CN112760420B - 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种用于检测新冠病毒SARS‑CoV‑2的引物、探针和试剂盒，属于试剂盒技术领域。解决了现有技术中新冠病毒SARS‑CoV‑2的检测方法，存在检测准确度低、对检测设备和检测人员要求高的问题，提高检测灵敏度和特异性。本发明的M基因引物包括M‑F3、M‑B3、M‑FIP、M‑BIP和M‑LP；N基因引物包括N‑F3、N‑B3、N‑FIP、N‑BIP和N‑LP。本发还提供用于检测新冠病毒SARS‑CoV‑2的探针和试剂盒。该SARS‑CoV‑2的引物、探针和试剂盒，不需要精密大型检测仪器和专业操作人员，符合现场即时诊断需求，且成本低，具有很高的检测准确性和灵敏度，避免诊断假阳性与假阴性的发生。

Description

一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒。
背景技术
新冠肺炎是一种新发的可人与人传播的急性感染性肺炎，并最终可导致患者死亡。新冠肺炎疫情现已具备全世界大流行特征。为了更好的防控疫情，避免交叉感染，急需在感染初期对疑似感染者进行精准的现场即时检测方法。
现有技术中，主要通过对新冠病毒进行体外核酸检测来判断是否感染新冠病毒。目前被普遍应用的检测方法的检测原理是基于逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，该方法虽然现在被普遍应用，但是在检测准确度与灵敏度上也存在一定不足，且需要大型精密仪器和专业的技术人员操作，无形中造成检测时间过长、检测成本偏高现象，使新冠病毒的检测只能在专业的基因检测机构或三甲医院中操作完成，尚不能成为新冠病毒的现场即时检测手段，无法有效缓解目前新冠病毒检测供不应求的问题。逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)是一种对核酸进行恒温扩增的检测技术，具有操作简单、扩增效率高的特点。现有技术中已存在一些用这种方法来检测新冠病毒的RNA的报道，但是这种检测方法仍不能完全达到对新冠病毒检测的特异性要求，同时也需要检测荧光，这使检测仍然需要价格不菲的荧光检测设备，尚不能实现真正意义上的现场即时检测。
发明内容
本发明为了解决现有技术中新冠病毒SARS-CoV-2的检测方法，存在检测准确度低、对检测设备和检测人员要求高的问题，提高检测灵敏度和特异性，提供了一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下。
本发明提供一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的M-F3、M-B3、M-FIP、M-BIP和M-LP；
所述M-F3的序列为TAGGCTTGATGTGGCTCA；
所述M-B3的序列为AAGATGTCCACGAAGGATC；
所述M-FIP的序列为CTGGATTGAATGACCACATGGAAGCTACTTCATTGCTTCTTTCAG；
所述M-BIP的序列为ACATTCTTCTCAACGTGCCACACAGCTCCGATTACGAGTT；
所述M-LP的序列为CGCGTACGCGCAAACAGT。
本发明还提供一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的N-F3、N-B3、N-FIP、N-BIP和N-LP；
所述N-F3的序列为TTGGCTACTACCGAAGAGCT；
所述N-B3的序列为TGCAGCATTGTTAGCAGGATT；
所述N-FIP的序列为CTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTACAGACGAATTCGTGGTGGTG；
所述N-BIP的序列为GACGGCATCATATGGGTTGCAAGCGGGTGCCAATGTGAT；
所述N-LP的序列为CTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAG。
本发明还提供一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因探针，包括物质的量比为1:1的M-hCG-P1和M-P2；
所述M-hCG-P1的序列为结合hCG-SNAP融合蛋白的M-P1；
所述M-P1的序列为5′-NH2-C6-GAAGCGGTCTGGTCAGAAT
所述M-P2的序列为ATGGCACTATTCTGACCAGACCGC。
进一步的，所述M-hCG-P1的制备方法为：
步骤一、通过苄基鸟嘌呤(BG)使M-P1序列获得O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，得到M-BG-P1探针；
步骤二、制备并纯化hCG-SNAP融合蛋白；
步骤三、通过纯化的hCG-SNAP融合蛋白中SNAP蛋白的半胱氨酸亲合进攻M-P1序列上O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，使半胱氨酸与苄基形成稳定的硫醚共价键，获得M-hCG-P1探针。
本发明还提供一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因探针，包括物质的量比为1:1的N-hCG-P1和N-P2；
所述N-hCG-P1的序列为结合hCG-SNAP融合蛋白N-P1；
所述N-P1的序列5′-NH2-C6-GACGGTAAAATGAAAGATCTCA；
所述N-P2的序列为ATCTTGGACTGAGATCTTTCATTTTACCGTC。
进一步的，所述N-hCG-P1的制备方法为：
步骤一、通过苄基鸟嘌呤(BG)使N-P1序列获得O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，得到N-BG-P1探针；
步骤二、制备并纯化hCG-SNAP融合蛋白；
步骤三、通过纯化的hCG-SNAP融合蛋白中SNAP蛋白的半胱氨酸亲合进攻N-P1序列上O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，使半胱氨酸与苄基形成稳定的硫醚共价键，获得N-hCG-P1探针。
本发明还提供含有M基因引物、N基因引物、M基因探针和N基因探针的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒。
进一步的，所述用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒还包括验孕试纸或验孕棒。
图1所示，本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒的原理为：采用RT-LAMP核酸扩增方法对核酸进行扩增，然后通过Toehold辅助的链置换反应，实现了从检测序列到hCG蛋白的信号传导，最终以验孕棒或验孕试纸作为反应信号的输出方式，当不存在阳性样本时，体系中没有产生针对目的序列的特异性RT-LAMP产物，hCG-P探针在体系中没有发生链置换反应，探针可顺利爬上试纸条，在验孕试纸条检测结果部位同时显示对照检测线和测试线两条条带，此为阴性结果；而当阳性样本存在时，体系中发生针对目的序列的特异性RT-LAMP扩增，hCG-P探针中的hCG-P1探针与RT-LAMP中的特异环状部位结合发生链置换反应，由于RT-LAMP产物体积较大，使hCG-P1无法顺利通过试纸条，因此在试纸条的检测结果部位只出现对照检测线一条条带，此为阳性结果。Toehold辅助的链置换反应因其对序列信息要求严格，故可准确反应检测样本中出现的甚至一个碱基的拷贝差异，因此可以有效提高检测结果的特异性，利用绒毛膜促性腺激素蛋白(hCG)与探针偶联，使用商品化的验孕试纸作为检测输出信号对病原体基因进行直接检测，该方法操作简单，全程检测方法抛开了精密大型检测仪器和专业操作人员，符合现场即时诊断需求；最大程度降低了检测过程中的人力、物力成本。上述两种方法可分别在检测特异性和检测成本上与RT-LAMP完美互补，有利于实现新冠病毒的现场即时检测。由此完成针对新冠病毒的“有或无”的“信号关”型超灵敏现场即时检测方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的用于检测新冠病毒的SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒，在原理上满足并超过SARS-CoV-2新冠病毒的检测，不需要精密大型检测仪器和专业操作人员，符合现场即时诊断需求，且成本低，具有很高的检测准确性和灵敏度，避免诊断假阳性与假阴性的发生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒的检测原理图；
图2为本发明实施例1的以pUC57-M质粒和SARS质粒为待测物时的RT-LAMP扩增结果；
图3为本发明实施例2的以pUC57-N质粒和SARS质粒为待测物时的RT-LAMP扩增结果；
图4为本发明实施例1的以SARS-CoV-2的M基因的RNA序列为待测物时的RT-LAMP扩增结果；
图5为本发明实施例2的以SARS-CoV-2的N基因的RNA序列为待测物时的RT-LAMP结果；
图6为本发明实施例3和实施例4中M-BG-P1或N-BG-P1与hCG-SNAP蛋白hCG-SNAP融合蛋白连接效率；
图7为本发明实施例3和实施例4中M-hCG-P1或N-hCG-P1探针的纯化效率；
图8为本发明实施例5的检测结果；
图9为本发明实施例6的检测结果；
图10为本发明实施例7的检测结果；
图11为本发明实施例8的检测结果；
图12为本发明用控温热水壶完成检测的结构示意图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒，针对的是新冠病毒SARS-CoV-2的M基因和N基因。M基因的序列为AUGGCAGAUUCCAACGGUACUAUUACCGUUGAAGAGCUUAAAAAGCUCCUUGAACAAUGGAACCUAGUAAUAGGUUUCCUAUUCCUUACAUGGAUUUGUCUUCUACAAUUUGCCUAUGCCAACAGGAAUAGGUUUUUGUAUAUAAUUAAGUUAAUUUUCCUCUGGCUGUUAUGGCCAGUAACUUUAGCUUGUUUUGUGCUUGCUGCUGUUUACAGAAUAAAUUGGAUCACCGGUGGAAUUGCUAUCGCAAUGGCUUGUCUUGUAGGCUUGAUGUGGCUCAGCUACUUCAUUGCUUCUUUCAGACUGUUUGCGCGUACGCGUUCCAUGUGGUCAUUCAAUCCAGAAACUAACAUUCUUCUCAACGUGCCACUCCAUGGCACUAUUCUGACCAGACCGCUUCUAGAAAGUGAACUCGUAAUCGGAGCUGUGAUCCUUCGUGGACAUCUUCGUAUUGCUGGACACCAUCUAGGACGCUGUGACAUCAAGGACCUGCCUAAAGAAAUCACUGUUGCUACAUCACGAACGCUUUCUUAUUACAAAUUGGGAGCUUCGCAGCGUGUAGCAGGUGACUCAGGUUUUGCUGCAUACAGUCGCUACAGGAUUGGCAACUAUAAAUUAAACACAGACCAUUCCAGUAGCAGUGACAAUAUUGCUUUGCUUGUACAGUAA；
N基因的序列为AUGUCUGAUAAUGGACCCCAAAAUCAGCGAAAUGCACCCCGCAUUACGUUUGGUGGACCCUCAGAUUCAACUGGCAGUAACCAGAAUGGAGAACGCAGUGGGGCGCGAUCAAAACAACGUCGGCCCCAAGGUUUACCCAAUAAUACUGCGUCUUGGUUCACCGCUCUCACUCAACAUGGCAAGGAAGACCUUAAAUUCCCUCGAGGACAAGGCGUUCCAAUUAACACCAAUAGCAGUCCAGAUGACCAAAUUGGCUACUACCGAAGAGCUACCAGACGAAUUCGUGGUGGUGACGGUAAAAUGAAAGAUCUCAGUCCAAGAUGGUAUUUCUACUACCUAGGAACUGGGCCAGAAGCUGGACUUCCCUAUGGUGCUAACAAAGACGGCAUCAUAUGGGUUGCAACUGAGGGAGCCUUGAAUACACCAAAAGAUCACAUUGGCACCCGCAAUCCUGCUAACAAUGCUGCAAUCGUGCUACAACUUCCUCAAGGAACAACAUUGCCAAAAGGCUUCUACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGUCAAGCCUCUUCUCGUUCCUCAUCACGUAGUCGCAACAGUUCAAGAAAUUCAACUCCAGGCAGCAGUAGGGGAACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCUCUUGCUUUGCUGCUGCUUGACAGAUUGAACCAGCUUGAGAGCAAAAUGUCUGGUAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACUGUCACUAAGAAAUCUGCUGCUGAGGCUUCUAAGAAGCCUCGGCAAAAACGUACUGCCACUAAAGCAUACAAUGUAACACAAGCUUUCGGCAGACGUGGUCCAGAACAAACCCAAGGAAAUUUUGGGGACCAGGAACUAAUCAGACAAGGAACUGAUUACAAACAUUGGCCGCAAAUUGCACAAUUUGCCCCCAGCGCUUCAGCGUUCUUCGGAAUGUCGCGCAUUGGCAUGGAAGUCACACCUUCGGGAACGUGGUUGACCUACACAGGUGCCAUCAAAUUGGAUGACAAAGAUCCAAAUUUCAAAGAUCAAGUCAUUUUGCUGAAUAAGCAUAUUGACGCAUACAAAACAUUCCCACCAACAGAGCCUAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCUGAUGAAACUCAAGCCUUACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACUGUGACUCUUCUUCCUGCUGCAGAUUUGGAUGAUUUCUCCAAACAAUUGCAACAAUCCAUGAGCAGUGCUGACUCAACUCAGGCCUAA。
本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因引物和N基因引物均可通过Primer Explorer V5软件设计。
本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因引物包括物质的量比为1:1:4:4:2的M-F3、M-B3、M-FIP、M-BIP和M-LP；其中，M-F3的序列为TAGGCTTGATGTGGCTCA；M-B3的序列为AAGATGTCCACGAAGGATC；M-FIP的序列为CTGGATTGAATGACCACATGGAAGCTACTTCATTGCTTCTTTCAG；M-BIP的序列为ACATTCTTCTCAACGTGCCACACAGCTCCGATTACGAGTT；M-LP的序列为CGCGTACGCGCAAACAGT。
本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因引物包括物质的量比为1:1:4:4:2的N-F3、N-B3、N-FIP、N-BIP和N-LP；其中，N-F3的序列为TTGGCTACTACCGAAGAGCT；N-B3的序列为TGCAGCATTGTTAGCAGGATT；N-FIP的序列为CTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTACAGACGAATTCGTGGTGGTG；N-BIP的序列为GACGGCATCATATGGGTTGCAAGCGGGTGCCAATGTGAT；N-LP的序列为CTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAG。
本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因探针序列和N基因探针序列通过NUPACK软件设计。该Toehold辅助的链置换探针序列的特点是探针M(N)-P1与RT-LAMP的其中一个环状区域序列(检测识别区域)互补，并在序列的5’磷酸基团部位修饰NH2-C6；序列M(N)-P2与M(N)-P1互补，但是M(N)-P2序列较M(N)-P1序列长出8bp碱基，且这8bp碱基与检测识别区域部分序列相同。通过苄基鸟嘌呤(BG)使M(N)-P1序列获得O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，通过制备的hCG-SNAP融合蛋白中SNAP蛋白的半胱氨酸亲合进攻P1序列上O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，使半胱氨酸与苄基形成稳定的硫醚共价键，获得连接hCG的M(N)-P1探针，即M-hCG-P1或N-hCG-P1。
具体的，本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因探针包括物质的量比为1:1的M-hCG-P1和M-P2，M-hCG-P1为结合hCG-SNAP融合蛋白的M-P1序列，M-P1序列为5′-NH2-C6-GAAGCGGTCTGGTCAGAAT，M-P2的序列为ATGGCACTATTCTGACCAGACCGC。
上述M-hCG-P1的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将M-P1序列修饰BG制备M-BG-P1序列
将M-P1探针、BG-GLA-NHS、HEPES混匀于溶剂中，室温震荡孵育2-2.5h，脱盐柱分离，得到M-BG-P1序列。
M-P1探针、BG-GLA-NHS、HEPES的物质的量比为1:30:200；
步骤二、制备hCG-SNAP融合蛋白
使用PEI转染试剂，利用pcDNA3.4-hCG-SNAP-His转染HEK293T细胞，培养48h后收集细胞上清液，使用0.45μm滤器过滤细胞上清液，亲和层析柱分离，透析，得到hCG-SNAP融合蛋白；
步骤三、完成M-BG-P1与hCG-SNAP融合蛋白的连接
取hCG-SNAP融合蛋白与M-BG-P1探针按物质的量1:2.5进行混合，用恒温金属浴于25℃，750rpm孵育24h后得到产物；
步骤四、纯化M-hCG-P1
采用快速蛋白液相色谱方法，利用GE HiTrapQ HP离子交换柱利用预设程序从步骤三的产物中分离出M-hCG-P1并回收，浓缩。
本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因探针序列包括物质的量比为1:1的N-hCG-P1和N-P2，N-hCG-P1为结合hCG-SNAP融合蛋白的N-P1序列，N-P1的序列为5′-NH2-C6-GACGGTAAAATGAAAGATCTCA，N-P2的序列为ATCTTGGACTGAGATCTTTCATTTTACCGTC。
本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因探针的制备方法：
步骤一、将N-P1序列修饰BG制备N-BG-P1序列
将N-P1探针、BG-GLA-NHS、HEPES按物质的量比为1:30:200混匀于溶剂中，室温震荡孵育2-2.5h，脱盐柱分离，得到N-BG-P1序列；
步骤二、制备hCG-SNAP融合蛋白
使用PEI转染试剂，利用pcDNA3.4-hCG-SNAP-His转染HEK293T细胞，培养48h后收集细胞上清液，使用0.45μm滤器过滤细胞上清液，亲和层析柱分离，透析，得到hCG-SNAP融合蛋白；
步骤三、完成N-BG-P1与hCG-SNAP融合蛋白的连接
取hCG-SNAP融合蛋白与N-BG-P1探针按物质的量1:2.5进行混合，用恒温金属浴于25℃，750rpm孵育24h后用得到产物；
步骤四、纯化N-hCG-P1
采用快速蛋白液相色谱方法，利用GE HiTrapQ HP离子交换柱利用预设程序从步骤三的产物中分离出N-hCG-P1并回收，浓缩。
本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒，包括M基因引物、N基因引物、M基因探针和N基因探针，还可以包括验孕试纸或验孕棒。
本发明的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒的使用方法为：
步骤一、基于RT-LAMP法扩增SARS-CoV-2新冠病毒的M基因序列
采用25μL RT-LAMP反应体系：1×Isothermol Buffer中含有4μL待测物，0.6μM M-B3，0.6μM M-F3，2.4μM M-FIP，2.4μM M-BIP，1.2μM M-LP，1.12mM dNTPs，2mMMgSO4，1mM甜菜碱，12U DNA聚合酶(Bst 2.0poly merase)，7.5U逆转录酶(warmstartRTx ReverseTranscriptase)。反应条件为：先在58℃反应1.5h，随后在80℃反应20min。反应装置采用的是等温加热装置，可以PCR仪或可控温热水壶，如图12所示。得到的为M基因序列RT-LA MP扩增产物。
步骤二、基于RT-LAMP法扩增SARS-CoV-2新冠病毒的N基因序列
采用25μL RT-LAMP反应体系：1×Isothermol Buffer中含有0.6μMN-B3，0.6μM N-F3，2.4μMN-FIP，2.4μMN-BIP，1.2μM N-LP，1.12mM dNTPs，4mMMgSO4，0.6mM甜菜碱，12U Bst2.0polymerase，3.75U WarmstartRTx Reverse Transcriptase。反应条件为：先在58℃反应1.5h，然后在80℃反应20min。反应装置采用的是等温加热装置，可以PCR仪或可控温热水壶，如图12所示。得到的为N基因序列RT-LAMP扩增产物。
步骤三、准备1.5mL离心管，管中加入终浓度20nM M-hCG-P1与20nM M-P2，加入1×PBS使终体积满足7.5μL，混匀后室温孵育1h；
步骤四、准备1.5mL离心管，每管中加入终浓度25nM N-hCG-P1与25nM N-P2，加入1×PBS使终体积满足10μL，混匀后室温孵育1h：
步骤五、将步骤一得到的M基因序列RT-LAMP扩增产物15μL加入到步骤三的离心管中，充分混匀后室温孵育35min；加入22.5μL的1×PBS，使终体积为45μL，将商品化验孕试纸插入到反应体系液面下，2min后待试纸条结果稳定出现在检测部位后取出，观察结果；
步骤六、将步骤二得到的N基因序列RT-LAMP扩增产物15μL加入到步骤四的离心管中，充分混匀后室温孵育30min；加入20μL的1×PBS，使终体积为45μL，将商品化验孕试纸插入到反应体系液面下，2min后待试纸条结果稳定出现在检测部位后取出，观察结果。
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中的SARS-CoV-2新冠病毒的M和N基因来源：先将新冠病毒SARS-CoV-2的M和N基因序列交至生工生物有限公司进行基因合成。参考序列为National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)数据库中的MN908947.3序列，部分该序列分别插入pUC57载体上，获得pUC57-M和pUC57-N质粒。分别以pUC57-M和pUC57-N质粒为待测物，获得针对M的RT-LAMP扩增序列和N的RT-LAMP扩增序列的带有T7转录序列的PCR产物，并对产物进行纯化；通过利用纯化的产物进行转录反应，分别获得携带M和N序列的RNA片段；其中，针对M的RT-LAMP序列进行扩增的带有T7转录序列的PCR产物的引物为RS-M-F(序列TAATACGACTCACTATAGGGGTATCGCAAT)和RS-M-R(序列为CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTA)；针对N的RT-LAMP序列进行扩增的带有T7转录序列的PCR产物的引物为RS-MT-N1-F(序列为TAATACGACTCACTATAGGGGGCGTTCCAATTAACACCAATA)和RS-MT-N1-R(序列为CTTTTGGCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTTGTAGCACGAT)。RS-M-F、RS-M-R、RS-MT-N1-F和RS-MT-N1-R通过Primer 5软件设计获得。PCR的反应体系为：50ng质粒待测物，1μL 10μM上游引物(RS-M-F或RS-M-R)，1μL10μM下游引物(RS-MT-N1-F或RS-MT-N1-R)，2.5μL 10×PCR缓冲液，1.5μL 25mM镁离子，0.5μL 10mM dNT P，5UTaq DNA聚合酶，ddH2O补足体系到25μL，PCR反应条件为：先95℃反应5min，然后95℃反应30s，56℃反应30s，72℃反应30s，上述三个30s的反应循环30次，最后95℃反应5min。将PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离与验证，利用紫外/蓝光照胶仪确定PCR产物为M和N的DNA片段。最后在紫外/蓝光照胶仪内利用刀片将处于正确位置的M和N的PCR产物条带回收到干净的1.5mL EP管中，使用莫纳生物公司的MonPureTM Gel&PCRClean Kit试剂盒，根据说明书操作回收并纯化M和N基因PCR片段产物。首先向胶块中加入1倍体积的Buffer PN，50℃水浴温育，其间每隔2-3min温和地上下颠倒离心管，待胶溶液为黄色，并确保胶块全部充分溶解；将溶解的胶溶液放入组装好的吸附柱中，室温放置2min，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入450ΜBuffer PW(已预先计入相应体积的无水乙醇)，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；重复此步骤一次；将空吸附柱和收集管放入离心机，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱室温放置数分钟，彻底去除残留的Buffer PW；将吸附柱放到一个新的1.5mLEP管中，向吸附膜中间位置悬空加入30μL的Buff er EB，室温放置2min，13000rpm离心1min，收集到的即为纯化后的M或N的PCR片段。接下来用T7转录试剂盒进行针对M和N的PCR片段产物的体外转录。在20μL反应体系中加入2μL ATP,2μL GTP,2μL UTP,2μL CTP,2μL 10×T7 Buffer,2μL酶混合物以及8μL DNA片段，于37℃反应4小时；随后在反应体系中加入1μL Turbo DNase(试剂盒中提供)继续于37℃反应30min使体系中的DNA待测物完全降解；在反应体系中加入10μL 2×loading buffer并混合均匀，放入PCR仪中95℃反应3min；最后用5％PAGE电泳确定目的RNA已转录完成。随后纯化RNA片段。将带有目的RNA的PAGE胶切下放入1.5mL离心管中，加入450μL RNase-free H2O,50μL醋酸铵，放置在恒温金属浴中，37℃800rpm过夜。第二天取出离心管，13000rpm离心15min,将上清液转移到0.45μm的过滤管中，13000rpm离心15min,取过滤后的液体于新的1.5mL离心管中，加入1mL预冷的无水乙醇，1μL助沉剂，混匀后于-80℃静置2h，随后4℃，13000rpm离心20min，利用真空泵吸去上清，待沉淀晾干后加入RNase-free H2O，使用NanoDrop One紫外可见分光光度计定量RNA产物。
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因引物，为M-F3、M-B3、M-FIP、M-BIP和M-LP按照物质的量比为1:1:4:4:2的组合物；其中，M-F3的序列为TAGGCTTGATGTGGCTCA；M-B3的序列为AAGATGTCCACGAAGGATC；M-FIP的序列为CTGGATTGAATGACCACATGGAAGCTACTTCATTGCTTCTTTCAG；M-BIP的序列为ACATTCTTCTCAACGTGCCACACAGCTCCGATTACGAGTT；M-LP的序列为CGCGTACGCGCAAACAGT。
基于RT-LAMP法扩增SARS-CoV-2新冠病毒的M基因序列：采用25μLRT-LAMP反应体系：1×Isothermol Buffer中含有4μL待测物，0.6μM M-B3，0.6μM M-F3，2.4μM M-FIP，2.4μM M-BIP，1.2μM M-LP，1.12mM dNTPs，2MmMgSO4，1mM甜菜碱，12UBst 2.0polymerase，7.5UwarmstartRTx Reverse Transcriptase(当以pUC57-M质粒为待测物时，不加此逆转录酶)。反应条件为：先在58℃反应1.5h，随后80℃反应20min。反应装置采用的是等温加热装置，可以PCR仪或可控温热水壶。得到的为M基因序列RT-LAMP扩增产物。
待测物分别为：TEbuffer或者水、pUC57-M质粒(浓度0.5copy/μL-2000copies/μL)、SARS质粒(浓度2000copies/μL)、SARS-CoV-2的M基因的RNA片段(浓度0.5copy/μL-2000copies/μL)。
用1％的琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果：
图2为以TEbuffer或者水、pUC57-M质粒和SARS质粒为待测物时的RT-LAMP扩增结果；结果显示，在无模板的体系中没有发生RT-LAMP扩增，当存在SARS-CoV-2质粒(pUC57-M质粒)或SARS的质粒时，均有扩增产物产生；
图4为以SARS-CoV-2的M基因的RNA为待测物时的RT-LAMP结果，结果显示，当存在阳性RNA样本时，均发生RT-LAMP反应。说明本发明的RT-LAMP体系可以有效扩增低至0.5copy/μL的SARS-CoV-2样本。
实施例2
用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因引物，为N-F3、N-B3、N-FIP、N-BIP和N-LP按照物质的量比为1:1:4:4:2的组合物；其中，N-F3的序列为TTGGCTACTACCGAAGAGCT；N-B3的序列为TGCAGCATTGTTAGCAGGATT；N-FIP的序列为CTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTACAGACGAATTCGTGGTGGTG；N-BIP的序列为GACGGCATCATATGGGTTGCAAGCGGGTGCCAATGTGAT；N-LP的序列为CTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAG。
基于RT-LAMP法扩增SARS-CoV-2新冠病毒的N基因序列：采用25μL RT-LAMP反应体系：1×Isothermol Buffer中含有4μL待测物，0.6μM N-B3，0.6μM N-F3，2.4μM N-FIP，2.4μM N-BIP，1.2μM N-LP，1.12mM dNTPs，4mM MgSO4，0.6mM甜菜碱，12U Bst 2.0polymerase，3.75U WarmstartRTx Reverse Transcriptase(当以pUC57-N质粒为待测物时，不加此逆转录酶)。反应条件为：先在58℃反应1.5h，然后在80℃反应20min。反应装置采用的是等温加热装置，可以PCR仪或可控温热水壶。得到的为N基因序列RT-LAMP扩增产物。
待测物分别为：TEbuffer或者水、pUC57-N质粒(浓度0.5copy/μL-2000copies/μL)、SARS质粒(浓度20000copies/μL)、SARS-CoV-2的N基因的RNA片段(浓度0.5copy/μL-2000copies/μL)。
用1％的琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果：
图3为以TEbuffer或者水、pUC57-N质粒和SARS质粒为待测物时的RT-LAMP扩增结果；结果显示，在无模板的体系中没有发生RT-LAMP扩增，当存在SARS-CoV-2质粒(pUC57-N质粒)或SARS质粒时，均有扩增产物产生。
图5为以SARS-CoV-2的N基因的RNA为模板时的RT-LAMP结果，结果显示，当存在阳性RNA样本时，均发生RT-LAMP反应。实施例2说明本发明的RT-LAMP体系可以有效扩增低至0.5copy/μL的SARS-CoV-2样本。
实施例3
用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因探针，包括物质的量比为1:1的M-hCG-P1和M-P2；M-hCG-P1的序列为结合hCG-SNAP融合蛋白的M-P1；M-P1的序列为5′-NH2-C6-GAAGCGGTCTGGTCAGAAT；M-P2的序列为ATGGCACTATTCTGACCAGACCGC。
上述用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因探针的制备方法：
步骤一、将M-P1序列修饰BG制备M-BG-P1序列
将4μL 2mM的M-P1探针(溶于ddH2O中)，12μL 20mM BG-GLA-NHS(溶于DMSO中)，8μL200mM HEPES(溶于ddH2O中)，用ddH2O补齐体积至100μL，斡旋混匀于1.5mL离心管中，室温震荡孵育2-2.5h，获得含有M-BG-P1的溶液。将100μL的M-BG-P1溶液与400μL ddH2O加入NAP-5脱盐柱(GE Healthcare illustra NAP-5Columns Sephadex G-25脱盐柱)中，取EP管在下方接取流出液；随后将收集的流出液加入另一只新的NAP-5脱盐柱中，取新的EP管在下方接取流出液，得到M-BG-P1序列。
步骤二、制备hCG-SNAP融合蛋白
使用PEI转染试剂，利用pcDNA3.4-hCG-SNAP-His转染HEK293T细胞，培养48h后收集细胞上清液，使用0.45μm滤器过滤细胞上清液。将细胞上清液分批加入预装好的NiSepharose HP亲和层析柱中，直到全部上清液均通过柱体；加入10倍柱内填料体积的结合缓冲液(20mM NaH2PO4，20mM Na2HPO4，500mM NaCl，20mM咪唑)于柱中，待液体全部通过柱体后，准备几只新的1.5mL离心管置于柱子出液口，向柱中加入6mL洗脱液(20mM NaH2PO4，20mMNa2HPO4，500mM NaCl，500mM咪唑)，以每管1mL收集流出液。最后将流出液放入活化好的8000-15000KD透析袋中，将透析袋浸入1×PBS缓冲液，使用磁力搅拌器过夜透析流出液，最终获得hCG-SNAP融合蛋白，用试纸条确定该融合蛋白表达活性。
步骤三、完成M-BG-P1与hCG-SNAP融合蛋白的连接
取hCG-SNAP融合蛋白与M-BG-P1探针按物质的量1:2.5进行混合，用恒温金属浴于25℃，750rpm孵育24h后用得到产物；
步骤四、纯化M-hCG-P1探针
采用快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，FPLC)方法，利用GE HiTrapQ HP离子交换柱利用预设程序从步骤三的产物中分离出M-hCG-P1探针并回收该M-hCG-P1探针。将回收的M-hCG-P1探针用超滤柱以5000rpm 15min进行浓缩，至超滤柱内剩余液体达到100μL时，取出超滤柱，弃去收集柱内液体，加入4mL 1×PBS，再次以5000rpm15min进行浓缩，至超滤柱内剩余液体达到100μL；此过程重复6次，以获得溶于1×PBS中的浓缩后的M-hCG-P1探针。
实施例4
用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因探针，包括物质的量比为1:1的N-hCG-P1和N-P2；N-hCG-P1的序列为结合hCG-SNAP融合蛋白N-P1；N-P1的序列5′-NH2-C6-GACGGTAAAATGAAAGATCTCA；N-P2的序列为ATCTTGGACTGAGATCTTTCATTTTACCGTC。
上述用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因探针序列的制备方法：
步骤一、将N-P1序列修饰BG制备N-BG-P1序列
将4μL 2mM的N-P1探针(溶于ddH2O中)，12μL 20mM BG-GLA-NHS(溶于DMSO中)，8μL200mM HEPES(溶于ddH2O中)，用ddH2O补齐体积至100μL，斡旋混匀于1.5mL离心管中，室温震荡孵育2-2.5h，获得含有N-BG-P1的溶液。将100μL的N-BG-P1溶液与400μL ddH2O加入NAP-5脱盐柱(GE Healthcare illustra NAP-5Columns Sephadex G-25脱盐柱)中，取EP管在下方接取流出液；随后将收集的流出液加入另一只新的NAP-5脱盐柱中，取新的EP管在下方接取流出液，得到N-BG-P1序列。
步骤二、制备hCG-SNAP融合蛋白
使用PEI转染试剂，利用pcDNA3.4-hCG-SNAP-His转染HEK293T细胞，培养48h后收集细胞上清液，使用0.45μm滤器过滤细胞上清液。将细胞上清液分批加入预装好的NiSepharose HP亲和层析柱中，直到全部上清液均通过柱体；加入10倍柱内填料体积的结合缓冲液(20mM NaH2PO4，20mM Na2HPO4，500mM NaCl，20mM咪唑)于柱中，待液体全部通过柱体后，准备几只新的1.5mL离心管置于柱子出液口，向柱中加入6mL洗脱液(20mM NaH2PO4，20mMNa2HPO4，500mM NaCl，500mM咪唑)，以每管1mL收集流出液。最后将流出液放入活化好的透析袋中，将透析袋浸入1×PBS缓冲液，使用磁力搅拌器过夜透析流出液，最终获得表达hCG-SNAP融合蛋白，用试纸条确定该融合蛋白表达活性。
步骤三、完成N-BG-P1与hCG-SNAP融合蛋白的连接
取hCG-SNAP与N-BG-P1探针按物质的量1:2.5的比例进行混合，用恒温金属浴于25℃，750rpm孵育24h后用10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，得到产物；
步骤四、纯化N-hCG-P1探针
采用快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography，FPLC)方法，利用GE HiTrapQ HP离子交换柱利用预设程序从步骤三的产物中分离出N-hCG-P1探针并回收该N-hCG-P1探针。将回收的N-hCG-P1探针用超滤柱以5000rpm 15min进行浓缩，至超滤柱内剩余液体达到100μL时，取出超滤柱，弃去收集柱内液体，加入4mL 1×PBS，再次以5000rpm15min进行浓缩，至超滤柱内剩余液体达到100μL；此过程重复6次，以获得溶于1×PBS中的浓缩后的N-hCG-P1探针。
对实施例3和实施例4中的步骤三得到的产物进行10％SDS-PAGE电泳后进行考马斯亮蓝染色确定M-BG-P1或N-BG-P1与hCG-SNAP融合蛋白连接效率。结果如图6中所示，1泳道和4泳道为未连接的hCG-SNAP融合蛋白，2泳道中出现的最上方条带为连接上的M-hCG-P1，5泳道出现在最上方的条带为连接上的N-hCG-P1；由此图可证实大部分hCG-SNAP与M和N的BG-P1探针完成连接。
对实施例3和实施例4中的步骤四得到的产物进行10％SDS-PAGE电泳后进行考马斯亮蓝染色确定纯化的探针，如图7显示，1泳道和4泳道为未连接的hCG-SNAP融合蛋白，2泳道为N-hCG-P1，5泳道为M-hCG-P1；由此图可证实M-hCG-P1与N-hCG-P1纯化效果良好。
实施例5
检测新冠病毒SARS-CoV-2的M基因
准备两个1.5mL离心管，每管中加入终浓度20nM实施例3的M-hCG-P1与20nM实施例3的M-P2探针，加入1×PBS使终体积满足7.5μL，混匀后室温孵育1h；取RT-LAMP扩增产物15μL加入到离心管中，充分混匀后室温孵育35min；加入22.5μL的1×PBS，使终体积为45μL，将商品化验孕试纸插入到反应体系液面下，2min后待试纸条结果稳定出现在检测部位后取出，利用智能手机拍摄试纸条结果；
其中，采用的RT-LAMP扩增产物为：
实施例1得到的待测物分别为不同浓度的SARS-CoV-2的M基因的RNA片段(浓度0.5copy/μL-2000copies/μL，以2×108拷贝/微升为标准，根据梯度稀释原则，使用1×TE溶液稀释样本分别达到2000、200、20、2、1、0.5拷贝/微升；空白对照为1×TE溶液)的RT-LAMP扩增产物；结果如图8所示。
从图8可以看出，对于SARS-CoV-2的M基因，空白对照的试纸条结果为同时出现对照检测线和测试线两个条带，显示阴性结果；阳性样品管的试纸条上只有对照检测线一条条带，显示阳性结果。
实施例6
检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因
准备两个1.5mL离心管，每管中加入终浓度25nM N-hCG-P1与25nM N-P2探针，加入1×PBS使终体积满足10μL，混匀后室温孵育1h：将RT-LAMP扩增产物15μL加入到离心管中，充分混匀后室温孵育30min；加入20μL的1×PBS，使终体积为45μL，将商品化验孕试纸插入到反应体系液面下，2min后待试纸条结果稳定出现在检测部位后取出，利用智能手机拍摄试纸条结果；
其中，采用的RT-LAMP扩增产物为：
实施例2得到的待测物分别为不同浓度的SARS-CoV-2的N基因的RNA片段(浓度0.5copy/μL-2000copies/μL，以2×108拷贝/微升为标准，根据梯度稀释原则，使用1×TE溶液稀释样本分别达到2000、200、20、2、1、0.5拷贝/微升；空白对照为1×TE溶液)的RT-LAMP扩增产物；结果如图9所示。
从图9可以看出，对于SARS-CoV-2的N基因，空白对照的试纸条结果为同时出现对照检测线和测试线两个条带，显示阴性结果；阳性样品管的试纸条上只有对照检测线一条条带，显示阳性结果。
实施例7
过程与实施例5相同，其中，采用的RT-LAMP扩增产物替换为：实施例1中待测物分别为：阴性对照(TEbuffer或者水)、pUC57-M质粒、SARS质粒的RT-LAMP扩增产物。测试结果如图10所示。
从图10可以看出，针对M的检测结果均显示，只有在阳性样本存在的情况下试纸条才会只出现一条对照检测线，说明检测结果为阳性；在阴性对照和SARS样本存在的情况下，试纸条上均出现两条条带，说明检测结果为阴性。由此说明本发明检测SARS-CoV-2新冠病毒的特异性良好。
实施例8
过程与实施例6相同，其中，采用的RT-LAMP扩增产物替换为：实施例2中待测物分别为：阴性对照(TEbuffer或者水)、pUC57-N质粒、SARS质粒的RNA片段的RT-LAMP扩增产物。测试结果如图11所示。
从图11可以看出，针对N的检测结果均显示，只有在阳性样本存在的情况下试纸条才会只出现一条对照检测线，说明检测结果为阳性；在阴性对照和SARS样本存在的情况下，试纸条上均出现两条条带，说明检测结果为阴性。由此说明本发明检测SARS-CoV-2新冠病毒的特异性良好。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国科学院长春应用化学研究所
<120> 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物、探针和试剂盒
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 669
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
auggcagauu ccaacgguac uauuaccguu gaagagcuua aaaagcuccu ugaacaaugg 60
aaccuaguaa uagguuuccu auuccuuaca uggauuuguc uucuacaauu ugccuaugcc 120
aacaggaaua gguuuuugua uauaauuaag uuaauuuucc ucuggcuguu auggccagua 180
acuuuagcuu guuuugugcu ugcugcuguu uacagaauaa auuggaucac cgguggaauu 240
gcuaucgcaa uggcuugucu uguaggcuug auguggcuca gcuacuucau ugcuucuuuc 300
agacuguuug cgcguacgcg uuccaugugg ucauucaauc cagaaacuaa cauucuucuc 360
aacgugccac uccauggcac uauucugacc agaccgcuuc uagaaaguga acucguaauc 420
ggagcuguga uccuucgugg acaucuucgu auugcuggac accaucuagg acgcugugac 480
aucaaggacc ugccuaaaga aaucacuguu gcuacaucac gaacgcuuuc uuauuacaaa 540
uugggagcuu cgcagcgugu agcaggugac ucagguuuug cugcauacag ucgcuacagg 600
auuggcaacu auaaauuaaa cacagaccau uccaguagca gugacaauau ugcuuugcuu 660
guacaguaa 669
<210> 2
<211> 1260
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
augucugaua auggacccca aaaucagcga aaugcacccc gcauuacguu ugguggaccc 60
ucagauucaa cuggcaguaa ccagaaugga gaacgcagug gggcgcgauc aaaacaacgu 120
cggccccaag guuuacccaa uaauacugcg ucuugguuca ccgcucucac ucaacauggc 180
aaggaagacc uuaaauuccc ucgaggacaa ggcguuccaa uuaacaccaa uagcagucca 240
gaugaccaaa uuggcuacua ccgaagagcu accagacgaa uucguggugg ugacgguaaa 300
augaaagauc ucaguccaag augguauuuc uacuaccuag gaacugggcc agaagcugga 360
cuucccuaug gugcuaacaa agacggcauc auauggguug caacugaggg agccuugaau 420
acaccaaaag aucacauugg cacccgcaau ccugcuaaca augcugcaau cgugcuacaa 480
cuuccucaag gaacaacauu gccaaaaggc uucuacgcag aagggagcag aggcggcagu 540
caagccucuu cucguuccuc aucacguagu cgcaacaguu caagaaauuc aacuccaggc 600
agcaguaggg gaacuucucc ugcuagaaug gcuggcaaug gcggugaugc ugcucuugcu 660
uugcugcugc uugacagauu gaaccagcuu gagagcaaaa ugucugguaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaacugucac uaagaaaucu gcugcugagg cuucuaagaa gccucggcaa 780
aaacguacug ccacuaaagc auacaaugua acacaagcuu ucggcagacg ugguccagaa 840
caaacccaag gaaauuuugg ggaccaggaa cuaaucagac aaggaacuga uuacaaacau 900
uggccgcaaa uugcacaauu ugcccccagc gcuucagcgu ucuucggaau gucgcgcauu 960
ggcauggaag ucacaccuuc gggaacgugg uugaccuaca caggugccau caaauuggau 1020
gacaaagauc caaauuucaa agaucaaguc auuuugcuga auaagcauau ugacgcauac 1080
aaaacauucc caccaacaga gccuaaaaag gacaaaaaga agaaggcuga ugaaacucaa 1140
gccuuaccgc agagacagaa gaaacagcaa acugugacuc uucuuccugc ugcagauuug 1200
gaugauuucu ccaaacaauu gcaacaaucc augagcagug cugacucaac ucaggccuaa 1260
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taggcttgat gtggctca 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagatgtcca cgaaggatc 19
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctggattgaa tgaccacatg gaagctactt cattgcttct ttcag 45
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acattcttct caacgtgcca cacagctccg attacgagtt 40
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgcgtacgcg caaacagt 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggcactat tctgaccaga ccgc 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttggctacta ccgaagagct 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgcagcattg ttagcaggat t 21
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctggcccagt tcctaggtag tacagacgaa ttcgtggtgg tg 42
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gacggcatca tatgggttgc aagcgggtgc caatgtgat 39
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgagggagc cttgaataca ccaaaag 27
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gacggtaaaa tgaaagatct ca 22
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atcttggact gagatctttc attttaccgt c 31
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
taatacgact cactataggg gtatcgcaat 30
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caaaaaaccc ctcaagaccc gttta 25
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taatacgact cactataggg ggcgttccaa ttaacaccaa ta 42
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttttggcaa tgttgttcct tgaggaagtt gtagcacgat 40
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
taatacgact cactataggg gtatcgcaat 30
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caaaaaaccc ctcaagaccc gttta 25
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
taatacgact cactataggg ggcgttccaa ttaacaccaa ta 42
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cttttggcaa tgttgttcct tgaggaagtt gtagcacgat 40

Claims (4)

1.用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，含有M基因引物、N基因引物、M基因探针和N基因探针；
所述M基因引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的M-F3、M-B3、M-FIP、M-BIP和M-LP；
所述M-F3的序列为TAGGCTTGATGTGGCTCA；
所述M-B3的序列为AAGATGTCCACGAAGGATC；
所述M-FIP的序列为CTGGATTGAATGACCACATGGAAGCTACTTCATTG CTTCTTTCAG；
所述M-BIP的序列为ACATTCTTCTCAACGTGCCACACAGCTCCGATTA CGAGTT；
所述M-LP的序列为CGCGTACGCGCAAACAGT；
所述N基因引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的N-F3、N-B3、N-FIP、N-BIP和N-LP；
所述N-F3的序列为TTGGCTACTACCGAAGAGCT；
所述N-B3的序列为TGCAGCATTGTTAGCAGGATT；
所述N-FIP的序列为CTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTACAGACGAATTCGT GGTGGTG；
所述N-BIP的序列为GACGGCATCATATGGGTTGCAAGCGGGTGCCAAT GTGAT；
所述N-LP的序列为CTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAG；
所述M基因探针，包括物质的量比为1:1的M-hCG-P1和M-P2；
所述M-hCG-P1的序列为结合hCG-SNAP融合蛋白的M-P1；M-P1的序列为5′-NH2-C6-GAAGCGGTCTGGTCAGAAT-3′；
所述M-P2的序列为ATGGCACTATTCTGACCAGACCGC；
所述N基因探针，包括物质的量比为1:1的N-hCG-P1和N-P2；
所述N-hCG-P1的序列为结合hCG-SNAP融合蛋白的N-P1；N-P1的序列5′-NH2-C6-GACGGTAAAATGAAAGATCTCA-3′；
所述N-P2的序列为ATCTTGGACTGAGATCTTTCATTTTACCGTC。
2.根据权利要求1所述的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，所述M-hCG-P1的制备方法为：
步骤一、通过苄基鸟嘌呤使M-P1序列获得O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，得到M-BG-P1探针；
步骤二、制备并纯化hCG-SNAP融合蛋白；
步骤三、通过纯化的hCG-SNAP融合蛋白中SNAP蛋白的半胱氨酸亲核进攻M-P1序列上O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，使半胱氨酸与苄基形成稳定的硫醚共价键，获得M-hCG-P1探针。
3.根据权利要求1所述的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，所述N-hCG-P1的制备方法为：
步骤一、通过苄基鸟嘌呤使N-P1序列获得O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，得到N-BG-P1探针；
步骤二、制备并纯化hCG-SNAP融合蛋白；
步骤三、通过纯化的hCG-SNAP融合蛋白中SNAP蛋白的半胱氨酸亲核进攻N-P1序列上O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，使半胱氨酸与苄基形成稳定的硫醚共价键，获得N-hCG-P1探针。
4.根据权利要求1-3任何一项所述的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，还包括验孕试纸或验孕棒。
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