JPH02502121A - ブドウ球菌性乳腺炎診断試験方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ブドウ球菌性乳腺炎診断試験方法 皮血豆上 本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　）に特異的な乳房内感染（乳 腺炎）検定法に関する。

１１韮ｌ 黄色ブドウ球菌（江肚■旦匹匹胚ａｕｒｅｕｓ　）　ハヒト及び動物の重要な病 原体の一つである　（２８，２９）、酪農家畜において、それは乳腺炎の原因と して最も多いものであり（１２）、乳腺炎は米国における食品生産動物の疾病と して最も経済的被害の大きいものである（２２１．黄色ブドウ球菌は、感染ウシ に保持され、抗菌剤的治療によっては通常乳腺から根絶することはできない（１ ０１，従って、継続的に感染しているウシは重要な保菌源であり、病原菌を撒き 散らすことは他のウシに感染を広めることに寄与する＋２２１゜ ウシ乳腺炎は、ウシの乳腺又は乳房の炎症である。

乳腺炎は黄色ブドウ球菌によって引き起こされることが最も多いが、ストレプト コッカス・アガラクチアエ（鎚匡吐＝三と肱虹匹Ｕと）、シュードモナス属細菌 （ムｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ、ｌ　、ある種の大腸菌及びマイクプラズマを 包含する他の多くの生物によっても引き起こされる。

乳腺炎によって乳房が損傷を受は乳の生産量が落ちる。

従って、乳腺炎は酪農業に経済的な負担を与えている。

乳腺炎の病因は複雑であるので、病原菌が同定されるまでは最も有効な治療方法 は明らかではない、病原菌の同定は通常、商業的には病原菌を培養し、従来の分 類操作によって分類することによって行なわれている。

黄色ブドウ球菌は、免疫学的には極めて複雑であり、種々のブドウ球菌性抗原が 、乳又は血清中でのブドウ球菌性抗体を検出するための免疫分析における指標の 候補として研究されている。これらの抗原には、プロティンＡに対する抗体（リ ブとラヌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　９６＝１４−２３　（１９６８） を参照）、エンテロトキシン（フエイら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、、　１９：３４−３８　（１９８４）参照）、ヘモリシン（スペンサーとフ ァツクレル、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９：３９４−９８（１９８４）参照）、オプデベー クら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、、　４３：１７７０−７５１１９８２ ）　）　、クリステンソンら、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５ｃａｎｄ、。

Ｓｅｅ　Ｂ、　９１：３５１−５６　（１９８３）、粗莢膜抗原（オブデペーク とノルクロス、Ａｓ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ＋、、　４６：１５６１　（１ ９８５１”照）、ワトソンとデービーズ（Ｒｅｓ、　Ｙｅｔ、　Ｓｃｉ、　１９ ８５゜３９：５２−５８参照）、食菌（マチジンら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ。

Ｒｅｓ、、　４５：２５１ｇ−２４（１９８４）　参照）、ティコ酸（グランス トロム、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１７：６４０−４６　（１ ９８３）　参照）、ペプチドクリカン（クリステンソンら、　Ｊ、、Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９：６８０−８６　（１９８４）Ｉ照）、リューコ シジン（ロエフラーとノルクロス、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、、　４ ６：１７２８　（１９８５＋参照）及びヌクレアーゼ（ガラディング。

Ａｃｔａ、　Ｖｅｔ、　５ｃａｎｄ、、　２１：１−１４　（１９８０１が包含 される。

慢性的に黄色ブドウ球菌に感染しているヒト患者は、診断の目的のために用いる ことができるブドウ球菌性抗原に対する抗体を有している（８，９．１１．１３ ．１９．２９．３３）、異なる抗原及び試験様式を用いる数種類の試験が記載さ れているが、最も一般的な試験方法は、黄色ブドウ球菌に特異的なティコ酸に対 する抗体を検出することである（２９．３３）。

ウシの乳腺分泌物は、診断に用いられる可能性がある、血液及び他の局所的部分 由来の免疫グロブリンを含んでいる（５．７．２４．３１）、さらに、多くの研 究者により、黄色ブドウ球菌による乳腺の感染及び／又は黄色ブドウ球菌による 免疫化及び／又は黄色ブドウ球菌抗原による免疫化によって、血液及び母乳中に 検出することができる特異的な免疫グロブリンが誘起されることが示されている （１５．８．２０．２１．２５．２６．３０．３２）。

ノークロスとオブデベークは、米国特許第４．４２５．３３０号において、黄色 ブドウ球菌！！ｏｏｄ４６株を用いてブドウ球菌性アルファヘモリシンを生産し 、それをカルター、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　９２：１６５５−６２　（ １９６６１の方法によって粗精製している。この製剤は次いでＥＬＩＳＡの試薬 として用いられた。

我々の発明はノークロスとオプデベークの発明とは、分子量が１８０００ないし ２６００Ｇダルトンの高度に精製された抗原を用いると言う事実によって区別さ れる。これを抗原として用いる意義は、この抗原に結合する抗体が黄色ブドウ球 菌に感染した殆ど全てのウシの母乳中に存在し、感染していないウシの母乳中に はそのような抗体は存在していないことにある。抗原製剤は、アルファ又はベー タヘモリシン活性を有さず、有意量の多糖類を含まない。

我々の発明と同じ目的のために役立つ唯一の市販のものは細菌培養物である。こ れを用いる一方法の不利益は次の通りである。１）この方法では生きた細菌のみ が検出されるので、抗生物質残渣によって検出が妨害されるおそれがある、２） 汚染のために検出結果がしばしば正確ではなく、従って滅菌試料を準備する必要 がある、３）手間と時間がかかる。４）本発明に比べて１試料当りのコストが１ ０倍かかる。我々の知る限り、母乳中のいずれかの抗体を検出するためのＥＬＩ ＳＡのキットは市販されていない。

ブドウ球菌タンパク質抗原のいくつかのものの分子量は以下の通りである。アル ファヘモリシン（３６０００１、ベータへモリシン（３３，０００）　、ガンマ ヘモリシン（４５０００１、リューコシジン（３１０００１，エンテロトキシン Ａ　（３４７００１、エンテロトキシンＢ　（２８，３６６１、エンテロトキシ ンＣ（３４，１００）　、エンテロトキシンＣ１（３４０００１，エンテロトキ シンＥ　（２９６００１，エンテロトキシンＦ　（２００００）、プロティンＡ 　（４１０００）、モルビー、−５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ　ａｎｄ　５ｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”ｐｐ、６４４−６４５　（Ｅ ｓｍａｎ　ａｎｄ　Ａｄｌａｍ編、　１９８３．　ｖｏｌ、２　参照のこと。

犬１目１１示 臨床診断のために用いることができる乳腺的感染の鋭敏で特異的な試験方法を開 発するために、我々は、感染ウシの母乳中の抗体に結合することができるが、非 感染ウシの母乳中の抗体とは免疫学的に反応しないということを基準にして黄色 ブドウ球菌の抗原を選択し、精製キソプロテイン（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎｌを分 子ふるい及び５ＯＳ−ＰＡＧＥにより精製した。黄色ブドウ球菌が乳腺的感染を したウシは母乳中にこの１４〜２６ｋｄのエキソプロティンに対する抗体を有し ていた。対照的に、乳腺的感染をしていないウシの母乳は、産後３０日以上たっ た後に採取し、かつ毎日１３．６　ｋｇ以上の母乳が生産される場合には、これ らの抗原に対する検出可能な抗体を、もしあったとしてもほとんど含んでいなか った。

これらのタンパク質は、母乳中に存在する場合には黄色ブドウ球菌による乳腺的 感染を示す抗体を検出するための酵素免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡＩに都合良く用 いることができる。

このような分析によると、感染ウシに対して適切な治療を施すことが可能になる 。なぜなら、この分析では、乳腺炎が例えばストレプトコッカス・アガラクチア エやマイコプラズマが病原菌の場合には陽性にはならないからである。

請求の範囲は、好ましい態様を列挙するものとしで、この明細書に組み入れられ たものとする。

１１匹！皇皇１ａ 第１図ニゲループＡ（黄色ブドウ球菌感染、ｎ＝３０）　、Ｂ（非感染ｎ　＊３ ７）、ｃ　（ｉｓｏｏｏｏ以上の体細胞で感染ｎ　・９）からの体細胞数に対し てプロットした試料の吸光度第２図：母乳中での日数に対してプロットした非感 染ウシ（グループＢ、Ｃ及びり、ｎ・６９）からの試料の吸光度 第３図：母乳生産量に対してプロットした非感染ウシ（クループＢ、Ｃ及びＦ、 ｎ・５３）からの試料の吸光度 第４図二分子量標準物質（レーンＡ）、セファデックスＧ−２００クロマトグラ フイー後の黄色ブドウ球菌エキソプロティンの５ＯＳ−ＰＡＧＥの銀染色（レー ンＢ）及び母乳中の抗体を検出するためのＥＬＩＳＡに用いた１４〜２６ｋｄの 溶離物（レーンＣ）。

るための　　のン態 先ず、ＥＬｆＳＡにより、１２種類の母乳試料（黄色ブドウ球菌陽性　４種類、 コアグラーゼ陰性ブドウ球菌陽性　４種類、非感染　４種！Ｉ）を用いて黄色ブ ドウ球菌エキソプロティンをスクリーニングした。黄色ブドウ球菌陽性動物から の母乳は、分画していないエキソプロティンと反応する抗体を含んでいた（表Ｉ Ｃ）、ｔ、かしながら、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染ウシからの２つの母乳 試料と、非感染ウシからの１つの試料は反応する抗体を有しており、　０．１０ ０を起える吸光度が得られた。黄色ブドウ球菌感染ウシからの母乳抗体が、他の グループからの母乳抗体とは異なる抗原を認識していたものと仮定すれば、エキ ソプロティンは、Ｇ−２００セフアデツクスカラム及び５ＯＳ−ＰＡＧＥを用い て分画化されたことになる。

ブドウ　　エキソプロティンの−′ アメリカン・クイブ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ１０８３２）から得 た黄色ブドウ球菌の１ｌｏｏｄ−４６株を肉汁中又は血液寒天基体（Ｄｉｆｃｏ 社製）上で凍結して保持する。　Ｗｏｏｄ−４６の一夜培養物（ｃｃｙ培地中で 生育）６００μｌを、４０ｇのカゼイン加水分解物、ｌＯｇの透析酵母抽出物、 ２０ｇのベータグリセロリン酸ナトリウム、１０ｍ１の５０％乳酸ナトリウム、 １ｇのＮａｔＨＰＯ４・Ｈ，０，１ｇの（ＮＨ４１Ｓｏ、、８０ｍｇのＤＬ−） リブトファン、１００　Ｂのし一システィン及びｄＨ，ｏ残部から成る１２のＣ ＣＹ液体培地に加えた。これを１５ＰＳＩの圧力下で３０分間オートクレーブに かけた。２０■ｇのチアミンと４０■ｇのニコチン酸を１００ｍ１のｄＨ１ｏ中 に含む溶液（予め別途にオートクレーブにかけておく）のｌＯ＋１をこれに加え る。この大体積の液体に、０．２ｇのＭｇ５Ｏａ・７Ｈ，Ｏｌｏ、１ｇのＭｎ５ Ｏ，・４Ｈ，０，０，０６ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ，０及び０．０６　ｇのクエン 酸を１００１１のｄＨ！０中に含む、微量元素溶液（別途オートクレーブしたも の）の１０ｍ１を加える（ウッデン・エイ・ダブリュ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、　Ｊ、　７３：　２２５−２３７゜１９５９）　、細菌は好気的条件下で２ ４時間ないし４８時間、振盪下又はフィルターを通した空気をバブリングしなが ら培養する。培養物は、血液寒天上に画線することによってその純度を調べる。

コアグラーゼ活性及びラテックス凝集（プロトロンビン／ＩｇＧ被覆）及びグラ ム染色を、継代培養物について行なう、　１５００　ｘ　ｇ、２０分間の遠心に よってＣＣＹ培地から細胞を除去し、上清を保持する。

Ｗｏｏｄ−４６は好ましい菌株であるが、他の菌株も用いることができ、特に興 味の範囲内で乳腺炎を引き起こすの野生菌株のうち、我々は、「アルファトキシ ン」単離物及び［ベータトキシン単離物」からのエキソプロティンと、Ｗｏｏｄ 　４６菌株のエキソプロティンとを、我々のＥＬＩＳＡにおいて抗原として比較 した。異なるエキソプロティンの相対生産量を変化させ、あるいは培地からのタ ンパク質の精製を単純化するかもしれない他の培地を用いることもできる。

１４〜２６　ｋｄエキソプロティンの　１Ａ、濃縮及び限外ろ過 上記上清に、フェニルメチルスルホニルフロリド（０，１３Ｍアセトン中）を終 濃度１　ｍ旧こ、Ｎ−アルファーｐ−トシル−１−リジンクロロメチルケトン粉 末を終濃度０．１ｍＭに加える。プロテアーゼ阻害剤、０．Ｏ１■閏フェニルメ チルスウルホニルフロリド、　０．００１　ｍＭＮ−アルファーＰ−トシルー１ −リジンクロロメチルケトン、０゜０５■（エチレンジニトリロ）−四酢酸にナ トリウム塩）及び０．０５　ａＭヨードアセトアミドを含む、５０−ＭＴＲｌ５ 緩衝液ｐＨ８，０に対する透析あるいは換気室中での蒸発による濃縮とにより、 透析チューブ内（１０ｋｄカットオ））の体積が初めの体積の約ｌ／３０になる まで緩衝液を５．６回交換する。透析チューブ内の溶液を１５００　ｘ　ｇで３ ０分間遠心し、上清を０．２０ｕ−フィルターを介してろ過する。

Ｂ、ゲルろ迦クロマトグラフィー １．４７　Ｂ／ｍｌのタンパク質（３）を含む試料（３８ｍｌ）を、セファデッ クスＧ−２００が充填された５００ｍ１のカラム（シグマ・ケミカル社、ミズリ ー州セント・ルイス）上にのせ、プロテアーゼ阻害剤を含む０．１５Ｍリン酸緩 衝食塩水ｐＨ８，０水で平衡化した。４ｍＭの画分な集め、後述のように酵素免 疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）で分析し、３１６ｍ１と３７６曹ｌの間に溶離する物 質から成るプールを得た。このプールを透析チューブ中に入れ、１ｍｇ／ｍｌの タンパク質を含む約６．５　＋ｍｌの体積になるまで蒸発により濃縮した。

５つの連続的な抗原プールを作り、１２種類の母乳試料に対してＥＬＩ　ＳＡに より試験した（表２）、５っのプールは全て、黄色ブドウ球菌感染ウシからの母 乳中の抗体と反応した。得られた吸光度は非分画エキソプロティンについて得ら れる吸光度よりも低かった。しかしながら、３１６■ｌないし３７６■ｌの画分 において、非感染と感染ウシとの差が最も大きかった。

Ｃ，５ＤＳ−ＰＡＧＥ セファデックスＧ−２００カラムからの材料の一部を、１５％ポリアクリルアミ ド分離ゲル及び５％積層ゲル（１７）を含む１．５−簡の鉛直スラブゲル装置（ ホエッファー・サイエンティフィック社、カリフォルニア州すンフランシスコ） 中で、ドデシル硫酸ナトリウムを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動（５Ｏ Ｓ−ＰＡＧＥ）　　（バイオラド社、カリフォルニア州すッチモンド）にかけた 。

抗原溶液（０，２５−ｇ）を５０　ｍＭ　ＴＲｌ５緩衝液ｐＨ８，０でｌ■ｌに 希釈し、還元剤として２−メルカプトエタノール（シグマケミカル社、ミズーリ 州セントルイス）を含む等容の試料緩衝液と混合し、煮沸した。予め染色した標 準タンパク質（リゾチーム１４．３　ｋｄ　、ベータラクトグロブリン１８．４ 　ｋｄ　、アルファーキモトリプシノーゲン２５．７ｋｄ　、オバルブミン４３ ．Ｏｋｄ　、ウシ血清アルブミン６８．０ｋｄ　、ホスフォリラーゼＢ９７．４ 　ｋｄ　、マイオシン（Ｈ−鎖）　２００．Ｏｋｄ　（ペセスダ・リサーチ・ラ ボラトリーズ、メリーランド州ガイザースバーグ）を別々のレーンの端において 同時に泳動した。電源は１３０Ｖ、２０ｍＡであり、染料が分離ゲルの頂部から １０ｃｍの位置に来るまで泳動を行なった。

７つの水平の小片（６ｖ■幅）を１４．３　ｋｄの標準物質の中間から上に向か って切り出した。この７つの小片を６ｍＭの緩衝液と共に透析チューブ内に起き 、ゲルの長手方向に垂直な方向に３０Ｖ、７５〜１００＋ｓＡで３時間電気泳動 した。チューブ内及び室内の緩衝液は。

０．１９２　Ｍグリシンを含む２５ｍＭＴＲｌ５緩衝液ｐＨ８，０（ジェイ・テ ィ・ペイカー・ケミカル社、二ニーシャーシー州フィリップスバーグ）。

濃縮エキソプロティン、Ｇ−２００溶離物及びＰＡＧＥ−ＳＤＳ電気溶離物につ いて、ＥＬＩＳＡにより、母乳試料を用いて反応性を調べた。スチレンマイクロ タイタープレートであるイムロン１　（ダイナチック・ラボラトリーズ社、バー ジニア州チャンチリ−）の１２のウェルを０．０５■１の抗原で３７℃、３時間 被覆した。エキソプロティン及びＧ−２００溶離物は、ウェルを被覆するために 。

０．１Ｍ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液ｐＨ９，６で希釈し、ＰＡＧＥ−ＳＤＳ溶難 物は上記した電気溶離緩衝液で希釈した。

ウェルは、０．２％アジド及び０．５％Ｂ　Ｓ　Ａ　（シグマ・ケミカル社、ミ ズーリ州セントルイス）を含む０．０５　ｍｌのＰＢＳで、３７℃、２時間ブロ ックした０次いでプレートを０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０　（ジェイ・ティ・ ペイカー・ケミカル社、二ニーシャーシー州フィリップスバーグ）を含むＰＢＳ で３回洗った。４つの黄色ブドウ球菌感染ウシからの母乳と、４つのコアグラー ゼ陰性感染ウシからの母乳と、４つの非感染ウシ（後述のように血液寒天上での 培養で陰性）からの母乳を、０．２％アジド、０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔ ｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳで１：２に希釈し、それぞれの０．５　ｍｌをそれ ぞれの小片に対応する１２個のウェルのそれぞれに加えた。プレートを３７℃で ３０分間インキュベートし、上記と同じ緩衝液で４回洗った。セイヨウワサビパ ーオキシダーゼ標識抗ウシ１ｇＧ１．＊（ブイ・エム・アール・ディ社、ワシン トン州プルマン）を、０，５％ＢＳＡ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢ Ｓで１　：　５００に希釈したものの０．５　ｍｌをそれぞれのウェルに加え、 ３７℃で３０分間インキュベートした。３回洗浄した後、５−アミノサリチル酸 （シグマ・ケミカル社、ミズーリ州セントルイス）を加え、室温で１時間インキ ュベートした。

吸光度は分光光度計によって４９０　ｎｍで測定した。

表３には、ＰＡＧＥ−ＳＯＳ小片からの７つの選択溶離物の反応性が示されてい る。黄色ブドウ球菌感染ウシの最も強い反応性と他の２つのグループのウシの最 も弱い反応性は、１４〜２６ｋｄの見掛は分子量範囲内に存在した。

黄色ブドウ球菌感染ウシからの母乳試料と反応した際に最も高い吸光度を示し、 コアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染ウシ及び非感染ウシからの母乳試料に対して最 低の吸光度を示す溶離物を、下記に示すグループＡないしＦの母乳試料を試験す るための抗原として用いた。

抗原の精製は、限外ろ過、ポリエチレングリコール濃縮イオン交換又は塩析によ って行なうこともできる。

もしモノクローナル抗体、単一特異的ポリクローナル抗体又は他の高親和性の特 異的結合リガンドを生産することができれば（抗原はおそらく酵素活性を有する ので基質結合部位が存在する）、抗原は上清から直接免疫アフィニティクロマト グラフィー又はリガンドアフィニティクロマトグラフィーにより精製することが できる。

我々は、精製過程において、Ｇ−２００カラムに代えてＤＥＡＥカラムを用いる と、「活性画分」は１８〜３４ｋｄに現われることを見出した。この拡大は、黄 色ブドウ球菌のタンパク質分解酵素によって引き起こされる翻訳後の修飾に基づ くものであろう。

腺β　　　　　　　　イ　　１、としての１４−２６ＫＯとα゛ウ　素百　との 我々は、　Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　３株、ｗｏｏｄ　４６株、ａ毒素およびβ毒素 産生株から得たエキソプロティンの違いを区別できるか比較を行なった。下記に β毒素単離物を精製してウシ免疫グロブリンの３つの異なるアイソタイプを検出 したエキソプロティンを用いた最初のスクリーニングの結果（光学濃度）を示す 。

表ＩＡ 試験１（抗Ｃ＋） Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　　　コアクラ−ｆ陰性　　非感染感染　　　　　ブドウ球 菌感染 ０．２８２　　　　０．２２４　　　０．０２８０．０８３　　　　０．０２５ 　　　０．０５１０．３７５　　　　０．０１１　　　０．００４０．２５０　 　　　０．０５６　　　０．０７２試験　２　（抗Ｇ１１） Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　　　コアクラ−ｆ陰性　　非感染感染　　　　　ブドウ球 菌感染 ０、１２５　　　　０．０９９　　　０．００４０．０３８　　　　０．０２５ 　　　　Ｇ、０３３０．３４５　　　　０．０２１　　　−０．００３０．１２ ７　　　　０．０３５　　　０．０４０試験２（抗Ｇ、Ｉ Ｓ、　　ａｕｒｅｕｓ　　　　　コアクラ−ｆ　陰性　　　　非感染感染　　　 　１Ｆつ球菌感染 ０．３４２　　　　０．０３１　　　０．００８０．１９７　　　　０．０２６ 　　　０．０１５０．３４８　　　　０．０１９　　　０．００４０．０３５　 　　　０．０２８　　　０．００７α毒素単難物から精製したエキソプロティン を用いた最初のスクリーニングの結果を下記に示す。

表ＩＢ　　　　　　　　　抗Ｇ１ Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　　　コアクラ−ｆ陰性　　非感染感染　　　　ブドウ球菌 感染 ０．１２８　　　　０．０８１　　　０．０１６０．０２４　　　　０．００９ 　　　０．０４１０、１５８　　　　０．００９　　　０．００９０．０３３　 　　　０．０３３　　　０．０２４下記にエキソプロティン分画処理前のｗｏｏ ｄ−４６単離物を用いた最初のスクリーニングの結果を示す、抗原のみを変え、 その他の条件は全て一定である。

表ＩＣ 抗Ｇ。

Ｓ、　　ａｕｒｅｕｓ　　　　　コアクラ−ぞ　陰性　　　　非感染感染　　　 　１Ｆつ球菌感染 ０．４６１　　　　０．１８８　　　０．００９０．３１７　　　　０．０１６ 　　　０．０４６０．６０４　　　　０．００６　　　０．０１？０．４９９　 　　　０．１４５　　　０．１０９この時点で、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓに感染した 牛の全サンプルの応答は良好であり、また他の牛のサンプルのいくつかに穏やか な応答が見られたことから、　Ｗｏｏｄ−４６からの単離物を分画して、抗原特 性を有するフラクションを残し非特異性のものを取り除くとこが出来ると考えら れる。下記の表に前記した精製方法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により残ったものの効 果を示す。

表　　１０ 抗Ｇ１ Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　　　コアクラ−ぞ陰性　　非感染感染　　　　ブドウ球菌 感染 ０．３２８　　　　０．０３８　　　−０゜０１００．３３８　　　　０．００ ３　　　０．００２０．２４９　　　　−０．００８　　　−０．０１３０．３ ７７　　　　０．００４　　　−０．００４界ｒ２、−　　スクリーニング　る ためのミルク九Ｚズ上旦１量 ９　我々はＳ、　ａｕｒｅｕｓによる乳房的感染を起こした牛の分泌するミルク 中のＥＬＩＳＡ法により検出できる抗体が抗原調製にいられると考えた。

Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ群に広く共通した抗原を選択して試験の感度を良くし、また 充分特異な抗原を選択して試験の特異性を良くするためには、ミルクサンプルを 注意深く定義された二つのｉｉｉ！晴、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓによる乳房的感染を 起こした牛から取ったサンプルとその証拠がない牛から取ったサンプルとに分け る必要があることが分かった。

このために、体細胞数の計数および細菌培養をホルスタイン乳牛示らサンプリン グしたミルクについて１ケ月ごとに行なった。観察結果を下記にまとめると、Ｓ 、　ａｕｒｅｕｓが、しばしば体細胞数が上昇することなく１度または数回分離 された。他の研究者が認めるように（Ｄｏｄｄ、　Ｆ、　Ｈ，国際乳腺炎審議会 、１９８６．２月）、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓが体細胞数が上昇することなく牛のミ ルクサンプルから純粋に単利されても、それを乳房的感染の証拠とするには不十 分であることが明らかになった。このようなＳ、ａｕｒｅｕｓの単離は、明らか にヒトまたは回りからの混入によるものか乳腺からは離れた部分の感染いよるも のである。

ウシのあるものからはＳ、　ａｕｒｅｕｓが定期的に、ときどきは体細胞数が上 昇したままの状態で単離された。この現象はたぶんＳ、ａｕｒｅｕｓの感染の程 度が有機物が周期的に放出されるような低いもののためである。このような牛か らの培養は無理と考えられる。

更に１体細胞数は通常感染性のまだあるものや乳房的感染に成ると思われるもの を持つ牛では上昇すること（１５０，０００／謬１より多い）が分かっている。

乳房的感染を起こしていない牛の体細胞数は、通常１５０．０００／ｍｌより少 ない。

１つの研究に３つの異なるホルスタイン乳牛の群ｌ、２．３群からサンプリング したミルクを用いた。混成したミルクサンプルは集め、各サンプル５０ｓ＋１は １６　ｘ　１００−一の血液寒天プレートに広げた。続いて３７°Ｃで２４時間 培養し、コロニーの形態および瀉血パターンにより試験的にブドウ球菌性の単離 菌を同定した。ブドウ球菌でないものは更に確立された手順（ウシ乳腺炎診断用 微生物学的手順、第２版、国際乳腺炎審議会、１９８１、ＣａｒｔｅｒＰｒｅｓ ｓ、　Ｉｎｃ、、　Ａｓｅｓ、　Ｉｏｗａｌ　に従って同定した。すべての単離 したブドウ球菌は、ダラム染色しカタラーゼ及びコアグラーゼ生産性を調べた。

スタフ・トラフ・ストリップス（５ｔａｐｈ　Ｔｒａｃ　５ｔｒｉｐｓｌ　（Ａ 　Ｐ　１社、ニューシャーシー州プレインビュー）もまた全てのブドウ急菌の同 定のために行なわれた。マイコプラズマでについては試みなかった。

混成ミルクは培養し、体細胞数は過去１年間に渡って３群中乳が出ているものか ら毎月サンプリングし計数した。ミルク抗体テスト用に用いた各群におけるＳ、 ａｕｒｅｕｓ感染症の有病率は次の通りである。１群３．９％、２群１４．５％ 、３群４２．３％である。黄色ブドウ球菌について。

ＥＬＩＳＡにより、選択された母乳試料の、プールされたＰＡＧＥ−ＳＤＳ溶難 物抗原に対する抗体が存在するかどうかを調べた。３群のウシのサンプルは、５ つのグループに分けられた。

グループＡにはＳ、　ａｕｒｅｕｓによる乳腺内感染が認められたウシの３１サ ンプルが含まれる。これらのサンプルは少なくとも４か月間連続してＳ、　ａｕ ｒｅｕｓが検出されたウシからのものであった。抗体決定用のサンプルはＳ。

ａｕｒｅｕｓが検出された最初と最後の月を除いた培養陽性の月のものから選ん だ、グループＡの全てのサンプルは、体細胞数が１５０．０００／ｍｌより大き い、このグループの体細胞数は１６４．０００〜８．４９３．０００　ｃｅｌｌ ／ｍｌである。更に、グループＡすべでのサンプルは出産後３０日以上で１日当 たりのミルク生産量が１３．６　Ｋｇより多くなったときのものである。

グループＢはＳ、　ａｕｒｅｕｓによる乳房的感染の確証がないとされたウシか らの３７のサンプルを含む、これらのサンプルは乳を分泌している間にＳ、　５ ｕｒｅｕｓに感染しなかったウシから得られた。グループＢすべでのサンプルは 体細胞数が１５０．０００　ｃｅｌｌ／蒙１より少ない、これらのサンプルもま た出産後３０日以上で１日当たりのミルク生産量が１３．６Ｋｇより多くなった ときのものである。培養結果は次の通りである。　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｌ、　コア グラゼ陰性ブドウ球菌６、その他無し。

グループＣはサンプリングを行なった乳が出ている間にｓ、　ａｕｒｅｕｓに感 染しなかったウシからサンプリングしたものである。抗体とのテストを行なった サンプルは１５０．０００／＋＋＋１の体細胞を含む、この群における体細胞数 の範囲は１日当り１３．６　ｋｇよりもであり、ウシは産後３０日よりも大きか った。培養の結果は次の通りである。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌４．その他は 陰性。

グループＤは出産後３０日未満でサンプリングをおこなった乳が出ている間にＳ 、　ａｕｒｅｕｓが検出されなかったウシからサンプリングしたちの２３を含む 、これらのサンプル体細胞数は２９．０００〜１．７０Ｇ、０００　ｃｅｌｌｓ ／ｍｌである。

培養の結果は次の通りである。Ｓ、　ｕｂｅｒｏｕｓ　　１　、コアグラーゼ陰 性ブドウ球菌４、その他陰性。

グループＥにはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を少なくとも４か月間連続的に単離 したウシから得た６つのサンプルを含む、　Ｓ、　ａｕｒｅｕｓに対する抗体と のテストを行なったサンプルはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌が単離された最初お よび最後の１か月にはサンプリングしたものではない、ウシはサンプリングを行 なった時には産後少なくとも３０日で１日当たり１３．６　Ｋｇより多くのミル クが出ていた。このグループの体細胞数は３７．０００〜２６２．０００　ｃｅ ｌｌｓ／ｍｌである。

グループＦには、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓによる感染の確証がな（，１日当りのミル クツ生産量が１３．６　Ｋｇ以下であるウシからサンプリングしたもの７つが含 まれる０体細胞数ｒ！２４７．［１００〜２．２１１，０００　ｃｅｌｌｓ／＋ ＊ｌである。培養結果は次の通りである。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌１、その 他陰性。

フトウニ　　　　　にお番るＥＬＩＳＡ〜　とじてのエキソプロティン１４−２ ６　ＫＤ　　のテスト１４〜２６Ｋｄの溶出物は２つのＰＡＧＥ−ＳＯ３より得 られ。

グループＡ−Ｆのミルクサンプルとのテストに使われた。プールした抗原の希釈 は溶出緩衝液に１：１４の割合いで行なうのが最も好ましい、プールした抗原と 結合したミルクサンプルの種々のグループの抗体を図４に表わした。グループＡ 　（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ感染ウシ）は抗原に対する反応が最も強く、グループＢ が最も弱かった。これら２つのグループの光学濃度範囲は一致しなかった。

グループＣ（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ感染によらない体細胞の上昇）はＳ、　ａｕｒ ｅｕｓによる感染に関係なく抗原試料との反応性と体細胞数の上昇との間に相関 関係があるかどうかを観るためにテストを行なった。グループＡとＣの光学濃度 範囲は一致しなかった１図１はグループＡ、Ｂ、Ｃにおいて体細胞数と光学濃度 の関係が乏しいことを示している。

グループＤは最初の実験で発見されたので産後３０日未満のＳ、　ａｕｒｅｕｓ 　Ｋ性つシのミルクサンプルは抗原と反応するとされた。これらの発見はＳ、　 ａｕｒｅｕｓ陰性グループＢ、Ｃ，Ｄの吸光度を母乳中での日数（ｎｕｍｂｅｒ 　ｏｆｄａｙｓ　ｉｎ　５ｉｌｋｌ　に対してプロットした第２図に示されるデ ータによって確認される。産後３０日以内のウシからの７つの試料は、抗体反応 性の存在を示す０．１よりも大きな吸光度を示した。

コアグラーゼ陰性ブドウ球菌感染したウシのサンプル（グループＥ）はテストを 行ないこの感染により抗体が１４−２６　　Ｋｄ　Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ抗原と交 差反応を生じるかどうかを観た。グループＥとＡとの間には光学濃度の一致は認 められず、抗体との交差反応がほとんどないことが示された。

グループＦのウシのミルク生産量は１日当たり１３．６Ｋｇより少なかった。こ れらのサンプルの中には抗原に対する抗体がＳ、　ａｕｒｅｕｓによる乳房内感 染が明らかに認められないにもかかわらず検出された９図３に１日当たりのミル ク生産量に対するＳ、　ａｕｒｅｕｓ陰性グループＢ。

Ｃ，Ｆの光学濃度を示す。

産後３０日未満で乳房内Ｓ、　５ｕｒｅｕｓ感染の認められないウシのミルクに は抗原試料と結合する抗体が存在した。これらの結果から調整および産後の期間 にＩｇＧ＋が血液からミルクへ移行することが説明された　（５）、乳房内感染 を起こしていないウシの血液中にＳ、　ａｕｒｅｕｓの抗原に得意的な抗体が存 在するのは多分乳腺以外の場所でいろいろな感染あるいはＳ、　ａｕｒｅｕｓに よる感染が起きたためである。１日当たりのミルク生産量が１３．６　Ｋｇ未満 の無感染ウシ（グループＦ）のミルク中にＳ、　ａｕｒｅｕｓ抗原に特異的な抗 体が存在することは、乳房の退縮の間にＩｇＧ＋が血液から乳房分泌物に移行す ることにより説明されつる１３１１゜ コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に感染したウシのミルクサンプル（グループＥ）で はＳ、　ａｕｒｅｕｓ抗原に対する反応性に欠けるということはこの感染により Ｓ、　ａｕｒｅｕｓの１４〜２６　Ｋｄ外部抗原に対するミルク中に検出できる 抗体を誘導しないということである。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌はＳ、　ａｕ ｒｅｕｓと他の細菌に比べ非常に近い関係にあるので、この発見は単離した１４ −２６　Ｋｄ抗原の特異性を証明するものであろう。

更に、交差反応抗原の生産やＳ、　ａｕｒｅｕｓ抗体が血管から乳房分泌物中に 染み出るような血管損傷の機構の中で間違った負の反応を引き起こす他の微生物 の存在もあり得る。後者の状態は急性大腸菌型感染により起こる。この型の感染 症のウシの限られたサンプルからは間違った負の反応は観察されなかった。

Ｓ、　ａｕｒｅｕｓに感染したウシのミルクは対細胞数が高く、産後３０日を過 ぎ１日辺りのミルク生産量が１３．６Ｋｇを越える感染していないウシのほとん どは対細胞数が少ない１体細胞数が上昇しているＳ、　５ｕｒｅｕｓ￥Ｍ性のウ シの反応性の範囲は低い（０，００３−ｏ、ｏｓｔ）、不幸にも我々の基礎デー タは体細胞数の上昇した感染していない産後３０日を過ぎ１日辺りのミルク生産 量が１３．６　Ｋｇを越えているウシに関するものがほんのはずかしかない。

それにもかかわらず、その結果からＳ、　ａｕｒｅｕｓ感染を伴わない対細胞数 のみの上昇は、試験における間違った負の反応が原因ではない０体細胞数と体細 胞数が２、６０００．０００細胞／Ｉｌｌまで上昇したグループＡのサンプル（ Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ感染）の光学濃度との相関関係がないことを支持している（ 第１図）。

前記の１４−２６　Ｋｄ画分の抗原としての利用に加えて、これらのフラクショ ンのサブフラクションを用いること及び個々の蛋白質を精製し抗原特異的である と思われるものを選択することもこの発明の範囲内に含まれる。

ＰＡＧＥ−５ＯＳ溶出前の分子ふるいによるフラクションの銀染色は多数の蛋白 質が存在することを示している。

ＰＡＧＥ−３ＤＳで溶出されたＳ、　ａｕｒｅｕｓ感染ウシのミルクともっとも 反応性が高い蛋白質は、１４〜２６Ｋｄの間の非常に狭い範囲の分子量を有する ものであり、もっともよく見られるのは分子量１４−２６　Ｋｄの蛋白質である 。Ｓ。

ａｕｒｅｕｓの分子量１４−２６　Ｋｄの蛋白質には１分子量１３−１５　Ｋｄ のスタフィロキナーゼ　（２）、分子量１６．８　Ｋｄのヌクレアーゼ　＋１） 、分子量１８．ＯＫｄの発熱性の毒素Ｂ　　（２３１、分子量２０．ＯＫｄのエ ンテロトキシンＦ　　（２３１、分子量２１、ＯＸｄ　（７）　’）　ンバ球ミ トゲン１２３１　、分子量２６．ＯＫｄ　（７）γ毒素　＋２３１　、分子量２ ６．ＯＫｄのβ毒素　（２３）を含む多くの蛋白質がある。また、ヌクレアーゼ 　（１５）及びβ毒素　（２０）の未精製試料に対するミルク中の抗体について は報告されている。溶出中の蛋白質の本質や機能的な活性については抗原の分子 構造がそうであるように知られていない、銀染色されたタンパク質に炭水化物が 付随しているか否かを調べる試みはなされなかった。第４図のレーン３に示され る染色された抗原は、ＥＬＩＳＡプレートに付着したものであり、それに対して 母乳抗体が結合するものであると考えられる。感染に特異的な抗原がゲル中に見 当たらないことはあり得ることである。

もし抗原が亜単位または生成物や高分子の破損したものであることが分かれば、 またはもしここでいう抗原から抗原決定基が決定されれば、異なる抗原試料が発 見できた。モノクローナル抗体の技術を用いて、抗イデイオタイプ抗体は抗原を プレートに置くのに用いられる。特異的な抗原決定基の複製は、ペプチド合成ま たは発現ベクター内での抗原遺伝子コードの発現により行なわれる。

これらの抗原はまたＳ、ａｕｒｅｕｓ感染ウシのワクチン試料に利用される。

乳腺炎関連抗体のＥＬＩＳＡ法による分析必然的に同様の分析形式が我々が選択 した抗原を用いてミルクサンプルからの乳腺炎関連抗体のスクリーニングをする のにも、また予め確立された方法で試験を行なったミルクサンプルを使った分析 に利用可能なテスト抗原のスクリーニングにも用いられる。

β５　　　のＥＬＩＳＡ法による 必然的に同様な分析形式が、我々が選択した抗原を用いて乳腺炎関連抗体をミル クサンプルからスクリーニングするために、あるいはあらかじめ確立された方法 でテストされたミルクサンプルを用いて分析に利用できるテスト抗原をスクリー ニングするために用いられる。

本発明のＥＬＩＳＡ法において、抗原は外からの作用によってポリスチレンプレ ートに結合しミルクサンプルに接する。ミルク中の特異的な抗体がその抗原と結 合する。結合しなかった成分は洗浄して取り除き、ホースラディシュベルオキシ ダーゼで標識したアイソタイプに特異的な抗ウシ免疫グロブリン配合体を加える 。ペルオキシダーゼの基質が次に加えられて、その結果検出可能な生成物ができ る。

グイナテックイムロン１はプレートは抗原滴液０．０５■ｌを塗り３７＠Ｃで３ 時間反応させた後、アジド０．２％及びウシ血清アルブミン０．５％を含むＰＢ Ｓ溶液０．０５　ｍｌを加えて３７″Ｃで２時間反応させ１反応を止める。プレ ートはツイーン２０を０．０５％含むＰＢＳ溶液で３回洗浄する。ミルクサンプ ルはアジド０．２％、ＢＳＡ　０．５％、ツイーン２００．０５％を含むＰＢＳ 溶液で１＝２の割合に希釈し、その各０．０５■ｌをウェルに加える。プレート は３７°Ｃで３０分間培養したのち、前記と同様の緩衝液で４回洗浄する。抗ウ シ免疫グロブリンＧ１．２はＢＳＡ　Ｏ，５％及びツイーン２００．０５％を含 むＰＢＳ溶液で５００倍に希釈し、その溶液０．０５　ｍｌを各ウェルに加えて ３７°Ｃで３０分間培養する。洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、基質（５−アミ ノサリチル酸）を加える。光学濃度を分光光学的に波長４９０ｎｍで測定する。

ホースラディシュペルオキシダーゼが好ましい標識であるが、免疫検定で公知の 酵素標識でないものも含めた他の標識を用いることもできる。標識は直接抗抗体 にしても良いしまた。ビオチン−アビディン結合のような間接的な方法でも良い 、抗抗体はアイソタイプに特異的なものまたは単にウシ免疫グロブリンに特異的 なものが良く、免疫グロブリンに特異的であることが必要である。

抗体以外の抗体結合タンパク質は、抗抗体に置換される。検出形式は、結合した 成分と結合しなかった成分とが物理的分離を必要としないで区別できるように変 えることができる。

１８−２６　Ｋｄ　　原生産にｒ　る＊ｏｏｄ−４６とａ毒−産生　のＬ救 両株とも本発明で述べたように一定の条件下で成育し各棟から得た濃縮エキソプ ロティン（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）は前記検定法における阻害性を試験した。一 般的に、α毒素からの単離物はＷｏｏｄ−４６株から得られたものに比ベタンバ ク質ｌＩｇ当たりで５〜ｌＯ倍の阻害効果を有する。我々が試験したＳ、　ａｕ ｒｅｕｓ約３０株全てり阻害物質を作ると思われるが、α毒素産生株以外でＷｏ ｏｄ−４６よりも阻害性の強いものを作る株はない。

我々は、α毒素産生株から得たエキソプロティン（ｅｘ。

ｐｒｏｔｅｉｎｌ試料を用いて抗原精製法を行ない、活性を有するフラクション が分子量１８〜２６　Ｋｄの間にあり、最も活性の強いフラクションが１１ｏｏ ｄ０４６株のそれに比べ１８Ｋｄよりにあることを見出した。これはα毒素産生 株の重要な抗原がＷｏｏｄ−４６株のそれに比べ僅かに分子量が小さいのであろ う、しかしながら、それらが１ｌｌｏｏｄ−４６由来のタンパク質に対する抗体 の特異的な結合を阻害することから、抗原決定基は実質的に類似または同一であ ると推定される。

土ｍλ机月 前記の実施例は分子量により分画したＳ、　ａｕｒｅｕｓの抗原のミルク中の抗 体を検出するための利用に関するものであるが、血清や尿のような他の体液ある いは培地のような生物学的溶液中の同一あるいは類似抗体の存在をスクリーニン グするためにも用いることができる。さらに、その検定法はウシのブドウ球菌関 連乳腺炎の検出に特に適しているが、同じ（あるいは同様に選択されたが異なる ）抗原を用いて他の晴乳類特に人間のブドウ球菌性の感染症の検査にも用いるこ とができる。

表２　セファデックスＧ−２００マクリツクス１より溶出したＳ、　ａｕｒｅｕ ｓエキソプロティンフラクションの対するミ゛ルク抗体反応 溶出容量　Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　　　コアクラ−ｆ陰性　　培養陰性（閣ｌ）　　 感染ウシ１　　ブドウ球菌　　　ウシ感染ウシ １３６−２００　　０．２１９　　÷　０．１４０　０．１７７　　÷　０．１ ０７　０．０６０　　＋　　０．０６０２２４−２６４　　０．１５２　　＋　 　０．０７１　０．１１６　　÷　０．１２１　０．０８０　　＋　　０．０４ ３２６８−３１２　　０．１３９　　＋　　０．０６７　０．０５３　　＋　　 ０．０２１　０．０３８　　＋　　０．０２４３１６−３７６　　０．２８５　 　＋　　０．０６３　０．０４９　　＋　　０．０２１　０．０２７　４　０． ０１８３８０−５４４　　０．１２２　　＋　　０．０５３　０．０４Ｇ　　÷ 　０．０７０　０．［１２５＋　　０．０２８ａ：　全ての溶出物はコーチング 緩衝液で希釈して蛋白質濃度１０　ｕｇ／＋１にした ｂ＝　ウシ４匹の光学濃度の標準偏差値　（ｎ：４）表３　ポリアクリルアミド ゲルから溶出したＳ、　ａｕｒｅｕｓ抗原フラクションに対するミルク抗体のＥ ＬＩＳＡ反応性フラクションの　　　　Ｓ、　　ａｕｒｅｕｓ　　　　　　ボッ クラーゼ陰性　　　　培養陰性見掛けの　　感染ウシ　　　ブドウ球菌　　　　 ウシ分子量Ｋｄ　　　　　　　　　　　感染ウシ３４−３８　０．４７８÷０． １７８”　０．０２５◆０．０１３０．０６１÷０．０２３３０−３４　０．１ ５１÷０．１３６　０．００８＋０．０１１０．００６　＋　０．００４２６− ３０　０．２７５十０．１８３　０．００８　＋　０．００９０．００６÷０． ００６２２−２６　０．４２１　＋　０．１５０　０．００７÷０．００７０． ００５　＋　０．００４１８−２２　０．３４７　＋　０．１８２　０．０２０ 　＋　０．０１３０．０１９　＋　０．００３１４−１８　０．３０９　＋　０ ．０６６　０．０１８÷０．０１００．０１８÷０．００５＜１４　　０．０２ ３　＋　０．０２６　０．００３　＋　０．００４０．００５　＋　０．００６ 緩衝液　ｏ、　ｏｏｓ十０．００９　０．０００　＋　０．００４０．００２　 ＋　０．００２ａ：　ウシ４険体につき２溶出物の標準偏差値（ｎ・８）表４　 　ＥＬＩＳＡ法によるＳ、　ａｕｒｅｕｓの１４−２６　Ｋｄの抗原に対するミ ルクサンプル中に分泌された抗体の反応性グループａ　サンプルＮｏ、　　　平 均中ＳＤ　　　　　範囲Ａ　　　　　　３１　　０．３３２◆０．１２３ｂ０． ０８９−０．６３４Ｂ　　　　　　３７　　０．０１４◆０．０１１　０．００ ０−０．０３５（９０，０２１◆０．０１６　０．００３−０．０５１Ｄ　　　 　　　２３　　０．１１４◆０．１５８　０．００１−（１６８４１：　　　　 　　６　　０．０２０÷０．０２６　０．００１−０．０６８Ｆ　　　　　　７ 　　０．１９１÷０．１２５　０．０１０−０．３７０１　クループ　＾：　　 Ｓ、　　ａｕｒｅｕｓ　　感染、　クループ　Ｂ：　　Ｓ、ａｕｒｅｕｓ陰性、 クトブＣＣ＝　　対細胞数上昇Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ陰性、クトブｐ：出産後３０ 日以降Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ陰性、クトブＥ：コアクラーゼ陰性ブドウ球菌感染、 グトブＦ：ミルク生産量が１日当たり１３．６　Ｋｇより少ないＳ、　ａｕｒｅ ｕｓ陰性 す光学濃度 引用文献 １、アービドジン・ニス・オー１９８３．　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅｎｚ ｙｍｅｓ　　ｆｒｏｍ−５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　５ｕｒｅｕｓ、　　 ｐ、　　７５７−７６８゜Ｉｎ　　Ｃ，Ｓ、　　　Ｆ、　　Ｅａｓｍｏｎ　　ａ ｎｄ　　Ｃ，Ａｄｌａｍ　　（ｅｄ、）。

５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ　ａｎｄ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　１ｎｆ ｅｃｔｉｏｎｓ、　Ｖｏｌ。

２、　　Ｔｈｅ　　ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　　Ｉｎ　　Ｖｉｖｏ　　ａｎｄ　　Ｉ ｎ　　Ｖｉｔｒｏ、　　ＡｃｅｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ。

２．７−ビドジン・ニス・オー　１９８３．　Ｅｘｓｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ ｒ＋ｚｙｓｅｓ　　　ｆｒｏ−ｍ　　　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　　ａ ｕｒｅｕｓ、　　　ｐ、　　　７９０−７９６゜Ｉｎ　　Ｃ，Ｓ、’Ｆ、　　Ｅ ａｓｍｏｎ　　ａｎｄ　　Ｃ，Ａｄｌａｍ　　（ｅｄ、）。

５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ　ａｎｄ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　　１ｎ ｆｅｃｔｉｏｎｓ、　Ｖｏｌ。

２、　Ｔｈｅ　ｏｒｇ、ａｎｉｓｍｓ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　ａｎｄ　Ｉｎ　Ｖｉｔ ｒｏ、　Ａｃｅｄｅｍｉｃｐｒ６５Ｂ、　　Ｌｏｎｄｏｎ。

３．プラトフオーム・エム　１９７６、　Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｊ ｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒ　　ｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍ１ ｃｒｏｒａｓ＋　ｑｕａｒｒｔｉｔｉｅｓｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｕｔｉｌｉｚ ｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅｂｉｎｄ ｉｎｇ、　　Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　７１：２４８゜４、ブラムリ ー・エイ・ジェイとエフ・エイチ・トッド１９８４、１ｌａｓｔｉｌｉｓ　Ｃｏ ｎｔｒｏｌ：　Ｐｒｏｆｒｅｓｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、　Ｊ。

Ｄａｉｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ、５１：４８１−５１２゜５、プラン、トン・エム ・アール、ディ・エル・ワトジン及びエイ・ケイ・ラセレス　１９７１．　Ｔｈ ｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓ＋ｓ　ｏｆｔｒａｎｓｆｅｒ　　ｏｆ　　ｉｍｍｕｎｏｇ ｌｏｂｕｌｉｎ　　１ｎｔｏ　　ｍａｗ＋５ａｒｙ　　５ｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆ 　ｃｏｗｓ、　　Ａｕ５ｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｂｊｏｌ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ 、　４９：　６１３−６２３゜ ６、ブツシュネル・アール・ビー１９８０．　Ｈｅｒｄ　ＨｅａｌｔｈＡｐｐｒ ｏａｃｈ　ｔｏ　Ｍａｓｔｉｔｉｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ｍＮｋ　Ｑｕａ ｎｔｉｔｙ。

ＪＡＶＭＡ　　１７６：　　　７４１ｉ−７５０゜７、カフイン・ジェイ・ビー 、ビー・ボートレル及びビー・ライナート１９８３．　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ａｌ　ａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　　ｆａｃｔｏｒｓ　　ｉｎｆｌｕｅｎ ｃｉｎｇ　ｂｏｖｉｎｅｉｓｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇｒ　ｃｏｎｃｅｎｔ ｒａｔｉｏｎｉｎ　ｍ１ｌｋ　Ｊ、　ＤａｉｒｙＳｃ＋、　　６６：２１６１− ２１６６゜８、クリステンジン・ビー、ニス・エイ・ヘトストロム及びジー・ク ロンボール　１９８３．　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｔ。

ａｌｐｈａ−ａｎｄ　　ｂｅｔａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ　　ｆｒｏｍ　　Ｓｔａ 　　ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ　　ｉｎ　　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔ ｈ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　　ａｎｄ　　ｉｎ　 　ｎｏｒｍａｌｓ、　　Ａｃｔｓ　　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ。

１ｉ＋ｕｉｕｎｏ１．　５ｃａｎｄ、　　９１：５１−３５６゜′９．クリステ ンソン・ビー、エフ・エスパーセン、ニス・エイ・ヘトストロム及びジー・クロ ンボール１９８３゜５ｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　　ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓ ａｙ　　ｏｆ　　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　　Ｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　 ｔｏｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｐｅｐｔｉｄｏｇ］ｙｃａ ｎｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　１ｎｆ ｅｃｔｉｏｎｓ＋ＡｃｔａＰａｔｈ、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　　５ｃａｎｄ、　　９１：４０１−４０６゜１０、ドツト・エフ・エイ チ１９８３−　Ｍａｓｔｉｔｉｓ：　Ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ 、　Ｊ、　Ｄａｉｌｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　６６：　１７７３−１７７９゜１１、 ドイル・アール・ジェイ、イー・エム・ソネフェルト、ケイ・コスト及びニス・ タニャバーン１９８２．　Ａｎｔｊ−ＰＯＩｙ（ｇｌｙｃｅｒｏｌｐｈｏｓｐｈ ａｔｅ）　　ｉｎ　　ｈｕｍａｎ　　５ｅｒａ、　　Ｊ。

Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　１５：１１６９−１１７１゜ １２、フォックス・エル・ケイ、ジェイ・ニス・マクドナルド及びディ・ディ・ パノコック１９８７．　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆＳｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｐ ｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　　ｉｎｔｒａｇ＋ａｍｍａｒｙｉｎｆｅｃｔｉｏｎ 　ｂｙ　ｃｏａｇｕｌａｓｅＯｐｏＳｉｔｉｖｅｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ： 　ａ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｒｅｐｏｒｔ、　ｐ、　９３−１０１゜Ｎａｔ ｉｏｎａｌ　１ｌａｓｔｉｔｉｓ　Ｃｏｕｎｃｉｌ、　Ｉｎｃ、　２６ｔｈ　Ａ ｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ、　ｏｒｌａｎｄｏ、　ＦＬ。

１３、ガンストロム・エム、アイ・ジー・ジュランジー。

ニス・エイ・ヘトストロム及びアール・モルビー１９８３゜Ｅｎｚｙｍｅ−１ｉ ｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｂｏ ｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔ　　ｔｅｉｃｈｏｉｃ　　ａｃｉｄ　　ｉｎ　　ｐａｔ ｉｅｎｔｓ　　ｗｉｔｈｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓ、　　Ｊ、　　Ｃ１１ｎｉｃａ１１！ｉｃｒｏｂｊｏｌｏｇｙ、１７：６４０ −５４６．１４、グツトガ−・ダブリュ・ジェイ及びジー・ファープラン１９８ ７゜ Ｂｅｎｅｆｉｔｓ　ａｎｄ　Ｃｏ５ｔｓ　ｏｆ　ａ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｐｒｏｇ ｒａｍ　ｆｏｒ　ａｎＥｐｉｚｏｏｔｉｃ　ｏｆ　Ｓｔａ　ｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｕｒｅｕｓ　１ｌａｓｔｊｔｉｓ、　ＪＡＶＭＡ１９０：　１２８４−１ ２８７゜ １５、ガラディング・アール１９７７、　Ａｎ　ａｇａｒ　ｄｅｓｃｕｓｓｊｏ ｎｍｅｔｈｏｄ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　　ｏｆ 　　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ａｇａｉｎｓｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　 ａｕｒｅｕｓ　ｄｅｏｘｙｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、　Ａｃｔａ　Ｖｅｔ。

５ｃａｎｄ、　１８：４８０−４９３゜１６、　Ｊｅｌｊａｓｚｅｗｉｃｚ、　 Ｊ、、　Ｌ、　Ｍ、　５ｗ１ｔａｌｓｋｉ、　ａｎｄ　Ｃ。

Ａｄｌａｍ、　１９８３．　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏａｇｕｌａｓｅ　ａｎｄ　ｃ ｌｕｍｐｉｎｇｆａｃｔｏｒ、　ｐ、　５４８．　Ｉｎ　Ｃ，Ｓ、　Ｆ、　Ｅａ ｓｍｏｎ　ａｎｄ　Ｃ，Ａｄｌａ＋１（ｃｄ、）、　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ｉ　ａｎｄ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、　Ｖｏｌ、 　２．　Ｔｈｅ　ｏｒｇａｎｉｓｍ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　ａｎｄ　ＩｎＶｉｔｒｏ 、　Ａｃａｄｅｍｊｃ　Ｐｒｅｓｓ、ルｏｎｄｏｎ。

１７、ラエムリ、　ＵＫ、　１９７０．　Ｍｏ５ｔ　ｃｏｍｍｏｎｌｙ　ｕｓｅ ｄｄｊｓｃｏｕｎｔｉｎｕｏｕｓ　　ｂｕｆｆｅｒ　　ｓｙｓｔｅｍ　　ｆｏｒ 　　５ＤＳｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｆｆｆ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８ ０＋１８、ラスマニス・ジェイとジー・アール・スペンサー１９５４゜ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｆｏｒ　　ｈｅｍｏｌｙｓｉｎｓ　　ｏｆ　　ｍ１ｃ ｒｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｙｏｇｅｎｅｓｉｎ　ｗｈｅｙ　ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ　 ｏｆ　ｄａｉｌｙ　ｃａｔｔｌｅ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ。

Ｒｅｓ、　ＩＳ：５１７−５１９゜ １９、リブ・アイとアール・ニス・ラヌ　１９６Ｂ。

Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　　ｏｆ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　 Ａ　　ｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ：　ｔｈｅ　ｐｒｅｃ ｉｐｉｔａｔｉｎｏｇｅｎ’　ａｓ　ａｎａｎｔｉｇｅｎ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒ ｍｉｎｉｎｇａｎＮｂｏｄｉｅｇ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐａｓｓｉｖｅｈｅｍａｇｇ ｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　９６：１４−２３゜２０、ロエフラー・デ ィ・エイとエフ・エル・ノルクロス１９８７、　　Ｕｓｅ　　　ｏｆ　　ｅｎｚ ｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　ａｓｓａｙｔｏ　５ ｅａｓｕｒｅ　ｍＮｋ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ａｌｐｈａ　ｔｏｘｉｎ 、　ｂｅｔａｔｏｘｉｎ、　ａｎｄ　５ｕｒｆａｃｅ　ｅｘｏｐｌｏｙｓａｃｃ ｈａｒｉｄｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕ ｒｅｕｓ、　　Ｖｅｔ　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　Ｉ＊５ｕｎｏｐａｔｈ。

１４：　　１４５−１５６゜ ２１、マチジン・ビー・エイ、ケイ・ダブリュ・ケリー、及びダブリュ・シー・ ディビス１９８４．　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆｂｏｖｉｎｅ　ｊｔｓｕ ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ＊　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｂｉｎｄｉｎｇＳｔａｐｈ ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、　ｕｓｉｎｇａ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍｏｎｏ ｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ、　Ａｓ　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、　４５：　 ２５１８−２５２４゜２２、マクドナルド・ジェイ・ニス　１９８４゜５ｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃａｌ　　ａｎｄ　　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　　ｍａｓｔ ｉｔｉｓｔ。

Ｖｅｔｅｒｎａｒｙ　　Ｃ１１ｎｉｃｓ　　ｏｆ　　Ｎｏｒｔｈ　　Ａｍｅｒｉ ｃａ：　　Ｌａｒｇｅ　　Ａｎｉｉ＋ａｌＰｒａｃｔｉｃｅ、　Ｓｙｍｐｏｓｉ ｕｍ　ｏｎ　Ｒａｖｉｎｅ　Ｍａｓｔｉｔｉｓ、　６：　２６９−２８５゜ ２３、ノルビー・アール、　１９８３゜ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｐ ｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ＋＊ｅｓｂｒａｎｅ　　ｄａｍａｇｉｎｇ　　ｔｏｘｉｎｓ 、　　ｐ＋　６４４−６４５．　　Ｉｎ　　Ｃ，Ｓ、　　Ｆ。

Ｅａｓｍｏｎ　　ａｎｄ　　Ｃ，Ａｄｌａｍ　　（ｅｄ＋）、　　５ｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｉ　　ａｎｄｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　　１ｈｆｅｃｔｉｏ ｎｓ、　Ｖｏｌ、　　２．　　Ｔｈｅ　ｏｒｇａｎｉｓｍ　ＩｎＶｉｖｏ　　ａ ｎｄ　　Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ、　　＾ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｌｏ ｎｄｏｎ−２４、ニッカージン・ニス・シー１９８５゜ｌｍ５ｕｎｅ　ｍｅｃｈ ａｎｓｉｓｍｓ　ｏｆｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅ　ｕｄｄｅｒ：　ａｎ　ｏｖｅｒｖ ｉｅｗ、　ＪＡＶＭ＾、　１８７：　４１−４５゜２５、オプデベーク・ジエイ とエフ・エル・ノルクロス１９８１、　　Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ 　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　５ｐａｃｉｆｉｃ 　　ｆｏｒ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ａｌｐｈａｈｅｍｏｌｙｓｉｎ　 ｉｎ　ｂｏｖｉｎｅ　５ｉｌｋ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒ ｙＳｃｉｅｎｃｅ、　３０：　８３−１１６゜２６、オプデベーク・ジェイとエ フ・エル・ノルクロス１９８５゜ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　１ａｃｔｅ ａｌ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎｓｔｏ　ｃａｐｓｕｌａｒ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ 　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、　Ａｍ。

Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、　４６：　１５６１−１５６４゜２７、シャルム・オ ー・ダブリュとアール・ダブリュ・オームスビー　１９４９゜ Ｅｆｆｅｃｔｓ　　ｏｆ　　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　　ａｎｄ　　ｔｈｅｒａｐ ｙ　　ｏｎ　　ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉｓａｍｍａｒｙ　　１ｎｆｅｃｔｉ ｏｎｓ、　　ＪＡＶＩＩＡ、　　１１５：　　４６Ｂ。

２８、シアグレン・ジエイ・エフ　１９８４゜Ｓｔａ　ｈ　１ｏｅｏｃｃｕｓ　 ａｕｒｅｕｓ：Ｔｈｅ　　ｐｒｅｓｉｓｔｅｎｔ　　ｐａｔｈｏｇｅｎ、　　丁 ｈｅ　　Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 、　３１０：　１３６８−１３７３゜２９、シアグレン・ジエイ・エフ　１９８ ４゜Ｓｔａ　　ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ：Ｔｈｅ　　ｐｅｒｓｉ ｓｔｅｎｔ　　ｐａｔｈｏｇｅｎ、　　Ｔｈｅ　　Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　 　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　　３１０：　　１４３７−１４ ４２゜３０、スペンサー・シー・アール、イー・エイチ・スタンベンフェルト及 びディー・エム・フルバ−ティ　１９６３゜Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ａ　ｇｒｏ ｗｔｈ−ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　５ｔａｐｈ　Ｉｏｃｏｃｃｕｓ 　ａｕｒｅｕｓ　１ｎｃａｔｔｌｅ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、　２ ４：　８３−８７゜３１、ワトジン・ディ・エル、エム・アール・ブラントン及 びエイ・ケイ・ラセレス１９７２゜ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　　ｏｆ　　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　　 ｉｎ　　ｓａｍｍａｒｙ　　ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｒｅｆｒｅｎｃｅ　ｔｏ　 ５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　Ｉｇｃｌ。

Ａｕ５ｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ。

５０：　５３５−５３９゜ ３２、ワトジン・ディ・エルとエイチ・アイ・デーピース１９８５゜ Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　ａｃｔｉｖｉｔｙ　　ｏｆ　　ｓ ｕｐｒａｍａｍｍａｒｙ　　ｌｙｍｐｈｎｏｄｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｖｅ　ｄ ｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｖｅｒｙ　ｅａｒｌｙ　ｐｈａｓｅ　ｏｆｓｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃａｌ　　ｍａｓｔｉｔｉｓ、　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　ｉｎ　　Ｖｅ ｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅ、　　３９：　　５２−５８゜３３、ウェスト ・ティ・イー、エフ・エム・バーシュ、エイ・エム・ボーム及びエム・イー・ウ ェスト、　　１９８３゜Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ａ　　ｃｏｍｍｅｒ ｃｉａｌｃｏｕｎｔｅｒ　ｉｓｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｋｉ ｔ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＳｔｅｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ ｅｕｓ　ｔｅｉｃｈｏｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ。

Ｊ、ｏｆ　　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　　１７：　　 ５６７−５７０゜３４、ウッデン争エイ・エム　１９５９．　Ｆｒａｃｔｉｏｎ ａｔｉｏｎ　ｏｆＬｅｕｃｏｃｊｄｉｎ　　ｆｒｏｓ＋　　Ｓｔａ　　ｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ。

Ｂｉｏｃｈｅ＋５ｉｓｔｒｙ　　Ｊ、７３：２２５−２３７゜味ＬＡ ”Ａｔ／ｊ ｃ−Ａｉｅ−ｙｉ 国際調査報告

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の体液について、約１４ｋｄないし約２６ｋｄの分子量を有する複 数の黄色ブドウ球菌エキソブロテインに対して親和性を有する抗体の存在を調べ ることから成る、哺乳動物がブドウ球菌性炎症感染症に罹患しているか否かを決 定する方法。
2. ２．哺乳動物はウシである請求項１記載の方法。
3. ３．体液は母乳である請求項１記載の方法。
4. ４．感染症は乳腺炎であり、体液は母乳である請求項２記載の方法。
5. ５．（ａ）黄色ブドウ球菌によって引き起こされる乳腺炎に罹患していないこと が知られているウシの母乳中に存在する抗体に対するよりも、黄色ブドウ球菌に よって引き起こされた乳腺炎に罹患していることが知られているウシの母乳中の 抗体に対してより反応する、分子量に従って選択された黄色ブドウ球菌エキソブ ロテインの抗原性製剤を調製する工程と、 （ｂ）該抗原性製剤をウシから得られた母乳試料と共にインキュベートする工程 と、 （ｃ）前記試料が前記エキソブロテインによって結合されるか否かを調べる工程 とを含む、ウシが黄色ブドウ球菌によるウシ乳腺炎に罹患しているかを決定する 方法。
6. ６．実質的に全てのエキソブロテインが１４ｋｄないし２６ｋｄの分子量を有す る請求項５記載の方法。
7. ７．前記抗原性製剤は、黄色ブドウ球菌細胞からエキソブロテインを得、分子量 に従ってそれを分画し、所定の分子量範囲内の実質的に全てのエキソブロテイン を選択することによって調製される請求項１記載の方法。
8. ８．前記分子量範囲は１４ｋｄないし２６ｋｄである請求項７記載の方法。
9. ９．前記分子量範囲は２４ｋｄないし２６ｋｄである請求項８記載の方法。
10. １０．エキソブロテインは支持体上に不動化される請求項５記載の方法。
11. １１．複数の１４ｋｄないし２６ｋｄの黄色ブドウ球菌エキソブロテインを含む 免疫試薬。
12. １２．抗原が支持体に結合される請求項１１記載の試薬。
13. １３．抗原は黄色ブドウ球菌のＷｏｏｄ−４６株から誘導される請求項１１記載 の免疫試薬。
14. １４．アルファ及びベタヘモリシン活性を実質的に有さず、かつ、実質的に多糖 類を含まない請求項１１記載の免疫試薬。
15. １５．黄色ブドウ球菌に特異的な、１８ｋｄないし２６ｋｄのエキソブロテイン に結合する抗体が母乳中に存在するか否かを調べることから成る、黄色ブドウ球 菌によるウシ乳腺炎感染症と他の病原菌によるウシ乳腺炎感染症とを区別する方 法。
16. １６．エキソブロテインはアルファ及びベータヘモリシン活性を欠いている請求 項６記載の方法。
17. １７．不動化された黄色ブドウ球菌タンパク質は実質的にアルファ及びベータヘ モリシン活性を有さない請求項６記載の方法。