００８６】 ポリペプチドに生じる修飾はしばしば、該ポリペプチドがどのように作製され
たかに依存する。例えばクローン化した遺伝子を宿主中で発現させることによっ
て産生させたポリペプチドの場合、修飾の性質及び範囲は主として宿主細胞の翻
訳後修飾能力とポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルとによっ
て決定されるであろう。例えば、グリコシル化が大腸菌のような細菌宿主中では
しばしば生じないことが知られている。従って、グリコシル化が望まれる場合、
ポリペプチドを通常は真核細胞から成るグリコシル化宿主中で発現させる必要が
ある。昆虫細胞はしばしば哺乳類細胞と同じ翻訳後修飾を行う。このような理由
で、天然型のグリコシル化パターンを有する哺乳類タンパク質を効率的に発現さ
せるために昆虫細胞発現系が開発された。その他の修飾に関しても同様の考察が
可能である。
【００８７】 所与のポリペプチドの複数の部位に同じ種類の修飾が同じ程度または異なる程
度で存在し得ることは理解されよう。また、所与のポリペプチドは多くの種類の
修飾を含有し得る。
【００８８】 一般に、本文中で使用されたポリペプチドなる用語は、上記のような修飾のす
べて、特に、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させることによって合成され
たポリペプチド中に存在する修飾を包含する。
【００８９】 “多量体ポリペプチド複合体”及び“多量体ポリペプチド抗原”及び“ポリペ
プチド複合体”なる用語は本文中で互換的に使用されており、少なくとも２つま
たはそれ以上の別々の単個ポリペプチド鎖を含む統一体を意味する。これらの鎖
は等しい場合にも異なる場合にも、共有結合的または非共有結合的に結合し得る
。これらのポリペプチド鎖は組換え産生されてもよく、化学合成されてもよく、
または、天然ソースから単離されてもよい。単個鎖から多量体ポリペプチド複合
体を作製するために当業者に公知の技術を使用し得る。
【００９０】 このような多量体ポリペプチド複合体の最も簡単な例は等しい単個鎖から成る
ダイマーである。これらの鎖は、例えばジスルフィド結合によって共有結合され
てもよく、または、例えば水素結合及び静電相互作用によって非共有結合されて
もよい。もう少し複雑な例は、異なる単個鎖から成るダイマーである。この場合
にもこれらの鎖は共有結合されてもよく非共有結合されてもよい。多量体ポリペ
プチド複合体の別の複合レベルは、トライマー、テトラマー、ペンタマー及びよ
り高次の複合体のような複合体を形成する単個鎖の数の増加であろう。また、幾
つかの鎖が共有結合的に相互作用し、残りの鎖が非共有結合的に相互作用しても
よい。このような編成はタンパク質の結晶構造または溶液構造で観察され、構造
を生じる相互作用の詳細な性質が明らかになる。例えば、ヘモグロビンの複合体
は４つの単個鎖を含み、２つの鎖が１つの配列（α）を有し、２つの鎖が別の配
列（β）を有し、α２α２のヘテロテトラマーを形成している。別の例はα２β
β’σという編成を有する大腸菌ＲＮＡポリメラーゼであり、２つのα鎖と１つ
のβ鎖と１つのβ’鎖（βに相同であるが同一でしない）と１つのσ鎖とが複合
体を構成している。より複雑な多くの複合体が公知である。幾つかのタンパク質
では、複数の鎖の各々が多数存在し、全体のサイズが一定でかつ化学量論が維持
されている。例えば、２４コピーのサブユニットｔと１２コピーのホモダイマー
ｐ２と１２コピーのホモダイマーｆ２とから成るピルビン酸デヒドロゲーゼ〔ｔ ２４ （ｐ２）１２（ｆ２）１２〕がある。その他には、相対的組成が一定である
が全体のサイズが一定でない重合構造例えば微小管〔（αβ）ｎ〕がある。
【００９１】 一般に、本文中で使用された多量体ポリペプチド複合体という用語は上記のよ
うな編成をすべて包含する。
【００９２】 “成熟”ポリペプチドなる用語は、該当ポリペプチド及び起原細胞に適正な完
全な翻訳後修飾が行われたポリペプチドを意味する。
【００９３】 特定ポリペプチドの“フラグメント”は、特定ポリペプチドに由来する少なく
とも約３−５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８−１０個のアミノ酸、よ
り好ましくは少なくとも約１５−２０個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を意味
する。
【００９４】 “組換え宿主細胞”、“宿主細胞”、“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”
、及び、その他の単細胞統一体として培養された微生物またはより高等な真核細
胞系を表す同様の用語は、組換えベクターまたはその他の転移されたＤＮＡのレ
シピエントとして使用され得るまたは使用された細胞を意味しており、トランス
フェクトされた起原的細胞の起原的後代を包含する。
【００９５】 本文中で使用された“レプリコン”は、細胞中の自律的ポリヌクレオチド複製
単位として挙動するプラスミド、染色体またはウイルスのような遺伝子要素を意
味する。
【００９６】 “ベクター”は、別のポリヌクレオチドセグメントが結合されており、結合セ
グメントの複製及び／または発現を生じさせるようなレプリコンを意味する。
【００９７】 “コントロール配列”なる用語は、該配列に結合しているコーディング配列の
発現を実行させるために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。このようなコ
ントロール配列の特性は宿主生物次第で異なる。原核生物では、このようなコン
トロール配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーター
を含む。真核生物では、このようなコントロール配列は一般に、プロモーター、
ターミネーターを含み、幾つかの場合にはエンハンサーを含む。従って、“コン
トロール配列”なる用語は最小でも、その存在が発現に必要なすべての構成要素
を含み、更に、その存在が有利であるような追加の構成要素、例えばリーダー配
列を含み得る。
【００９８】 “読取り枠”または“ＯＲＦ”なる用語は、ポリペプチドをコードしているポ
リヌクレオチド配列の領域を意味する。この領域がコーディング配列の一部分を
表してもよく、またコーディング配列の全部を表してもよい。
【００９９】 “コーディング配列”は、適正な調節配列のコントロール下に配置されたとき
にｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列を意味
する。コーディング配列の境界は５′−末端の翻訳開始コドンと３′−末端の翻
訳終止コドンとによって決定される。コーディング配列の非限定例は、ｍＲＮＡ
、ｃＤＮＡ及び組換えポリヌクレオチド配列である。
【０１００】 “によって／として免疫学的に同定可能”という用語は、指定された（１つま
たは複数の）ポリペプチド中に存在する該ポリペプチドに固有の（１つまたは複
数の）エピトープ及び（１つまたは複数の）ポリペプチドの存在を意味する。免
疫学的一致は抗体結合及び／または結合競合によって決定され得る。これらの技
術は当業者に公知であり、本文中にも記載されている。また、エピトープの固有
性は、ＧｅｎＢａｎｋのような既知のデータバンクのコンピュータサーチによっ
てエピトープをコードするポリヌクレオチド配列を探し出し、既知の別のタンパ
ク質とのアミノ酸配列比較によって決定できる。
【０１０１】 本文中で使用された“エピトープ”は、ポリペプチドまたはタンパク質の抗原
決定基を意味する。エピトープは３つのアミノ酸をエピトープに固有の空間コン
ホメーションで含むと考えられる。一般に、１つのエピトープは少なくとも５個
のこのようなアミノ酸から成り、より多くの場合には少なくとも８−１０個のア
ミノ酸から成る。空間コンホメーションの試験方法は当業界で公知であり、例え
ば、Ｘ−線結晶学及び二次元核磁気共鳴がある。
【０１０２】 “コンホメーショナルエピトープ”は、免疫学的に認識可能な構造の特定アミ
ノ酸配置から成るエピトープである。このようなアミノ酸は同じポリペプチドに
連続順序もしくは不連続順序で存在するかまたは異なるポリペプチドに存在する
。
【０１０３】 ポリペプチドは、該ポリペプチドに含まれている特異的エピトープの抗体認識
によって抗体に結合するときは抗体に“免疫反応性”である。免疫反応性は、抗
体結合によって、より特定的には抗体結合の動力学によって、及び／または、抗
体の対象であるエピトープを含む既知の（１つまたは複数の）ポリペプチドを（
１つまたは複数の）競合物質として使用する結合の競合によって測定し得る。ポ
リペプチドが抗体に免疫反応性であるか否かを判定する方法は当業界で公知であ
る。
【０１０４】 本文中で使用された“問題のエピトープを含有する免疫原性ポリペプチド”と
いう用語は、天然に産生する問題のポリペプチドまたはそのフラグメント、及び
、別の手段、例えば化学合成もしくは組換え生物中のポリペプチドの発現のよう
な手段によって調製されたポリペプチドを意味する。
【０１０５】 “トランスフェクション”なる用語は、原核性または真核性の宿主細胞に外因
性ポリヌクレオチドを導入することを意味する。導入に使用される方法は問わな
い。“トランスフェクション”なる用語は、ポリヌクレオチドの安定な導入及び
一過性の導入の双方を意味しており、ポリヌクレオチドの直接取込み、形質転換
、形質導入及びｆ−交配を包含する。宿主細胞にいったん導入された外因性ポリ
ヌクレオチドは非組込みレプリコン、例えばプラスミドとして維持されてもよく
、あるいは、宿主ゲノムに組込まれてもよい。
【０１０６】 “処置”は予防及び／または治療を意味する。
【０１０７】 本文中で使用された“個体”なる用語は、脊椎動物、特に哺乳類の動物を意味
しており、非限定例は、飼育動物、競走用動物、霊長類及びヒトである。より特
定的にはこの用語はヒトを指す。
【０１０８】 “被検サンプル”なる用語は、分析物（例えば問題の抗原または問題の抗体）
のソースである個人の身体の成分を意味する。これらの成分は当業界で公知であ
る。被検サンプルは典型的には、ターゲット配列を含有する疑いのある任意のサ
ンプルである。被検サンプルは例えば、個体から標本を採取し、必要ならば標本
に含まれている任意の細胞を破壊し、これによってターゲット核酸を遊離させる
当業界で公知の方法を用いて調製できる。これらの被検サンプルとしては、本文
中に記載の本発明の方法によって試験され得る生物サンプルがあり、例えば全血
、血清、血漿、脳脊髄液、気管支洗浄液、気管支吸引液、尿、リンパ液のような
ヒト及び動物の体液、並びに、呼吸器、腸管及び尿生殖器の種々の外分泌物、涙
、唾液、乳、白血球、骨髄腫など；細胞培養上清のような生物流体；固定され得
る組織標本；及び、固定され得る細胞標本がある。
【０１０９】 “精製された産生物”は、常態で産生物と会合している細胞成分及び問題のサ
ンプル中に存在し得る別の種類の細胞から産生物を単離することによって得られ
た調製物を意味する。
【０１１０】 本文中に使用された“分析物”なる用語は、被検サンプル中に存在し得る検出
すべき物質を意味する。分析物は、天然の特異的結合要素（例えば抗体）が存在
するかまたは特異的結合要素の調製が可能な任意の物質でよい。従って、分析物
は、アッセイ中に１つまたは複数の特異的結合要素に結合できる物質である。“
分析物”はまた、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体及びその組合せを包含する
。分析物を特異的結合対の一方の要素となるので、天然の特異的結合パートナー
（対）を利用して分析物を検出できる。例えば、ビタミンＢ１２の検出には特異
的結合対の要素として内因子タンパク質を使用し、葉酸の検出には葉酸塩結合タ
ンパク質を使用し、糖質の検出には特異的結合対の一方の要素としてレクチンを
使用し得る。分析物としては、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ヌクレオ
チドターゲットなどがある。分析物は、血液、血漿または血清、尿などの体液に
可溶性でもよい。分析物は、組織中に存在してもよく、細胞表面または細胞内部
に存在してもよい。分析物は、血液、尿、乳組織吸引液のような体液中に分散し
た細胞上もしくは細胞内に存在してもよく、または生検サンプルとして得られて
もよい。
【０１１１】 “乳の疾患”、“乳疾患”及び“乳異常”という用語は、異常増殖、線維腺腫
、乳腺嚢胞症及び癌を非限定例とする任意の乳疾患または異常を示すために本文
中で互換的に使用されている。
【０１１２】 本文中で使用された“乳癌”なる用語は、上皮内導管癌、上皮内小葉癌、浸潤
性導管癌、髄様癌、管状癌、膠様癌、浸潤性小葉癌、浸潤性コメド癌及び炎症性
癌を非限定例とする任意の悪性乳疾患を意味する。
【０１１３】 “発現配列タグ”または“ＥＳＴ”は、組織から抽出され、次いでベクターに
挿入され、ｍＲＮＡの逆転写によって作製されたｃＤＮＡインサートの部分配列
を意味する。
【０１１４】 “転写物イメージ”は、ライブラリー中のＥＳＴの定量的分布を示す表または
リストを意味しており、ライブラリーの作製に用いた組織中で活性の遺伝子を表
す。
【０１１５】 本発明は特異的結合要素を利用するアッセイを提供する。本文中で使用された
“特異的結合要素”なる用語は、特異的結合対の１つの要素を意味する。即ち、
一方の分子が化学的または物理的手段を介して第二の分子に特異的に結合する異
なる２つの分子のうちの１つの要素を意味する。従って、常用のイムノアッセイ
の抗原及び抗体から成る特異的結合対に加えて、ビオチンとアビジン、糖質とレ
クチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子
と酵素、酵素インヒビターと酵素、などのような特異的結合対がある。更に、特
異的結合対としては、原型の特異的結合要素の類似体である要素、例えば分析物
−類似体がある。免疫反応性特異的結合要素としては、抗原、抗原フラグメント
、モノクローナル及びポリクローナルの双方の抗体及び抗体フラグメント、その
複合体があり、組換えＤＮＡ分子によって形成されるものも含む。
【０１１６】 特異的結合要素は“特異的結合分子”を包含する。“特異的結合分子”は、任
意の特異的結合要素、特に免疫反応性特異的結合要素を意味する。従って、この
ような場合の“特異的結合分子”は、抗体分子（ポリクローナル及びモノクロー
ナル調製物から得られる）、並びに、ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば
、Ｗｉｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９（１９９１）及び米
国特許第４，８１６，５６７号参照）；Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ）フラグメ
ント；Ｆｖ分子（非共有結合ヘテロダイマー、例えば、Ｉｎｂａｒら，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２（１９７２
）及びＥｈｒｌｉｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９：４０９１−４０９６（１９８
０）参照）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）
参照）；ヒト化抗体分子（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２
：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
９：１５３４−１５３６（１９８８）及び１９９４年９月２１日公開の英国特許
公開第ＧＢ２，２７６，１６９号参照）；並びに、このような分子から得られた
親抗体分子の免疫学的結合特性を維持している任意の機能性フラグメントを包含
する。
【０１１７】 本文中で使用された“ハプテン”なる用語は、部分的抗原を意味するか、また
は、抗体結合能力を有しているがキャリアータンパク質に結合しないと抗体形成
を誘発できない非タンパク質結合要素を意味する。
【０１１８】 本文中で使用された“捕獲試薬”なる用語は、サンドイッチアッセイでは分析
物に特異的であり、競合アッセイでは指示薬もしくは分析物に特異的であり、間
接アッセイではそれ自体が分析物に特異的な補助特異的結合要素に特異的である
ような未標識の特異的結合要素を意味する。捕獲試薬は、アッセイ処理前または
アッセイ処理中に直接または間接に固相物質に結合でき、これによって、固定さ
れた複合体を被検サンプルから分離し得る。
【０１１９】 “指示薬”は、シグナル発生能を有しており特異的結合要素にコンジュゲート
された（“付着された”）外的手段によって検出され得る測定可能なシグナルを
発生する“シグナル発生化合物”（“ラベル”）から成る。特異的結合対の抗体
要素であることに加えて、指示薬はまた、ハプテン−抗−ハプテン系のような任
意の特異的結合対の一方の要素、例えば、ビオチンまたは抗ビオチン、アビジン
またはビオチン、糖質またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター
またはレセプター分子、酵素補因子と酵素、酵素インヒビターまたは酵素、など
でもよい。免疫反応性特異的結合要素は、サンドイッチアッセイで問題のポリペ
プチドに結合でき、競合アッセイで捕獲試薬に結合でき、間接アッセイで補助特
異的結合要素に結合できる抗体、抗原、または、抗体／抗原複合体である。プロ
ーブ及びプローブアッセイについて記述するときは、“リポーター分子”なる用
語を使用し得る。リポーター分子は、カルバゾールまたはアダマンタンなどの特
異的結合対の特異的結合要素にコンジュゲートした上記のようなシグナル発生化
合物から成る。
【０１２０】 考えられる種々の“シグナル発生化合物”（ラベル）としては、色原体、酵素
のような触媒、フルオレセイン及びローダミンのような発光化合物、ジオキセタ
ン、アクリジニウム、フェナントリジニウム及びルミノールのような化学発光化
合物、放射性元素並びに直接可視ラベルがある。酵素の例は、アルカリホスファ
ターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼなどである。
特定ラベルの選択は決定要因ではない。しかしながらラベルは、単独でシグナル
を発生するかまたは１つもしくは複数の付加物質とのコンジュゲーションによっ
てシグナルを発生する能力を有していなければならない。
【０１２１】 “固相”（“固体支持体”）は当業者に公知であり、反応トレーのウェル壁、
試験管壁、ポリスチレンビーズ、磁性または非磁性のビーズ、ニトロセルロース
ストリップ、膜、ラテックス粒子のようなマイクロ粒子、ヒツジ（または他の動
物）の赤血球、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）（ピルビン酸アルデヒド及びホ
ルムアルデヒドによって“固定された”赤血球、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）などがある。“固相
”は決定要因ではなく、当業者が選択できる。従って、ラテックス粒子、マイク
ロ粒子、磁性または非磁性のビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウ
ェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（または他の動物の）赤血球及
びＤｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）はすべて好適例である。固相をペプチドに固
定する適当な方法は、イオン性、疎水性または共有結合性相互作用などである。
本文中で使用された“固相”なる用語は、不溶性であるかまたはその後の反応に
よって不溶化し得る任意の材料を意味する。固相は、捕獲試薬を吸引し固定し得
る固有能力に基づいて選択され得る。あるいは固相が、捕獲試薬を吸引し固定す
る能力を有している付加的レセプターを保持し得る。付加的レセプターは、捕獲
試薬自体または捕獲試薬にコンジュゲートされた荷電物質に反対の電荷をもつ荷
電物質でもよい。あるいはまた、レセプター分子が、固相に固定（付着）されて
おり特異的結合反応を介して捕獲試薬を固定化する能力を有している任意の特異
的結合要素でもよい。レセプター分子は、アッセイ処理前またはアッセイ処理中
に捕獲試薬を固相材料に間接に結合させ得る。従って固相は、プラスチック、誘
導プラスチック、磁性または非磁性の金属、試験管のガラスまたはシリコン表面
、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、マイクロ粒子、チップ、ヒツジ（
または他の動物）の赤血球、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）及び平均的な当業
者に公知の他の形状でよい。
【０１２２】 また本発明の範囲内で、検出抗体がアクセスできる十分な多孔度を有しており
かつ抗原に結合する適当な表面親和性を有している任意の適当な多孔質材料を固
相に使用することも考えられる。一般には微孔質構造が好ましいが、水和状態で
ゲル構造をもつ材料も使用できる。このような有用な固体支持体の非限定例は、
ニトロセルロース及びナイロンである。本文中に記載のこのような多孔質固体支
持体として、好ましくは約０．０１−０．５ｍｍ、特に好ましくは約０．１ｍｍ
の厚みのシートの形態が考えられる。細孔サイズは広い範囲内で変更でき、好ま
しくは約０．０２５−１５ミクロン、特に約０．１５−１５ミクロンである。こ
のような支持体の表面は、抗原または抗体を支持体に共有結合させる化学的プロ
セスによって活性化され得る。しかしながら一般には、十分には解明されていな
い疎水性の力によって抗原または抗体が多孔質材料に吸着されることによって抗
原または抗体が不可逆的に結合する。その他の適当な固体支持体は当業界で公知
である。
【０１２３】 試薬 本発明は、少なくとも１コピーのＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）配列と少
なくとも１コピーの乳グロビンポリペプチド（配列５）とを含むが、更に１つま
たは複数の未知のポリペプチドを含み得る多量体ポリペプチド複合体または抗原
、及び、該多量体ポリペプチド複合体に特異的な抗体のような試薬を提供する。
本発明のポリペプチドまたは抗体は、乳癌のような乳疾患及び異常の検出、診断
、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ ｖｉｖｏ造影、予防または治療、ある
いは病因素質の判定、などを可能にする情報を提供するために使用され得る。
【０１２４】 本発明は、先行特許出願に提示されたような推定アミノ酸配列及び１つまたは
複数の未知のポリペプチド配列を構成要素として含む多量体ポリペプチド複合体
、並びに、このような多量体ポリペプチド複合体のフラグメント、類似体及び誘
導体に関する。本発明の多量体ポリペプチド複合体は、組換えによって産生され
てもよく、天然ソースから精製されてもよく、または、合成されてもよい。多量
体ポリペプチド複合体のフラグメント、誘導体または類似体は、いずれかの構成
ポリペプチド鎖の１つまたは複数のアミノ酸残基が保存されているかまたは非保
存のアミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）によって置換され、このよう
な置換アミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされているかコードされてい
ないポリペプチドであってもよく；１つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含
むポリペプチドであってもよく；多量体ポリペプチド複合体の鎖のいずれかまた
は全部が多量体ポリペプチド複合体の半減期を延長する化合物（例えばポリエチ
レングリコール）のような別の化合物に融合したポリペプチドであってもよく；
または、付加アミノ酸が多量体ポリペプチド複合体の鎖のいずれかまたは全部、
例えばリーダー配列もしくは分泌配列または多量体ポリペプチド複合体もしくは
プロタンパク質配列の精製に使用される配列に融合しているポリペプチドであっ
てもよい。このようなフラグメント、誘導体及び類似体は本発明の範囲内に包含
される。本発明の多量体ポリペプチド複合体は好ましくは単離形態で提供され、
好ましくは精製されている。
【０１２５】 従って、本発明の多量体ポリペプチド複合体の任意の鎖は、天然発生ポリペプ
チドのアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有するか、あるいは、１つまたは
複数のアミノ酸置換に起因する小変異をもつアミノ酸配列を有し得る。変異は、
置換アミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有するような“保存性変化”、
例えばイソロイシンによるロイシンの置換またはセリンによるトレオニンの置換
でもよい。対照的に、変異が非保存性変化、例えばトリプトファンによるグリシ
ンの置換でもよい。同様の小変異はまた、アミノ酸の欠失または挿入またはその
双方でもよい。生物学的または免疫学的な活性を変化させることなく置換、挿入
または欠失し得るアミノ酸の種類及び個数を決定する指針は、当業界で公知のコ
ンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ
Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を使用することによって見出される。
【０１２６】 従って、本発明の多量体ポリペプチド複合体は、少なくとも１コピーのＢＵ１
０１配列（α）と少なくとも１コピーの乳グロビン配列（β）と任意に少なくと
も１つの未知の配列α’またはβ’とから成る組成を有し得る。これらの要素は
任意の比で存在し得る。
【０１２７】 本発明はまた、本発明で提供されるポリペプチドの産生に関する教示を提供す
る。
【０１２８】 薬剤スクリーニング 本発明は、多量体ポリペプチド複合体に特異的に結合する少なくとも１つの化
合物を同定するために、複数の化合物を多量体ポリペプチド複合体またはその任
意のフラグメントに対する特異的結合に基づいてスクリーニングする方法を提供
する。このような方法は、少なくとも１つの化合物を準備する段階と、多量体ポ
リペプチド複合体を各化合物に混合し、結合に適した条件下で結合に十分な時間
維持する段階と、各化合物に対する多量体ポリペプチド複合体の結合を検出する
段階とから成る。
【０１２９】 このような試験に使用されるポリペプチド複合体、ポリペプチド、または、（
１つまたは複数の）ペプチドフラグメントは、溶液中で遊離状態でもよく、固体
支持体に固定されていてもよく、細胞表面に担持されていてもよく、または、細
胞内に配置されていてもよい。１つのスクリーニング方法では、ポリペプチド複
合体、ポリペプチドまたはペプチドフラグメントを発現し得る組換え核酸を安定
にトランスフェクトした真核性または原核性の宿主細胞を使用する。薬剤、化合
物または他の任意の物質はこのようなトランスフェクト細胞に対する競合結合ア
ッセイによってスクリーニングされ得る。例えば、ポリペプチドと被検物質との
間の複合体の形成を生存細胞または固定細胞中で測定し得る。
【０１３０】 従って本発明は、多量体ポリペプチド複合体に関連する疾患を治療するために
使用できる薬剤、化合物または他の任意の物質のスクリーニング方法を提供する
。これらの方法は、物質をポリペプチド複合体、ポリペプチドまたはそのフラグ
メントに接触させ、物質とポリペプチドとの複合体の存在、またはポリペプチド
と細胞との複合体の存在を検定する段階から成る。競合結合アッセイでは一般に
ポリペプチドを標識する。適当なインキュベーション後、遊離（即ち非複合）ポ
リペプチドまたはそのフラグメントを結合形態で存在するポリペプチドまたはそ
のフラグメントから分離し、遊離即ち複合体非形成ラベルの量を、特定物質のポ
リペプチド結合能力またはポリペプチド／細胞複合体妨害能力の尺度とする。
【０１３１】 本発明はまた、ポリペプチドに特異的に結合し得る中和抗体がポリペプチド複
合体、ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する結合に関して被検物質と競
合するような競合スクリーニングアッセイの使用を包含する。このアッセイでは
、本発明で提供される多量体ポリペプチド複合体に共通の１つまたは複数の抗原
決定基を有している被検サンプル中の任意のポリペプチドの存在を検出するため
に抗体を使用できる。
【０１３２】 別のスクリーニング技術は、本発明で開示された多量体ポリペプチド複合体の
少なくとも１つのポリペプチドに適当な結合親和性を有している化合物を高処理
量でスクリーニングし得る。簡単に説明すると、プラスチックピンまたは他の任
意の表面のような固相上で多数の異なる小ペプチドから成る被検化合物を合成す
る。被検ペプチド化合物をポリペプチドと反応させて洗浄する。このようにして
固相に結合したポリペプチドを当業界で公知の方法によって検出する。また、本
文中に記載のスクリーニング技術に使用するために精製ポリペプチドをプレート
に直接コートしてもよい。更に、ポリペプチドを捕獲し固体支持体に固定させる
ために非中和抗体を使用してもよい。例えば、１９８４年９月１３日公開の欧州
特許ＥＰ８４／０３５６４参照。該特許の記載内容は参照によって本発明に含ま
れるものとする。
【０１３３】 合理的な薬剤設計の目的は、考察中の生物活性ポリペプチドまたは該ポリペプ
チドと相互作用するアゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビターのような
小分子の構造的類似体を産生することである。このような構造的類似体は、より
活性の形態もしくはより安定な形態のポリペプチドから成る薬剤またはポリペプ
チドのｉｎ ｖｉｖｏ機能を増進もしくは妨害する薬剤を設計するために使用で
きる。Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１（
１９９１）参照。該文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする
。
【０１３４】 例えば１つの方法では、ポリペプチドまたはポリペプチド−インヒビター複合
体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューターモデリング、または、最も典型的
には双方の併用によって決定する。分子の構造を解明し分子の（１つまたは複数
の）活性部位を決定するためには、ポリペプチドの形態及び電荷を確認しなけれ
ばならない。使用される機会は少ないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情
報はまた相同タンパク質の構造に基づくモデリングによって得られる。双方の場
合に、類似のポリペプチド様分子を設計するためまたは効率的なインヒビターを
同定するために適当な構造情報が使用される。
【０１３５】 合理的な薬剤設計の有用な例は、Ｓ．Ｂｒａｘｔｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ３１：７７９６−７８０１（１９９２）に示されたような改良された活
性もしくは安定性をもつ分子、または、Ｓ．Ｂ．Ｐ．Ａｔｈａｕｄａら，Ｊ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１３（６）：７４２−７４６（１９９３）によ
って示されたような天然型ペプチドのインヒビター、アゴニストもしくはアンタ
ゴニストとして作用する分子である。これらの引用文献の記載内容は参照によっ
て本発明に含まれるものとする。
【０１３６】 また、上記のようなアッセイによって選択されたターゲット特異的抗体を単離
し、次いでその結晶構造を決定することも可能である。原則としてこの方法は、
以後の薬剤設計の基礎となるファーマコホア（薬作用発生団）を産生する。更に
、薬理学的に活性の機能性抗体に対する抗−イディオタイプ抗体（“ａｎｔｉ−
ｉｄ”）を産生させることによってタンパク質結晶学を完全に無視することも可
能である。鏡像の鏡像なのでａｎｔｉ−ｉｄの結合部位は起原レセプターの類似
体である。次に、ａｎｔｉ−ｉｄを使用して、化学的または生物学的に産生され
たペプチドバンクからペプチドを同定及び単離し得る。単離されたペプチドはフ
ァーマコホア（即ち、原型医薬）として作用し得る。
【０１３７】 本発明の組換えポリペプチド複合体は、Ｘ線結晶学のような分析的研究を行う
ために十分な量で提供される。更に、核酸配列から誘導され得るポリペプチドの
アミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代替または付加してコンピユーターモデリ
ング技術を使用する技術者に指針を提供するであろう。
【０１３８】 多量体ポリペプチド複合体に特異的な抗体（例えば抗−多量体ポリペプチド複
合体抗体）は更に、ポリペプチド複合体に結合することによってポリペプチド複
合体の生物作用を阻害するために使用され得る。このような場合、抗体を例えば
乳癌及びその転移のような乳組織疾患を治療する治療方法で使用し得る。
【０１３９】 更に、このような抗体は被検サンプル中の多量体ポリペプチド複合体の有無を
検出でき、従って、乳組織の疾患または異常、特に乳癌を診断する診断用マーカ
ーとして有用である。このような抗体はまた、乳癌のような乳組織疾患状態の診
断用マーカーとして機能し得る。
【０１４０】 本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト及びインヒビターを目
的とする。アンタゴニスト及びインヒビターは、ポリペプチド複合体の機能を阻
害または排除する因子である。従って例えば、アンタゴニストは本発明のポリペ
プチドに結合し、該ポリペプチドの機能を阻害または排除し得る。アンタゴニス
トは例えば、ポリペプチドに結合することによって多量体ポリペプチド複合体の
活性を除去する抗ポリペプチド抗体でもよく、または、幾つかの場合にはアンタ
ゴニストがオリゴヌクレオチドでもよい。小分子インヒビターの非限定例は、小
ペプチドまたはペプチド様分子である。
【０１４１】 アンタゴニスト及びインヒビターは、生理的食塩水、緩衝生理的食塩水、デキ
ストロース、水、グリセロール、エタノール及びその混用を非限定例とする医薬
として許容される担体に組合せた組成物として使用され得る。多量体ポリペプチ
ド複合体インヒビターは全身性投与で使用されるのが好ましい。本発明はまた、
このようなポリペプチド複合体の作用を阻害する抗体を提供する。
【０１４２】 組換え技術 本発明は、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）、乳グロビンポリペプチド（配
列５）及び未知のα’及び／またはβ’ポリペプチドを同時発現させる宿主細胞
及び発現ベクターを提供し、また、これらによってコードされた多量体ポリペプ
チド複合体の産生方法を提供する。このような方法は、ＢＵ１０１ポリペプチド
（配列６）、乳グロビンポリペプチド（配列５）及び未知のα’及び／またはβ
’ポリペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物から（１
つまたは複数の）多量体ポリペプチド及び／または多量体ポリペプチド複合体を
回収する段階から成る。
【０１４３】 本発明はまた、本発明のＢＵ１０１ポリペプチド、乳グロビンポリペプチド及
び未知の（１つまたは複数の）α’及び／またはβ’ポリペプチドを個別にコー
ドするベクター、本発明のベクターによって遺伝子操作された宿主細胞を提供し
、また、本発明の多量体ポリペプチド複合体の全部または任意のサブユニットを
組換え技術によって製造する方法を提供する。
【０１４４】 クローニングベクターまたは発現ベクターから成るベクターによって宿主細胞
を遺伝子操作（トランスフェクト、形質導入または形質転換）する。ベクターは
、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態でよい。操作した宿主細胞を
、プロモーターを活性化し、トランスフェクト細胞を選択するかまたはＢＵ１０
１遺伝子（配列２）、乳グロビン遺伝子（配列１）もしくは（１つまたは複数の
）未知のα’及び／またはβ’遺伝子を増幅するように適宜改質した慣用の栄養
培地で培養し得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、選択された発現用宿主細胞に
従来から使用されている培養条件であり、平均的な当業者に明らかであろう。
【０１４５】 組換え技術によって（１つまたは複数の）ポリペプチドまたはポリペプチド複
合体を産生させるためにポリヌクレオチドを使用し得る。従って、ポリペプチド
を発現させる多様な発現ビヒクル、特にベクターまたはプラスミドのいずれかに
ポリヌクレオチド配列を含ませるとよい。このようなベクターとしては、染色体
ＤＮＡ配列、染色体性ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０誘導体；
細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮ
Ａ、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び偽狂犬病ウイルス
のようなウイルスＤＮＡとの組合せに由来するベクターがある。しかしながら、
宿主体内で複製可能であり生存可能であるならば他の任意のプラスミドまたはベ
クターを使用し得る。
【０１４６】 適当なＤＮＡ配列を多様な手順によってベクターに挿入し得る。一般に、当業
者に公知の手順によってＤＮＡ配列を適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入
する。このような手順及びその他の手順は当業者の知識の範囲内にあると考えて
よい。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令する（１つまたは複
数の）適当な発現コントロール配列（プロモーター）に作動可能に連結されてい
る。このようなプロモーターの非限定的代表例は、ＬＲＴまたはＳＶ４０プロモ
ーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ラムダファージＰ ｓｕｂ Ｌプロモータ
ー、並びに、原核細胞もしくは真核細胞もしくはそれらのウイルス中で遺伝子発
現をコントロールすることが判明している他のプロモーターである。発現ベクタ
ーはまた、翻訳開始用リボソーム結合部位と転写ターミネーターとを含む。ベク
ターはまた、適当な発現増幅配列を含む。加えて発現ベクターは好ましくは、真
核細胞培養物のジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性または大腸
菌のテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性のようなトランスフェクト
された宿主細胞を選択するための表現形質を与える遺伝子を含有する。
【０１４７】 上記のような適当なＤＮＡ配列と適当なプロモーターまたはコントロール配列
とを含有するベクターを適当な宿主にトランスフェクトし、宿主にタンパク質を
発現させるために使用し得る。適当な宿主の代表例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｍｕｒｉｕｍ）、放
線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）のような細菌細胞；酵母のような菌類
細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びＳｆ９のような昆虫細胞
；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓメラノーマのような動物細胞；植物細胞、な
どがある。適当な宿主の選択は本文中の教示から当業者が想到し得ると考えられ
る。
【０１４８】 より特定的には本発明はまた、上記に広義に定義された１つまたは複数の配列
を含む組換え構築物を包含する。構築物は、本発明の配列が順方向または逆方向
に挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターから成る。こ
の実施態様の好ましい特徴は、構築物が更に、配列に作動的に連結された調節配
列例えばプロモーターを含むことである。多数の適当なベクター及びプロモータ
ーが当業者に公知であり市販されている。以下のようなベクターを例示し得る。
細菌性ベクター：ｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ），ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉ
Ｘ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１
６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ
、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）；真核性ベクター：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、
ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主体内で複製可能及び生
存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用し得る。
【０１４９】 プラスミドｐＩＮＣＹは、ポリリンカー（多重クローニング部位）に２つの修
飾を有している以外はプラスミドｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にほぼ一致する。これらの修飾は
、（１）ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が欠失している、（２）ＥｃｏＲＩ制限部位が
異なる位置に存在する、ことである。ｐＩＮＣＹは、ｐＳＰＯＲＴ１をＨｉｎｄ
ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで開裂し、ポリリンカーの切除フラグメントを合成ＤＮＡ
フラグメント（配列３−４）で置換することによってｐＳＰＯＲＴ１から作製さ
れる。この置換は平均的な当業者に公知の任意の方法で行われる。例えば、５′
末端ホスフェートをもつ２つのヌクレオチド配列、即ち、配列３−４を合成的に
作製し、一緒に混合し、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断されたｐ
ＳＰＯＲＴ１プラスミドに、付着末端の結合が生じる標準条件下で結合させる。
次に、適当な宿主細胞（例えば大腸菌ＤＨ５α細胞）に結合ＤＮＡをトランスフ
ェクトし、組換えクローンをアンピシリン耐性に基づいて選択する。次に、プラ
スミドＤＮＡを個々のクローンから調製し、制限酵素分析またはＤＮＡ配列決定
を行って、適正方向の挿入配列の存在を確認する。平均的な当業者に公知の別の
クローニング戦略も使用し得る。
【０１５０】 プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベ
クターまたは選択可能マーカーをもつ他のベクターを使用して所望の任意の遺伝
子から選択できる。２つの適当なベクターは、ｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７で
ある。特定の名称の細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、ＳＰ６、
Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ ｓｕｂ Ｒ、Ｐ ｓｕｂ Ｌ及びｔｒｐである。真核
性プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモータ
ー、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０
、レトロウイルス及びマウスメタロチオネイン−Ｉに由来のＬＴＲがある。適当
なベクター及びプロモーターの選択は平均的な当業者のレベルの十分に範囲内で
ある。
【０１５１】 別の実施態様において本発明は、上記の構築物を含有する宿主細胞を提供する
。宿主細胞は、哺乳類細胞のような高等真核細胞でもよく、または、酵母細胞の
ような下等真核細胞でもよく、あるいは、細菌細胞のような原核細胞でもよい。
宿主細胞に構築物を導入するためには、リン酸カルシウムトランスフェクション
、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクションまたは電気穿孔を使用し得
る〔Ｌ．Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌ
ａｎｇ，Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌ
ｋ，ＣＴ（１９９４）〕。
【０１５２】 宿主細胞中の構築物は組換え配列によってコードされた遺伝子産物を産生する
ために慣用の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは慣用のペ
プチドシンセサイザーによって合成的に製造し得る。
【０１５３】 組換えタンパク質は哺乳類細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で適正なプ
ロモーターのコントロール下で発現され得る。また、ＤＮＡ構築物に由来のＲＮ
Ａを使用してこのようなタンパク質を産生させるために無細胞翻訳系を使用でき
る。原核性及び真核性の宿主と共に使用できる適当なクローニングベクター及び
発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載されている。
該文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０１５４】 高等真核細胞による（１つまたは複数の）本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増進され
る。エンハンサーは、通常は約１０−３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素であ
り、転写を増進するようにプロモーターに作用する。その例としては、複製起点
の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０ｂｐ）、サイトメガロウイル
ス初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサ
ー及びアデノウイルスエンハンサーがある。
【０１５５】 一般に、組換え発現ベクターは、複製起点と、宿主細胞にトランスフェクショ
ンさせ得る選択可能マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、酵母菌
（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＲＰ１遺伝子と、高度に発現された遺伝子に
由来し下流の構造配列の転写を指令するプロモーターとを含む。このようなプロ
モーターは特に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、アルファ因子、
酸ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質のような解糖酵素をコードするオ
ペロンに由来し得る。ヘテロロガスな構造配列を翻訳開始配列、終止配列、及び
、好ましくは翻訳されたタンパク質を細胞周辺腔または細胞外培地に分泌するよ
うに指令し得るリーダー配列に適正フェーズで組立てる。ヘテロロガス配列は任
意に、発現された組換え産物の安定化または精製容易化のような所望の特性を与
えるＮ−末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【０１５６】 細菌に使用し得る発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ
配列を適当な翻訳開始シグナル及び終止シグナルと共に機能性プロモーターに対
して作動可能な読取りフェーズで挿入することによって構築される。ベクターは
１つまたは複数の表現型選択可能マーカーとベクターの維持を確保し所望の場合
には宿主体内で増幅させる複製起点とを含むであろう。トランスフェクションに
適当な原核性宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ）、及び、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）及びブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属に含まれる様々な種であ
り、また、使用可能なその他の宿主も常法で選択できよう。
【０１５７】 細菌に使用される有用な発現ベクターは、選択可能マーカーと、公知のクロー
ニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子要素を含むプラス
ミドに由来の細菌複製起点とを含む。その他のベクターの非限定例は、ＰＫＫ２
２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌ
ａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，ＷＩ）である。これらのｐＢＲ３２２の“主鎖”セクションを適正プロモ
ーター及び発現させるべき構造配列に組合せる。
【０１５８】 適当な宿主をトランスフェクションし宿主を適正な細胞密度まで増殖させた後
、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘発）
によって抑制解除し、細胞を追加期間培養する。細胞を、典型的には遠心によっ
て収集し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を取出し
て更に精製する。タンパク質の発現に使用された微生物細胞を、凍結−解凍の繰
返し、音波処理、機械的破壊のような慣用の方法または細胞溶解剤の使用によっ
て破壊し得る。このような方法は平均的な当業者に公知である。
【０１５９】 種々の哺乳類細胞培養物もまた組換えタンパク質を発現させるために使用でき
る。哺乳類発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１
）に記載されたサル腎臓線維芽細胞系ＣＯＳ−７、並びに、Ｃ１２７、ＨＥＫ−
２９３、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系のような相溶性ベクターを
発現し得るその他の細胞系である。哺乳類発現ベクターは、複製起点と適当なプ
ロモーター及びエンハンサーとを含み、また必要なリボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、スプライスのドナー及びアクセプター部位、転写終了配列及び５
′フランキング非転写配列を任意に含むであろう。例えばＳＶ４０ウイルスゲノ
ム、例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポ
リアデニル化部位に由来のＤＮＡ配列を、必要な非翻訳遺伝子要素を提供するた
めに使用し得る。有用なベクターの代表はｐＲｃ／ＣＭＶ及びｐｃＤＮＡ３（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）である。
【０１６０】 ポリペプチドを、アフィニティクロマトグラフィー、硫安沈殿またはエタノー
ル沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル
ロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィーまたはレクチンクロマトグラフィーなどの公知の方
法で組換え細胞培養物から回収し精製し得る。精製中に低濃度（約０．１−５ｍ
Ｍ）のカルシウムイオンを存在させるのが好ましい〔Ｐｒｉｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：９１７（１９６９）〕。ポリペプチドの配置（ｃｏｎｆ
ｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を完成するために必要に応じてタンパク質の再生段階を使
用し得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製段階と
して使用し得る。
【０１６１】 従って、本発明のポリペプチドは高発現細胞系から発現された天然精製産物で
もよく、または化学合成手順の生成物でもよく、または原核性もしくは真核性の
宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞の培養物）から組換
え技術によって産生されてもよい。組換え産生手順に使用される宿主次第で、本
発明のポリペプチドは哺乳類もしくはその他の真核生物の糖質によってグリコシ
ル化されていてもよくまたは非グリコシル化でもよい。本発明のポリペプチドは
また、開始アミノ酸としてメチオニン残基を含んでもよい。
【０１６２】 ｃＤＮＡを含むプラスミドは公表されている公知の手順で市販のプラスミドか
ら構築し得る。更に、記載のプラスミドに等価のプラスミドは当業界で公知であ
り平均的な当業者に明らかであろう。ｃＤＮＡを特定宿主体内でタンパク質を発
現させるために有用な別の既知のベクターにシャトルさせてもよい。ターゲット
ｃＤＮＡの両端の直鎖（ｓｔｒｅｔｃｈ）にハイブリダイズする十分なクローニ
ング部位とＤＮＡセグメントとを含むオリゴヌクレオチドプライマーは標準方法
で化学合成できる。次にこれらのプライマーを使用して所望の遺伝子セグメント
をＰＣＲ増幅させる。得られた新しい遺伝子セグメントを標準条件下で適正な制
限酵素で消化し、ゲル電気泳動で単離する。あるいは、同様の遺伝子セグメント
を産生するために、ｃＤＮＡを適正な制限酵素で消化し、欠失した遺伝子セグメ
ントを化学合成オリゴヌクレオチドで充填してもよい。２つ以上の遺伝子に由来
のコーディング配列のセグメントを互いに結合し、組換え配列を最適に発現でき
る適正なベクターにクローニングし得る。
【０１６３】 このようなキメラ分子に適した発現宿主の非限定例は、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞のような哺乳類細胞、
Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのような酵母細胞、大腸菌のような細菌である。これらの細胞系の各々に対
して有用な発現ベクターも、細菌中の増殖を可能にする複製起点と、細菌中の選
択を可能にするベータ−ラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子のような選択可能マー
カーとを含むであろう。更にベクターは、トランスフェクトされた真核宿主細胞
中の選択を可能にするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような第
二の選択可能マーカーを含み得る。問題の配列にポリＡが欠失しているときは、
真核発現宿主に使用するベクターに３′ポリＡテールを付加することが必要であ
ろう。
【０１６４】 ベクターは更に、遺伝子発現を増進させるプロモーターまたはエンハンサーを
含有し得る。このようなプロモーターは宿主特異的であり、その非限定例は、Ｃ
ＨＯ細胞用のＭＭＴＶ、ＳＶ４０またはメタロチオニンプロモーター；細菌宿主
用のｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃまたはＴ７プロモーター；酵母用のアルファ因子、
アルコールオキシダーゼまたはＰＧＨプロモーターである。ラウス肉腫ウイルス
（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを任意に有するアデノウイル
スベクターは哺乳類細胞系のおけるタンパク質発現を誘発するために使用され得
る。組換え細胞の均質培養物が得られると、大量の組換え産生タンパク質をなら
し培地から回収し、当業界で公知のクロマトグラフィー方法を用いて分析する。
大量の分泌タンパク質を産生させる代替方法では、哺乳動物胚をトランスフェク
ションし、トランスジェニック雌牛、ヤギ、ヒツジなどの産乳から組換えタンパ
ク質を回収する。ポリペプチド及び近縁分子はタンパク質を容易に精製できるよ
うな方法で組換え発現され得る。１つの方法では、ヒトのポリペプチドに天然に
は存在しない１つまたは複数の追加のポリペプチドドメインを含むキメラタンパ
ク質を発現させる。精製を容易にするこのようなドメインの非限定例は、固定金
属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンドメインのような金属キ
レート化ペプチド、固定免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡド
メイン、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ，Ｓ
ｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）に使用されるドメインである。Ｆａｃｔｏｒ ＸＡまたは
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のエンテロキナーゼのよう
な開裂可能なリンカー配列をポリペプチド配列と精製ドメインとの間に混在させ
ることもポリペプチドの回収に役立つであろう。
【０１６５】 イムノアッセイ： ポリペプチド、多量体ポリペプチド複合体、そのフラグメント、誘導体、類似
体、または、このようなポリペプチドまたは多量体ポリペプチド複合体を発現す
る細胞、などは種々のアッセイに使用し得る。乳組織に対する抗体を検出するた
めの多くのアッセイが本文中に記載されている。これらのポリペプチドはまた、
抗体を産生させるために免疫原として使用できる。これらの抗体は例えば、ポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、
Ｆａｂフラグメント、または、Ｆａｂ発現ライブラリーの産物である。当業界で
公知の種々の手順をこのような抗体及びフラグメントの産生に使用し得る。
【０１６６】 例えば、多量体ポリペプチド複合体に対する抗体は、多量体ポリペプチド複合
体を動物に直接注入するかまたは多量体ポリペプチド複合体をマウス、ウサギ、
ヤギまたはヒトのような動物に投与することによって得られる。マウス、ウサギ
またはヤギが好ましい。多量体ポリペプチド複合体は、ＢＵ１０１（配列６）、
乳グロビン（配列５）及び（１つまたは複数の）未知のα’及び／またはβ’ポ
リペプチド及びそのフラグメントから成る一群の配列から構成される。そのよう
に得られた抗体は多量体ポリペプチド複合体自体に結合する。このように、多量
体ポリペプチド複合体のフラグメントだけまたはその構成ポリペプチドのいずれ
かだけをコードする配列を使用して、天然型（ｎａｔｉｖｅ）ポリペプチド複合
体に結合する抗体を産生させ得る。このような抗体を次に、該多量体ポリペプチ
ド複合体を含むと疑われる組織のような被検サンプルから多量体ポリペプチド複
合体を単離するために使用できる。モノクローナル抗体を調製する場合には、連
続細胞系培養物によって産生される抗体を供給する任意の技術を使用できる。例
としては、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：
４９５−４９７（１９７５）によって記載されたようなハイブリドーマ技術、ト
リオーマ技術、Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８５
３）によって記載されたようなヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術、Ｃｏｌｅら，
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．
７７−９６（１９８５）によって記載されたようなヒトモノクローナル抗体を産
生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある。一本鎖抗体を産生するために記載さ
れた技術を、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する一本鎖抗体の産生に
応用できる。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照。該特許の記載内容
は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０１６７】 モノクローナル抗体またはそのフラグメントは多量体ポリペプチド複合体の抗
原を検出するために個別に提供され得る。本発明で提供されるモノクローナル抗
体（及びそのフラグメント）は、本発明の多量体ポリペプチド複合体に結合する
少なくとも１つの抗体が多量体ポリペプチド複合体の別の領域に特異的に結合す
る抗体と共に存在し、各抗体が異なる結合特異性を有しているような混合物即ち
“カクテル”の成分として組合せ使用してもよい。例えば、１つのモノクローナ
ル抗体は２つ以上の異なるポリペプチド成分に由来する共通エピトープを認識し
得るる。この場合、該エピトープは、ポリペプチドを含んでいる多量体複合体に
は特異的であろうが個別の単離ポリペプチドに結合しないであろう。別のモノク
ローナル抗体は単一ポリペプチド配列内部の特定エピトープを認識し得る。この
場合、該エピトープは、個別の単離ポリペプチド及び多量体ポリペプチド複合体
の双方に存在するであろう。別のモノクローナル抗体は単一ポリペプチド配列内
部の特定エピトープを認識し得る。この場合、エピトープは個別の単離ポリペプ
チド中に存在するが多量体ポリペプチド複合体中に存在しないであろう。別のポ
リペプチドと複合化した結果としてエピトープが隠れてしまったり異なるコンホ
メーションになってしまったりすることもあろう。従ってこのカクテルは、本文
中に開示された多量体ポリペプチドの任意の単一抗原決定基に対する本発明のモ
ノクローナル抗体、及び、これらの抗原または別の近縁タンパク質の別の抗原決
定基に特異的な別のモノクローナル抗体を含むであろう。
【０１６８】 アッセイフォーマットに使用できるポリクローナル抗体またはそのフラグメン
トは、アッセイに付加的に使用される本発明の多量体ポリペプチド複合体または
該複合体の構成ポリペプチドまたはそのフラグメントのいずれかに特異的に結合
しなければならない。使用されるポリクローナル抗体は好ましくは、多量体ポリ
ペプチド複合体に結合するヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジのポリクローナル抗
体のような哺乳類起原の抗体である。最も好ましくは、ポリクローナル抗体はウ
サギ起原の抗体である。アッセイに使用されるポリクローナル抗体は単独で使用
されてもよく、または、ポリクローナル抗体のカクテルとして使用されてもよい
。アッセイフォーマットに使用されるカクテルは多量体ポリペプチド複合体に対
して異なる結合特異性を有する複数のモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体から成るので、これらのカクテルは、乳癌のような乳疾患または異常の検出
、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ ｖｉｖｏ造影、予防または治療
、または病因素質の決定に有用である。
【０１６９】 “サンドイッチ”イムノアッセイなどの種々のアッセイフォーマットで本発明
の抗体を使用し得る。例えば、被検サンプル中に多量体ポリペプチド抗原が存在
するならば該抗原の存在を判定し得る種々のアッセイ系で本発明の抗体またはそ
のフラグメントを使用し得る。例えば、第一のアッセイフォーマットでは、固相
にコートしておいたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体またはそのフ
ラグメントまたはこれらの抗体の組合せを被検サンプルに接触させて第一混合物
を形成する。この第一混合物を抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十
分な時間インキュベートする。次いで、シグナル発生化合物を付着させたモノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体またはそのフラグメントまたはこれらの
抗体の組合せから成る指示薬を抗原／抗体複合体に接触させて第二混合物を形成
する。この第二混合物を次に、抗体／抗原／抗体複合体が形成される十分な条件
下で十分な時間インキュベートする。被検サンプル中に固相に捕獲された抗原が
存在するならば、シグナル発生化合物によって発生された測定可能なシグナルを
検出することによって該抗原の存在が判定される。被検サンプル中に存在する抗
原の量は発生シグナルに比例する。
【０１７０】 サンドイッチイムノアッセイの別の例では、本発明の抗体またはそのフラグメ
ントを、多量体ポリペプチド複合体を構成する個別の単離ポリペプチドの存在を
（もし存在するならば）判定するための種々のアッセイ系で使用できる。この場
合、使用される抗体は個別の単離ポリペプチド中に存在するが多量体ポリペプチ
ド複合体中の結合に利用されないエピトープに結合する。
【０１７１】 サンドイッチイムノアッセイの別の例では、本発明の抗体またはそのフラグメ
ントを、多量体ポリペプチド複合体を構成する個別の単離ポリペプチド及び多量
体ポリペプチド複合体自体の存在を（もし存在するならば）判定するための種々
のアッセイ系で使用できる。この場合、使用される抗体は個別の単離ポリペプチ
ド中及び多量体ポリペプチド複合体中に存在するエピトープに結合する。これら
の種々の抗原の量、より詳細には、多量体ポリペプチド複合体（結合）の量、個
別の単離ポリペプチド（遊離）の量、及び、多量体ポリペプチド複合体と個別の
単離ポリペプチドの量（全量）の測定、並びに、その比の算定は、乳癌のような
乳疾患及び異常の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ ｖｉｖｏ
造影、予防または治療、または病因素質の判定、に役立つ。例えば、国際出願Ｗ
Ｏ９２／０１９３６参照。該特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるも
のとする。
【０１７２】 代替的アッセイフォーマットにおいては、（１）遊離抗体の量、結合抗体の量
または抗体の全量が測定できるような多量体ポリペプチド抗原及び／またはその
構成ポリペプチド鎖の１つに特異的に結合するポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体またはそのフラグメント、または、固体支持体に結合したこのような抗
体の組合せと；（２）被検サンプルと；（３）シグナル発生化合物を付着させた
多量体ポリペプチド抗原及び／またはその構成鎖の１つ（またはこれらの抗体の
組合せ）の異なるエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクロ
ーナル抗体またはそのフラグメントから成る指示薬と；を接触させる。この混合
物を抗体／抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベ
ートする。被検サンプル中に存在し固相に捕獲された多量体ポリペプチド抗原及
び／または構成鎖の１つが存在するならば、その存在をシグナル発生化合物によ
って発生された測定可能なシグナルを検出することによって判定する。被検サン
プル中に存在する抗原の量は発生シグナルに比例する。
【０１７３】 別のアッセイフォーマットでは、固相にコートされた抗体または検出可能なラ
ベルで標識された抗体を、限定量の抗原に対して患者サンプル中に存在する（か
もしれない）抗体と競合させる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
の結合の減少が患者サンプル中の抗原の存在の指標となる。抗原に対する抗体の
存在は、患者の体内に乳組織疾患、特に乳癌が存在することの指標となる。
【０１７４】 また別の検出方法では、本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体の各々を、免疫組織化学分析によって組織切片中及び細胞中の多量体ポリペプ
チド複合体及び／またはその構成ポリペプチド鎖の１つを含む多量体ポリペプチ
ド抗原を検出するために使用し得る。組織切片を組織の凍結サンプルまたは化学
的に固定したサンプルから作製する。細胞内の抗原を検出する場合には、細胞を
血液、尿、乳組織吸引液またはその他の体液から単離し得る。細胞は外科的また
は穿刺による生検から得られる。本発明の抗体で染色すべき細胞の特定画分を富
化するために磁気粒子またはフェロ流体で標識した後で、細胞を遠心または磁気
吸引によって単離し得る。疾患の組織病理学を追跡するためにこれらの抗体を直
接標識するか（例えば、フルオレセイン、コロイド金、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼなどによって標識）、または、第二の標識抗−種
抗体（本文中に例示の種々のラベル）を使用して標識する細胞化学分析も本発明
の範囲に包含される。
【０１７５】 更に、これらのモノクローナル抗体をＣＮＢｒ−活性化セファロースに類似の
マトリックスに結合させると、例えば組換えタンパク質及び天然型タンパク質を
精製するなどの目的で細胞培養物または生物組織から多量体ポリペプチド複合体
及び／またはその構成鎖の１つをアフィニティ精製するために使用できる。
【０１７６】 本発明のモノクローナル抗体はまた、治療目的または他の同様の用途のキメラ
抗体の製造に使用され得る。
【０１７７】 また、組換え抗原を使用するアッセイ、または、多量体ポリペプチド複合体の
任意の構成ポリペプチド鎖のアミノ酸配列を含む合成ペプチドまたは精製ペプチ
ドを使用するアッセイで、多量体ポリペプチド抗原を検出することも本発明の範
囲内で考えられる。このようなポリペプチドのアミノ酸配列は、ＢＵ１０１ポリ
ペプチド（配列６）、乳グロビンポリペプチド（配列５）、未知のα’及びβ’
ポリペプチド配列及びそのフラグメントから成るグループから選択される。本発
明の範囲内ではまた、多量体ポリペプチド複合体の種々のエピトープを認識する
種々の合成ペプチド、組換えペプチドまたは精製ペプチドの組合せを、乳癌のよ
うな乳疾患及び異常の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ ｖｉ
ｖｏ造影、予防または治療、または病因素質の判定、を行うアッセイに使用でき
る。この場合、これらのペプチドまたはポリペプチドの全部を１つの固相にコー
トしてもよい。あるいは、個別のペプチドまたはポリペプチドの各々をマイクロ
粒子のような個別の固相にコートし、次いで組合せてペプチドまたはポリペプチ
ドの混合物を形成し、その後のアッセイに使用してもよい。更に、種々の抗原の
エピトープを規定する多数のペプチドまたはポリペプチドを、乳癌のような乳疾
患及び異常の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、ｉｎ ｖｉｖｏ造影
、予防または治療、または病因素質の判定に使用できると考えられる。固相にコ
ートされたかまたは検出可能なラベルで標識されたペプチドまたはポリペプチド
を限定量の抗体に対して患者サンプル中に存在する（かもしれない）ペプチドま
たはポリペプチドと競合させる。（１つまたは複数の）抗体に対する合成ペプチ
ド、組換えペプチドまたは精製ペプチドの結合の減少が患者サンプル中の多量体
ポリペプチド抗原の存在の指標となる。多量体ポリペプチド抗原の存在は患者体
内の乳組織疾患、特に乳癌の存在の指標となる。アッセイフォーマットの変形は
平均的な当業者に公知であり、多くの例を以下に記載する。
【０１７８】 別のアッセイフォーマットでは、本発明のポリペプチド、ペプチドまたは多量
体ポリペプチド複合体の１つまたは少なくとも２つの組合せを多量体ポリペプチ
ド抗原を検出するための競合プローブとして使用し得る。例えば、本発明に開示
されたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のような多量体ポリペプチド
複合体に対する抗体を単独または組合せて固相にコートする。次に、多量体ポリ
ペプチド複合体を含むと疑われる被検サンプルを、シグナル発生化合物と少なく
とも１つの本発明のモノクローナル抗体とから成る指示薬と共に、被検サンプル
と固相に結合した指示薬との抗原／抗体複合体または固相に結合した指示薬の抗
原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートする。固
相に対するモノクローナル抗体の結合の減少を定量的に測定できる。
【０１７９】 別のアッセイフォーマットでは、抗−多量体ポリペプチド抗体及び／または多
量体ポリペプチド抗原の存在を以下のような同時アッセイで検出できる。被検サ
ンプルを第一分析物の捕獲試薬と第二分析物の捕獲試薬とに同時に接触させて混
合物を形成する。第一分析物の捕獲試薬は、固相に付着させた第一分析物に特異
的な第一結合要素を含み、第二分析物の捕獲試薬は第二固相に付着させた第二分
析物に対する第一結合要素を含む。この混合物を、捕獲試薬／第一分析物及び捕
獲試薬／第二分析物の複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベ
ートする。このようにして形成された複合体を、シグナル発生化合物で標識した
第一分析物に特異的な結合対の１つの要素を含む指示薬と、シグナル発生化合物
で標識した第二分析物に特異的な結合対の１つの要素を含む指示薬とに接触させ
て、第二混合物を形成する。この第二混合物を、捕獲試薬／第一分析物／指示薬
複合体及び捕獲試薬／第二分析物／指示薬複合体が形成される十分な条件下で十
分な時間インキュベートする。一方または双方の固相に形成された複合体に関し
て発生されたシグナルを検出することによって１種または複数の分析物の存在を
判定し、被検サンプル中の１種または複数の分析物の存在の指標とする。このア
ッセイフォーマットでは、本発明で開示された発現系に由来する組換え抗原を使
用でき、また、本発明で開示された発現系に由来のタンパク質から産生されたモ
ノクローナル抗体を使用できる。例えばこのアッセイ系では多量体ポリペプチド
抗原が第一分析物である。このようなアッセイ系は欧州特許公開０４７３０６５
により詳細に記載されている。
【０１８０】 また別のアッセイフォーマットでは、本発明で開示されたポリペプチドを、被
検サンプル中の多量体ポリペプチド抗原に対する抗体の存在を検出するために使
用し得る。例えば、被検サンプルを、組換えタンパク質または合成ペプチドのよ
うな少なくとも１つのポリペプチドを付着させておいた固相と共にインキュベー
トする。ポリペプチドは、ＢＵ１０１（配列６）、乳グロビン（配列５）、α’
ポリペプチド、β’ポリペプチド及びそれらのフラグメントから成るグループか
ら選択される。これらを抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時
間反応させる。インキュベーション後、抗原／抗体複合体を検出する。選択した
アッセイ系次第で、検出を容易にする指示薬も使用し得る。
【０１８１】 別のアッセイフォーマットでは、被検サンプルを、本発明に記載のごとく産生
させた組換えタンパク質を付着させた固相に接触させ、また、好ましくは指示薬
で標識しておいたタンパク質特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体に接触させる。抗体／抗原複合体が形成される十分な条件下で十分な時間イン
キュベーション後、固相を遊離相から分離し、固相中または遊離相中のラベルを
検出して、多量体ポリペプチド抗原に対する抗体の存在の指標とする。
【０１８２】 本発明で開示された組換え抗原を使用する別のアッセイフォーマットも考えら
れる。これらのアッセイフォーマットは、被検サンプルを、第一ソースに由来の
少なくとも１つの抗原を付着させた固相に接触させ、固相と被検サンプルとを抗
原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートし、次い
で第一ソースとは異なる第二ソースに由来の標識抗原に固相を接触させる。例え
ば、大腸菌のような第一ソースに由来の組換えタンパク質を固相上の捕獲抗原と
して使用し、このように調製した固相に被検サンプルを添加し、望ましいまたは
必要な標準インキュベーション及び洗浄段階後に、異なるソース（即ち、非大腸
菌）に由来の組換えタンパク質を、後で検出される指示薬の一部として使用する
。同様に、固相上の組換え抗原と指示薬相中の合成ペプチドとの組合せも可能で
ある。第一ソースから産生また誘導される多量体ポリペプチド複合体に特異的な
抗原を捕獲抗原として使用し、かつ、異なる第二ソースに由来の多量体ポリペプ
チド複合体に特異的な抗原を使用するアッセイフォーマットも考えられる。従っ
て、組換え抗原の種々の組合せ、合成ペプチド、精製タンパク質の使用、などは
本発明の範囲内である。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、共有米国特
許第５，２５４，４５８号に記載されている。該特許の記載内容は参照によって
本発明に含まれるものとする。
【０１８３】 その他の種々の固相を使用する別の実施態様も考えられ、本発明の範囲に包含
される。例えば、固定化可能な反応複合体を負荷電ポリマーで固定化するイオン
捕獲手順（欧州特許公開ＥＰ０３２６１００及びＥＰ０４０６４７３に記載）を
本発明に従って使用し、高速溶液相免疫化学反応を惹起し得る。負荷電ポリマー
／免疫複合体と予め処理した正荷電多孔質マトリックスとの間のイオン相互作用
によって、固定化可能な免疫複合体を反応混合物の残りから分離し、先行文献に
記載された種々のシグナル発生系を使用することによって検出する。このような
系として例えば、公開されたＥＰＯ出願であるＥＰ０２７３１１５に記載のよう
な化学発光シグナル測定に記載された系がある。
【０１８４】 本発明方法はまた、マイクロ粒子（磁性または非磁性）を固相とする全自動ま
たは半自動の系を含むマイクロ粒子技術を使用する系に応用できる。このような
系は、例えば、ＥＰＯ出願公開ＥＰ０４２５６３３及びＥＰ０４２４６３４に記
載されている。
【０１８５】 イムノアッセイ用走査型プロープ顕微鏡法（ＳＰＭ）の使用も本発明のモノク
ローナル抗体を容易に応用できる技術である。走査型プロープ顕微鏡法、特に原
子力顕微鏡法では、捕獲相、例えば本発明のモノクローナル抗体の少なくとも１
つを固相に付着させ、走査型プロープ顕微鏡を使用して、固相の表面に存在する
ならば抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネリング顕微鏡法を使用するな
らば、多くのイムノアッセイ系が抗原／抗体複合体を検出するために通常は必要
とするラベルの使用が不要になる。特異的結合反応をモニターするためにＳＰＭ
を種々の方法で使用し得る。１つの実施態様では、特異的結合パートナーの一方
の要素（本発明のモノクローナル抗体である分析物特異的物質）を走査に適した
表面に付着させる。分析物特異的物質の付着は、平均的な当業者に公知の方法に
従って、プラスチックまたは金属表面の固相から成る試験ピースに吸着させるこ
とによって行う。または、誘導プラスチック、金属、シリコンまたガラスの固相
から成る試験ピースに特異的結合パートナー（分析物特異的物質）を共有結合に
よって付着させる方法を使用してもよい。共有結合による付着方法は当業者に公
知であり、特異的結合パートナーを試験ピースに不可逆的に結合させる多様な手
段が存在する。試験ピースがシリコンまたはガラスの場合、特異的結合パートナ
ーを付着させる前に表面を活性化しなければならない。また、技術及び化学を使
用することによって試験ピースの表面に特異的結合パートナーを固定化するため
に高分子電解質相互作用を使用してもよい。好ましい付着方法は共有結合である
。特異的結合要素を付着させた後、非特異的結合を最小に抑制するために表面を
血清、タンパク質またはその他のブロッキング剤のような物質で更に処理しても
よい。また、アッセイ目的に対する適性を確認するために製造現場または使用時
点で表面を走査してもよい。走査プロセスが試験ピースの特異的結合特性を変質
させるとは考えられない。
【０１８６】 本発明は固相の使用が好ましいことを開示したが、本発明の抗体、タンパク質
及びペプチドのような試薬は非固相のアッセイ系にも使用し得る。これらのアッ
セイ系は当業者に公知であり、本発明の範囲に包含される。
【０１８７】 アッセイに使用される試薬を、バイアルまたは瓶のような１つまたは複数の容
器を含む検査キットの形態で提供することも考えられる。各容器が、アッセイに
使用されるプローブ、プライマー、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗
体カクテルまたはポリペプチド（例えば、組換え的に、合成的に産生または精製
されたもの）のような個別の試薬を収容している。ポリペプチドは、ＢＵ１０１
（配列６）、乳グロビン（配列５）、α’ポリペプチドまたはβ’ポリペプチド
及びそれらのフラグメントから成るグループから選択される。バッファ、対照、
などのような平均的な当業者に公知の他の成分をこのような検査キットに含ませ
てもよい。また、採取可能な体液または老廃物、例えば血液、尿、唾液及び糞便
のような被検サンプルを採取する手段を含む検査キットを提供することも考えら
れる。このような採取用ツール（“採取材料”）としては、血液を採取し安定さ
せるランセット及び吸取り紙または布；唾液を採取し安定させるスワブ；尿また
は糞便サンプルを採取し安定させるコップがある。採取材料、紙、布、スワブ、
コップなどはサンプルを変質させたりまたは不可逆的に吸着したりしないように
任意に処理してもよい。また、標本の完全性を維持する助けになるように、保存
剤、安定剤または抗菌剤で採取材料を処理するかまたはこれらを採取材料に含有
させてもよい。手術または針生検によって得られた被検標本を収集、安定化及び
保存するように設計された検査キットも有用である。全部のキットを、別々に提
供され得る２つの部品から構成し、一方の部品が標本の採取及び運搬、他方の部
品が標本の分析に使用されるようにしてもよい。例えば、採取用部品は一般ユー
ザーに市販され、分析用部品は分析物の有無または量を判定する試験所の技師の
ような一般ユーザー以外に提供される。更に、素人が使用するように設計された
被検標本の採取、安定化及び保存用キットが在宅使用向けに市販され、在宅使用
後に被検サンプル分析研究所に送付されてもよい。
【０１８８】 抗体のｉｎ ｖｉｖｏ使用 本発明の抗体はｉｎ ｖｉｖｏで使用できる。即ち、乳疾患が疑われるかまた
は乳疾患に罹患した患者の体内に診断目的または治療目的で注入され得る。ｉｎ
ｖｉｖｏ診断のために抗体を使用することは当業界で公知である。Ｓｕｍｅｒ
ｄｏｎら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ １７：２４７−２５４（１９９０）は
、インジウム−ＩＩＩをラベルとして使用して癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現し
ている腫瘍のラジオイムノシンチグラフィック造影に最適な抗体−キレート剤を
記載している。Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ ９：６３１−６４０
（１９９１）は、再発結腸直腸癌が疑われる患者の腫瘍を検出するためにこの薬
剤を使用することを記載している。磁気共鳴造影用ラベルとして常磁性イオンと
共に同様の薬剤を使用することは当業界で公知である（Ｒ．Ｂ．Ｌａｕｆｆｅｒ
，Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２：３
３９−３４２（１９９１）。多量体ポリペプチド抗原に対する抗体は、患者の病
状診断また病期判定の目的で乳癌のような乳疾患の疑いのある患者に注入できる
と期待できる。使用されるラベルは選択された造影方法に依存する。平面走査ま
たは単一光子放出演算トモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）にはインジウム−ＩＩＩ、
テクネチウム−９９ｍ、またはヨウ素−１３１のような放射性ラベルを使用でき
る。また、フッ素−１９のようなポジトロン放出ラベルはポジトロン放出トモグ
ラフィー（ＰＥＴ）に使用できる。ＭＲＩには、ガドリニウム（ＩＩＩ）または
マンガン（ＩＩ）のような常磁性イオンを使用できる。乳房内または乳房外のラ
ベルの所在から、疾患の拡がりを判断できる。乳房内のラベルの量から乳癌の有
無を判断できる。
【０１８９】 乳疾患に罹っていることが判明している患者の場合、多量体ポリペプチド抗原
に対する抗体の注入は治療効果を有するであろう。抗体は組織または器官の上ま
たは中で発現された多量体ポリペプチド抗原に結合することによって付着物質を
使用しないで効果を発揮し得る。あるいは、治療効果を増強するために抗体を薬
物、毒素または放射性核種のような細胞障害性物質に結合させてもよい。Ｇａｒ
ｎｅｔｔ ａｎｄ Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６：
２４０７−２４１２（１９８６）は、薬物−モノクローナル抗体コンジュゲート
の調製を記載した。Ｐａｓｔａｎら，Ｃｅｌｌ ４７：６４１−６４８（１９８
６）は、種々の癌を治療するためにモノクローナル抗体にコンジュゲートされた
毒素の使用を記載した。Ｇｏｏｄｗｉｎ ａｎｄ Ｍｅａｒｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ
，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ８０：２６７５−２６８０（１９９７）は、正常組織
の毒性を抑制しながら腫瘍に対する投与量を最大にする種々の戦略でイットリウ
ム−９０標識モノクローナル抗体を使用することを記載した。その他の公知の細
胞障害性放射性核種は、銅−６７、ヨウ素−１３１及びレニウム−１８６である
。これらはすべて、乳癌治療用多量体ポリペプチド抗原に対するモノクローナル
抗体を標識するために使用できる。
【０１９０】 本発明の実施例を以下に示す。これらの実施例は本発明の範囲を代表するが本
発明の範囲を限定しない。
【０１９１】 実施例 実施例１：乳組織ライブラリーの乳グロビン遺伝子及びＢＵ１０１遺伝子に特 異的なクローンの比較 発現配列タグ（ＥＳＴ）または転写物イメージのライブラリー比較。ｃＤＮＡ
クローンインサートの部分配列、いわゆる“発現配列タグ”（ＥＳＴ）を、乳腫
瘍組織、乳非腫瘍組織並びに腫瘍及び非腫瘍の多数の別の組織から作製されたｃ
ＤＮＡライブラリーから入手し、データベース（ＬＩＦＥＳＥＱＴＭデータベー
ス、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
ＣＡ）に遺伝子転写物イメージとして入力した。国際公開ＷＯ９５／２０６８１
参照。（転写物イメージは、所与の組織ライブラリーに示されている遺伝子の各
々に関するＥＳＴの番号表である。相互配列オーバーラップのＥＳＴ共有領域を
クラスターに分類する。代表５′ＥＳＴからクラスターにクローン番号を割当て
る。しばしば、考察中のクラスターのコンセンサス配列を全自動クラスター化基
準に適合しなかった別のＥＳＴの配列に比較することによって該クラスターを延
長し得る。得られたクラスターの全部と単独ＥＳＴとを位置合せすることによっ
て、コンセンサス配列のもとになるｃｏｎｔｉｇが得られる。）次いで、転写物
イメージを評価して、乳組織ライブラリーの主要な代表ＥＳＴ配列を同定した。
これらのターゲットクローンを次に、ターゲットライブラリー中の数度（出現数
）及びバックグラウンドライブラリー中の非存在に従ってランク付けした。クロ
ーンのバックグラウンド出現数が少なく数度が高いほど、高い研究優先度をクロ
ーンに与えた。
【０１９２】 乳グロビンのコンセンサス配列（配列１）に対応するＥＳＴは乳組織ライブラ
リーの５６．４％（３９中の２２）に検出された。データベースの別の非乳組織
ライブラリーでは配列１またはそのフラグメントに対応するＥＳＴが０．９％（
７５４中の７）しか検出されなかった。従って、乳組織中では配列１またはその
フラグメントに対応するＥＳＴが非乳組織中の６０倍以上の頻度で検出された。
【０１９３】 ８／１５／９７出願の一部継続米国特許出願０８／９１２，１４９を選択する
ために放棄した８／１９／９６出願の米国特許出願０８／６９７，１０６は参照
によって本発明に含まれる。該出願は、１組の部分的にオーバーラップする隣接
ｃＤＮＡ配列及び該配列によってコードされたポリペプチドを開示している。乳
グロビンと呼ばれており乳組織から転写された該ポリペプチドは乳癌のような乳
疾患及び異常の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、予防または治療、
または個人の病因素質の判定、に有用である。
【０１９４】 また、ＢＵ１０１のコンセンサス配列（配列２）に対応するＥＳＴは乳組織ラ
イブラリーの２５．６％（３９中の１０）に検出された。データベースの別の非
乳組織ライブラリーでは配列２またはそのフラグメントに対応するＥＳＴが１．
１％（７５４中の８）しか検出されなかった。従って、乳組織中では配列２また
はそのフラグメントに対応するＥＳＴが非乳組織の２４倍以上の頻度で検出され
た。
【０１９５】 ８／１５／９７出願の一部継続米国特許出願０８／９１２，２７６を選択する
ために放棄した８／１９／９６出願の米国特許出願０８／６９７，１０５は参照
によって本発明に含まれる。該出願は、１組の部分的にオーバーラップする隣接
ｃＤＮＡ配列及び該配列によってコードされたポリペプチドを開示している。Ｂ
Ｕ１０１と呼ばれており乳組織から転写された該ポリペプチドは乳癌のような乳
疾患及び異常の検出、診断、病期判定、経過追跡、予後判定、予防または治療、
または個人の病因素質の判定、に有用である。
【０１９６】 乳グロビン（配列１）遺伝子及びＢＵ１０１（配列２）遺伝子を含むＥＳＴの
ライブラリーを同定する電子ノーザンブロットを比較すると、乳グロビン（配列
１）及びＢＵ１０１（配列２）が独立に発現された遺伝子であることが判明する
（図１−２）。電子ノーザンブロットによれば、幾つかのライブラリーは乳グロ
ビン（配列１）ＥＳＴを含有するがＢＵ１０１（配列２）ＥＳＴを含有せず、別
のライブラリーはＢＵ１０１（配列２）ＥＳＴを含有するが乳グロビン（配列１
）ＥＳＴを含有しないことが観察された。
【０１９７】 ＬｉｆｅＳｅｑデータベースでは乳グロビン（配列１）とＢＵ１０１（配列２
）との間にｍＲＮＡ発現の相関関係がないことが知見されたが、我々はリボヌク
レアーゼ保護アッセイ（図３）によって両者の発現の間に密接な相関関係がある
という対照的な結果を観察した。
【０１９８】 ＬＩＦＥＳＥＱＴＭデータベースの分析は、ＢＵ１０１ヌクレオチド配列（配
列２）の２５４位のＴ／Ｃ多形性の可能性を示す。データベースではＣヌクレオ
チド変異は３３回出現し（配列２）、Ｔヌクレオチド変異は８回出現した。ポリ
ペプチドの該当位置のＣヌクレオチド変異はプロリン残基（ＣＣＧ）をコードし
、Ｔヌクレオチド変異（ＣＴＧ）はロイシン残基をコードする。
【０１９９】 実施例２：多量体ポリペプチド複合体に対する抗体の産生 Ａ．ポリクローナル抗血清の産生 １．多量体ポリペプチド複合体を免疫原として使用する動物の免疫感作。体重
２ｋｇ以上の雌のニュージーランド白ウサギをポリクローナル抗血清の感作に使
用する。初回免疫の１週前に５−１０ｍｌの血液を動物から採取し、非免疫プレ
ブリードサンプルとして使用する。
【０２００】 精製した組換え多量体ポリペプチド複合体（実施例７の手順で調製）を使用し
、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に２ｍｇ／ｍｌの濃度の０．５ｍｌのタンパク質複合
体を０．５ｍｌの完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔ
ｒｏｉｔ，ＭＩ）で乳化することによって一次免疫原を調製する。免疫原を、皮
下、腹腔内及び／または筋肉内の投与経路で動物の複数の部位に注入する。初回
免疫の４週後にブースター免疫を投与する。ブースター免疫の投与に使用する免
疫原は、ポリペプチドを１ｍｇ／ｍｌに希釈する以外は初回免疫に使用したのと
同じ０．５ｍｌの多量体ポリペプチド複合体を０．５ｍｌの不完全フロインドア
ジュバント（ＩＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で乳化することに
よって調製する。ブースターの場合にも、ブースター用量を皮下、腹腔内及び筋
肉内注入の経路で複数の部位に投与する。ブースター免疫の２週後に動物から採
血（５ｍｌ）し、以下に記載の手順で多量体ポリペプチド複合体に対する血清の
免疫反応性を試験する。適当な抗体価が得られるまでブースター及び採血のスケ
ジールを４週毎に繰り返す。抗血清の力価または濃度を実施例３に記載のような
マイクロタイターＥＩＡで測定する。１：５００以上の抗体価を以後の使用及び
試験に好適な適正抗体価と判定する。
【０２０１】 ２．ペプチドを免疫原として使用する動物の免疫感作。８／１５／９７出願の
米国特許出願０８／９１２，２７６を選択するために放棄した８／１９／９６出
願の米国特許出願０８／６９７，１０５、及び、この多量体ポリペプチド複合体
の個別のＢＵ１０１ポリペプチド鎖及び乳グロビンポリペプチド鎖の各々に対す
る抗体の産生を記載している８／１５／９７出願の米国特許出願０８／９１２，
１４９を選択するために放棄した８／１９／９６出願の米国特許出願０８／６９
７，１０６は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０２０２】 Ｂ．モノクローナル抗体の産生 １．多量体ポリペプチド複合体を免疫原として使用する免疫感作プロトコル。
マウス体内でモノクローナル抗体を産生させるために使用した多量体ポリペプチ
ド複合体の量をウサギ体内でポリクローナル抗血清を産生させるために使用した
量の１／１０にする以外は実施例７に記載の手順で調製した免疫原を使用してマ
ウスを免疫する。即ち、一次免疫原は０．１ｍｌのＣＦＡ中の１００μｇの多量
体ポリペプチド複合体のエマルジョンから成る。ブースター免疫に使用した免疫
原は０．１ｍｌのＩＦＡ中の５０μｇの多量体ポリペプチド複合体から成る。モ
ノクローナル抗体産生用のハイブリドーマを標準技術で調製しスクリーニングす
る。モノクローナル抗体産生に使用した方法は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９４（１９７５）に詳細に記載され、Ｊ
．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ，ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８
２）に概説されているような当業界で公知の手順に従う。Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法に基づく別のモノクローナル抗体産生方法は、Ｌ．Ｔ．Ｍ
ｉｍｍｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：６０４−６１９（１９９０）の方法で
ある。該文献は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０２０３】 （マウスあたりの）免疫感作計画は、１回の初回免疫と複数の追加ブースター
免疫とから成る。初回免疫に使用した一次免疫原は、５０μｌのＣＦＡで予め乳
化した５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の１００μｇの多量体ポリペプチド複
合体から成る。初回免疫のほぼ２週後及び４週後に行うブースター免疫は５０μ
ｌのＩＦＡで乳化した５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の５０μｇの多量体ポ
リペプチド複合体から成る。合計１００μｌのこの免疫原を各マウスの腹腔内及
び皮下に接種する。３回目の免疫感作のほぼ４週後に実施例３に記載のようなマ
イクロタイタープレートエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）によって個々のマ
ウスを免疫応答に基づいてスクリーニングする。３回目の免疫感作のほぼ１５週
後にＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の５０μｇの多量体ポリペプチド複合体をマウスの
静脈内、脾臓内または腹腔内に接種する。
【０２０４】 この静脈内ブーストの３日後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を使用
して脾細胞を例えばＳｐ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に融合させる。Ｌ−グルタミン、
Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルギニン、葉酸を添加し１０％のウシ胎仔血清（ＦＣ
Ｓ）と１％のヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を含有す
るダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）で融合物を培養する。バルク培養
物を実施例３のプロトコルに従ってマイクロタイタープレートＥＩＡによってス
クリーニングする。免疫原として使用した多量体ポリペプチド複合体に反応性で
その他の非近縁タンパク質に反応性でないクローンを最終膨張用に選択する。こ
のように選択したクローンを膨張させ、アリコートに分け、１０％ＦＣＳと１０
％ジメチルスルホキシドとを含有するＤＭＥＭ中で凍結させる。
【０２０５】 ２．ペプチドを免疫原として使用する免疫感作プロトコル。８／１５／９７出
願の米国特許出願０８／９１２，２７６を選択するために放棄した８／１９／９
６出願の米国特許出願０８／６９７，１０５、及び、８／１５／９７出願の米国
特許出願０８／９１２，１４９を選択するために放棄した８／１９／９６出願の
米国特許出願０８／６９７，１０６に記載された手順でペプチド／キャリアー免
疫原（例えば、キャリアータンパク質にコンジュゲートしたペプチド）を使用し
てマウスを免疫した。マウス体内でモノクローナル抗体を産生させるために使用
したペプチド／キャリアータンパク質免疫原の量は、ウサギ体内でポリクローナ
ル抗血清を産生させるために使用した量のほぼ１／１０であった。従って、一次
免疫原は、キャリアータンパク質にコンジュゲートした１００μｇのペプチドを
含む０．１ｍｌのＣＦＡエマルジョンから構成されていた。ブースター免疫に使
用した免疫原は、０．１ｍｌのＩＦＡ中の５０μｇのペプチド／キャリアータン
パク質から構成されていた。モノクローナル抗体産生用のハイブリドーマを標準
技術で調製しスクリーニングした。モノクローナル抗体産生に使用した方法はＫ
ｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９４（１９
７５）に詳細に記載され、Ｊ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ，ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）に概説されているような当業界で公知の手順に
従った。Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法に基づく別のモノクローナ
ル抗体産生方法は、Ｌ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：６０４
−６１９（１９９０）の方法である。該文献は参照によって本発明に含まれるも
のとする。
【０２０６】 （マウスあたりの）免疫感作計画は、１回の初回免疫と複数の追加ブースター
免疫とから構成されていた。初回免疫に使用した一次免疫原は、５０μｌのＣＦ
Ａで予め乳化した５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の１００μｇのペプチド／
キャリアータンパク質複合体から構成されていた。初回免疫のほぼ２週後及び４
週後に行うブースター免疫は５０μｌのＩＦＡで乳化した５０μｌのＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．２）中の５０μｇのペプチド／キャリアータンパク質複合体から構成され
ていた。合計１００μｌのこの免疫原を各マウスの腹腔内に接種した。３回目の
免疫感作のほぼ４週後に実施例３に記載のようなマイクロタイタープレートエン
ザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）によって個々のマウスを免疫応答に基づいてス
クリーニングした。３回目の免疫感作のほぼ１５週後にＰＢＳ（ｐＨ７．２）中
の２５μｇのペプチド／キャリアータンパク質複合体をマウスの静脈内に接種し
た。
【０２０７】 この静脈内ブーストの３日後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を使用
して脾細胞を例えばＳｐ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に融合させた。Ｌ−グルタミン、
Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルギニン、葉酸を添加し１０％のウシ胎仔血清（ＦＣ
Ｓ）と１％のヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を含有す
るダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）で融合物を培養した。バルク培養
物を実施例３のプロトコルに従ってマイクロタイタープレートＥＩＡによってス
クリーニングした。免疫原として使用した多量体ポリペプチド複合体及びペプチ
ドに反応性でその他の非近縁タンパク質に反応性でないクローンを最終膨張用に
選択した。最終膨張後の上清を収集し、以後のキャラクタリゼーションに使用し
た。膨張増殖後のハイブリドーマ細胞を採集し、アリコートに分け、１０％ＦＣ
Ｓと１０％ジメチルスルホキシドとを含有するＤＭＥＭ中で凍結して保存した。
【０２０８】 ３．モノクローナル抗体を含有する腹水の産生。上記のごとく調製した凍結ハ
イブリドーマ細胞を解凍し、膨張培養した。生存ハイブリドーマ細胞をプリスタ
ン処理マウスの腹腔内に接種した。マウスから腹水を採取し、プールし、０．２
μフィルターで濾過し、免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）分析を行って、精製
に必要なプロテインＡカラムの容量を決定した。
【０２０９】 ４．腹水または細胞培養上清からのモノクローナル抗体の精製。プロテインＡ
、プロテインＧ及びプロテインＬカラムクロマトグラフィーまたは沈降のような
様々な方法を使用して腹水または細胞培養上清からモノクローナル抗体を精製し
得る。Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（Ｇ）ＩｇＧ精製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し
てモノクローナル抗体Ｈ８５Ｃ２１を精製した。２９μｇ／ｍＬのＩｇＧを含有
していた４７ｍｌのＨ８５Ｃ２１培養上清を、１００ｍＬの結合バッファ（０．
０２Ｍのリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）（Ｐｉｅｒｃｅ）と混合した。１４５
ｍｌの混合物を、結合バッファで平衡させたプロテインＧカラムに通した。次に
カラムを溶出バッファ（０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．７）（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）で溶出させた。１ｍｌの画分を中和用の１００μＬの１Ｍの炭酸水素ナト
リウムを入れた試験管に集めた。画分の２８０ｎｍの吸光度をモニターした。適
正な画分をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に２−８℃で一夜透析した。２８０
ｎｍの吸光度は、プロテインＧカラムから１．５１ｍｇのＩｇＧが回収されたこ
とを示した。このようにして調製し特性決定した精製モノクローナル抗体を−８
０℃で長期保存した。
【０２１０】 ５．モノクローナル抗体のより詳細なキャラクタリゼーション。上記のように
産生させたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブタイプをＥＩＡマイクロ
タイタープレートアッセイで決定した。簡単に説明すると、５０ｍＭの炭酸塩，
ｐＨ９，６中に１ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチド免疫原を調製し、Ｉｍｍｕｌｏｎ
２（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイタープレート（Ｄｙｎ
ｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各ウェルに１
００μｌを配置した。プレートを室温で１４−１８時間インキュベートし、脱イ
オン水で４回洗浄した。各ウェルに２００μｌのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商
標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，
ＩＬ）を添加することによってウェルをブロックし、室温で３０分間インキュベ
ートした後で溶液を廃棄した。前述のように免疫感作したウサギ及びマウスから
得られた抗血清を０．０５％のトゥイーン−２０（モノラウレートポリオキシエ
チレンエーテル）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）と０．０５％のナトリウムアジドとを含有するＰＢＳ中のタン
パク質ブロッキング剤（即ち、３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液）に
希釈し、コートされたマイクロタイタープレートの各ウェルに配置した。次にウ
ェルを室温で１時間インキュベートした。各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した
。３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液に１：２０００に希釈した１００
マイクロリットル（１００μｌ）のアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ
抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂま
たはＩｇＧ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａ
Ｌ）を各ウェルに添加した。ウェルを室温で１時間インキュベートした。次に、
各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。次いで、１００マイクロリットル（μｌ
）のパラ−ニトロフェニルホスフェート基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ
Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を
各ウェルに添加した。ウェルを室温で３０分間インキュベートした。各ウェルの
４０５ｎｍの吸光度を読み取った。アイソタイプ試験の結果を表１に示す。
【０２１１】 また、モノクローナル抗体の安定性試験は、モノクローナル抗体のアリコート
を２−８℃で連続保存し、所与の時間の経過中の光学密度（ＯＤ）の読み取り値
を分析することによって行うことができる。
【０２１２】 表１：モノクローナル抗体のキャラクタリゼーション
【０２１３】
【表１】
【０２１４】 実施例３：エンザイムイムノアッセイ Ａ．マイクロタイタープレート直接検出ＥＩＡ 組換えポリペプチド複合体（本願の実施例７に記載の手順または１２／８／９
８出願の米国特許出願０９／２１５，８１８（参照によって本発明に含まれる）
の実施例２に記載の手順で調製）に対するポリクローナル抗血清及び／またはモ
ノクローナル抗血清（ＢＵ１０１または乳グロビンに対する抗血清）の免疫反応
性をマイクロタイタープレートＥＩＡによって決定した。
【０２１５】 抗体価を測定するために、プールし透析した組換えポリペプチド複合体を、５
０ｍＭの炭酸塩バッファ，ｐＨ９．６中に２μｇ／ｍＬの濃度で調製し、１００
μｌをＩｍｍｕｌｏｎ ２（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイ
タープレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，
ＶＡ）の各ウェルに配置した。比較のために、合成の全長ＢＵ１０１ポリペプチ
ド（配列６）と一過性にトランスフェクトした乳グロビンＭ／Ｈ（実施例７Ｃに
後述）とを同様にして調製した。プレートを室温で１４−１８時間インキュベー
トし、次いで脱イオン水で４回洗浄した。各ウェルに２００μｌのＳｕｐｅｒｂ
ｌｏｃｋ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を添加することによってウェルをブロックし、プレート
を室温で３０分間インキュベートした後で溶液を廃棄した。実施例２に前述のよ
うに免疫感作したウサギ及びマウスから得られた抗血清を、０．０５％トゥイー
ン−２０（モノラウレートポリオキシエチレンエーテル）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｓｏｕｉｓ，ＭＯ）と０．０５％ナトリウ
ムアジドとを含有するＰＢＳ中のタンパク質ブロッキング剤（即ち３％Ｓｕｐｅ
ｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液）で１：１０、１：１００、１：１０００、１：
１００００、１：１０００００に希釈し、コートしたマイクロタイタープレート
の各ウェルに配置した。次にウェルを室温で１時間インキュベートした。各ウェ
ルを脱イオン水で４回洗浄した。３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で
１：２０００に希釈した１００マイクロリットル（１００μｌ）のアルカリホス
ファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を各ウェルに添加した。ウェルを室温で１
時間インキュベートした。次に、各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。次いで
、１００マイクロリットル（１００μｌ）のパラ−ニトロフェニルホスフェート
基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各ウェルに添加した。ウェルを室温で３
０分間インキュベートした。各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を読み取った。４０
５ｎｍで０．５単位の吸光度を生じた抗体の希釈度を抗体価と呼ぶ。
【０２１６】 幾つかの抗−ペプチド抗血清については、抗体価に加えて見掛け親和性〔Ｋｄ （ａｐｐ） 〕を測定した。この場合、プールし透析した組換えポリペプチド複合
体をＰＢＳ中に１：３、１：９、１：２７、１：８１、１：２４３、１：７２９
、１：２１８７、１：６５６１及び１：１９６８３の希釈度で調製し、１００μ
ｌをＩｍｍｕｌｏｎ ２（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイタ
ープレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖ
Ａ）の各ウェルに配置した。比較のために、合成の全長ＢＵ１０１ポリペプチド
（配列６）と一過性にトランスフェクトした乳グロビンＭ／Ｈ（実施例７Ｃに後
述）とを同様にして調製した。プレートを室温で１４−１８時間インキュベート
し、次いで脱イオン水で４回洗浄した。各ウェルに２００μｌのＳｕｐｅｒｂｌ
ｏｃｋ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を添加することによってウェルをブロックし、プレートを
室温で３０分間インキュベートした後で溶液を廃棄した。実施例２に前述のよう
に免疫感作したウサギ及びマウスから得られた抗血清を、０．０５％トゥイーン
−２０（モノラウレートポリオキシエチレンエーテル）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｓｏｕｉｓ，ＭＯ）と０．０５％ナトリウム
アジドとを含有するＰＢＳ中のタンパク質ブロッキング剤（即ち３％Ｓｕｐｅｒ
ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液）で適当な希釈度に希釈し、コートしたマイクロタ
イタープレートの各ウェルに配置した。次にウェルを室温で１時間インキュベー
トした。各ウェルを脱イオン水で４回洗浄した。３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登
録商標）溶液で１：２０００に希釈した１００マイクロリットル（１００μｌ）
のアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を各ウェルに添加した。ウ
ェルを室温で１時間インキュベートした。次に、各ウェルを脱イオン水で４回洗
浄した。次いで、１００マイクロリットル（１００μｌ）のパラ−ニトロフェニ
ルホスフェート基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各ウェルに添加した。ウ
ェルを室温で３０分間インキュベートした。各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を読
み取った。ＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイ結果を使用し、ミカエリス
・メンテンの式（Ｖ．Ｖａｎ Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，Ｖｏｌ．１２１，ｐ．４７２（１９８６）及びＸ．Ｑｉｕ
ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５６，ｐ．３３
５０（１９９６）により詳細に記載）の類似に基づいて見掛け解離定数〔Ｋｄ（ ａｐｐ） 〕を誘導した：
【０２１７】
【数１】 式中の、〔Ａｇ−Ａｂ〕は抗原−抗体複合体の濃度、〔Ａｇ−Ａｂ〕ｍａｘは
複合体最大濃度、〔Ａｂ〕は抗体濃度、Ｋｄは解離定数を表す。曲線近似では、
〔Ａｇ−Ａｂ〕を、バックグラウンドを減算した所与の濃度のＡｂのＯＤ４０５ ｎｍ 値によって置換した。Ｋｄ（ａｐｐ）に対応するＫｄと〔Ａｇ−Ａｂ〕ｍａ ｘ に対応する〔ＯＤ４０５ｎｍ〕ｍａｘとの双方を近似パラメーターとして処理
した。曲線近似のためにソフトウェアプログラムＯｒｉｇｉｎを使用した。図１
は、多量体ポリペプチド複合体を認識した３つのモノクローナル抗体の結合曲線
を表す。Ｋｄ（ａｐｐ）の値は、この複合体に対するモノクローナル抗体の相対
的親和性を表す尺度である。各モノクローナル抗体のＫｄ（ａｐｐ）値を表２に
まとめる。
【０２１８】 表２：モノクローナル抗体の結合特性
【０２１９】
【表２】 脚注： １．ＢＵ１０１．８は合成の全長ＢＵ１０１である。 ２．Ｍａｍ Ｍ／Ｈは実施例７Ｃの手順で調製した。 ３．ＲＰＣは実施例７Ｃの手順で産生した組換えポリペプチド複合体である。
【０２２０】 Ｂ．マイクロタイタープレートサンドイッチＥＩＡ 簡単に説明すると、抗原／抗体複合体を形成させるために、多量体ポリペプチ
ド抗原を含む疑いがあるサンプルを、抗ＢＵ−１０１、抗−Ｍａｍ、抗−α’ポ
リペプチド、抗−β’ポリペプチドまたは抗−多量体ポリペプチド抗体をコート
したマイクロタイターウェルのいずれかの組合せの存在下でインキュベートする
。次にマイクロタイターウェルを洗浄し、シグナル発生化合物（即ち、アルカリ
ホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素）にコンジュゲ
ートした抗体を含む指示薬を、マイクロタイターウェルの抗原／抗体複合体に添
加してインキュベートする。マイクロタイターウェルを洗浄し、シグナル発生化
合物と反応して測定可能シグナルを発生する基質（例えばそれぞれ、４−メチル
ウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）またはＯＰＤ／ペルオキシド）を添加
することによって結合抗体／抗原／抗体複合体を検出する。陰性対照で発生した
シグナルに比較して被検サンプル中のシグナルが高いとき、多量体ポリペプチド
抗原の存在が検出される。被検サンプル中の多量体ポリペプチド抗原の存在は、
乳癌のような乳疾患または異常の診断指標となる。
【０２２１】 同様にして、抗原／ステロイド複合体を形成させるために、多量体ポリペプチ
ド抗原を含む疑いがあるサンプルを、１種以上のステロイド（プロゲステロン、
アルドステロン、アンドロステンジオン、コルチコステロン、コルチゾル、デヒ
ドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エス
トリオール、エストロン、ヒドロキシプロゲステロン及びテストステロン）をコ
ートしたマイクロタイターウェルの存在下でインキュベートする。次にマイクロ
タイターウェルを洗浄し、シグナル発生化合物にコンジュゲートした抗体または
ステロイドを含む指示薬を、マイクロタイターウェル上のステロイド／抗原複合
体に添加してインキュベートする。マイクロタイターウェルを洗浄し、シグナル
発生化合物と反応して測定可能シグナルを発生する基質を添加することによって
結合ステロイド／抗原／指示薬複合体を検出する。陰性対照で発生したシグナル
に比較して被検サンプル中のシグナルが高いとき、多量体ポリペプチド抗原の存
在が検出される。被検サンプル中の多量体ポリペプチド抗原の存在は、乳癌のよ
うな乳疾患または異常の診断指標となる。
【０２２２】 Ｃ．マイクロタイタープレート競合ＥＩＡ 競合結合アッセイでは、標識ポリペプチドまたはタンパク質複合体が抗−ポリ
ペプチド抗体をコートしたマイクロタイターウェルに接触するときに測定可能シ
グナルを発生する標識ポリペプチドまたはタンパク質複合体を使用する。標識ポ
リペプチドを、多量体ポリペプチド抗原を含む疑いがある被検サンプルの存在下
で多量体ポリペプチド抗体をコートしたマイクロタイターウェルに添加し、標識
ペプチド（または標識タンパク質）−結合抗体複合体及び／または患者抗原−結
合抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートする。被検
サンプル中の多量体ポリペプチド抗原はマイクロタイターウェルの結合部位に対
して標識ポリペプチド（またはタンパク質）と競合する。被検サンプル中の抗原
とペプチドまたはタンパク質とが抗体結合部位に対して競合するので、被検サン
プル中の多量体ポリペプチド抗原はアッセイ中に、抗体でコートされたマイクロ
タイターウェルに対する標識ペプチドの結合を減少させる。（対照に比較して）
減少したシグナルは、被検サンプル中の多量体ポリペプチド抗原の存在の指標と
なる。多量体ポリペプチド抗原の存在は乳癌のような乳疾患または異常の診断を
示唆する。
【０２２３】 競合結合アッセイではまた、標識ポリペプチドまたはタンパク質複合体がステ
ロイド塗布面を備えたマイクロタイターウェルに接触するときに測定可能シグナ
ルを発生する標識ポリペプチドまたはタンパク質複合体を使用する。標識ポリペ
プチドを、多量体ポリペプチド抗原を含む疑いがある被検サンプルの存在下でス
テロイドをコートしたマイクロタイターウェルに添加し、標識ペプチド（または
標識タンパク質）−結合ステロイド複合体及び／または患者抗原−結合ステロイ
ド複合体が形成される十分な条件下で十分な時間インキュベートする。被検サン
プル中の多量体ポリペプチド抗原はマイクロタイターウェル上の結合部位に対し
て標識ポリペプチド（またはタンパク質）と競合する。被検サンプル中の抗原と
ペプチドまたはタンパク質とがステロイド結合部位に対して競合するので、被検
サンプル中の多量体ポリペプチド抗原はアッセイ中にステロイドでコートされた
マイクロタイターウェルに対する標識ペプチドの結合を減少させる。（対照に比
較して）減少したシグナルは被検サンプル中の多量体ポリペプチド抗原の存在の
指標となる。多量体ポリペプチド抗原の存在は乳癌のような乳疾患または異常の
診断を示唆する。
【０２２４】 上記で提供及び記載された多量体ポリペプチド複合体は乳組織疾患、特に乳癌
のマーカーとして有用である。組織、血液、血漿または血清のような被検サンプ
ル中のこのマーカーの出現に基づく試験は、医師による癌の診断または治療プロ
トコルの選択に役立ち、あるいは、選択した治療方法の成否をモニターするため
に役立つ廉価で非侵入性の診断情報を提供し得る。このマーカーは、血液、尿ま
たは糞便のような入手容易な体液中に、免疫学的方法によって検出可能な疾患組
織に由来する抗原として出現する。このマーカーは疾患状態では、増加するか、
変質するか、または、不適正な体内区画に出現する乳の正常タンパク質である。
【０２２５】 実施例４：多量体ポリペプチド複合体の免疫沈降 組織、血液、血清または他の体液から調製した溶液から多量体ポリペプチド複
合体を免疫沈降させるために実施例２に前述の手順で得られた免疫血清を使用す
る。組織標本としては、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５％（ｗ
／ｖ）のグリセロール、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン
及び１．０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド〔Ｋａｉｎら，Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ，１７：９８２（１９９４）〕中で組織サンプルを均質化す
ることによってタンパク質抽出物を調製する。均質化した後、ホモジェネートを
２０００×ｇで４℃で５分間遠心して上清を残渣から分離する。残渣を０．１Ｍ
のトリシンと０．１％のＳＤＳとを更に加えた上記と同じバッファで均質化する
ことによって再抽出する。血清標本は直ちに使用できる。他の体液は免疫沈降の
前に準備が必要である。
【０２２６】 サンプル（１０−２００μｌ）をエッペンドルフ管に入れると、（存在するな
らば）抗原が抗体にカップリングすることによって免疫沈降が開始する。希釈バ
ッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．
１％のトリトンＸ−１００，０．０２５％のナトリウムアジド，０．１％のウシ
血清アルブミン）で容量を２００μｌにする。ポリクローナル血清（０．５−５
μｌ）、ハイブリドーマ培養上清（１０−１００μｌ）または腹水（０．１−１
μｌ）を添加する。室温で１．５−６時間穏やかに撹拌する。２０−４０μｌの
５０％プロテインＡセファローススラリー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を添加することによって免疫複合体を沈降さ
せる。１．５−１６時間穏やかに撹拌する。２００×ｇで１分間遠心する。上清
を慎重に除去し、ペレットを回収する。１ｍＬの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２５％のナトリウムアジドでペレット
を洗浄し、次いで、１ｍＬの５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．８で洗浄する
。再び上清を慎重に除去し、ペレットを回収する。洗浄したプロテインＡセファ
ロースビーズに２０−５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファ（５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ，ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２％ベータ−メルカプ
トエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を加えて免疫複合体を解離
させる。サンプルを１００℃で５分間キャップし、加熱する。セファロースを微
量遠心してペレットとする。上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに加えて実
施例７に記載のように電気泳動処理する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質染
色、イムノブロット法及び／またはＸ線撮影法で抗原を検出し得る。
【０２２７】 実施例５：ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体の精製 実施例７に従って調製した固定化組換えポリペプチド複合体を使用して、実施
例２に前述したように得られた免疫血清をアフィニティ精製する。希釈した未精
製の抗血清をプロテインＡカラム（Ａｆｆｉ−ＧｅｌプロテインＡ，Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に通すことによって抗血清のＩｇＧ画分を得る
。バッファ（製造業者によって供給される結合バッファ）で溶出させると、免疫
グロブリンでないタンパク質の実質的に全部が除去される。０．１Ｍの緩衝グリ
シン（ｐＨ３）で溶出させると、アルブミン及びその他の血清タンパク質を実質
的に含まない免疫グロブリン調製物が得られる。
【０２２８】 特異的抗原結合抗体を高い割合で含む調製物を得るためにイムノアフィニティ
クロマトグラフィーを実施する。抗血清を感作するために使用したポリペプチド
をクロマトグラフィー樹脂に固定し、そのエピトープに特異的な抗体を樹脂に吸
着させる。未結合の成分を洗浄によって除去し、特異的抗体を０．１Ｍのグリシ
ンバッファ，ｐＨ２．３で溶出させる。免疫反応性を保存するために抗体画分を
１．０Ｍのトリスバッファ（ｐＨ８．０）で直ちに中和する。選択されるクロマ
トグラフィー樹脂は、ポリペプチド中に存在する反応性基に依存する。ポリペプ
チドがアミノ基を有するとき、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０またはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ
１５のような樹脂を使用する（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
ポリペプチドのカルボキシ基によるカップリングを望むならば、Ａｆｆｉ−Ｇｅ
ｌ １０２を使用し得る（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。ポリペ
プチドが遊離スルフヒドリル基を有しているならば、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１
のような有機水銀性樹脂を使用し得る（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃ
Ａ）。
【０２２９】 あるいは、脾臓を摘出し、モノクローナル抗体製造用ハイブリドーマを作製す
るために前述のような当業界に公知の常法に従って使用できる。
【０２３０】 実施例６：多量体ポリペプチド複合体の免疫組織化学的検出 ホルマリン固定しパラフィン封入した細胞系（実施例７に後述するようなＭＢ
８）、悪性乳組織及び正常乳組織を標準方法で免疫組織化学的に標識するために
、実施例２に記載し表３に要約したモノクローナル抗体を使用した。Ｄ．Ｌ．Ｓ
ｐｅｃｔｏｒら，：Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｐ
ｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８。簡単に説明すると、５μｍの切片を作製し
、スライドウォーマーで６０℃で３０分間温めた正電荷スライド上に配置した。
切片をキシレン中で各５分間ずつ２回、１００％エタノール中で各１分間ずつ２
回、９５％のエタノール中で各１分間ずつ３回、及び蒸留水で３分間再水和した
。切片をＢｌａｃｋ ａｎｄ Ｄｅｃｋｅｒ植物蒸煮器で１０ｍＭのクエン酸バ
ッファｐＨ６．０中で３０分間加熱し、次いで２０分間で室温に冷却した。切片
を蒸留水で５分間洗浄し、次いでトリス緩衝生理食塩水〔０．０５Ｍのトリス−
ＨＣｌ，ｐＨ７．６、０．１５ＭのＮａＣｌ〕（ＴＢＳ）に希釈した１Ｘカゼイ
ン（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で１５分間ブロッ
クした。ハイブリドーマ培養上清をＴＢＳで１：１に希釈した。この希釈上清を
切片に添加し、室温で６０分間インキュベートし、次いでＴＢＳで５分間ずつ２
回洗浄した。検出のために、ＬＳＡＢ＋キット（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒ
ｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用した。切片をリンク抗体と共に室温で３０分間
インキュベートし、次いでＴＢＳで５分間ずつ２回洗浄した。次に切片をストレ
プタビジンと共に室温で３０分間インキュベートし、ＴＢＳで５分間ずつ２回洗
浄した。切片をＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＩＮＴ基質（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒ
ｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で１５分間可視化し、蒸留水に入れ、水性固定用培地
で固定した。切片を、１０Ｘ対物レンズの付いたＮｉｋｏｎ Ｏｐｔｉｐｈｏｔ
ＩＩ光学顕微鏡で観察し、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＣｏｏｌＳｎａｐ Ｃ
ＣＤカメラ及びＭｅｔａｍｏｒｐｈバージョン４．０ソフトウェアで記録した。
図２及び図３は、モノクローナル抗体Ｈ９Ｃ６５及びＨ９５Ｃ３０によって２つ
の悪性乳切片と１つの正常乳切片とＭＢ８細胞系とを免疫組織化学的に染色した
結果を示す。 表３：ホルマリン固定パラフィン封入ＭＢ８細胞系及び組織切片で試験したモノ
クローナル抗体。ＭＢ８細胞系に全部の抗体を試験した。＊２つの悪性乳組織及
び１つの正常組織に試験したモノクローナル抗体。¶１０個の悪性乳組織及び３
つの正常組織に試験したモノクローナル抗体。
【０２３１】
【表３】
【０２３２】 実施例７：ヒト胚性腎２９３細胞に由来のＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ ／Ｈを含む複合体の安定なトランスフェクション及び発現 Ａ．安定なＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系の産生 ８／１５／９７出願の米国特許出願０８／９１２，２７６を選択するために放
棄した９／１９／９６出願の米国特許出願０８／６９７，１０５、及び、８／１
５／９７出願の米国特許出願０８／９１２，１４９を選択するために放棄した８
／１９／９６出願の米国特許出願０８／６９７，１０６の記載内容は参照によっ
て本発明に含まれるものとする。これらの特許出願は、クローン６０３１４８ま
たはクローン２０８３５７８を利用したＢＵ１０１ ｍｙｃ／ｈｉｓ（Ｍ／Ｈ）
発現プラスミド、及び、クローン８９９８９５を利用したＭａｍ Ｍ／Ｈ発現プ
ラスミドの作製を記載している。これらの発現プラスミドでＤＨ５アルファ細胞
を再び形質転換し、ＬＢ／アンピシリン寒天で平板培養し、１０ｍｌのＬＢ／ア
ンピシリンブイヨン中で増殖させた。プラスミドを、ＱＩＡ ｆｉｌｔｅｒＴＭ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して精
製し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした〔Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍら，Ｊ
．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７）〕。
【０２３３】 上記の精製発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした〔Ｆ．
Ｌ．Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７）〕。
これらの細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓ
ｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０から登録番号Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３で入
手できる。Ｍａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ発現プラスミドのトランスフ
ェクションは、Ｐ．Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら，Ｆｏｃｕｓ １５．７３（
１９９３）に記載されたカチオン性リポフェクタミン介在手順で行った。より詳
細には、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン
（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）及び必須アミノ酸を補充した１０
ｍｌのＤＭＥＭ培地で培養し、６０ｍｍの培養皿に１培養皿あたり９×１０６細
胞の密度で新しく播種した。トランスフェクション用細胞を３７℃で７０％−８
０％の単層集密度（コンフルエンシー）まで増殖させた。２μｇのＭａｍ Ｍ／
ＨプラスミドＤＮＡと２μｇのＢＵ１０１ Ｍ／ＨプラスミドＤＮＡとを８００
μｌの非補充ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，
ＮＹ）に添加した。８μｌのＰｌｕｓ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）をこの溶液に添加し、軽く撹拌した。１２μｌのリポフェ
クタミン（ＬＴ１）を別の８００μｌの非補充ＤＭＥＭ培地に添加した。１５分
間のインキュベーション後、２つの溶液を混合し、室温で更に１５−３０分間イ
ンキュベートした。この時間中にＨＥＫ２９３細胞を入れた培養皿から培養培地
を除去した。次に、Ｐｌｕｓ試薬：リポフェクタミン：プラスミドＤＮＡ複合体
を含むＤＭＥＭを細胞に重層した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で５時間インキ
ュベートした後、２０％ＦＢＳを含有する追加の２−８ｍｌのＤＭＥＭを添加し
た。１８−２４時間後、古い培地を吸引し、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を加え
た５％ＦＢＳを含む５ｍＬの新しいＤＭＥＭを細胞に重層した。７２時間が経過
するまでインキュベーションを継続した。上清のＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１
Ｍ／Ｈポリペプチド発現をウェスタンブロット分析によって分析した。
【０２３４】 トランスフェクションの７２時間後、細胞を限定トリプシン処理によって培養
皿から剥離し、１００ｍｍの培養皿にＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、４００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８から成る培地中で１：１００、１：１０００及び１：１００００の
希釈度で再度播種した。これらの培養物を、顕微鏡観察によって十分に単離した
細胞フォーカスが確認されるまで５−７日間増殖させた。これらのフォーカスを
クローニングシリンダーによって単離し、シリンダーの細胞を限定トリプシン処
理によって剥離し、個別のフォーカスを２４ウェルの培養皿の個別のウェルに同
じくＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８から成る培地中で移
入した。７−１０日間増殖させた後、各ウェルの上清のＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ
１０１ Ｍ／Ｈ発現を後述するようなウェスタンブロット分析によって分析した
。ＭＢ８と命名したクローン細胞系は上清中にＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１
Ｍ／Ｈの双方を発現していることが判明した。この細胞系を７５ｃｍ２のフラス
コで膨張させ、次いで１：３０で３回継代培養した後、Ｍａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ
１０１ Ｍ／Ｈの発現を再度確認して、挿入イベントの安定性を確保した。この
手順の最終生成物は、Ｍａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを発現するＨＥＫ
２９３細胞に由来の細胞系であり、ＭＢ８と命名した（ＨＥＫ２９３−ＭＢ８）
。
【０２３５】 Ｂ．培地の分析 ＭＢ８細胞の上清のアリコートについてＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／
Ｈの双方の組換えタンパク質の存在を分析した。標準方法及び当業界で公知の試
薬（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）を使用し、アリコートを還元性サンプルバ
ッファ（最終濃度で５０ｍＭのトリス，ｐＨ６．８、１０％グリセロール（ｖ／
ｖ）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、２％ベータ−メルカプトエタノ
ール（ｖ／ｖ）、０．０１％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ））中で調製し、
次いでＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動させた
。より詳細には、４０μｌのサンプルを１０μｌのサンプルバッファ（５×）に
添加し、混合物を５−１０分間煮沸した。このように調製したサンプルの１５μ
ｌを１ｍｍ厚みの１０−２０％のトリシンゲルに充填し（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、１１０Ｖで約９０分間電気泳動させた。次に、これらのゲ
ルをニトロセルロースのような固体培地に２０Ｖで一夜ブロットし、、ｍｙｃエ
ピトープを認識するモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ，ＣＡ）またはＢｕ１０１もしくは乳グロビンを認識するポリクローナル抗
血清を用いたウェスタンブロット法でＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈの
タンパク質バンドを可視化した。より詳細には、ニトロセルロースブロットを取
り出し、０．２％のＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ，ＭＡ）によって室温で６０分間ブロックした。適量の第一抗体を添加した。
例えば、ポリクローナル抗血清は１：５０００の希釈度で使用し、抗−ｍｙｃエ
ピトープモノクローナル抗体は１：５０００の希釈度で使用した。次に、第一抗
体溶液を室温で振盪しながら６０分間ブロットに作用させた。次にブロットをＩ
−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で３回洗浄した。ビオチニル化ヤギ抗−ウサギＩ
ｇＧまたはビオチニル化ヤギ抗−マウスＩｇＧのような第二抗体を適正希釈度（
１：５０００）のＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液として調製し、室温で振盪し
ながら６０分間ブロットに作用させた。次にブロットをＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商
標）溶液で３回洗浄した。次に、コンジュゲートとするアルカリホスファターゼ
標識ストレプタビジンを適正希釈度（１：１０，０００）のＩ−ｂｌｏｃｋ（登
録商標）溶液として調製し、室温で振盪しながら３０分間ブロットに作用させた
。次にブロットをＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で３回、次いでアッセイバッ
ファ（２０ｍＭトリス（ｐＨ９．８）／１ｍＭ塩化マグネシウム）で２回洗浄し
た。２５ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、ＢＣＩ
Ｐ、を０．５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解させた。１００μｌのこのＢＣ
ＩＰ溶液を次に３０ｍＬのアッセイバッファと混合し、このＢＣＩＰ基質溶液を
、可視バンドが生じるまでブロットに作用させた。次に基質溶液からブロットを
取り出し、空気中で乾燥した。乾燥したブロットを走査することによってブロッ
トの電子コピーが得られた。
【０２３６】 図４は、安定にトランスフェクトされたクローンＭＢ８から収集した増殖上清
のウェスタンブロットを含む。分画されたタンパク質を還元性条件下で、ｍｙｃ
エピトープを認識するモノクローナル抗体（図４、ブロット１）、ＢＵ１０１を
認識するポリクローナル抗血清（図４、ブロット２）またはＭａｍを認識するポ
リクローナル抗血清（図４、ブロット３）を使用して検出した。レーン２は、Ｔ
７５フラスコから収集した３５ｍＬの上清を表す。レーン３及び４の各々は、Ｔ
１５０フラスコから収集した３０ｍＬの上清を表す。この図から明らかなように
、レーン３及び４のＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈタンパク質濃度はレ
ーン２で観察された濃度のほぼ２倍である。これは上清容量：増殖面積の比に一
致する。
【０２３７】 図４のブロット２は、ＢＵ１０１を認識するポリクローナル抗血清によって可
視化した上記のようなウェスタンブロットを示す。図示のように、ＭＢ８細胞増
殖培地はＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを含有し、これは約１１ｋＤの極めて近接している
が連続していない２つのバンドとして観察される。
【０２３８】 図４のブロット３は、Ｍａｍを認識するポリクローナル抗血清によって可視化
した上記のようなウェスタンブロットを示す。図示のように、ＭＢ８細胞増殖培
地はＭａｍ Ｍ／Ｈを含有し、これはサイズ約２０ｋＤ及び３０ｋＤの２つの種
として観察される。これらの種は、ＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ及びＭａｍ Ｍ／Ｈの双
方を含むプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションに関
する先行研究（１２／１８／９８出願の米国特許出願０９／２１５，２１８）で
観察された結果に一致する。２０ｋＤ及び３０ｋＤのバンドはそれぞれ、１つの
グリコシル化Ａｓｎ残基をもつＭａｍ Ｍ／Ｈ及び２つのグリコシル化Ａｓｎ残
基をもつＭａｍ Ｍ／Ｈに起因する。ＭＢ８細胞系から得られるＭａｍ Ｍ／Ｈ
の優勢な形態はより完全にグリコシル化した形態であることが観察された。
【０２３９】 図４のブロット１は、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体によっ
て可視化した上記のようなウェスタンブロットを示す。図示のように、ＭＢ８細
胞増殖培地はｍｙｃタグの付いたＭａｍ及びＢＵ１０１を含有する。
【０２４０】 Ｃ．ニッケルキレート化クロマトグラフィー Ｍａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを精製するために上記のように得られ
たＭＢ８細胞の増殖上清を、ニッケルを充填したＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加えた。４０ｍＬの
Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを１６ｍｍ×１
０ｃｍのカラムに充填した。４０ｍｌの硫酸ニッケル（０．１Ｍ）水溶液をカラ
ムに通してカラムにニッケルを充填した。カラムを洗浄し、１０ｍＭのリン酸ナ
トリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム，ｐＨ７．４で平衡させた。２２０ｍｌ
のＭＢ８細胞増殖上清を平衡カラムに添加し、ヒスシジンタグの付いたタンパク
質をイミダゾール直線勾配を使用して溶出させた。流速を２ｍＬ／分とし、勾配
をバッファ１ｍｌあたり６．２５ｍＭのイミダゾールとし、溶出時間を８０分と
して、０−５００ｍＭイミダゾールとなる溶出プロフィルを作製した。各４ｍＬ
の画分をサンプルとして採取した。１００μｌの各画分をドットブロット装置の
ウェルに加えて、この量をニトロセルロースピースで吸引した。次に、ｍｙｃエ
ピトープを認識するモノクローナル抗体を使用し、ニトロセルロースフィルター
を実施例７Ｂで前述の手順と同じウェスタンブロット可視化手順で可視化した。
図５（上部ブロット）は、可視化したドットブロットを示す。該ドットブロット
は、抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による画分２０−３５の物質の免疫認識を示
す。これらの画分は、２５０−４３８ｍＭイミダゾールという溶出条件に対応し
、ヒスシジンタグの付いたタンパク質がニッケルカラムに十分に結合し、ヒスシ
ジン類似体によって溶出することを表す。画分２０−３５をプールし、各々をＳ
ｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｓｅｒｓ（３５００ＭＷＣＯ）を使用して２×４Ｌのリン酸
塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，５０ｍＭリン酸塩，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐ
Ｈ７．４）に４時間以上透析した。プールし、透析し、半精製したＭＢ８上清に
ついてＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈの双方の組換えタンパクの存在を
ウェスタンブロットで分析した。
【０２４１】 比較のために、Ｍａｍ Ｍ／Ｈを同様にして調製した。クローン８９９８９５
を利用するＭａｍ Ｍ／Ｈ発現プラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トラ
ンスフェクションによってＭａｍ Ｍ／Ｈを含有する上清を調製した。この手順
の方法及び試薬は、８／１５／９７出願の米国特許出願０８／９１２，１４９を
選択するために放棄した８／１９／９６出願の米国特許出願０８／６９７，１０
６に記載されている。１２５ｍｌのこのような上清をニッケルを充填した４０ｍ
Ｌの上記のようなＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏ
ｗカラムに加えた。上記と同様にしてカラムクロマトグラフィー及び画分の分析
を行った。図５（下部ブロット）は、可視化したドットブロットを示す。このド
ットブロットは、抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による画分１９−３６中の物質
の免疫認識を表す。画分１９−３６をプールし、各々をＳｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｓ
ｅｒｓ（３５００ＭＷＣＯ）を使用して２×４Ｌのリン酸塩緩衝生理食塩水に対
して４時間以上透析した。
【０２４２】 実施例７Ｂで前述したように、２つのサンプル（半精製ＭＢ８及びＭａｍ Ｍ
／Ｈ上清）を還元性サンプルバッファ中で調製し、電気泳動させ、ニトロセルロ
ースに移し、モノクローナル及びポリクローナル抗血清で可視化した。図６のパ
ネル１−８において、レーン１はＭａｍ Ｍ／Ｈの一過性トランスフェクション
から採取しプールし透析し半精製した上清を表し、レーン２は、プールし透析し
半精製したＭＢ８上清を表す。パネル１、２、３及び４は、ＢＵ１０１（１０９
１８、１０９２３及び１１５４３）またはＭａｍ（１０９３１）を認識するポリ
クローナル抗血清によって可視化した。パネル１、２及び３は、ＢＵ１０１がＭ
Ｂ８上清（レーン２）中にだけ検出されたことを表す。パネル４は、ＭａｍがＭ
ａｍ Ｍ／Ｈ上清（レーン１）及びＭＢ８上清（レーン２）中で検出されたこと
を表す。
【０２４３】 パネル５、６、７及び８は、ＢＵ１０１（Ｈ８５，Ｈ６８）、Ｍａｍ（Ｈ１１
１）またはｍｙｃをそれぞれ認識するモノクローナル抗体によって可視化した。
この試験でも、抗−ＢＵ１０１モノクローナル抗体は、ＢＵ１０１がＭＢ８上清
（パネル５及び６、レーン２）中にだけ存在することを示した。パネル７は、Ｍ
ａｍが、Ｍａｍ Ｍ／Ｈ上清（レーン１）及びＭＢ８上清（レーン２）の双方に
存在することを示した。パネル８は、ＢＵ１０１ Ｍ／ＨがＭＢ８上清に存在し
（レーン２）、Ｍａｍ Ｍ／Ｈが双方のレーンに存在することを示した。
【０２４４】 上記と同じサンプル（ＭＢ８上清及びＭａｍ Ｍ／Ｈ上清）に対して第二セッ
トのウェスタンブロットを行った。この実験では、上記のように、サンプルを非
還元性サンプルバッファ中で調製し、電気泳動させ、ニトロセルロースに移し、
モノクローナル及びポリクローナル抗血清で可視化した。パネル９−１６で、レ
ーン１はＭａｍ Ｍ／Ｈの一過性トランスフェクションから採取しプールし透析
し半精製した上清を表す。レーン２は、プールし透析し半精製したＭＢ８上清を
表す。パネル９、１０、１１及び１２は、ＢＵ１０１（１０９１８、１０９２３
及び１１５４３）またはＭａｍ（１０９３１）をそれぞれ認識するポリクローナ
ル抗血清で可視化した。抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗体で可視化したパネル
９、１０及び１１ではＭＢ９上清中に２つのバンド（レーン２）が同定されたが
、Ｍａｍ Ｍ／Ｈ上清中（レーン１）には何も同定されなかった。抗−Ｍａｍポ
リクローナル抗体で可視化したパネル１２ではＭＢ８上清中に抗−ＢＵ１０１ポ
リクローナル抗体で同定されたと同じ２つのバンド（レーン２）が同定された。
抗−Ｍａｍ抗体はＭａｍ Ｍ／Ｈ上清中に複数のバンド（パネル１２、レーン１
）を同定した。
【０２４５】 パネル１３、１４、１５及び１６は、ＢＵ１０１（Ｈ８５、Ｈ６８）、Ｍａ（
Ｈ１１１）またはｍｙｃをそれぞれ認識するモノクローナル抗体で可視化した。
この場合にも、抗−ＢＵ１０１モノクローナル抗体は、ＭＢ８上清中に２つのバ
ンドを同定した（パネル１３及び１４、レーン２）。抗−Ｍａｍモノクローナル
抗体はＭＢ８上清中の同じ２つのバンド（パネル１５、レーン２）及びＭａｍ
Ｍ／Ｈ上清中の複数のバンド（レーン１）を同定した。抗−ｍｙｃモノクローナ
ル抗体もまた、ＭＢ８上清中の同じ２つのバンド（レーン２）及びＭａｍ Ｍ／
Ｈ上清中の複数のバンド（レーン１）を同定した。
【０２４６】 ＭＢ８上清は２つの種を含有し、これらは非還元性条件下で、抗−ＢＵ１０１
ポリクローナル及びモノクローナル抗血清、抗−Ｍａｍポリクローナル及びモノ
クローナル抗血清、抗−ｍｙｃモノクローナル抗体によって同定された。パネル
１−８から、これらの試薬（抗−ＢＵ１０１及び抗−Ｍａｍポリクローナル及び
モノクローナル抗体）は交差反応性でないことが判明した。抗−ＢＵ１０１試薬
はＭａｍ Ｍ／Ｈを認識せず、抗−Ｍａｍ試薬はＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを認識しな
かった。従って、抗−ＢＵ１０１試薬及び抗−Ｍａｍ試薬の双方によってＭＢ８
上清中で検出された２つのバンドは、Ｍａｍ Ｍ／ＨとＢＵ１０１ Ｍ／Ｈとの
双方を含んでいた。２つのバンドは、ＢＵ１０１ Ｍ／ＨとＭａｍ Ｍ／Ｈとの
双方を含む複合体に起因し、Ｍａｍ Ｍ／Ｈは種々のグリコシル化状態を有し得
る。更に、この複合体は、ベータ−メルカプトエタノールのような還元剤の添加
によって解離し、ウェスタンブロット用の非還元性サンプルバッファになる。利
用できる別の還元剤は例えば、ジチオトレイトール、ベータ−メルカプトエチル
アミン、及び、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（Ｔ
ＣＥＰ）である。
【０２４７】 Ｄ．等電点電気泳動 考察中のタンパク質の等電点を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒ
ｏｕｐ）のアイソエレクトリック関数を使用して測定した。等電点はすべてのタ
ンパク質の特性であり、タンパク質が０の正味電荷を有するときのｐＨである。
Ｔｈｏｍａｓ Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｅｄ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ
ｅｄｔｉｏｎ，Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（１９
９３）。表４は考察中のタンパク質のｐＩをまとめた表である。 表４：考察中のタンパク質の等電点
【０２４８】
【表４】
【０２４９】 プールし透析し半精製したＭＢ８上清（ニッケルキレート化クロマトグラフィ
ーの上清）とプールし透析し半精製したＭａｍ Ｍ／Ｈ上清（ニッケルキレート
化クロマトグラフィーの上清）を、ＩＥＦ ３−１０ゲル、カソードバッファｐ
Ｈ３−１０、アノードバッファ及びサンプルバッファｐＨ３−１０（Ｎｏｖｅｘ
）を製造業者の指示通りに使用する等電点電気泳動のために調製した。簡単に説
明すると、５０μＬの上清を５０μＬのサンプルバッファに添加した。３０μｌ
をゲルの各ウェルに充填した。ゲルを１００Ｖで１時間、次いで２００Ｖで１時
間、最後に５００Ｖで半時間電気泳動させた。ゲルを２２Ｖの定電圧でニトロセ
ルロースに一夜ブロットした。実施例７Ｂで前述したように抗−ｍｙｃモノクロ
ーナル抗体でウェスタンブロットを可視化した。図７は得られたウェスタンブロ
ットを示す。Ｍａｍ Ｍ／Ｈ上清はレーン１に存在し、ＭＢ８上清はレーン２に
存在した。免疫反応性物質がゲルのカソード端（上端）（ｐＨ１０）から離れた
ゲルのアノード端（下端）（ｐＨ３）で観察された。これらの結果は、タンパク
質のｐＩ計算値に一致した。Ｍａｍ Ｍ／ＨのｐＩの計算値は４．６、Ｍａｍ
Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈが共存するときのｐＩの計算値は５．９であった
。実際、Ｍ／Ｈ（レーン１）は、Ｍａｍ ＭＢ８上清よりも顕著に低ｐＨ側にフ
ォーカスを生じた（レーン２）。
【０２５０】 Ｅ．イオン交換クロマトグラフィー ニッケルキレート化クロマトグラフィー精製後の半精製したＭＢ８細胞増殖上
清をアニオン交換クロマトグラフィーによって更に精製した。より詳細には、実
施例７Ｃで前述したように得られた１０ｍＬのニッケル精製ＭＢ８上清を、２リ
ットルの２０ｍＭピペラジン，ｐＨ６．０に透析した。この物質を２０ｍＭのピ
ペラジン，ｐＨ６．０で平衡させたＭｏｎｏ Ｑ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に加えた。塩化ナトリウムの直線勾配を使用してタンパク質を溶出させた
。流速を１ｍＬ／分、勾配をバッファ１ｍｌあたり２０ｍＭの塩化ナトリウムと
し、溶出時間を５０分にして、０−１０００ｍＭ塩化ナトリウムの溶出プロフィ
ルを作製した。溶出勾配を加える前のサンプル充填時間を３０分とした。各１ｍ
Ｌの画分をサンプルとして採取した。１００μｌの各画分を０．１％のベータ−
メルカプトエタノール中で沸騰させ、冷却し、次いでドットブロット装置のウェ
ルに加えて、この量をニトロセルロースピースで吸引した。次に、ｍｙｃエピト
ープを認識するモノクローナル抗体を使用し、ニトロセルロースフィルターを実
施例７Ｂに記載の手順と同じウェスタンブロット可視化手順で可視化した。図８
（上部ブロット）は、可視化したドットブロットを示す。このドットブロットは
、抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による画分３６−４７中の物質の免疫認識を示
す。免疫反応性物質は１２−３４０ｍＭの間の塩化ナトリウム中に溶出し、ピー
クの中央は１８０ｍＭの塩化ナトリウムに溶出する。これらの結果は、物質がｐ
Ｈ６．０のアニオン交換カラムに弱く結合したことを示し、Ｍａｍ Ｍ／Ｈ及び
ＢＵ１０１ Ｍ／Ｈが共存するときの等電点の計算値５．９に一致する。ＢＵ１
０１ Ｍ／Ｈ単独の等電点の計算値は７．６であり、このタンパク質は正味の正
電荷を有しているのでｐＨ６．０でアニオン交換カラムに結合するとは予測され
ない。ＢＵ１０１ Ｍ／Ｈはサンプル充填中にカラムを通過すると予測された（
最初の３０の画分）。しかしながら、これらの３０の通過画分で抗−ｍｙｃ免疫
反応物質は全く観察されなかった。これらの結果は、Ｍａｍ Ｍ／Ｈとの共有結
合的会合によってＢＵ１０１ Ｍ／Ｈの等電点特性が変化したことに一致する。
【０２５１】 比較のために、Ｍａｍ Ｍ／Ｈ上清を上記と同じ条件下で同じアニオン交換カ
ラムでクロマトグラフィー精製した。各１ｍＬの画分を上記のように分析した。
図８（下部ブロット）は、可視化したドットブロットを示す。該ドットブロット
は、抗ｍｙｃ−モノクローナル抗体による画分３８−４７中の物質の免疫認識を
表す。免疫反応性物質は１６０−３４０ｍＭの間の塩化ナトリウムに溶出する。
ドットブロットの溶出プロフィルは、ＭＢ８上清に由来の物質と違って、２００
ｍＭ塩化ナトリウム（画分４０）及び３００ｍＭ塩化ナトリウム（画分４５）に
中心をもつ２つのピークを示した。これらの結果は、Ｍｍ Ｍ／Ｈの等電点の計
算値が４．６であることに一致し、材料がｐＨ６．０でアニオン交換カラムに適
度に結合したことに一致する。
【０２５２】 Ｆ．ゲル濾過クロマトグラフィー ニッケルキレート化クロマトグラフィー処理したＭＢ８細胞の半精製した増殖
上清をゲル濾過クロマトグラフィーで更に精製した。より詳細には、上記のよう
な４．６５ｍＬのニッケル精製ＭＢ８上清を６５０μｌに濃縮し、２００μＬの
濃縮物を１０ｍｍ×３０ｃｍのＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に加えた。ＰＢＳバッファ（５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム，ｐＨ７．４）だけを０．４ｍＬ／分の流速でカラムに流した。カラムをＰｈ
ａｒｍａｃｉａから入手できる分子量標準で校正した。得られた分子量決定用標
準曲線を図９に示す。図９は、分子量と溶出量との関係を示す。
【０２５３】 Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２から溶出するｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いたＭａｍタン
パク質及びＢＵ１０１タンパク質を、抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による免疫
認識でモニターした。各０．４ｍＬの画分をサンプルとして採取した。１００μ
ｌの各画分を０．１％ベータ−メルカプトエタノールの存在下で沸騰させ、冷却
し、次いでドットブロット装置のウェルに加えて、この量をニトロセルロースピ
ースで吸引した。次に、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用
し、実施例７に前述した手順と同じウェスタンブロット可視化手順でニトロセル
ロースフィルターを可視化した。図１０は可視化したドットブロットを示す。該
ドットブロットは抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による画分３３−３６中の物質
の免疫認識を示す。画分３３、３４、３５及び３６はそれぞれ溶出量１３．２ｍ
Ｌ、１３．６ｍＬ、１４．０ｍＬ及び１４．４ｍＬであった。このピークの中心
（１３．８ｍＬ）は５６ｋＤの分子量に対応する。これらの結果は、Ｍａｍ Ｍ
／ＨとＢＵ１０１ Ｍ／Ｈとの会合に一致する。図６に示すように、ＢＵ１０１
Ｍ／Ｈ及びＭａｍ Ｍ／Ｈは個別の種として著しく異なる分子量（〜１１ｋＤ
及び〜３０ｋＤ）を有している。図９は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムの性能
及びこのような個別の種を分離するカラムの能力を示した。ところが溶出プロフ
ィルは平均分子量５６ｋＤの単一ピークを示した。この分子量は非還元性条件下
のＭＢ８上清で同定された種に一致した（図６、パネル９−１６）。
【０２５４】 実施例８：ヒト組織に由来の多量体ポリペプチド複合体の同定 Ａ．組織抽出物の調製 瞬間冷凍し−７０℃で保存しておいた１ｇの乳癌組織の２／１０を用いてウェ
スタンブロット分析用標本を調製した。組織サンプルを０．１Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１５％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１０
μｇ／ｍＬのロイペプチン及び１．０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド中で均質化することによってタンパク質抽出物を調製した。Ｓ．Ｒ．Ｋａｉｎ
ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：９８２（１９９４）。均質化後、ホモ
ジェネートを４℃で５分間遠心して、残渣から上清を分離した。タンパク質定量
のために２−５μｌの上清を１．５ｍＬのクーマシータンパク質試薬（Ｐｉｅｒ
ｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に添加し、５９５
ｎｍの吸光度を読み取った。
【０２５５】 Ｂ．組織抽出物の分析 上記のような乳癌組織抽出物をウェスタンブロットによって分析した。その他
のサンプルは組換えＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ及び後述するような
別の乳癌組織抽出物を含んでいた。サンプルを還元性サンプルバッファ（最終濃
度は５０ｍＭトリス，ｐＨ６．８、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、２％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、２％ベータ−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）、
０．０１％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ））、及び、非還元性サンプルバッ
ファ（最終濃度は５０ｍＭトリス，ｐＨ６．８、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）
、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、０．０１％ブロモフェノールブルー
（ｗ／ｖ））の双方中で調製し、次いで標準方法及び当業界で公知の試薬（Ｊ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，前出）を使用してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動させた。より詳細には、４０μｌのサンプルを１０
μｌのサンプルバッファ（５×）に添加し、混合物を５−１０分間沸騰させた。
このように調製した１５μｌのサンプルを１ｍｍ厚みの１０−２０％トリシンゲ
ル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に充填し、１１０Ｖで約９０分間電気泳
動させた。次にこれらのゲルを、ニトロセルロースのような固体培地に２０Ｖで
一夜ブロットし、Ｍａｍ及びＢＵ１０１のタンパク質バンドを、ＢＵ１０１また
は乳グロビンを認識するモノクローナル抗血清またはポリクローナル抗血清を用
いたウェスタンブロット法を使用して可視化した。より詳細には、ニトロセルロ
ースブロットを取り出し、０．２％のＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｔｒｏｐｉ
ｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって室温で６０分間ブロックした。次に適正量
の第一抗体を添加した。例えば、ポリクローナル抗血清を希釈度１：５０００で
使用し、モノクローナル培養上清を希釈度１：５０で使用した。第一抗体溶液を
室温で振盪しながらブロットに６０分間接触させた。次にブロットをＩ−ｂｌｏ
ｃｋ（登録商標）溶液で３回洗浄した。ビオチニル化ヤギ抗−ウサギＩｇＧまた
はビオチニル化ヤギ抗−マウスＩｇＧのような第二抗体を適正な希釈度（１：５
０００）のＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液として調製し、室温で振盪しながら
ブロットに６０分間接触させた。次にブロットをＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）で
３回洗浄した。コンジュゲートとするアルカリホスファターゼ標識したストレプ
タビジンを適正希釈度（１：５０００）のＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液とし
て調製し、室温で振盪しながらブロットに３０分間接触させた。次にブロットを
、Ｉ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で３回、次いでアッセイバッファ（２０ｍＭ
トリス（ｐＨ９．８）／１ｍＭ塩化マグネシウム）で２回洗浄した。２５ｍｇの
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、ＢＣＩＰ、を０．５ｍ
Ｌのジメチルホルムアミドに溶解した。１００μｌのこのＢＣＩＰ溶液を３０ｍ
Ｌのアッセイバッファと混合し、このＢＣＩＰ基質溶液を可視バンドが生じるま
でブロットに接触させた。次にブロットを基質溶液から取り出して、空気中で乾
燥した。乾燥したブロットを走査することによってブロットの電子コピーが得ら
れた。
【０２５６】 図１１は、乳癌組織抽出物及びｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いた組換えＭａｍタン
パク質及びＢＵ１０１タンパク質のウェスタンブロットを示す。上部のブロット
はＢＵ１０１を認識するモノクローナル抗体によって可視化し、下部のブロット
はＭａｍを認識するポリクローナル抗血清によって可視化した。２つのブロット
に関して４つのサンプルを分析した。レーン４−７のサンプルは、還元性サンプ
ルバッファ（実施例７Ｃに前述）で調製し、レーン１０−１３のサンプルは非還
元性サンプルバッファで調製した。第一サンプルは分化の少ない浸潤性（乳）腺
癌患者の組織標本であり、レーン４及び１０に示されている。第二サンプルは一
過性に発現されたｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いたＭａｍタンパク質／ＢＵ１０１タ
ンパク質複合体であり、レーン５及び１１に示されている。第三サンプルはＭＢ
８細胞から安定に発現されたｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いたＭａｍタンパク質／Ｂ
Ｕ１０１タンパク質複合体であり、レーン６及び１２に示されている。第四サン
プルは別の（乳）腺癌患者の組織標本であり、レーン７及び１３に示されている
。
【０２５７】 上部ブロットはＢＵ１０１に対するモノクローナル抗体によって可視化した。
レーン４−７ではサンプルが還元され、レーン１０−１３ではサンプルは還元さ
れなかった。還元性条件下で、ＢＵ１０１はレーン４及び７の組織標本中で観察
され、組換えＢＵ１０１ Ｍ／Ｈはレーン５及び６で（弱く）観察された。ｍｙ
ｃ−ｈｉｓタグはＢＵ１０１の分子量を約３ｋＤ増加させ、この結果はウェスタ
ンブロット上のやや高いバンドとして出現した。ある程度のバックグラウンド染
色は観察されたが、４つのサンプル全部でＢＵ１０１は単一種として検出された
。非還元性条件下で（レーン１０−１３）、ＢＵ１０１は、サンプルが還元され
たときよりも高い分子量に観察された。レーン１０及び１３の組織標本は、抗−
ＢＵ１０１モノクローナル抗体でプローブしたときに優勢な１つの種（図１１の
１つの線で示される）を示した。対照的に、レーン１１及び１２の組換えＢＵ１
０１ Ｍ／Ｈは多数の種を示した（図１１の複数の線で示される）。ｍｙｃ−ｈ
ｉｓタグの付いたタンパク質で多数種が観察された原因は、この組換え系の乳グ
ロビンが多数のグリコシル化状態を有するからであり、これは図１１の下部ブロ
ットで観察された。
【０２５８】 下部ブロットは乳グロビンに対するポリクローナル抗血清によって可視化した
。レーン４−７のサンプルは還元され、レーン１０−１３のサンプルは還元され
なかった。還元性条件下で、Ｍａｍはレーン４及び７の組織標本中で観察され、
組換えＭａｍ Ｍ／Ｈはレーン５及び６で観察された。ｍｙｃ−ｈｉｓタグはＭ
ａｍの分子量に約３ｋＤを付加し、この結果はウェスタンブロット上にやや高い
バンドとして表れた。Ｍａｍは組織標本中で単一種として検出されたが、組換え
系中では多数種として検出された。組換え系のこれらの多重バンドの原因はＭａ
ｍタンパク質が多数のグリコシル化状態を有することにある（参照によって本発
明に含まれる１２／１８／９８出願の米国特許出願０９／２１５，８１８に記載
）。簡単に説明すると、Ｍａｍはグリコシル化可能な２つのＡｓｎ残基を含む。
３つのバンドは、双方のＡｓｎ残基がグリコシル化されたＭａｍ、１つのＡｓｎ
残基がグリコシル化されたＭａｍ、Ａｓｎ残基がグリコシル化されないＭａｍを
それぞれ表す。安定な細胞系（ＭＢ８，レーン６）は一過性発現系（レーン１０
−１３）よりも完全にグリコシル化されたＭａｍを産生した。非還元性条件下の
Ｍａｍ（レーン１０−１３）はサンプルが還元されたときよりもやや高い分子量
で観察された。レーン１０及び１３の組織標本は、抗−Ｍａｍポリクローナル抗
体でプローブしたときに優勢な１つの種（図１１の１つの線で示される）を示し
た。対照的に、レーン１１及び１２の組換えＭａｍ Ｍ／Ｈは多数の種（図１１
の複数の線で示される）を示した。
【０２５９】 上部及び下部のブロットの直接比較によって、非還元性条件下では乳癌組織標
本中に抗−ＢＵ１０１抗体及び抗−Ｍａｍ抗体の双方によって同じバンドが検出
されることが観察された（レーン１０及び１３）。これらの結果は、ＢＵ１０１
とＭａｍとの会合が還元剤によって除去され得るという事実に一致する。このよ
うな会合は２つの種の間のジスルフィド結合であろう。
【０２６０】 Ｃ．イオン交換クロマトグラフィー 分化の少ない浸潤性の（乳）腺癌患者の乳癌組織抽出物（図１１、レーン４及
び１０）をアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。詳細には、８００μＬ
の抽出物を、２０ｍＭのピペラジン，ｐＨ６．０で平衡させたＭｏｎｏ Ｑ５／
５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加えた。塩化ナトリウムの直線勾配を使用し
てタンパク質を溶出させた。流速を１ｍＬ／分、勾配をバッファ１ｍｌあたり２
０ｍＭの塩化ナトリウムとし、溶出時間を５０分として、０−１０００ｍＭ塩化
ナトリウムの溶出プロフィルを作製した。溶出勾配を加える前のサンプル充填時
間は３０分間であった。各１ｍＬの画分をサンプルとして採取した。１００μＬ
の各画分を０．１％ベータ−メルカプトエタノールの存在下で沸騰させ、次いで
ドットブロット装置のウェルに加えて、この量をニトロセルロースピースに吸引
した。次にＢＵ１０１またＭａｍを認識するポリクローナル抗血清を使用し実施
例７Ｂに前述の手順と同じウェスタンブロット可視化手順でニトロセルロースフ
ィルターを可視化した。図１２は、可視化したドットブロットを示し、これらの
ドットブロットは画分４１−４８の物質が抗−乳グロビンポリクローナル抗血清
及び抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清の双方によって免疫認識されることを
表す。画分４１−４８は２２０−３６０ｍＭ塩化ナトリウムという塩濃度に対応
する。これらの結果は４．６未満の等電点に一致する。アニオン交換カラムから
の溶出条件を、溶出したタンパク質またタンパク質複合体の対応するｐＩと共に
表５にまとめる。
【０２６１】 表５：ｐＨ６．０のクロマトグラフ特性
【０２６２】
【表５】
【０２６３】 ＢＵ１０１（Ｍ／Ｈタグ無し）の等電点の計算値は８．４であった（表４）。
Ｍａｍ（Ｍ／Ｈタグ無し）の等電点の計算値は３．８であった（表４）。１つの
ＢＵ１０１ポリペプチドと１つのＭａｍポリペプチドとを含む複合体の等電点の
計算値は４．４であり、これらの値は観察されたクロマトグラフィー特性に一致
した。更に、１つのＢＵ１０１ポリペプチドと１つのＭａｍポリペプチドとを含
む複合体は、抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清と抗−Ｍａｍポリクローナル
抗血清との双方が画分４１−４８を認識した画分のドットブロット分析に一致し
た。
【０２６４】 物質を更に分析するために、各陽性画分（画分４１−４８）を還元性及び非還
元性の双方の条件下のウェスタンブロットで処理した。２つの等しいブロットを
生じさせ、抗−Ｍａｍポリクローナル抗血清または抗−ＢＵ１０１ポリクローナ
ル抗血清で可視化した。図１３では、上部ブロットは抗ＢＵ１０１ポリクローナ
ル抗血清で可視化し、下部ブロットは抗−Ｍａｍポリクローナル抗血清で可視化
した。
【０２６５】 抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清で可視化した上部ブロットでは、画分を
還元状態（ブロットの左側）及び非還元状態（ブロットの右側）の双方で処理し
た。還元状態では、ＢＵ１０１が各画分中で低分子量（〜７ｋＤ）の単一バンド
として観察された。非還元条件下では、より高い分子量（〜２３−３４ｋＤ）に
広い単一バンドが検出された。
【０２６６】 抗−Ｍａｍポリクローナル抗血清で可視化した下部ブロットでは、画分を還元
状態（ブロットの左側）及び非還元状態（ブロットの右側）の双方で処理した。
還元状態では、Ｍａｍが各画分中で低分子量１７−２３ｋＤに広い単一バンドと
して観察された。非還元条件下では、より高い分子量（〜２３−３４ｋＤ）に広
い単一バンドが検出された。
【０２６７】 ２つのバンドの比較は、抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清及び抗−Ｍａｍ
ポリクローナル抗血清が非還元性条件下で同じバンドを検出したことを示す。非
還元種の分子量は１つのＢＵ１０１ポリペプチドと１つのＭａｍポリペプチドと
の和に相関関係を有していた。これらのデータはジスルフィド結合したＭａｍと
ＢＵ１０１とから成る複合体に一致する。
【０２６８】 Ｄ．ゲル濾過クロマトグラフィー 上記のような半精製した乳癌組織抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーを使用
して更に精製した。詳細には、前述のようなイオン交換クロマトグラフィーから
得られた画分４１−４８を、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ ３０濃縮機を３０００×ｇ
で２５分間回転させることによって濃縮した。１０ｍｍ×３０ｃｍのＳｕｐｅｒ
ｏｓｅ １２カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を
加えた。ＰＢＳ（５０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム，ｐＨ７．
４）の単一バッファを０．４ｍＬ／分の流速でカラムに流した。Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａから入手し得る分子量標準でカラムを校正した。得られた分子量決定用標準
曲線を図９に示す。図９は、分子量と溶出量との関係を示す。
【０２６９】 Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムからのＭａｍ及びＢＵ１０１の溶出を抗−ＢＵ
１０１ポリクローナル抗血清及び抗−Ｍａｍポリクローナル抗血清による免疫認
識でモニターした。各０．４ｍＬの画分をサンプルとして採取した。１００μｌ
の各画分を０．１％ベータ−メルカプトエタノール中で沸騰させ、次いでドット
ブロット装置のウェルに加えて、この量をニトロセルロースピースで吸引した。
２つのドットブロットをこのようにして調製した。次にニトロセルロースフィル
ターを、一方のニトロセルロースフィルターには抗−ＢＵ１０１ポリクローナル
抗血清、他方のニトロセルロースフィルターには抗−Ｍａｍポリクローナル抗血
清を使用して、実施例７Ｂに前述の手順と同じウェスタンブロット可視化手順で
可視化した。図１４は、これらの可視化したドットブロットを示す。ドットブロ
ットは、抗−Ｍａｍポリクローナル抗血清及び抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗
血清による画分３４−３９中の物質の免疫認識を示す。画分３４、３５、３６、
３７、３８及び３９の溶出量はそれぞれ、１３．６、１４．０、１４．４、１４
．８、１５．２及び１５．６ｍＬである。これらの画分の分子量範囲は〜６３ｋ
Ｄ−〜２０ｋＤに対応する。このピークの中心は分子量〜４０ｋＤに対応する。
【０２７０】 ゲル濾過クロマトグラフィーからＭａｍと同じ画分中にＢＵ１０１が検出され
ることはＢＵ１０１及びＭａｍの双方を含む複合体に一致する。図１３に示すよ
うに、ＢＵ１０１及びＭａｍは個別の種として著しく異なる分子量（〜７ｋＤ及
び〜２３ｋＤ）を有している。図９は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムの性能及
びこのような個別の種を分離するカラムの能力を示す。ところが溶出プロフィル
は、平均分子量４０ｋＤの単一ピークを示した。これは、非還元性条件下の乳組
織抽出物中で同定された種に一致する（図１３）。このデータはＢＵ１０１及び
Ｍａｍが単離ポリペプチドとして存在しないことを意味する。更に、乳癌組織中
でＢＵ１０１及びＭａｍの双方を含む複合体が同定されることは該複合体がヒト
の組織及び疾患に生物学的関連を有することを示す。
【０２７１】 実施例９：前処理プロトコルを使用するＭａｍ Ｍ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／ Ｈから成る複合体の免疫認識の増強 ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞の増殖上清及びＭａｍ Ｍ／Ｈの一過性トランスフ
ェクションの上清の双方を半精製（実施例７Ｃに前述のようなニッケルキレート
化クロマトグラフィー）し、加熱または非加熱で非イオン性界面活性剤、アニオ
ン性界面活性剤または還元剤を使用する種々の前処理プロトコルで処理した。詳
細には、トゥイーン２０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはベータ−メ
ルカプトエタノール（β−ＭＥ）のアリコートを、１００μＬの上記の半精製上
清に、添加剤中の最終濃度０．１％、０．２５％、０．５％、１．０％、２．０
％及び４．０％で添加した。重複サンプルセットを５分間加熱処理して冷却した
。処理サンプルを次に、ドットブロット装置に充填し、この量をニトロセルロー
スピースに吸引した。ニトロセルロースフィルターを次に抗−ｍｙｃモノクロー
ナル抗体を使用して実施例７Ｂに前述の手順と同じ可視化手順で可視化した。
【０２７２】 Ｍａｍ Ｍ／Ｈを含有する半精製上清の前処理は、ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞
の半精製上清の前処理で得られた結果と同様の結果を与えた（図１５）。抗−ｍ
ｙｃモノクローナル抗体に関するポリペプチドの免疫認識は幾つかの前処理プロ
トコルによって増強された。加熱または非加熱のトゥイーン２０は、ｍｙｃ−ｈ
ｉｓタグの付いたポリペプチドに対する抗−ｍｙｃモノクローナル抗体の免疫認
識に全く効果はなかった。ＳＤＳ処理は０．１％及び０．２５％という低濃度の
ときに高濃度（＞０．５％）のときよりもｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いたポリペプ
チドに対する抗−ｍｙｃモノクローナル抗体の免疫認識を改善し、加熱及び非加
熱の双方の場合に改善効果が観察された。ベータ−メルカプトエタノール処理は
すべての濃度でｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いたポリペプチドに対する抗−ｍｙｃモ
ノクローナル抗体の免疫認識を改善し、加熱及び非加熱の双方で改善効果が観察
された。従って、ポリペプチドの免疫認識が幾つかの前処理プロトコルによって
増強されることが判明した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例７Ｃに従って産生された組換えポリペプチド複合体を認識した３つのモ
ノクローナル抗体の結合曲線を示す。
【図２】 ２つの悪性乳切片、１つの健康な乳切片及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系をモ
ノクローナル抗体Ｈ９Ｃ６５で免疫組織化学的に染色した結果を示す。
【図３】 ２つの悪性乳切片、１つの健康な乳切片及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系をモ
ノクローナル抗体Ｊ９３Ｃ３０で免疫組織化学的に染色した結果を示す。
【図４】 ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞の増殖後に採取した３つの上清を示す３つのウェス
タンブロットのスキャンである。
【図５】 抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示す２つのドットブロ
ットのスキャンである。
【図６】 １６パネルから成る４つのウェスタンブロットのスキャンである。
【図７】 等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３−１０）から得られたウェスタンブロットのスキ
ャンである。
【図８】 抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示す２つのドットブロ
ットのスキャンである。
【図９】 タンパク質標準の溶出量（ｖｏｌｕｍｅ）と分子量（ｗｅｉｇｈｔ）との関係
を示すＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムの標準曲線である。
【図１０】 抗−ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示すドットブロットの
スキャンである。
【図１１】 ２つの組織抽出物及び２つの上清を、ｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いた組換えＭａ
ｍ及びＢＵ１０１で分析した２つのウェスタンブロットのスキャンである。
【図１２】 抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上部ブロット）または抗−Ｍａｍポリク
ローナル抗体（下部ブロット）による物質の免疫認識を示す２つのドットブロッ
トのスキャンである。
【図１３】 抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上部ブロット）または抗−Ｍａｍポリク
ローナル抗体（下部ブロット）による物質の免疫認識を示す２つのドットブロッ
トのスキャンである。
【図１４】 抗−ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上部ブロット）または抗−Ｍａｍポリク
ローナル抗体（下部ブロット）による物質の免疫認識を示す２つのドットブロッ
トのスキャンである。
【図１５】 前処置プロトコルの使用によるｍｙｃ−ｈｉｓタグの付いたポリペプチドの免
疫認識の増強を示すドットブロットのスキャンである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ ４Ｈ０４５ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/532 Ａ 33/532 33/574 Ａ 33/574 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ａ (72)発明者 ラツセル，ジヨン・イー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、 ケノーシヤ、シツクステイフオース・コー ト・8275 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 BB24 CB01 CB03 DA36 FA16 FB03 FB05 FB07 4B024 AA01 AA12 BA36 BA44 CA01 DA03 GA11 HA15 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA45 CA46 4C085 KA03 KB82 LL18 4H045 AA11 AA30 BA41 CA40 DA86 EA28 EA51 FA74

Claims (79)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチド（配列６）と少な
    くとも１つの乳グロビンポリペプチド（配列５）とを含む精製された多量体ポリ
    ペプチド抗原（ＭＰＡ）。
  2. 【請求項２】 前記抗原が更に少なくとも１つのポリペプチドを含むことを
    特徴とする請求項１に記載の抗原。
  3. 【請求項３】 前記抗原が約２０−７０キロダルトンの分子量を有すること
    を特徴とする請求項１に記載の抗原。
  4. 【請求項４】 前記抗原が約７未満の等電点を有することを特徴とする請求
    項３に記載の抗原。
  5. 【請求項５】 前記少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドが、５３位の
    アミノ酸にプロリン及びロイシンから成るグループから選択された多形性を含む
    ことを特徴とする請求項１または２に記載の抗原。
  6. 【請求項６】 前記少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと前記少なく
    とも１つの乳グロビンポリペプチドとがジスルフィド結合によって共有結合され
    ていることを特徴とする請求項１または２に記載の抗原。
  7. 【請求項７】 前記少なくとも１つのポリペプチドが配列５、配列６及びそ
    のフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０
    ％の一致を有することを特徴とする請求項２に記載の抗原。
  8. 【請求項８】 請求項１または２に記載の抗原の少なくとも１つのエピトー
    プに特異的に結合する抗体であって、前記エピトープが配列５、配列６及びその
    フラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％
    の一致を有しているアミノ酸配列に由来することを特徴とする抗体。
  9. 【請求項９】 前記抗体がモノクローナルまたはポリクローナルであること
    を特徴とする請求項８に記載の抗体。
  10. 【請求項１０】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記ＭＰＡの存在を検出する方法であって、前
    記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、前記ＭＰＡの少なくとも１つのエピトープに特異的
    な少なくとも１つの抗体に、抗原／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分
    な時間接触させる段階と、 （ｂ）前記複合体を検出する段階とから成り、前記複合体の存在を前記被検サン
    プル中の前記ＭＰＡの存在の指標とすることを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】 前記ＭＰＡが更に、配列５、配列６及びそのフラグメント
    から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有す
    る少なくとも１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 前記少なくとも１つの抗体がＭＰＡに対して産生され、前
    記ＭＰＡが、ＨＥＫ−２９３ＭＢ８細胞によって産生されるか、または、少なく
    とも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド
    配列と少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つの
    ヌクレオチド配列とを含む構築物を含むベクターをトランスフェクトした宿主細
    胞によって産生されることを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記少なくとも１つの抗体がＭＰＡに対して産生され、前
    記ＭＰＡが２つのベクターを含む宿主細胞によって産生され、前記ベクターの一
    方が少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌ
    クレオチド配列を含む構築物を含み、前記２つのベクターの他方が少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を
    含む構築物を含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異
    的な抗体を含有する疑いのある被検サンプル中の前記抗体の存在を検出する方法
    であって、前記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、配列５、配列及びそのフラグメントから成るグルー
    プから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有するアミノ酸また
    はそのフラグメントに由来の少なくとも１つのエピトープを含む前記多量体ポリ
    ペプチド抗原（ＭＰＡ）に、抗体／多量体ポリペプチド抗原複合体が形成される
    十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、 （ｂ）前記複合体を検出する段階とから成り、前記複合体の存在を前記被検サン
    プル中の前記抗体の存在の指標とすることを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】 前記多量体ポリペプチド抗原が更に、配列５、配列６及び
    そのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２
    ０％の一致を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求
    項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 段階（ａ）の前記ＭＰＡが、ＨＥＫ−２９３ ＭＢ８細胞
    によって産生されるか、または、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコ
    ードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも１つの乳グロビンポリ
    ペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含む構築物を含む
    ベクターをトランスフェクトした宿主細胞によって産生されることを特徴とする
    請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 段階（ａ）の前記ＭＰＡが２つのベクターを含む宿主細胞
    によって産生され、前記ベクターの一方が少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプ
    チドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含み、前記
    ２つのベクターの他方が少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする
    少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含むことを特徴とする請求項
    １４または１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記多量体ポリペプチド抗原が固相に付着されていること
    を特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記ＭＰＡの存在を検出する方法であって、前
    記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、前記ＭＰＡの少なくとも１つのエピトープに特異的
    な少なくとも１つの抗体に、ＭＰＡ／抗体複合体が形成される十分な条件下で十
    分な時間接触させる段階と、 （ｂ）得られた前記ＭＰＡ／抗体複合体に、検出可能なシグナルを発生し得るシ
    グナル発生化合物を付着させた抗体を含むコンジュゲートを添加し、前記コンジ
    ュゲートが前記結合抗原に結合し得る十分な条件下で十分な時間維持する段階と
    、 （ｃ）前記シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出することによ
    って前記被検サンプル中に存在するならば前記ＭＰＡの存在を検出する段階とか
    ら成る方法。
  20. 【請求項２０】 前記多量体ペプチド抗原が更に、配列５、配列６及びその
    フラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％
    の一致を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１
    ９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 段階（ａ）の前記抗体がＭＰＡに対して産生され、前記Ｍ
    ＰＡがＨＥＫ−２９３ＭＢ８細胞によって産生されるか、または、少なくとも１
    つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と
    少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレ
    オチド配列とを含む構築物を含むベクターをトランスフェクトした宿主細胞によ
    って産生されることを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 段階（ａ）の前記少なくとも１つのエピトープがＭＰＡに
    由来し、前記ＭＰＡが２つのベクターを含む宿主細胞によって産生され、前記ベ
    クターの一方が少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくと
    も１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含み、前記２つのベクターの他方が少
    なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオ
    チド配列を含む構築物を含むことを特徴とする請求項１９または２０に記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記ＭＰＡの存在を検出する方法であって、前
    記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、前記ＭＰＡの少なくとも１つのエピトープに特異的
    な少なくとも１つの抗体に、ＭＰＡ／抗体複合体が形成される十分な条件下で十
    分な時間接触させる段階と、 （ｂ）得られた前記ＭＰＡ／抗体複合体に、検出可能なシグナルを発生し得るシ
    グナル発生化合物を付着させたステロイドまたは抗体を含むコンジュゲートを添
    加し、前記コンジュゲートが前記結合抗原に結合し得る十分な条件下で十分な時
    間維持する段階と、 （ｃ）前記シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出することによ
    って前記被検サンプル中に存在するならば前記ＭＰＡの存在を検出する段階とか
    ら成ることを特徴とする方法。
  24. 【請求項２４】 前記多量体ペプチド抗原が更に、配列５、配列６及びその
    フラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％
    の一致を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求項２
    ３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記ステロイドが、プロゲステロン、アルドステロン、ア
    ンドロステンジオン、コルチコステロン、コルチゾル、デヒドロエピアンドロス
    テロン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストリオール、エスト
    ロン、ヒドロキシプロゲステロン及びテストステロンから成るグループから選択
    されることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 段階（ａ）の前記抗体がＭＰＡに対して産生され、前記Ｍ
    ＰＡがＨＥＫ−２９３ＭＢ８細胞によって産生されるか、または、少なくとも１
    つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と
    少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレ
    オチド配列とを含む構築物を含むベクターをトランスフェクトした宿主細胞によ
    って産生されることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記ＭＰＡに特異的な抗体の存在を検出する方
    法であって、前記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、配列５、配列６及びそのフラグメントから成るグル
    ープから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有するアミノ酸配
    列またはそのフラグメントに由来の少なくとも１つのＭＰＡエピトープに、ＭＰ
    Ａ／抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、 （ｂ）得られた前記ＭＰＡ／抗体複合体に、（１）被検サンプル中の前記抗体に
    結合する抗体と、（２）検出可能なシグナルを発生すべく（１）の抗体に付着さ
    せたシグナル発生化合物と、から成るコンジュゲートを添加し、前記コンジュゲ
    ートが前記結合抗体に結合し得る十分な条件下で十分な時間維持する段階と、 （ｃ）前記シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出することによ
    って前記被検サンプル中に存在するならば前記抗体の存在を検出する段階とから
    成ることを特徴とする方法。
  28. 【請求項２８】 前記多量体ポリペプチド抗原が更に、配列５、配列６及び
    そのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２
    ０％の一致を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求
    項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 段階（ａ）の前記少なくとも１つのＭＰＡエピトープがＭ
    ＰＡに由来し、前記ＭＰＡがＨＥＫ−２９３ＭＢ８細胞によって産生されるか、
    または、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つ
    のヌクレオチド配列と少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少
    なくとも１つのヌクレオチド配列とを含む構築物を含むベクターをトランスフェ
    クトした宿主細胞によって産生されることを特徴とする請求項２７または２８に
    記載の方法。
  30. 【請求項３０】 段階（ａ）の前記少なくとも１つのＭＰＡエピトープがＭ
    ＰＡに由来し、前記ＭＰＡが２つのベクターを含む宿主細胞によって産生され、
    前記ベクターの一方が少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少
    なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含み、前記２つのベクターの他
    方が少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌ
    クレオチド配列を含む構築物を含むことを特徴とする請求項２７または２８に記
    載の方法。
  31. 【請求項３１】 多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的な抗体を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記抗体の存在を判定するアッセイキットであ
    って、前記アッセイキットがＭＰＡを収容した容器を含み、前記ＭＰＡが配列５
    、配列６及びそのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に
    少なくとも２０％の一致を有するエピトープを含むことを特徴とするアッセイキ
    ット。
  32. 【請求項３２】 前記容器内の前記抗原が固相に付着されていることを特徴
    とする請求項３１に記載のアッセイキット。
  33. 【請求項３３】 前記キットが更に、還元剤及び界面活性剤から成るグルー
    プから選択される少なくとも１つの要素を含むことを特徴とする請求項３１に記
    載のアッセイキット。
  34. 【請求項３４】 多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有する疑いのある
    被検サンプル中の前記抗原の存在を判定するアッセイキットであって、前記アッ
    セイキットが、配列５、配列６及びそのフラグメントから成るグループから選択
    されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有するアミノ酸配列をもつ少な
    くとも１つのエピトープを含むＭＰＡに特異的に結合する抗体を収容した容器を
    含むことを特徴とするアッセイキット。
  35. 【請求項３５】 前記アッセイキットが更に、還元剤及び界面活性剤から成
    るグループから選択される少なくとも１つの要素を含むことを特徴とする請求項
    ３４に記載のアッセイキット。
  36. 【請求項３６】 前記抗体がＭＰＡに対して産生され、前記ＭＰＡがＨＥＫ
    −２９３ＭＢ８細胞によって産生されるか、または、少なくとも１つのＢＵ１０
    １ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と
    を含む構築物を含むベクターをトランスフェクトした宿主細胞によって産生され
    ることを特徴とする請求項３４に記載のアッセイキット。
  37. 【請求項３７】 前記少なくとも１つの抗体がＭＰＡに対して産生され、前
    記ＭＰＡが２つのベクターを含む宿主細胞によって産生され、前記ベクターの一
    方が少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌ
    クレオチド配列を含む構築物を含み、前記２つのベクターの他方が少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を
    含む構築物を含むことを特徴とする請求項３４に記載のアッセイキット。
  38. 【請求項３８】 多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的に結合する抗
    体の産生方法であって、単離された免疫原性ポリペプチドまたはそのフラグメン
    トを免疫応答を誘発すべく十分な量で個体に投与する段階から成り、前記免疫応
    答ポリペプチドまたはそのフラグメントが配列５、配列６及びそのフラグメント
    から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有す
    る少なくとも１つのＭＰＡエピトープを含むことを特徴とする方法。
  39. 【請求項３９】 多量体ポリペプチド抗原から成り、前記抗原が少なくとも
    １つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドとを
    含むことを特徴とする物質組成物。
  40. 【請求項４０】 前記抗原が更に、配列５、配列６及びそのフラグメントか
    ら成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有する
    少なくとも１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求項３９に記載の物質
    組成物。
  41. 【請求項４１】 組成物が更に、前記多量体ポリペプチド抗原に結合した少
    なくとも１つの抗体を含み、前記抗体が、ＢＵ１０１ポリペプチド、乳グロビン
    ポリペプチド、配列５、配列６及びそのフラグメントから成るグループから選択
    されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有する１つのポリペプチド、及
    びそれらのフラグメントから成るグループから選択された少なくとも１つのポリ
    ペプチドに特異的であることを特徴とする請求項３９または４０に記載の物質組
    成物。
  42. 【請求項４２】 ２つの抗体が存在し、各抗体が配列５、配列６及びそれら
    のフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０
    ％の一致を有するアミノ酸配列を有する個別のポリペプチドに結合することを特
    徴とする請求項４１に記載の物質組成物。
  43. 【請求項４３】 前記２つの抗体の各々がＢＵ１０１ポリペプチドまたはそ
    のフラグメントに結合することを特徴とする請求項４２に記載の物質組成物。
  44. 【請求項４４】 前記２つの抗体の各々が乳グロビンポリペプチドまたはそ
    のフラグメントに結合することを特徴とする請求項４２に記載の物質組成物。
  45. 【請求項４５】 前記２つの抗体の一方がＢＵ１０１ポリペプチドまたはそ
    のフラグメントに結合し、前記２つの抗体の他方が乳グロビンポリペプチドまた
    はそのフラグメントに結合することを特徴とする請求項４２に記載の物質組成物
    。
  46. 【請求項４６】 前記２つの抗体の一方がＢＵ１０１ポリペプチドまたはそ
    のフラグメントに結合し、前記２つの抗体の他方が配列５、配列６及びそれらの
    フラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％
    の一致を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合することを特徴とする
    請求項４２に記載の物質組成物。
  47. 【請求項４７】 前記２つの抗体の一方が乳グロビンポリペプチドまたはそ
    のフラグメントに結合し、前記２つの抗体の他方が配列５、配列６及びそれらの
    フラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％
    の一致を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合することを特徴とする
    請求項４２に記載の物質組成物。
  48. 【請求項４８】 乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の検出方法であって、
    （ａ）少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの乳グロビン
    ポリペプチドとを含む多量体タンパク質抗原（ＭＰＡ）に特異的な標識抗体を前
    記患者に投与する段階と、 （ｂ）前記ラベルの存在を検出する段階とから成り、前記ラベルの存在を前記患
    者体内のＭＰＡ及び乳癌の存在の指標とすることを特徴とする方法。
  49. 【請求項４９】 前記ＭＰＡが更に、配列５、配列６及びそのフラグメント
    から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％の一致を有す
    る少なくとも１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求項４８に記載の方
    法。
  50. 【請求項５０】 段階（ａ）の前記抗体がＭＰＡに対して産生され、前記Ｍ
    ＰＡが、ＨＥＫ−２９３ＭＢ８細胞によって産生されるか、または、少なくとも
    １つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列
    と少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌク
    レオチド配列とを含む構築物を含むベクターをトランスフェクトした宿主細胞に
    よって産生されることを特徴とする請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 段階（ａ）の前記抗体がＭＰＡに対して産生され、前記Ｍ
    ＰＡが２つのベクターを含む宿主細胞によって産生され、前記ベクターの一方が
    少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレ
    オチド配列を含む構築物を含み、前記２つのベクターの他方が少なくとも１つの
    乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む
    構築物を含むことを特徴とする請求項４８または４９に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的な抗体を患者
    に投与することから成り、前記ＭＰＡが少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチ
    ドと少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドとを含むことを特徴とする患者の
    乳癌の治療方法。
  53. 【請求項５３】 前記多量体ポリペプチド抗原が更に、配列５、配列６及び
    そのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２
    ０％の一致を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求
    項５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記抗体がＭＰＡに対して産生され、前記ＭＰＡが、ＨＥ
    Ｋ−２９３ＭＢ８細胞によって産生されるか、または、少なくとも１つのＢＵ１
    ０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも
    １つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列
    とを含む構築物を含むベクターをトランスフェクトした宿主細胞によって産生さ
    れることを特徴とする請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記抗体がＭＰＡに対して産生され、前記ＭＰＡが２つの
    ベクターを含む宿主細胞によって産生され、前記ベクターの一方が少なくとも１
    つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を
    含む構築物を含み、前記２つのベクターの他方が少なくとも１つの乳グロビンポ
    リペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含む
    ことを特徴とする請求項５２または５３に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の診断方法であって、 （ａ）前記患者から摘出した腫瘍に由来の組織切片または細胞培養物を調製する
    段階と、 （ｂ）多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）の少なくとも１つのポリペプチドをＢ
    Ｕ１０１ポリペプチドと、乳グロビンポリペプチドと、配列５、配列６及びそれ
    らのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２
    ０％の一致を有するポリペプチドとから成るグループから選択し、前記組織切片
    または細胞培養物を、前記選択されたポリペプチドに特異的な抗体に、抗原／抗
    体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、 （ｃ）前記組織切片または細胞培養物中の前記複合体の存在を検出する段階とか
    ら成り、前記複合体の存在を前記患者の体内のＭＰＡ及び乳癌の存在の指標とす
    ることを特徴とする方法。
  57. 【請求項５７】 前記抗体がＭＰＡに対して産生され、前記ＭＰＡが、ＨＥ
    Ｋ−２９３ＭＢ８細胞によって産生されるか、または、少なくとも１つのＢＵ１
    ０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも
    １つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列
    とを含む構築物を含むベクターをトランスフェクトした宿主細胞によって産生さ
    れることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記抗体がＭＰＡに対して産生され、前記ＭＰＡが２つの
    ベクターを含む宿主細胞によって産生され、前記ベクターの一方が少なくとも１
    つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を
    含む構築物を含み、前記２つのベクターの他方が少なくとも１つの乳グロビンポ
    リペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含む
    ことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の診断方法であって、
    多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）の少なくとも１つのポリペプチドを、ＢＵ１
    ０１ポリペプチドと、乳グロビンポリペプチドと、配列５、配列６及びそれらの
    フラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２０％
    の一致を有するポリペプチドとから成るグループから選択し、前記患者から採取
    した生物サンプル中で前記選択されたポリペプチドの存在または非存在を検出す
    る段階から成り、前記少なくとも１つのポリペプチドの存在を前記患者の体内の
    ＭＰＡ及び乳癌の存在の指標とすることを特徴とする方法。
  60. 【請求項６０】 前記生物サンプルが、組織、尿、骨髄及び血液から成るグ
    ループから選択されることを特徴とする請求項５９に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の診断方法であって、
    前記患者の体内で細胞外ＢＵ１０１ポリペプチドの有無を検出し、前記細胞外Ｂ
    Ｕ１０１の存在を、前記患者体内の乳癌存在、及び、多量体ポリペプチド抗原（
    ＭＰＡ）中の乳グロビンによるＢＵ１０１の細胞外輸送の指標とする段階から成
    り、前記ＭＰＡは少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１つの
    乳グロビンポリペプチドとを含むことを特徴とする方法。
  62. 【請求項６２】 前記多量体ポリペプチド抗原が更に、配列５、配列６及び
    そのフラグメントから成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも２
    ０％の一致を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むことを特徴とする請求
    項６１に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の検出方法であって、 （ａ）前記患者から生物サンプルを採取する段階と、 （ｂ）前記生物サンプル中の遊離ＢＵ１０１ポリペプチドの量を測定する段階と
    、 （ｃ）前記生物サンプルに存在し乳グロビンポリペプチドと複合体を形成してい
    るＢＵ１０１ポリペプチドの量を測定する段階と、 （ｄ）複合体を形成しているＢＵ１０１ポリペプチドに対する遊離ＢＵ１０１ポ
    リペプチドの比を比較する段階とから成り、１よりも大きい比を前記患者の体内
    の乳癌の存在の指標とすることを特徴とする方法。
  64. 【請求項６４】 乳癌を有する疑いがある患者の乳癌の検出方法であって、 （ａ）前記患者から生物サンプルを採取する段階と、 （ｂ）前記生物サンプル中の遊離乳グロビンポリペプチドの量を測定する段階と
    、 （ｃ）前記生物サンプル中に存在しＢＵ１０１ポリペプチドと複合体を形成して
    いる乳グロビンポリペプチドの量を測定する段階と、 （ｄ）複合体を形成している乳グロビンポリペプチドに対する遊離乳グロビンポ
    リペプチドの比を比較する段階とから成り、１よりも大きい比を前記患者の体内
    の乳癌の存在の指標とすることを特徴とする方法。
  65. 【請求項６５】 ＭＰＡのイムノアッセイにおけるＭＰＡの認識強化方法で
    あって、前記ＭＰＡを抗体または化学的化合物に接触させる前に、還元剤及び界
    面活性剤から成るグループから選択された少なくとも１つの要素を前記ＭＰＡに
    作用させる段階を含むことを特徴とする方法。
  66. 【請求項６６】 前記ＭＰＡに熱を作用させる段階を更に含むことを特徴と
    する請求項６５に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 還元剤及び界面活性剤から成るグループから選択された少
    なくとも１つの要素を前記ＭＰＡに作用させる段階を含むことを特徴とするＭＰ
    Ａの解離方法。
  68. 【請求項６８】 前記ＭＰＡに熱を作用させる段階を更に含むことを特徴と
    する請求項６７に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 ＭＢ８細胞によって産生されるか、または、少なくとも１
    つのＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と
    少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレ
    オチド配列とを含む構築物を含むベクターをトランスフェクトした宿主細胞によ
    って産生される診断用試薬。
  70. 【請求項７０】 ２つのベクターをトランスフェクトした宿主細胞によって
    産生され、前記２つのベクターの一方が少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチ
    ドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含み、前記２
    つのベクターの他方が少なくとも１つの乳グロビンポリペプチドをコードする少
    なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含むことを特徴とする診断用試
    薬。
  71. 【請求項７１】 ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系に由来の単離細胞。
  72. 【請求項７２】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記ＭＰＡの存在を検出する方法であって、前
    記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド、ＭＰＡのフラグメ
    ント及びＭＰＡのポリペプチドのフラグメントから成るグループから選択された
    標識抗原に接触させる段階と、 （ｂ）前記被検サンプル及び段階（ａ）の標識抗原を、抗ＭＰＡ抗体に、ＭＰＡ
    ／抗−ＭＰＡ複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、
    （ｃ）前記標識抗原によって発生されたシグナルを検出することによって前記被
    検サンプル中に存在するならばＭＰＡの存在を検出する段階とから成る方法。
  73. 【請求項７３】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記ＭＰＡの存在を検出する方法であって、前
    記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、ＭＰＡに結合する標識抗体に、ＭＰＡ／標識抗体複
    合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、 （ｂ）段階（ａ）の前記複合体を、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド、ＭＰＡのフ
    ラグメント及びＭＰＡのポリペプチドのフラグメントから成るグループから選択
    された抗原に、抗原／標識抗体複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接
    触させる段階と、 （ｃ）前記標識抗体によって発生されたシグナルを検出する段階とから成り、前
    記シグナルを前記被検サンプル中のＭＰＡの存在の指標とすることを特徴とする
    方法。
  74. 【請求項７４】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記ＭＰＡの存在を検出する方法であって、前
    記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、ＭＰＡに結合する標識ステロイドに、ＭＰＡ／標識
    ステロイド複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、 （ｂ）段階（ａ）の前記ＭＰＡ／標識ステロイド複合体を、ＭＰＡ、ＭＰＡのポ
    リペプチド、ＭＰＡのフラグメント及びＭＰＡのポリペプチドのフラグメントか
    ら成るグループから選択された抗原に、抗原／標識ステロイド複合体が形成され
    る十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、 （ｃ）前記標識ステロイドによって発生されたシグナルを検出することによって
    前記被検サンプル中に存在するならばＭＰＡの存在を検出する段階とから成るこ
    とを特徴とする方法。
  75. 【請求項７５】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記ＭＰＡの存在を検出する方法であって、前
    記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、ステロイドに、ＭＰＡ／ステロイド複合体が形成さ
    れる十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、 （ｂ）前記で得られたＭＰＡ／ステロイド複合体に、検出可能なシグナルを発生
    し得るシグナル発生化合物に付着させた抗体から成るコンジュゲートを添加し、
    前記コンジュゲートが前記結合ＭＰＡに結合し得る十分な条件下で十分な時間維
    持する段階と、 （ｃ）前記シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出することによ
    って前記被検サンプル中に存在するならば前記ＭＰＡの存在を検出する段階とか
    ら成ることを特徴とする方法。
  76. 【請求項７６】 前記被検サンプルを抗体または化学的化合物に接触させる
    前に、還元剤及び界面活性剤から成るグループから選択された少なくとも１つの
    要素を前記被検サンプルに作用させることを特徴とする請求項１０、１９、２３
    、７２または７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的な抗体を含有
    する疑いのある被検サンプル中の前記抗体の存在を検出する方法であって、前記
    方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、抗−抗体に、抗体／抗−抗体複合体が形成される十
    分な条件下で十分な時間接触させる段階と、 （ｂ）得られた前記抗体／抗−抗体複合体に、検出可能なシグナルを発生し得る
    シグナル発生化合物に付着させたＭＰＡから成るコンジュゲートを添加し、前記
    コンジュゲートが前記結合抗体に結合し得る十分な条件下で十分な時間維持する
    段階と、 （ｃ）前記シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出することによ
    って前記被検サンプル中に存在するならば前記抗体の存在を検出する段階とから
    成ることを特徴とする方法。
  78. 【請求項７８】 ＭＰＡに特異的な抗体を含有する疑いのある被検サンプル
    中の前記抗体の存在を検出する方法であって、前記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド、ＭＰＡのフラグメ
    ント及びＭＰＡのポリペプチドのフラグメントから成るグループから選択された
    標識抗原に、抗体／標識抗原複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触
    させる段階と、 （ｂ）段階（ａ）で得られた前記複合体を、ＭＰＡに結合する抗体に、未結合の
    標識抗原がＭＰＡに結合する前記抗体に結合し得る十分な条件下で十分な時間接
    触させる段階と、 （ｃ）前記標識抗原によって発生されたシグナルを検出することによって前記被
    検サンプル中に存在するならば前記抗体の存在を検出する段階とから成ることを
    特徴とする方法。
  79. 【請求項７９】 少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチドと少なくとも１
    つの乳グロビンポリペプチドとを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異
    的な抗体を含有する疑いのある被検サンプル中の前記抗体の存在を検出する方法
    であって、前記方法が、 （ａ）前記被検サンプルを、ステロイドとのＭＰＡとの複合体に、抗体／ＭＰＡ
    ／ステロイド複合体が形成される十分な条件下で十分な時間接触させる段階と、 （ｂ）得られた前記抗体／ＭＰＡ／ステロイド複合体に、前記被検サンプル中の
    抗体に反応性の抗体と該抗体に付着させた検出可能なシグナルを発生し得るシグ
    ナル発生化合物とのコンジュゲートを添加し、前記コンジュゲートが結合抗体に
    結合し得る十分な条件下で十分な時間維持する段階と、 （ｃ）前記シグナル発生化合物によって発生されたシグナルを検出することによ
    って前記被検サンプル中に存在するならば前記抗体の存在を検出する段階とから
    成ることを特徴とする方法。
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