CN101109753A - 用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法 - Google Patents

Abstract

一种用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，属于生物技术领域。本发明先将产志贺毒素的大肠杆菌的B亚单位进行基因扩增，获得目的片断，将该片断与载体连接，得到重组表达质粒，导入大肠杆菌表达，获得融合表达的Stx－B融合蛋白，纯化该融合蛋白，将纯化后的融合蛋白用于制备单克隆抗体和多克隆抗体，用胶体金标记多克隆抗体，将其作为示踪标记物，在检测线、质控线与相应的抗原抗体发生特异性结合被截留而显色，根据检测线、质控线显色与否来判定阴阳性结果。本发明能快速、准确地检测样品中的志贺毒素，为及时诊断、防控产志贺毒素的大肠杆菌提供简便、实用的诊断试剂盒。

Description

用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的方法，具体是一种用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法。

背景技术

产志贺毒素大肠杆菌(STEC)感染导致的腹泻常为血性腹泻，并可能导致威胁人生命的溶血性尿毒综合征。STEC是一大类含有众多血清型的致病性大肠杆菌。STEC中除主要血清型0157:H7外，其他的血清型如0111、026、0146、091等也可产生志贺毒素引起致病。STEC通过食物和水源等传播，传播速度快，2005年美国加州的‘毒菠菜事件’引起了国际社会和国际卫生组织的高度重视，其原因就是菠菜中污染了大肠杆菌0157:H7。志贺毒素(Stx)是STEC产生的毒性极强的外毒素，具有神经毒、细胞毒和肠毒等3种生物活性，与临床上的中毒性腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征等严重并发症密切相关，且致病剂量极低，对小鼠的LD₅₀为0.002μg/kg，近年来已被国际社会列入生物武器核查清单中。加入WTO之后，食品包括畜禽产品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，因此出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的检测志贺毒素的方法。

传统的血清学诊断产志贺毒素大肠杆菌的方法有经典的选择分离培养、生化试验。由于产志贺毒素大肠杆菌所包含的血清型的多样性及其生化特性的不稳定性如：发酵山梨醇的不确定性，给鉴别诊断造成一定的困难。利用产志贺毒素大肠杆菌诊断血清、H抗原诊断血清、单克隆抗体诊断试剂进行凝集试验和免疫乳胶凝集试验，菌株需要纯培养，试验耗时长，过程繁琐，检测结果具有一定的假阳性率。而免疫胶体金直接检测的是志贺毒素，此方法的检测对象单一且针对性强，准确率高。检测速度快，所需时间短，只需5-10分钟、不需经培训的专业人员就可使用本方法来检测，满足出入境、海关等检验部门快速、正确地诊断该毒素的要求，并且便于基层推广和运用，从而从源头上控制产志贺毒素大肠杆菌的污染，减少经济损失。

经对现有技术的文献检索发现，Sjgren AC等在《Eur J Clin MicrobiolInfect Dis.》(临床微生物感染杂志)(Mar 2004，23(3)：208-211)发表了“肠出血性肠炎的小孩的志贺毒素B亚单位抗体的酶联免疫吸附试验的检测”，该文中提到间接酶联免疫吸附方法和细胞毒性中和试验，方法是通过检测其志贺毒素的抗体来判定小孩是否因感染了产志贺毒素的大肠杆菌而出现的肠出血性肠炎，其不足在于只能对感染人和动物进行检测判定，且检测程序复杂，所需时间长，需要专业人员操作。在国内有经典的细胞毒性试验和聚合酶链式反应(PCR)，细胞毒性试验需要培养细胞耗费大量的时间并需要专业人员操作，不适合常规的检测使用；而国内外均无检测该毒素快速试纸条出售。

发明内容

本发明的目的在于克服现有方法的不足，提供一种快速、简便地用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，利用志贺毒素的多克隆抗体来捕获毒素，志贺毒素的单克隆抗体与所捕获的毒素特异性结合，胶体金作为示踪标记物，通过夹心法的胶体金免疫层析方法进行检测，可直接检测大肠杆菌所产志贺毒素，对环境和植物也能进行检测，同时不需要专门培训。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明先将产志贺毒素的大肠杆菌的B亚单位进行基因扩增，获得目的片断，将该片断与载体连接，得到融合表达质粒，导入大肠杆菌表达，获得融合表达的Stx-B融合蛋白，纯化该融合蛋白，将纯化后的融合蛋白用于制备单克隆抗体和多克隆抗体，用胶体金标记多克隆抗体，将其作为示踪标记物，在检测线、质控线与相应的抗原抗体发生特异性结合被截留而显色，根据检测线、质控线显色与否来判定阴阳性结果。

产志贺毒素大肠杆菌的主要血清型大肠杆菌0157菌株分泌一种或同时分泌两种Stx1和Stx2，是导致人的溶血性尿毒综合征和出血性肠炎的主要毒力因子，两者都有1个A单位和5个B亚单位组成，B亚单位是受体结合蛋白，介导与靶细胞膜的结合，致使毒素分子内化，A亚单位酶解生成一个具有催化活性的27000的A1亚单位，A1发挥RNAN-糖苷酶的活性，特异性裂解真核细胞28SrRNA，从而抑制细胞蛋白合成过程中的肽链延伸，致使细胞死亡。因此将志贺毒素作为产志贺毒素大肠杆菌主要毒力检测指标。

本发明包括具体步骤如下：

①通过聚合酶链式反应扩增大肠杆菌的Stx-B亚单位基因；

②将步骤①所得的扩增的大肠杆菌Stx-B亚单位基因通过酶切插入到带有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合表达载体pGEX，构建融合表达质粒pGEX-StxB，将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21中，IPTG(异丙基巯基半乳糖苷)诱导表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定；

③用步骤②表达的融合蛋白与等量的弗氏不完全佐剂乳化完全，新西兰大白兔背部皮下多点免疫，每次免疫前耳沿静脉采血，用间接酶链免疫吸附试验(ELISA)测效价，效价达到1∶10000以上时，颈动脉采血，采用硫酸铵分级沉淀和亲和层析法纯化采集的血清，获得抗Stx-B重组融合蛋白的多克隆抗体；

④用步骤②表达的融合蛋白与等量的弗氏完全佐剂乳化完全，脾下注射免疫8周龄BALB/C小鼠，每只0.3ml；三周后，改用弗氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量，进行再次免疫；三周后，腹腔注射，用不加佐剂的抗原0.3ml进行第三次加强免疫，于免疫5天后眼底静脉采血，用间接酶链免疫吸附试验测效价，效价达到1∶10000以上时处死小鼠，取其脾脏，用于细胞融合，用间接酶联免疫吸附试验方法筛选阳性杂交瘤细胞，通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞来大量制备小鼠腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法纯化腹水，获得纯化的抗Stx-B重组融合蛋白的单克隆抗体；

⑤用0.01％(质量体积百分比)柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金。待标记的抗体蛋白用0.005mol/L的氯化钠溶液透析除盐，然后用制备好的40nm的胶体金来标记多克隆抗体蛋白。

⑥将标记好的多克隆抗体蛋白喷涂到金标垫上，小鼠的单克隆抗体喷涂到T线，羊抗兔多克隆抗体喷涂到C线，然后组装好试纸条，37℃烘箱干燥，在4℃保存备用。

⑦待检样品的处理，即从食品、动物性制品采集来的被检样品用胰蛋白大豆培养基增菌培养37℃4h，12000转/分钟离心5分，其上清转移到5ml的无菌管中备用。

⑧把试纸条的测试端插入装有待检液体的样品缸里(不能超过Max线)，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的抗体发生结合被截留而显色，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。

胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl₄)在还原剂如白磷、单宁酸/柠檬酸钠和柠檬酸三钠等作用下(本发明用的是柠檬酸三钠作为还原剂)，聚合成特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质高分子被吸附到胶体金颗粒表明的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表明的负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团因静电作用而形成牢固结合。这种球型的胶体金颗粒具有高电子密度，能够对多种生物高分子物质如葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽等非共价结合，形成可见的紫红色，使其成为免疫反应的优良标记物，因此广泛应用于各种物质的检测。

酶联免疫吸附试验由于液相中的抗原(或抗体)需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应，需较长时间，各个步骤需彻底地洗涤，并且需要特定的酶和底物显色，因此耗时长，程序繁琐；聚合酶链式扩增试验需电泳和凝胶成像系统来显示结果，操作复杂；实时定量聚合酶链式扩增试验可以进行定量，但价格昂贵，不能快速检测且不能广泛用于基层。胶体金免疫层析法克服了以上常规试验方法的不足，胶体金免疫层析试验法利用抗原抗体反应原理，胶体金标记示踪物与固定在膜上的抗原或抗体形成复合物被截留而显色，不需要特定的酶和底物显色，也不需要抗原抗体之间的较长时间的物理吸附，而根据显色与否判定阴阳性结果。

本发明步骤①中，所述聚合酶链式反应，其反应条件为94℃3min预变性，94℃30s，58℃30s，72℃30s 35个循环，最后72℃延伸10min；引物序列如下：

P1：5’-cccgaattccggcggattgcgcta-3’

P2：5’-ccgctcgaggcctcagtcattatt-3’。

本发明步骤③中，所述融合蛋白，由重组表达菌进行表达，其重组菌的增菌OD₆₀₀为0.6，其表达条件为温度30℃，异丙基巯基半乳糖苷的终浓度为1mMol，振摇为150rpm/min 4小时。

本发明步骤⑤中，所述胶体金颗粒的制备，具体为：先将100ml的0.01％HAuCl₄溶液加热至沸腾，迅速加入1ml的1％柠檬酸三钠水溶液，加热，煮沸7～10min出现透明的酒红色，最后加三蒸水至100ml，制备得到40nm的胶体金溶液。

本发明步骤⑤中，所述用制备好的40nm的胶体金来标记多克隆抗体蛋白，具体为：标记前用0.1mol/L K₂CO₃调节金溶液的pH为9.0，再缓慢加入抗体蛋白8mg缓慢搅拌结合1小时，然后加入10％牛血清白蛋白至终浓度1％来稳定胶体金溶液，8000g离心1小时，弃上清，再用50mMol/LTris缓冲液恢复，反复3次，以除去杂质，最后将沉淀溶于原体积的1/10同一缓冲液中备用。

本发明步骤⑧中，若待检液中含Stx毒素，当待测液进入测试端时，由于毛细效应往前移动，Stx毒素与金标垫上的金标多克隆抗体(Au-Ab)形成Au-Ab-Stx二联复合物，复合物在NC膜上继续层析泳动，与检测线上(T线)的单克隆抗体结合形成McAb-Stx-Au-Ab三联复合物，并被固定在T线的单克隆抗体截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的Stx-Ab复合物由于层析作用，继续迁移向前，与固定在质控线(C线)上的羊抗兔多克隆抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带，即阳性结果是在T线和C线上均呈现棕红色条带。

本发明步骤⑧中，若待测液不含Stx毒素，固定于金标垫上的金标多克隆抗体因毛细效应随待测液体向前移动，则不能与检测线上(T线)的单克隆抗体结合，因此也不能截留金标兔抗多克隆抗体，金标多克隆抗体继续层析向前，与固定在质控线(C线)上的羊抗兔多克隆抗体结合形成二联复合物而被截留下来，形成可见的棕红色条带，即阴性结果只在C线上形成棕红色条带。

胶体金免疫层析试验利用胶体金标记的抗原或抗体，在NC膜上进行的抗原或抗体的测定。胶体金免疫层析试验的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的胶体金标记。固定在NC膜上的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，胶体金标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又有示踪的功能。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)通过毛细作用向前移行与金标垫上的抗原或抗体起反应。继续向前移行，与固定在T线抗原或抗体结合形成免疫复合物被截留而显色，约为一条宽为1MM的棕红色条带，多余的金标抗体继续向前移动，与固定在C线的羊抗兔多克隆抗体结合被截留而显色，约为一条宽为1MM的棕红色条带。此时T线形成金标复合物与标本中受检物质的量呈一定的比例，故可根据T线呈现的颜色深浅进行定性或半定量分析。本发明是以大肠杆菌Stx毒素B亚单位的融合蛋白的单克隆抗体固定T线，胶体金标记大肠杆菌Stx毒素B亚单位的融合蛋白的多克隆抗体固定金标垫，羊抗兔的多克隆抗体固定C线，将样品垫插入装有样品液的样品缸里，根据T线的显色与否来判定结果，C线的显色与否来判定试纸条的本身质量。

本发明是鉴于待测样品若有该毒素，由于毛细效应向前层析移动，样品液中的Stx毒素与金标多克隆抗体形成的复合物，与T线的单克隆抗体结合形成三联复合物被截留，胶体金沉积在T线显色来判定食品等检测样品有志贺毒素；相应地待测样品若没有该毒素，T线则不显色，由此判定食品等检测样品没有志贺毒素。用原核表达的融合蛋白作为免疫原制备单克隆抗体和多克隆抗体，通过胶体金标记物的层析移行是否在T线显色，来判定食品中等检测样品是否污染了产志贺毒素的大肠杆菌。

本发明检测对象单一且针对性强，准确率高。检测速度快，所需时间短，只需5-10分钟、不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足出入境、海关等检验部门快速、正确地诊断该毒素的要求，并且便于基层推广和运用，从而从源头上控制志贺毒素对人和动物的毒害，减少经济损失。

附图说明

图1为本发明实施例用试纸条的结构图

图2为本发明实施例试纸条的阳性结果图

图3为本发明实施例试纸条的阴性结果图

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等在《分子克隆实验指南》(纽约：Cold Spring Harbor LaboratoryPress冷泉港实验室出版社，2001)和朱立平、陈学清在《免疫学常用试验方法》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实例首先将大肠杆菌0157进行聚合酶链式反应扩增，获得目的片断，再将目的片断与载体质粒谷胱甘肽S-转移酶(GST)连接，得到融合表达质粒，并导入大肠杆菌BL21表达，获得一个分子量为34KD的融合蛋白，该融合蛋白经过GST纯化试剂盒进行纯化，得到纯度较高的目的蛋白；将该蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔和BALB/C小鼠分别制备多克隆抗体和单克隆抗体并进行纯化；用1％的柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金，用此胶体金来标记纯化的多克隆抗体蛋白；按金标多克隆抗体、单克隆抗体、羊抗兔多克隆抗体喷涂金标垫、检测线(T线)、质控线(C线)，然后组装成试纸条，置37℃烘箱烘干，存放4℃冰箱保存备用；检测时，将试纸条的测试端插入装有样品液的样品缸里，试纸条平放，5-10分钟观察结果。

实施例

1、免疫原的制备

大肠杆菌0157的Stx2B的克隆

用碱裂解法提取大肠杆菌0157基因组DNA。根据大肠杆菌0157的Stx2B基因保守序列设计引物进行聚合酶链式反应扩增，扩增后连接到GST载体并测序，根据测序结果扩增删除信号肽的基因序列，设计上游包含EcoRI限制性酶切位点和下游包含XhoI限制性酶切位点的引物，进行聚合酶链式反应扩增。其反应条件为94℃3min预变性，94℃30s，58℃30s，72℃30s 35个循环，最后72℃延伸10min。

引物序列如下：

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P2：5’-ccgctcgaggcctcagtcattatt-3’

Stx2B的表达载体的构建

用EcoR I和Xho I酶切上述聚合酶链式反应产物，然后酶切产物和GST，T4 DNA连接酶(Takara公司)16℃连接12h连接产物转入大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，提取质粒，用EcoR I和Xho I酶切鉴定，将鉴定呈阳性的融合质粒测序，结果显示所扩增序列与GenBank上的登录号为AB168110.1、AF291819、AB071845.1的大肠杆菌0157:H7的Stx2B亚单位同源性达到98％。经过聚合酶链式反应后，所扩增的序列是大肠杆菌0157的Stx2B亚单位。

目的蛋白的表达及鉴定

将所鉴定过的阳性重组质粒，转入大肠杆菌BL21中，挑取1个菌落接种5ml氨苄青霉素的LB培养基过夜培养，取50μl过夜培养菌液接种50ml氨苄青霉素LB培养基，37℃250rpm/min培养2～3h至OD₆₀₀为0.6左右，加异丙基巯基半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mMol，温度约30℃，振摇为150rpm/min(转/分)4小时后，收集菌液。用12％的浓缩胶和5％的分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶成像系统显示34KD处有明显的条带，与预期的条带相吻合，而对照组没有此条带，表明目的蛋白已表达。

2、多抗的制备

将GST亲和层析试剂盒(申能博彩)纯化后的融合蛋白于PBS中透析42h-72h后根据标准曲线算出其浓度然后稀释作为免疫原。

将约0.5mg/只的纯化蛋白与等量的弗氏不完全佐剂乳化完全，新西兰大白兔背部皮内多点免疫，每次免疫前耳沿静脉采血，用间接酶联免疫反应测效价，效价达到后颈动脉采血，采用硫酸铵分级沉淀和亲和层析法纯化采集的血清。

3、单抗的制备

将抗原与等量的弗氏完全佐剂(上海生工)充分乳化，皮下注射免疫8周龄BALB/C小鼠，每只0.3ml；再次免疫：三周后，改用弗氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量，进行二免。加强免疫：三周后，腹腔注射，不加佐剂的抗原0.3ml，于免疫5天后眼底静脉采血测效价，效价达到1∶10000以上时处死小鼠，取其脾脏，与骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞来大量制备小鼠腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法纯化腹水。

4、胶体金的制备

先将100ml的0.01％HAuCl₄溶液加热至沸腾，迅速加入1ml的1％柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的酒红色，最后加三蒸水至100ml，就这样制备了40nm的胶体金溶液。然后用电镜镜检，确保制备的金颗粒尽量使其大小一致，均匀，颗粒直径在40nm左右，否则重先制备。

5、多克隆抗体的标记

待标记的抗体蛋白用0.005mol/L的氯化钠溶液透析48小时除盐，然后用制备好的40nm的胶体金来标记多克隆抗体蛋白。具体步骤为：①用0.1mol/LK₂CO₃调节金溶液的pH为9.0。②于100ml金溶液中缓慢加入的抗体蛋白溶液8mg(体积为2～3ml)，缓慢搅拌1小时，使其充分结合。③加入10％牛血清白蛋白溶液至终浓度为1％，通过加入大分子蛋白来稳定金溶液。④于8000g离心1小时，小心吸去上清液(切忌倾倒)。⑤将沉淀缓慢悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/mlBSA的50mMol/LTris缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，反复3次，以除去杂质，最后一次将沉淀溶于原体积的1/10同一缓冲液中，加入0.5mg/mL叠氮钠至终浓度0.02％(质量体积百分比)防腐，置4℃保存备用。以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。

6、胶体金试纸条的组装

将标记好的多克隆抗体蛋白喷涂到金标垫上，喷涂单克隆抗体到T线，喷涂二抗到C线，然后组装好试纸条，37℃烘箱干燥，置4℃冰箱保存备用。试纸条的组装顺序如附图1，由下到上的顺序为1为塑料底衬、2为黏合剂、3为硝酸纤维素膜、5为对照线、4为检测线、6为样品垫、7为金标垫、8为吸水垫、9为保护膜。

7、胶体金试纸条的使用及结果判定

把试纸条的测试端插入装有待检液体的样品缸里(不能超过Max线)，由于毛细效应，液体的层析方向向上，若待检液中含Stx毒素，当待测液进入测试端时，由于毛细效应往前移动，Stx2毒素与金标垫上的金标多克隆抗体(Au-Ab)形成Au-Ab-Stx二联复合物，复合物在NC膜上继续层析泳动，与检测线(T线)的单克隆抗体结合形成McAb-Stx2-AuAb三联复合物，并被固定在T线的单克隆抗体截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的Stx2-Ab复合物由于层析作用，继续迁移向前，与固定在质控线(C线)上的羊抗兔多克隆抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带，进行定性判定；根据检测线显色深浅程度来大概判定检测到的毒素量的多少，属于半定量，然后再结合酶联免疫试验进行定量。如附图2。

若待测液不含Stx2毒素，金标垫的金标兔抗多克隆抗体继续向前移动，则不能结合与检测线(T线)的单克隆抗体，因此也不能截留金标兔抗多克隆抗体，金标多克隆继续层析向上，与固定在质控线(C线)上的羊抗兔多克隆抗体结合形成二联复合物而被截留下来，形成可见的棕红色条带，如附图3。

由上述实施例可以看出，本发明直接可对样品检测大肠杆菌所产志贺毒素，同时不需要专门培训，一般人员很方便的即可操作，5～10分钟就可出结果，从而达到快速、简便、及时地检测该毒素的目的。

Claims (10)

1.一种用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征在于，先将大肠杆菌的志贺毒素的B亚单位进行基因扩增，获得目的片断，将该片断与载体连接，得到重组表达质粒，导入大肠杆菌表达，获得融合表达的Stx2B融合蛋白，纯化该融合蛋白，将纯化后的融合蛋白用于制备单克隆抗体和多克隆抗体，用胶体金标记多克隆抗体，将其作为示踪标记物，在检测线、质控线与相应的抗原抗体发生特异性结合被截留而显色，根据检测线、质控线显色与否来判定阴阳性结果。

2.根据权利要求1所述的用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征是，包括如下步骤：

①通过聚合酶链式反应扩增大肠杆菌的Stx-2B亚单位基因；

②将步骤①所得的扩增的大肠杆菌Stx-2B亚单位基因通过酶切和连接插入到带有谷胱甘肽S-转移酶的融合表达载体pGEX，构建重组表达质粒pGEX-Stx2B，将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21中，异丙基巯基半乳糖苷诱导表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，鉴定为分子量34KD的融合蛋白；

③用步骤②表达的融合蛋白与等量的弗氏不完全佐剂乳化完全，新西兰大白兔背部皮下多点免疫，每次免疫前耳沿静脉采血，用间接酶链免疫吸附试验测效价，效价达到1∶10000以上时，颈动脉采血，采用硫酸铵分级沉淀纯化采集的血清；

④用步骤②表达的融合蛋白与等量的弗氏完全佐剂乳化完全，脾下注射免疫8周龄BALB/C小鼠，每只0.3ml；三周后，改用弗氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量，进行再次免疫；三周后，腹腔注射，用不加佐剂的抗原0.3ml进行第三次加强免疫，于免疫5天后眼底静脉采血，用间接酶链免疫吸附试验测效价，效价达到1∶10000以上时处死小鼠，取其脾脏，用于细胞融合，用间接酶联免疫吸附试验方法筛选阳性杂交瘤细胞，通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞来大量制备小鼠腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法纯化腹水；

⑤用质量体积百分比为0.01％的柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金，待标记的抗体蛋白用0.005mol/L的氯化钠溶液透析除盐，然后用制备好的40nm的胶体金来标记Stx-2B亚单位重组融合蛋白的多克隆抗体蛋白；

⑥将标记好的多克隆抗体喷涂到金标垫上，Stx-2B融合蛋白的单克隆抗体喷涂到检测线，羊抗兔多克隆抗体喷涂到质控线，然后组装好试纸条，37℃烘箱干燥，在4℃保存备用；

⑦待检样品的处理，即采集来的被检样品用胰蛋白大豆培养基增菌培养后无菌管中备用；

⑧把试纸条的测试端插入装有待检液体的样品缸里，不能超过Max线，由于毛细效应，液体的层析方向向上，与固定在检测线、质控线上的抗体发生结合被截留而显色，根据检测线、质控线的显色情况判定阴阳性结果。

3.根据权利要求2所述的用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征是，步骤①中，所述聚合酶链式反应，其反应条件为94℃ 3min预变性，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s 35个循环，最后72℃延伸10min；

引物序列如下：

P1：5’-cccgaattccggcggattgcgcta-3’

P2：5’-ccgctcgaggcctcagtcattatt-3’。

4.根据权利要求2所述的用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征是，步骤③中，所述融合蛋白，由重组表达菌进行表达，其重组菌的增菌OD₆₀₀为0.6，IPTG(异丙基巯基半乳糖苷)的终浓度为1mMol，其表达条件为温度30℃，振摇为150rpm/min 4小时。

5.根据权利要求2所述的用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征是，步骤⑤中，所述胶体金颗粒的制备，具体为：先将100ml的0.01％HAuCl₄溶液加热至沸腾，迅速加入1ml的1％柠檬酸三钠水溶液，加热，煮沸7～10min出现透明的酒红色，最后加三蒸水至100ml，制备得到40nm的胶体金溶液，对制备得到的40nm胶体金溶液用电镜镜检，确保制备的金颗粒大小一致，均匀，颗粒直径在40nm左右，否则重先制备。

6.根据权利要求2或5所述的用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征是，步骤⑤中，待标记的抗体蛋白用0.005mol/L的氯化钠溶液透析48小时除盐。

7.根据权利要求2或5所述的用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征是，步骤⑤中，所述用制备好的40nm的胶体金来标记多克隆抗体蛋白，具体为：标记前用0.1mol/L K₂CO₃调节金溶液的pH为9.0，再缓慢加入抗体蛋白8mg缓慢搅拌结合1小时，然后加入10％牛血清白蛋白至终浓度1％来稳定胶体金溶液，8000g离心1小时，弃上清，再用50mMol/LTris缓冲液恢复，反复3次，以除去杂质，最后将沉淀溶于原体积的1/10同一缓冲液中备用。

8.根据权利要求2所述的用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征是，步骤⑦中，所述待检样品的处理，具体：从食品、动物性制品采集来的被检样品用胰蛋白大豆培养基增菌培养37℃4h，12000转/分钟离心5分，其上清转移到5ml的无菌管中备用。

9.根据权利要求2所述的用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征是，步骤⑧中，若待检液中含Stx2毒素，当待测液进入测试端时，由于毛细效应往上移动，Stx2毒素与金标垫上的金标兔的多克隆抗体Au-Ab形成Au-Ab-Stx2二联复合物，复合物在NC膜上继续层析泳动，与检测线的小鼠的单克隆抗体结合形成McAb-Stx2-Au-Ab三联复合物，并被固定在检测线的单克隆抗体截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合的Stx2-Ab复合物由于层析作用，继续迁移向上，与固定在质控线上的羊抗兔多克隆抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。

10.根据权利要求2或9所述的用胶体金免疫层析试验检测大肠杆菌志贺毒素的方法，其特征是，步骤⑧中，若待测液不含Stx2毒素，金标垫的金标兔的多克隆抗体继续向前移动，则不能与检测线的小鼠的单克隆抗体结合，因此也不能截留金标兔的多克隆抗体，金标多克隆继续层析向上，与固定在质控线上的羊抗兔多克隆抗体结合形成二联复合物而被截留下来，形成可见的棕红色条带。

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