ES2592381T3 - Ensayos genéricos para la detección de virus de la gripe - Google Patents

Ensayos genéricos para la detección de virus de la gripe Download PDF

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Abstract

El método para cuantificar la cantidad de partículas intactas de virus de la gripe en una muestra, caracterizada en que se llevan a cabo los siguientes pasos: a. Se elimina de la muestra el ARN libre de virus b. Se aplica el método para detectar el ARN remante de virus en la muestra, que se caracteriza en que se amplifica una región en la que se conserva genoma de la gripe. c. La señal generada en el apartado (b) es comparado con la señal generada por ARN estándar d. Se concluye la cantidad de partículas de virus intactas.

Description

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Ensayos genericos para la deteccion de virus de la gripe Descripcion
Esta solicitud de patente reclama prioridad ante la solicitud de patente provisional de Estados Unidos 61/215, 704, presentada el 8 de mayo de 2009, y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos 61/217, 045, presentada el 26 de mayo de 2009.
CAMPO TECNICO
La presente invencion se refiere a nuevos, genericos metodos para la deteccion y cuantificacion de virus de la gripe. La invencion utiliza preferentemente una transcripcion inversa (RT-PCR) Tiempo Real (q-PCR) ensayo que amplifica una region conservada con cepas de gripe A o B. el ensayo de la invencion permite la cuantificacion de las moleculas ARN del virus de la gripe o partlculas de virus completas, independientemente de la cepa de virus en concreto (p.ej. humano, aviar, porcina). Los metodos de la invencion son particularmente aplicables como ensayos diagnosticos o en la monitorizacion de procesos de production de vacunas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Actualmente hay disponibles varios tipos de vacunas contra la gripe. Generalmente las vacunas se basan tanto en virus vivos como en virus inactivados. Las vacunas inactivadas pueden estar basadas en viriones completos, viriones “divididos”, o en antlgenos de superficie purificada (ver detalles en WO 2008/068631 al cual es expresamente referido). Las vacunas de la gripe son tlpicamente trivalentes y contienen dos cepas de gripe A y una cepa de gripe B. Ademas de los metodos tradicionales basados en produccion de huevos para las vacunas de la gripe, mas recientemente se han descrito metodos de fabrication basados en el cultivo de diferentes celulas (p. ej. Ver capltulos 17 y 18 en: Vaccines, eds. Plotkin & Oreinstein: 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0; Wilschut; Mc Elhaney, Palache in “Influenza”; 2. Edition; Elsevier 2006; ISBN 0-7234-3433-6 Capitulo 9).
La aplicacion de metodos basados en la deteccion de acido nucleico dentro del proceso de produccion de la vacuna de la gripe (p. ej. Para procesos de control de calidad) han sido limitados hasta ahora. Esto se debe al hecho de que las cepas de gripe utilizadas en la produccion de vacunas cambian de estacion a estacion, y por lo tanto para cada estacion serla necesario el desarrollo de un nuevo ensayo de deteccion de la cepa especlfica. La presente invencion proporciona un nuevo ensayo de acido nucleico que analiza una region conservada dentro del genoma de las cepas de gripe A y gripe B (independientemente del origen, p. ej. Humano, aviar, porcina). Estos ensayos son por lo tanto adecuados para el analisis de varias cepas e gripe.
La invencion proporciona un metodo para cuantificar la cantidad de partlculas de virus de la gripe intactas en una muestra, caracterizado porque se llevan a cabo los siguientes pasos:
a. Se elimina de la muestra el ARN de virus libre,
b. Se aplica un metodo para la identification del ARN de virus de la gripe remanente en la muestra, caracterizado en que se amplifica la region de conservation dentro del genoma de la gripe,
c. La senal generada en la parte (b) es comparado con la senal generada por el ARN estandar,
d. Se concluye la cantidad de partlculas de virus intacto.
La invencion tambien proporciona un metodo para la produccion de vacunas contra la gripe, en el cual se emplea un metodo de la invencion para cuantificar la cantidad de partlculas de virus de la gripe intactas en una muestra dentro de la etapa de fermentation del proceso de produccion basado en el cultivo de celulas, y que la cantidad de partlculas de virus sea cuantificada con objeto de determinar el tiempo optimo para cosechar los virus.
La invencion tambien proporciona un metodo para la produccion de vacunas contra la gripe basada en el cultivo de celulas, caracterizado porque se llevan a cabo los siguientes pasos:
- Las celulas se propagan en un recipiente de fermentacion;
- Se anaden semillas de virus;
- Se monitoriza la propagacion del virus empleando el metodo de la invencion para cuantificar la cantidad de partlculas de virus de la gripe intactas en una muestra;
- La suspension de virus es centrifugada y filtrada;
- El virus es purificado mediante fases de cromatografla y ultra-/diafiltracion, , inactivado, partido para solubilizar los antlgenos de superficie viral HA y NA;
- Los antlgenos son filtrados para obtener granel monovalente; y
- Opcionalmente, mezclando el granel monovalente en graneles multivalentes (tlpicamente graneles trivalentes) y depositandolo en el contenedor final.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
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La presente invencion describe un nuevo metodo para detectar ARN de virus de la gripe. El metodo de la invencion analiza una region conservada dentro del genoma de gripe A y gripe B, preferiblemente la region que codifica la protelna de la matriz (M). Las secuencias de nucleotidos de gen M de GenBank que fueron empleados para la alineacion de los genes A M de la gripe y los genes B M de la gripe son mostrados en las tablas 3 y 4, respectivamente.
Paras el analisis, se lleva a cabo un ensayo de acido nucleico. Un ensayo preferente es la Reaccion en Cadena de Polimerasa Transcriptasa Reversa (RT-PCR). En cualquier caso, tambien son aplicables metodos de ampliacion del ARN equivalentes, como es sabido por las personas expertas en la materia (Ampliation Basada en Secuencias de Acido Nucleico o NASBA™ como en el US-5409818; 3SR™; Ampliacion Mediante Transcription o TMA™ como en el US-5399491, etc.) el ensayo de acido nucleico es preferentemente ejecutado como ensayo en tiempo real (p. ej. “qPCR”; Taqman™, Lightcycler™; Scorpion™ etc.)
Descripcion detallada del preferente “una etapa RT-tiempo real PCR”
En una realization particularmente preferente, se emplea el ensayo una etapa RT-tiempo real PCR (“una etapa RT-qPCR). Al experto en la tecnica le es familiar la ejecucion de ensayos como el “una etapa RT qPCR”. Sabe como encontrar condiciones de reaccion detalladas para tal amplification. As! la reaccion de transcripcion reversa (RT) y la reaccion de amplificacion (qPCR) pueden ser realizadas en el mismo recipiente (p. ej. En un tubo sencillo o vial) mejor que en recipientes separados.
Preferiblemente, se emplean los juegos comercialmente adquiribles RT-PCR, p. ej. Qiagen QuantiTect™Virus o Invitrogen Super Script™ III Platinum™. Las senales fluorescentes generadas pueden ser analizadas utilizando sus respectivos softwares cicladores a tiempo real, como se conoce en la tecnica.
Los ensayos de acido nucleico de la invencion pueden ser cuantificados comparando las senales fluorescentes generadas con su respectiva senal estandar en acido nucleico, como se conoce en la tecnica. En dicho estandar, son preferiblemente empleadas una serie de diluciones de una transcripcion in vitro (IVT) de las respectivas regiones del virus. El IVT adecuado puede ser generado como es requerido o son comercialmente adquiribles suministros como p. ej. Panomics™ “Ifn-A” (282 nucleotidos) y “Ifn-B” (276 nucleotidos) moleculas de ARN mono catenarias de 10ng/ml.
Preferiblemente, RT-qPCR es realizado empleando las secuencias de cebadores y sondas como se muestra debajo en la tabla 1. De cualquier modo, la persona experta en la tecnica conoce como disenar adicionales, equivalentes cebadores y sondas dirigidas al genoma del virus que codifica la protelna M o a otras regiones conservadas dentro del genoma de la gripe. La persona experta en la tecnica conoce que las sondas Taqman mostradas en la tabla mas abajo pueden ser sustituidas por sondas LightCycler u otros sistemas de sondas a tiempo real.
En una realizacion particularmente preferente, los cebadores de SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 7 estan combinados con la sonda de SEQ ID NO 3 para la detection del virus de la gripe A. En otra realizacion preferente, los cebadores de SEQ ID NO 11 y SEQ ID No 1 estan combinados con la sonda de SEQ ID NO 9 para la deteccion de virus de la gripe B.
Los ejemplos (ver mas abajo) muestran que la invencion ensayo una etapa RT qPCR es capaz de detectar virus de la gripe de diferentes orlgenes.
Realizacion preferente: deteccion de virus intactos
En una realizacion preferente, los ensayos de la invencion se emplean para determinar la cantidad de partlculas intactas de virus en una muestra. Esto es particularmente util para monitorizar los procesos de production de vacunas (ver con mas detalle debajo). Una diferenciacion entre ARN de virus libre o ARN de nucleoprotelna- asociada y ARN dentro de las partlculas de virus puede ser conseguida mediante la elimination de ARN libre de la muestra antes de la amplificacion. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante tratamiento con RNasa, como se conoce en la tecnica. El proceso preferente es el siguiente:
a. Se toma una muestra de los viriones, viral ARN y nucleoprotelna (p. ej. Un volumen de 21pl).
b. Se incuba con RNasa. Por ejemplo, se emplea una mezcla de RNasa A/T1 (15U/7.5U) para 1 hora.
c. Se diluye la muestra. Por ejemplo, pre diluciones (1:100-1:10000) de muestra son realizadas empleando un
robot de pipetas para obtener resultados cuantitativos fiables en rango linear con el qPCR (C, 15-33);
d. Se extrae acido nucleico. Por ejemplo, extraction completamente automatizada mediante imanes;
e. qPCR. qPCR puede ser preparado por un robot de pipetas. El calculo de las copias/mL en las muestras
esta relacionada con la curva de UV-RNA in vitro transcrito (IVT) cuantificado.
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As! la invencion proporciona un metodo para cuantificar la cantidad de partlculas de virus de la gripe intactas en una muestra, comprendiendo las etapas: (a) eliminacion de ARN no viral encapsulado de la muestra (p. ej. Mediante digestion con RNasa); (b) amplificando y cuantificando el ARN remanente en la muestra (como se ha descrito), (c) empleando los resultados dela etapa (b) para calcular la cantidad de partlculas de virus intactas en la muestra. Este metodo es particularmente util para virus de gripe A y B, especialmente durante la fabrication de vacunas.
La etapa (b) puede incluir PCR cuantitativo (p. ej. RT-PCR). Los resultados de la etapa (b) son comparados con la senal generada por el ARN estandar como parte del calculo de la etapa (c). Entre las etapas (a) y (b), los viriones pueden ser tratados para liberar su ARN, dicha liberation puede ocurrir inherentemente mientras se realiza el proceso PCR.
Aplicacion preferente dela invencion en la produccion de vacuna para la gripe
Los ensayos de la invencion son particularmente utiles para la produccion de vacunas para la gripe basadas en huevos o basadas en cultivo de celulas (ver para revision: Wilschut; Mc Elhaney, Palache en “Influenza”; 2. Edition; Elsevier 2006; ISBN 0-7234-3433-6 Capltulo 9). La invencion puede ser utilizada en diferentes etapas durante la produccion de la vacuna, particularmente con objeto de monitorizar y cuantificar el rendimiento del virus en las primeras etapas del proceso. El proceso de la invencion resulta en principio adecuado para la produccion de varios tipos de vacuna para la gripe (p. ej. Virus vivo, viriones completamente inactivados, viriones “divididos”, antlgenos de superficie purificada; para mas detalle ver WO 2008/068631 a la cual expresamente se refiere la solicitud). En estos metodos de produccion, los viriones son cultivados y recolectados desde fluidos que contienen virus, p. ej. Fluido alantoideo o sobrenadante de cultivo celular. Para la purification de los viriones, pueden emplearse diferentes metodos, p. ej. Centrifugation zonal mediante el uso de una solution lineal de sacarosa que incluye detergente par interrumpir los viriones. Los antlgenos pueden ser purificados, tras la dilution opcional, mediante diafiltraci'on. Los viriones divididos se obtienen tratando viriones purificados con detergentes (p. ej. Etil-e'ter, polisorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Triton X-100, Triton N-101, bromuro de cetiltrimetilamonio, Tergitol NP9, etc.) Para producir preparados de subviriones, incluyendo el proceso de division “Tween-eter”. Metodos para la division de virus de la gripe, como por ejemplo, los bien conocidos en la materia (ver para revision WO 2008/068631). Ejemplos de vacunas de la gripe divididas son los productos BEGRlVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ y FLUSHIELD™. Los metodos de la invencion tambien pueden ser empleados en la produccion de vacunas vivas. Los virus en estas vacunas deben ser atenuados. Las vacunas de virus vivos incluyen el producto de Medlmmune FLUMIST™ (vacuna de virus viro trivalente). Las vacunas de virus de la gripe de antlgenos de superficie purificada comprenden la hemaglutinina de antlgenos de superficie y, generalmente, tambien la neuraminidasa. Los procesos para preparar estas protelnas en formas purificadas son bien conocidos en la tecnica. Los productos FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ y INFLUVAC™ son vacunas con subunidades de gripe. Otro modo de antlgeno inactivo es el virosoma (viral libre de acido nucleico como partlculas de liposomas). Los virosomas pueden preparase mediante solubilizacion de virus con un detergente seguido de la eliminacion de la nucleocapside y reconstitucion de la membrana que contiene las glicoprotelnas virales. Un metodo alternativo para preparar virosomas implica la adicion de glicoprotelnas de membrana viral para exceder la cantidad de fosfollpidos para generar liposomas con protelnas virales en sus membranas.
Aplicacion particularmente preferente de la invencion en la produccion de vacunas de la gripe basadas en cultivo de celulas
En una realization particularmente preferente, la invencion es utilizada en la produccion de vacunas contra la gripe basadas en cultivo de celulas. Las llneas celulares adecuadas se describen en p. ej. WO 2008/068631. Las llneas celulares mas adecuadas para el crecimiento de virus de la gripe son las llneas celulares MDCk. La llnea celular MDCK original esta disponible desde ATCC hasta CCL-34, pero tambien pueden emplearse derivados de dicha llnea celular u otras llneas celulares MDCK. Por ejemplo, en el WO 97/37000 se describe una llnea celular MDCK que fue adaptada para crecer en cultivos en suspension (“MDCK 33016”, depositado como DSM ACC 2219). Del mismo modo, WO01/64864 describe una llnea celular derivada-MDCK que crece en suspension en un cultivo libre de suero (“B-702”, depositado como FERM BP-7449). El WO2006/071563 describe celulas MDCK no tumorigenicas, incluyendo, “MDCK-S” (ATCC PTA-6500), “MDCK-SFIOI” (ATCC PTA-6501), “MDCK-SF 102” (ATCC PTA-6502) y “MDCK-SF 103” (PTA-6503). El WO2005/113758 describe llneas celulares de MDCK con gran susceptibilidad a la infection, incluyendo celulas “MDCK.5F1” (ATCC CRL-12042). Cualquiera de estas llneas celulares MDCK puede ser empleada.
El proceso de produccion de vacunas basadas en el cultivo de celulas generalmente comprende los siguientes pasos: el material inicial para cada granel monovalente es un vial simple del banco de celulas de trabajo MDCK (WCB). Las celulas se propagan en un medio qulmicamente definido para optimizar el crecimiento de las celulas durante la produccion. Los WCB se expanden por el paso secuencial en matraces de agitation seguido por un aumento proporcional en recipientes de fermentation mayores. Se anade la semilla de virus y se lleva a cabo la propagation del virus en el fermentador en un periodo comprendido de dos a cuatro dlas. Al final del ciclo de infeccion, la suspension del virus es centrifugada y filtrada para eliminar las celulas intactas residuales del cultivo a colectar. El granel centrifugado y filtrado denominado colecta de virus clarificado, es el final del proceso de fermentacion. La colecta de virus clarificado debe estar almacenada a temperatura ambiente (16-25°C) en un
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recipiente de almacenaje de acero inoxidable por mas de 24 horas. El virus de la gripe se purifica mediante etapas de cromatografia y ultra-/diafiltracion, inactivados por beta-propiolactona (BPL) y dividido por bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) para solubilizar los antigenos superficie viral HA y NA. El proceso de produccion del farmaco concluye con el filtrado del concentrado en el recipiente de granel final para obtener el granel monovalente. Finalmente, los graneles monovalentes pueden ser mezclados con graneles multivalentes (generalmente graneles trivalentes) y depositados en su contenedor final, p. ej. Jeringas. Esta es una practica estandar para minimizar la cantidad de lineas celulares de ADN residual en la vacuna final, con objeto de minimizar cualquier actividad oncogenica del ADN (ver en detalle WO2008/068631).
La presente invencion puede ser aplicada en diferentes puntos dentro de este proceso. De cualquier modo, es particularmente preferible que los metodos de la invencion sean empleados para la monitorizacion y/o cuantificacion del rendimiento del virus en las primeras etapas del proceso (fermentacion, recoleccion, hasta la inactivacion). Los ensayos de la invencion pueden ser empleados como suplementos o metodos alternativos del metodo del estado del arte (Difusion Radial Simple (SRD)). El metodo de la invencion es rapido (resultados en ~ 4 horas; SRD ~ 3 dias) y permite la aplicacion en gran cantidad de muestras. El metodo es independiente a reactivos especificos (p. ej. Anticuerpos especificos de la cepa). El ensayo de la invencion es particularmente aplicable cunado la sensibilidad del SRD es muy baja (antes de la purificacion/concentracion) o los resultados del SRD no son fiables (en la recoleccion/no se miden particulas HA asociadas al virus).
En otra realizacion particularmente preferente, el analisis de acido nucleico es precedido por una digestion de RNasa de la muestra de virus. De este modo es posible distinguir entre ARN de virus libre y particulas de virus intactas, y asi cuantificar las particulas de virus intactas.
Composicion de las vacunas y administracion de las vacunas
La presente exposicion tambien describe vacunas producidas mediante los procesos de fabrication de la invencion descritos anteriormente. Dichas vacunas generalmente contienen HA como inmunogeno principal, y las dosis de las vacunas son estandarizadas en referencia a los niveles de HA, generalmente medido mediante SRD. Las vacunas que existen generalmente contienen alrededor de 15pg de HA por cepa, aunque dosis menores pueden ser empleadas p. ej. Para ninos, o en situaciones pandemicas, o cuando se utiliza un auxiliar. Se han empleado dosis fraccionadas en ^ (p.ej. 7-5pg de HA por cepa), % y 1/8, asi como dosis mayores (p. ej. Dosis en 3x o 9x). En consecuencia las vacunas deben incluir entre 0.1 y 150pg de HA por cepa de gripe, preferiblemente entre 0.1 y 50pg p. ej. 0.1-20pg, 0.1-15pg, 0.1-10pg, 0.1-7.5pg, 0.5-5pg, etc. Dosis particulares incluyen p. ej. Alrededor de 45, alrededor de 30, alrededor de 15, alrededor de 10, alrededor de 7.5, alrededor de 5, alrededor de 3.8, alrededor de 3.75, alrededor de 1.9, alrededor de 1.5, etc. por cepa. Para vacunas vivas, la dosificacion es medida mediante la mediana de las dosis de cultivo de tejido infeccioso (TCID50) mas que por el contenido de HA, y es tipico un TDID50 comprendido entre el 106 y el 108 (preferiblemente entre 1065 - 1075) por cepa
Las cepas de gripe producidas mediante la invencion deben contener un HA natural como se haya en los virus de tipo salvaje, o un HA modificado. Por ejemplo, se conoce que el modificar HA para eliminar determinantes (p. ej. Regiones hiper-basicas alrededor del area d escision del HA1/HA2) que causan que un virus sea altamente patogeno en especies de aves. El uso de la llamada “genetica inversa” facilita dichas modificaciones.
Las cepas de virus de la gripe par ser empleadas en vacunas cambian de estacion a estacion. En periodos intepandemicos, las vacunas generalmente incluyen dos cepas de gripe A (H1N1 y H3N2) y una cepa de gripe B, y son tipicas las vacunas trivalentes. La invencion tambien puede ser empleada en la produccion de vacunas contra cepas virales de pandemia (p. ej. cepas a las cuales el recipiente de la vacuna y la poblacion humana general son inmunologicamente sensibles, particularmente al virus de la gripe A), como las cepas de subtipos H2, H5, H7 o H9 y tambien las cepas de subtipo H1, y vacunas contra la gripe para cepas pandemicas que pueden ser monovalentes o pueden estar basadas en una vacuna trivalente normal complementada por una cepa pandemica. Dependiendo de la estacion y en la natura del antigeno incluido en la vacuna, sin embrago, la invencion tambien puede ser incluida en la produccion de la vacuna contra uno o mas subtipos de HA, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16, y/o subtipo de NA, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, o N9.
Ademas de ser adecuado para la produccion de vacunas contra cepas inter pandemicas, las composiciones de la exposicion son particularmente adecuadas para la produccion de vacunas contra cepas pandemicas. Las caracteristicas de una cepa de gripe que le otorgan el potencial para causar un brote pandemico son: (a) contiene una nueva hemaglutinina comparada con la hemaglutinina que actualmente circula en las cepas humanas, p. ej. Una que no ha sido evidente en la poblacion humana en mas de una decada (p. ej. H2), o que no ha sido vista previamente en toda la poblacion humana (p. ej. H5, H6 o H9, que generalmente ha sido hallada solo en poblaciones de aves), de tal manera que la poblacion humana sera inmunologicamente sensible a la hemaglutinina de la cepa; (b) es capaz de ser horizontalmente transmitida en la poblacion humana; y (c) es patogena en humanos. Un virus con tipos de hamaglutinina H5 es preferente para inmunizaciones contra la gripe pandemica, como la cepa de H5N1. Otras posibles cepas incluyen el H53, H9N2, H2N2 y H7N7 y otras cepas pandemicas potencialmente emergentes y tambien la cepa H1N1.
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La composicion de la description puede incluir antlgeno(s) de una o mas (p.ej. 1, 2, 3, 4 o mas) cepas del virus de la gripe, incluyendo virus A y/o virus B. Cuando la vacuna contiene mas de una cepa de gripe, las diferentes cepas son generalmente cultivadas por separado y mezcladas una vez que los virus han sido recolectados y los antlgenos han sido preparados. As! el proceso de la invention debe incluir la etapa de mezclar antlgenos de una o mas cepas de gripe. La vacuna trivalente normalmente, incluye antlgenos de las cepas de virus de gripe A y una cepa de virus de gripe B. Una vacuna tetravalente tambien puede ser util, incluyendo antlgenos de dos cepas de virus de gripe A y dos cepas de virus de gripe B, o tres cepas de virus de gripe A y una cepa de virus de gripe B (WO2008/068631.
La fabrication de la composicion de la vacuna de acuerdo a la invencion es farmaceuticamente aceptable. Generalmente incluyen componentes adicionales a los antlgenos p.ej. generalmente se anaden uno o mas portadores y/o excipientes farmaceuticos. Como se describe mas adelante, tambien pueden anadirse adyuvantes. Una discusion a fondo sobre cuales estan disponibles en la referencia (WO2008/068631 al cual es expresamente referido). Las composiciones e la descripcion deben provechosamente incluir un adyuvante, que puede actuar para mejorar las inmunes respuestas (humorales y/o celulares) provocadas en un paciente que recibe la composicion. Los adyuvantes preferentes comprenden emulsiones aceite-en-agua. Varios de dichos adyuvantes son conocidos, y generalmente incluyen al menos un aceite y al menos un surfactante, siendo el aceite y el surfactante biodegradable (metabolizable) y biocompatible. El aceite debe comprender escualeno. Las gotas de aceite en la emulsion generalmente son de menos de 5pm de diametro, e idealmente tienen diametro submicronico, alcanzandose estos pequenos tamanos mediante un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Son preferibles gotas de tamanos inferiores a 220 nm ya que pueden ser sometidos a un filtrado de esterilizacion. Se describen en detalle los posibles adyuvantes en WO2008/068631 (pagina 14 siguiente; a lo que expresamente es referido; p. ej. MF59™). Entre los contenedores adecuados para la composicion de la presente exposition (o kit de componentes) se incluyen viales esteriles, jeringas (p. ej. Jeringas desechables), espray nasal, etc. Dichos contenedores se describen en detallen en el WO2008/068631 (pagina 31, al cual expresamente se refiere).
La exposicion describe una vacuna fabricada de acuerdo con la invencion. Estas composiciones de vacuna son adecuadas para la administration a pacientes humanos, y la exposicion describe un metodo de elevar la inmune respuesta en un paciente, comprendiendo la etapa de administracion de la composicion de la invencion al paciente (descrito en detalle en WO2008/068631; paginas 32 y siguientes), a los que expresamente se refiere).
Secuencias y Kits
La exposicion describe las secuencias de cebador y sonda esbozada en la Tabla 1 (SEQ ID Nos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11). SEQ ID NO: 8 incluye dos bases degeneradas y por lo tanto puede ser presentada como cuatro secuencias de oligonucleotidos separados e individuales.
Para gripe A: los cebadores directos incluyen SEQ ID Nos: 5, 2 y 7; un cebador inverso es SEQ ID NO: 4; y una sonda util es SEQ ID NO: 3. Para la gripe B: los cebadores inversos incluyen SEQ IF Nos: 8, 10, y 1; un cebador directo es SEQ ID NO: 11; y una sonda util es SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 6 es tambien un cebador directo para la gripe A. el termino “directo” se emplea solo por comodidad y se refiere a un cebador que teniendo el mismo sentido que las cadenas de codification contenedoras de ATG de la matriz de protelnas. Como el virus de la gripe tiene un genoma de cadena negativa los terminos “directo” e “inverso” pueden ser invertidos cuando se refieren a la hibridacion de un segmento de ARN genomico viral.
La exposicion tambien describe la combination especlfica de los cebadores SEQ ID Nos 4 y 7 con la sonda de SEQ ID NO 3 (gripe A), y la combinacion especlfica de los cebadores de SEQ ID Nos 11 y 1 con la sonda de SEQ ID NO 9 (gripe B), en particular en forma de kit. El kit puede contener mas componentes, p. ej. Amortiguadores, polimerasas y demas componentes reactivos para la amplification. Otro aspecto de la presente exposicion es empleado para las mencionadas secuencias, combinaciones y kits para la detection de los virus de la gripe y en particular para la cuantificacion de virus con procesos de production de vacunas para aplicaciones diagnosticas.
Otros cebadores utiles son SEQ ID NO: 12, 13, 14 y 15. Otras sondas utiles son SEQ ID Nos: 16 y 17. SEQ ID Nos: 14 y 15 pueden emplearse en combinacion con SEQ ID NO: 16. SEQ ID NO: 17 puede emplearse en combinacion con SEQ ID Nos: 4 y 7.
Las sondas (p. ej. SEQ ID Nos: 3 y 9) deben ser etiquetadas p. ej. Con una etiqueta de 6- carboxifluoresceina (6FAM) de 5'y/o una etiqueta de 3'” BlackBerry Quencher (BBQ)”.
La exposicion tambien describe acidos nucleicos que comprenden una secuencia nucleotido de SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11. Estos acidos nucleicos deben ser de cadena simple con una longitud de menos de 80 nucleotidos p. ej. Menos de 50 nucleotidos, o menos de 30 nucleotidos. Pueden utilizarse como cebadores y sondas para la deteccion de virus de la gripe. El acido nucleico puede tener el mismo residuo de 3'que el SEQ ID NO: p. ej. Puede comprender unas secuencias 5'-X-Y-3'donde: Y es una secuencia seleccionada del SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, y 11; y X es una secuencia nucleotido de uno o mas nucleotidos. El acido nucleotido con secuencias 5'-X-Y-3'puede hibridar con un acido nucleico matriz del virus de la gripe.
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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra la correlacion de las medidas de virus qPCR con cineticas de virus infecciosos conocidos, medidas durante la infeccion. El eje X indica las horas post infeccion. El eje Y muestra el numero de copias por mL evaluadas por qPCR en una escala logarltmica. La figura representa que la curva de qPCR corresponde a la cinetica de tltulo de virus infeccioso standard en baja multiplication de la infeccion. En particular, la descendencia del virus es medible en sobrenadantes despues de 16-24 horas y la maxima infectividad aparece en 48 horas. Cada llnea muestra un experimento diferente.
La figura 2 muestra la correlacion de las partlculas de virus evaluadas por microscopio electronico de transmision versus el numero de partlculas de virus evaluadas por qPCR de acuerdo con la presente invention. El eje X muestra el numero de partlculas de virus TEM por mL y el eje Y muestra el numero de copias por mL avaluados por qPCR.
MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCION Deteccion de diferentes subtipos de la gripe
Las cepas de virus de la gripe se obtienen del centro nacional de referencias de Alemania para gripe animal (Frierich Loeffler Institute, Riems). Las cepas se cultivan en celulas MDCK 33016PF y los sobrenadantes de paso uno y dos se analizan utilizando el metodo RT-PCR de la invencion empleando tanto un kit de Virus Qiagen QuantiTect™ como un kit Invitrogen Super Script(TM) III Platinum™. Los cebadores y sondas empleados son los representados en la tabla 1.
Cuando se utiliza el kit Virus QuantiTect™ se ejecutan los siguientes perfiles de temperatura:
- medida de la senal fluorescente: 60°C
- ratio de desnivel 2°C/s.
- paso RT: 50°C para 20 min
- activation Taq 95°C para 5 min
- ejecucion principal: 45 ciclos: 94°C para 15 s.; 60°C para 45 s. (proceso de 2 etapas) o 45 ciclos: 94°C para 15 s; 60°C para 30 s; 72°C para 30 s (proceso de 3 etapas).
Cuando se utiliza el kit Super Script™ III Platinum™ se ejecutan los siguientes perfiles de temperatura:
- medida de la senal fluorescente: 60°C
- ratio de desnivel 2°C/s.
- paso RT: 50°C para 15 min
- activacion Taq 95°C para 2 min
- ejecucion principal: 45 ciclos: 94°C para 15 s.; 60°C para 45 s
Cuando las senales fluorescentes se analizan empleando el respectivo software en tiempo real. Las senales son cuantificadas comparando la senal fluorescente generada con la respectiva senal de series de dilucion de un IVT. Los resultados mostrados en la tabla 2 demuestran que todos los subtipos de virus de la gripe testados pueden ser identificados con el mismo set de cebador y sonda. Esto muestra que los metodos de la invencion son capaces de detectar diversos subtipos de virus de la gripe. Los inventores tambien testaron las cepas de la gripe mostradas en la tabla 7.
Con objeto de evaluar la sensibilidad del metodo de la invencion, se han hecho una serie de diluciones de muestras que contienen tanto de cepas de la gripe A/Bayern/7/95 como de cepas B/Bayern/3/06. Las muestras estan sujetas a qPCR usando tanto el kit Virus QuantiTect™ como el kit Super Script™III Platinum™ de acuerdo con los metodos de la presente invencion (como se ha descrito anteriormente) o el Cebador A/B de virus de la gripe Cepheid™ y el Set de Sonda siguiendo el protocolo del fabricante Las senales fluorescentes se analizan empleando el respectivo software en tiempo real. Las senales son cuantificadas por comparacion de la senal fluorescente generada con la respectiva senal de las series de diluciones de un IVT. Los resultados se muestran en las tablas 5 y 6. Para la cepa de virus de la gripe A, se muestra que las partlculas de virus son aun detectables por encima de una dilution 1:1000000 cuando se emplean los metodos de la invencion mientras que el kit Cepheid puede detectar
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partlcuias de virus solo por encima de diluciones 1:100000. Para la cepa de virus de la gripe B, se muestra que las partlculas de virus son aun detectables por encima de una dilucion 1:10000000 mientras que el kit Cepheid puede detectar partlculas de virus solo por encima de diluciones 1:10000. Los metodos de la invencion son por lo tanto, mucho mas sensibles que los metodos del estado del arte anterior.
Cuantificacion de las partlculas de virus de la gripe en una muestra
Las partlculas de virus de la gripe se miden en muestras Brevemente, una muestra de 21pL estan sujetas a RNasa usando una mezcla de 15U de RNasa A y 7.5U de T1. La muestra se incuba con la mezcla de RNasa para una hora. La muestra pre-tratada se diluye en ratios de 1:100 a 1:10000 con objeto de obtener una dilucion en la cual el qPCR da resultados en un rango linear. La muestra esta sujeta al qPCR de acuerdo con los metodos de la invencion. Los resultados son comparados son una curva estandar empleando un ARN transcripto in vitro (IVT). Los resultados (representados en la Figura 1) muestran que las curvas obtenidas de los numeros de copias de qPCR corresponden a la cinetica de tltulos de virus infecciosos estandar en baja multiplicacion de la infeccion. En particular, la descendencia del virus es medible en sobrenadantes tras 16-24 horas y tltulos de infeccion maxima se observan a 48 horas.
Correlacion de partlculas de virus evaluada mediante microscopio de transmision electronica y qPCR de acuerdo con la presente invencion
Las cepas de virus de la gripe obtenidas son A/Bayern/7/95, A/New Caledonia/20/99, A/Hong Kong/8/68, B/Lee/40 y A/Puerto Rico/8/34 obtenidas de ABI online. El numero de partlculas de virus es evaluado mediante microscopio de transmision electronica (TEM). Con este fin, las partlculas de virus se aplican en rejillas banadas en cobre y secadas al aire. Despues el material se fija con 2.5% (v/v) glutaraldehldo, lavado y expuesto a 2% (w/v) acetato uranil acuoso y 2% (w/v) acido fosfotungstico (PTA) pH 6.5. Se determina el numero de partlculas de virus mediante TEM. El numero de partlculas de virus contadas por TEM es comparado con el numero de partlculas de virus evaluado por qPCR de acuerdo con la presente invencion. Los resultados (ver Figura 2) muestran que los metodos de la invencion determinan exactamente el numero de partlculas de virus en una muestra para varios diversos virus de la gripe.
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Tabla 1: secuencias de cebadores y probetas preferentes para la deteccion de virus de la gripe A y B. Las
secuencias de sonda son sondas Taqman™
Name (primer/probe) Sequence Genus Tm°C
1
InfBM_BR17 (primer) gcagatagaggcaccaattagtg B 62.9
2
InfA_M_BR9 (primer) caggccccctcaaag A 51.6
3
InfA_M_TMa (probe) aggtgacagg attg gtcttgtctttagcc A 70.4
4
InfA_MBR11 (primer) gcgtctacgctgcagtcc A 60.7
5
InfA_MBR12 (primer) cttctaaccgaggtcgaaacg A 61.3
6
InfA_MBR13 (primer) gaccaatcctgtcacctctgac A 6.0
7
InfAM_BR18 (primer) caggccccctcaaagc A 55.8
8
InfB_M_BR8 (primer) gtgctttytgtatatcagttargc B 60.1
9
InfB_M_TM (probe) agatggagaaggcaaagcagaactagc B 68.3
10
InfB_MBR10 (primer) gatagaggcaccaattagtg B 56.4
11
InfBM_BR16 (primer) gtttggagacacaattgcctacc B 62.9
12
BF (Youil) ctgtttggagacacaattgc B
13
BR (Youil) gtgctttytgtatatcag B
14
FluSw H1 F236 tgggaaatccagagtgtgaatcact A
15
FluSw H1 R318 cgttccattgtctg aactagrtgtt A
16
FluSw H1 TM292 ccacaatgtaggaccatgagcttgctgt A
17
InfA_M_swine aggtgacaagattggtcttgtctttagcc A
Tabla 2
Subtype
AIV-Strain HA-Test aPCR copies/ml
Passage Passage
1 2 1 2
H5N6
A/duck/Potsdam/22 128 64 2,9E+0 1,0E+0
H9N2
A/turkey/Germany/1 128 128 7,9E+0 3.0E+0
H3
R2076/3/07 64 64 6,8E+0 3,2E+0
H4N6
R2619/2/07 <2 <2 6,1E+0 <100
H6
R2707/2/07 <2 <2 4,9E+0 <100
H8
R2709/2/07 <2 <2 5,1E+0 <100
H2N1
R2711/2/07 <2 <2 2,0E+0 <100
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A/Bangkok/1/1979(H3N (1027)
A/Wellington/4/2003 (977)
A/canine/Texas/1/2004(H3N8) (1026)
A/Canterbury/152/2001 (1000)
A/chicken/Bangli Bali/BBPV6-1/2004 (981)
A/Chicken/California/9420/2001(H6N2) (1002)
A/chicken/Germany/R28/03(H7N7) (982)
A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2) (1027)
A/Dk/ST/5048/2001 (H3N8) (988)
A/duck/Hokkaido/9/99 (H9N2) (986)
A/Dunedin/10/2002 (977)
A/equine/Ohio/1/2003(H3N8) (1027)
A/FPV/Dobson/27 (H7N7) (1027)
A/Hong Kong/1073/99 (1025)
A/human/Zhejiang/16/2006(H5N1) (998)
A/Leningrad/134/17/57 (1027)
A/mallard/Alberta/24/01 (1027)
A/Memphis/15/1983 (1000)
A/New Caledonia/20/1999(H1N1) (985)
A/New York/719/1994 (978)
A/seal/Mass/1/80(H7N7) (1027)
A/swan/Mongolia/2/06(H5N1) (987)
A/swine/IN/PU542/04 (H3N1) (1030)
A/swine/Iowa/15/1930 (1027)
A/Thailand/1(KAN-1 )/2004(H5N1) (1039)
A/Thailand/676/2005(H5N1) (1003)
A/USSR/90/1977(H1 N1) (1027)
A/USSR/90/77 (1000)
A/Vietnam/CL119/2005(H5N1) (982)
AA/WDk/ST/1737/2000(H6N8) (990)
A/WDk/ST/988/2000(H4N9) (815)
AB166865
AB188819 AB189048 AB212651 AB239305 AF046082
AF073180
AF073181 AF073182 AF073185 AF073186 AF073187
AF073188
AF073189 AF073190 AF073192 AF073193 AF073195
AF073203
AF073205 AF156458 AF156459 AF156464 AF156466
AF156467
AF156468 AF203788 AF231360 AF231361 AF250486
AF262213
AF398876 AF401293 AF474049 AF474050 AF474051
AF474052
AF474053 AF474054 AF474055 AF474056 AF474057
AF474058
AF508687 AF508692 AF508693 AF508694 AF508695
AF508696
AF508697 AF508698 AF508700 AF508702 AY075029
AY130766
AY210030 AY210042 AY210047 AY210051 AY210053
AY210054
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AY210063
AY221538 AY241601 AY241613 AY724262 AY862621
AY210065
AY241591 AY241602 AY241614 AY724263 AY862622
AY210244
AY241592 AY241603 AY253755 AY737292 AY862623
AY210253
AY241593 AY241604 AY303652 AY737298 AY950237
AY210258
AY241594 AY241605 A303653 AY770077 AY950238
AY210264
AY241595 AY241606 AY303654 AY770998 AY950239
AY210265
AY241596 AY241607 AY303655 AY800234 AY950240
AY221530
AY241597 AY241608 AY303656 AY818145 AY950241
AY221531
AY241598 AY241609 AY340091 AY862615 CY002955
AY221532
AY241599 AY241610 AY590578 AY862616 CY004584
AY221533
AY651391 AY241611 AY609315 AY862617 CY004722
AY221536
AY651413 CY007036 AY611525 CY007220 CY005445
CY005519
AY653194 CY007044 AY646079 CY007228 CY005448
CY005606
CY006956 CY007052 CY007132 CY007236 CY007356
CY005653
CY006964 CY007060 CY007140 CY007244 CY007364
CY005692
CY006972 CY007068 CY007148 CY007252 CY007372
CY005832
CY006980 CY007076 CY007156 CY007260 CY007380
CY005839
CY006988 CY007084 CY007164 CY007268 CY007388
CY006045
CY006996 CY007092 CY007172 CY007292 CY007396
CY006924
CY007004 CY007100 CY007188 CY007300 CY007404
CY006932
CY007012 CY007108 CY007196 CY007316 CY007412
CY006940
CY007020 CY007116 CY007204 CY007340 CY007420
CY006948
CY007028 CY007124 CY007212 CY007348 CY007428
CY007436
CY007668 CY007868 CY008084 CY008349 CY008589
CY007444
CY007676 CY007876 CY008092 CY008357 CY008597
CY007452
CY007684 CY007884 CY008100 CY008365 CY008605
CY007460
CY007692 CY007892 CY008108 CY008373 CY008613
CY007468
CY007700 CY007900 CY008132 CY008381 CY008621
CY007476
CY007708 CY007916 CY008140 CY008389 CY008629
CY007484
CY007716 CY007924 CY008157 CY008397 CY008637
CY007492
CY007724 CY007932 CY008197 CY008405 CY008645
CY007500
CY007732 CY007940 CY008221 CY008413 CY008653
CY007508
CY007740 CY007948 CY008229 CY008421 CY008749
CY007516
CY007748 CY007956 CY008237 CY008429 CY008757
CY007524
CY007756 CY007964 CY008245 CY008437 CY008765
CY007532
CY007764 CY007988 CY008253 CY008445 CY008773
CY007540
CY007772 CY007996 CY008261 CY008477 CY008781
CY007548
CY007780 CY008004 CY008269 CY008485 CY008789
CY007556
CY007788 CY008012 CY008277 CY008493 CY008797
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CY007564
CY007796 CY008020 CY008285 CY008501 CY008805
CY007572
CY007804 CY008028 CY008293 CY008509 CY008821
CY007580
CY007812 CY008036 CY008301 CY008541 CY008829
CY007588
CY007820 CY008044 CY008309 CY008549 CY008837
CY007596
CY007828 CY008052 CY008317 CY008557 CY008845
CY007604
CY007844 CY008060 CY008325 CY008565 CY008853
CY007652
CY007852 CY008068 CY008341 CY008573 CY008861
CY007660
CY007860 CY008076 CY008333 CY008581 CY009021
CY009029
CY009581 CY010141 CY010413 CY015054 DQ064395
CY009037
CY009589 CY010149 CY010421 CY015074 DQ064396
CY009045
CY009597 CY010157 CY010429 CY015082 DQ064397
CY009077
CY009621 CY010165 CY010437 CY015097 DQ064398
CY009085
CY009757 CY010173 CY010445 CY015109 DQ064399
CY009093
CY009765 CY010181 CY010453 CY015116 DQ064402
CY009101
CY009789 CY010189 CY010461 CY015152 DQ064403
CY009109
CY009797 CY010197 Cry010469 CY015444 DQ064404
CY009117
CY009805 CY010205 CY010477 CY016125 DQ064405
CY009133
CY009813 CY010213 CY010549 CY016277 DQ064406
CY009141
CY009821 CY010221 CY010557 CY016285 DQ064407
CY009149
CY009829 CY010229 CY010765 CY016293 DQ083661
CY009157
CY009845 CY010237 CY010773 CY016301 DQ083665
CY009165
CY009853 CY010245 CY010781 DQ009919 DQ083666
CY009181
CY009861 CY010253 CY011065 DQ021745 DQ083668
CY009189
CY009877 CY010261 CY011081 DQ021746 DQ083669
CY009197
CY009885 CY010269 CY011089 DQ021758 DQ083670
CY009213
CY009933 CY010277 CY011409 DQ064381 DQ083671
CY009221
CY009941 CY010285 CY011777 DQ064382 DQ083672
CY009229
CY009949 CY010293 CY011785 DQ064383 DQ083675
CY009277
CY009957 CY010301 CY012433 DQ064384 DQ083678
CY009389
CY009965 CY010309 CY013241 DQ064385 DQ083679
CY009397
CY009973 CY010317 CY014672 DQ064386 DQ083682
CY009413
CY009981 CY010325 CY014822 DQ064387 DQ083686
CY009421
CY010085 CY010333 CY014881 DQ064388 DQ083687
CY009437
CY010093 CY010341 CY014910 DQ064389 DQ083688
CY009533
CY 010101 CY010349 CY015007 DQ064390 DQ083690
CY009541
CY010109 CY010365 CY015015 DQ064391 DQ083692
CY009549
CY 010117 CY010381 CY015020 DQ064392 DQ083697
CY009557
CY010125 CY010389 CY015028 DQ064393 DQ094252
CY009573
CY010133 CY010397 CY015034 DQ064394 DQ094255
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DQ094256
DQ094270 DQ095642 DQ320961 DQ320999 DQ376656
DQ094257
DQ095632 DQ095643 DQ320964 DQ321000 DQ376657
DQ094258
DQ095633 DQ095644 DQ320976 DQ321003 DQ376658
DQ094259
DQ095635 DQ095645 DQ320992 DQ321006 DQ376659
DQ094260
DQ095636 DQ095646 DQ320993 DQ323678 DQ376660
DQ094261
DQ095637 DQ236084 DQ320994 DQ351858 DQ376662
DQ094262
DQ095638 DQ237951 DQ320995 DQ351859 DQ376664
DQ094263
DQ095639 DQ320942 DQ320996 DQ351860 DQ376666
DQ094264
DQ095640 DQ320959 DQ320997 DQ366333 DQ376667
DQ094265
DQ095641 DQ320960 DQ320998 DQ376655 DQ376668
DQ376669
DQ376689 DQ492913 DQ492939 DQ492979 DQ997179
DQ376670
DQ449633 DQ492915 DQ492940 DQ508828 DQ997226
DQ376671
DQ482663 DQ492916 DQ492943 DQ508836 DQ997304
DQ376672
DQ482664 DQ492917 DQ492948 DQ643985 DQ997457
DQ376673
DQ482665 DQ492918 DQ492952 DQ650660 DQ997473
DQ376674
DQ485211 DQ492920 DQ492953 DQ650664 DQ997488
DQ376675
DQ485219 DQ492921 DQ492954 DQ676831 DQ997498
DQ376676
DQ485227 DQ492922 DQ492956 DQ676835 DQ997512
DQ376677
DQ492903 DQ492923 DQ492957 DQ676839 FLAM1A
DQ376678
DQ492904 DQ492925 DQ492959 DQ849018 FLAM1M2A
DQ376679
DQ492905 DQ492926 DQ492961 DQ997086 FLAM2C
DQ376680
DQ492906 DQ492927 DQ492964 DQ997099 IAU49119
DQ376683
DQ492907 DQ492928 DQ492967 DQ997108 IAU65564
DQ376684
DQ492909 DQ492929 DQ492971 DQ997119 IAU65571
DQ376686
DQ492911 DQ492930 DQ492973 DQ997124 IAU65574
DQ376688
DQ492912 DQ492937 DQ492975 DQ997138
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
B/Aichi/5/88 (1142)
B/Ann Arbor/1/1986 (1155)
BBangkok/460/03 (1074)
B/Barcelona/215/03 (1088)
B/Beijing/184/93 (1096)
B/Bucharest/795/03 (1087)
B/England/23/04 (1053)
B/Hong Kong/05/1972 (1154)
B/Hong Kong/330/2001 (1190)
B/Houston/1/91 (1079)
B/Ibaraki/2/85 (1141)
B/Jiangsu/10/03 (1059)
B/Lee/40 (1191)
B/Los Angeles/1/02 (1076)
B/Memphis/13/03 (1076)
B/Nanchang/6/96 (1076)
B/Oslo/71/04 (1095)
B/Panama/45/90 (1139)
B/Singapore/222/79 (1187)
B/Trento/3/02 (1077)
B/Victoria/504/2000 (1190)
B/Yamagata/1/73 (1188)
B B/Yamagata/K519/2001 (1076)
AB036878
AF100375 AF100377 AF100380 AF100381 AF100382 AF100383
AF100384
AF100385 AF100386 AF100387 AF100388 AJ783377 AJ783379
AJ783381
AJ783382 AJ783383 AJ783384 AJ783386 AJ783387 AJ783388
AJ783392
AJ783393 AJ783394 AJ783395 AY260941 AY260955 AY504613
AY504621
AY581971 AY581982 AY581983 AY687399 DQ508916 DQ508924
FLBMO
NC_002210
Tabla 5: A/Bayern/7/95
Dilution
TCID50/mL (8.1) Ct Ct Ct Ct
Quantitect Virus (Field-Test) 3-step 2-step
Superscript III Platinum Cepheid Influenza Virus A/B Primer and Probe Set ASR
undiluted
125.892.541 14,26 13,05 12,43 15,76
1:10
12.589.254 17,49 16,18 15,96 18,52
1:100
1.258.925 20,70 19,92 20,29 22,14
1:1000
125.893 24,50 22,77 23,22 25,23
1:10000
12.589 27,72 26,55 26,31 28,96
1:100000
1.259 31,12 30,14 29,25 33,26
1:1000000
126 35,57 36,68 32,99 0,00
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Dilution
TCID50/mL (7.9) Ct Ct Ct Ct
Quantitect Virus (Field- Test) 3-step 2-step
Superscript III Platinum Cepheid Influenza Virus A/B Primer and Probe Set ASR
Undiluted
79.432.823 15,47 14,49 13,59 16,91
1:10
7.943.282 18,61 18,10 16,99 19,45
1:100
794.328 22,20 21,32 20,96 23,29
1:1000
79.433 25,28 24,27 24,66 27,10
1:10000
7.943 28,92 28,11 28,16 30,96
1:100000
794 0,00 31,54 31,07 0,00
1:1000000
79 0,00 36,96 34,77 0,00
1:10000000
8
Tabla 7
A/Bayern/7/95
A/New Caledonia/20/99 B/Brisbane/60/2008
A/Brisbane/59/2007 IVR 148
A/PR/8/34 B/BadenWuerttemberg/3/2006
A/Brisbane/10/2007 IVR 147
A/Solomon Islands/03/2006 B/Florida/04/2006
A/California/04/2009
A/LJruguay 716/07 X-175C B/Fujian/1272/2008
A/California/07/2009 X179A
A/Uruguay/716/07 B/Lee/40
A/HH/01/2009
A/Wisconsin/67/2005 B/Malaysia/2506/2004
A/HK/8/68
B/Banglades h/3333/2007 B/Perth/210/2008
A/Mexiko/4108/2009
BBrisbane/33/2008

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. El metodo para cuantificar la cantidad de partlculas intactas de virus de la gripe en una muestra, caracterizada en que se llevan a cabo los siguientes pasos:
    a. Se elimina de la muestra el ARN libre de virus
    b. Se aplica el metodo para detectar el ARN remante de virus en la muestra, que se caracteriza en que se amplifica una region en la que se conserva genoma de la gripe.
    c. La senal generada en el apartado (b) es comparado con la senal generada por ARN estandar
    d. Se concluye la cantidad de partlculas de virus intactas
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde son conservadas regiones con los codigos de la protelna M parcial o completamente.
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el metodo proporciona una ampliacion que comprende SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 9.
  4. 4. El metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que se ejecuta el RT- qPCR de una etapa.
  5. 5. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 4 caracterizado en que al menos uno de los cebadores y las probetas de la Tabla 1 (SEQ ID Nos 1-11) son utilizados
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, donde en la etapa (a) se elimina el ARN mediante tratamiento con RNasa.
  7. 7. El metodo para la produccion de vacunas para la gripe, en el cual el metodo descrito es el de una de las reivindicaciones precedentes donde la etapa de fermentacion se basa en un proceso de cultivos celulares, y en que la cantidad de partlculas de virus es cuantificada con objeto de determinar el tiempo optimo para recolectar los virus.
  8. 8. El metodo para la produccion de vacunas para la gripe basada en cultivos celulares, caracterizada en que se ejecutan los siguientes pasos:
    a. Las celulas se propagan en un recipiente de fermentacion
    b. Se anaden semillas de virus
    c. La propagacion del virus se monitoriza utilizando el metodo de las reivindicaciones 1-6
    d. La suspension de virus es centrifugada y filtrada
    e. El virus es purificado por procesos de cromatografla y ultra-/di filtracion, inactivados, interrumpidos para solubilizar antlgenos virales de superficie HA y Na.
    f. Los antlgenos son filtrados para obtener graneles monovalentes
    g. Opcionalmente, mezclando el granel monovalente con granel multivalente, mas preferiblemente graneles trivalente, y rellenando el contenedor final.
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