KR20120014924A - 인플루엔자 바이러스의 검출을 위한 일반적 분석법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 검출 및 정량을 위한 신규한 일반적 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인플루엔자 A 또는 B 주 내의 보존 영역을 증폭하는 역전사(RT-PCR) 실시간(q-PCR) 분석법을 사용한다. 분석법은 특정 바이러스 주(예를 들면, 사람, 조류, 돼지 플루)와 무관하게, 인플루엔자 바이러스 RNA 분자 또는 전체 바이러스 입자의 정량을 허용한다. 방법은 진단 분석법으로서 또는 백신 생산 공정의 모니터링에 있어서 구체적으로 적용가능하다.

Description

인플루엔자 바이러스의 검출을 위한 일반적 분석법{GENERIC ASSAYS FOR DETECTION OF INFLUENZA VIRUSES}

이 특허 출원은 2009년 5월 8일에 출원된 미국 가특허출원 61/215,704, 및 2009년 5월 26일에 출원된 미국 가특허출원 61/217,045의 우선권을 주장하며, 이 둘다의 전체 내용은 여기에 참고로 포함된다.

기술분야

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 검출 및 정량을 위한 신규한 일반적 방법에 관한 것이다. 본 발명은 바람직하게는 인플루엔자 A 또는 B 주 내의 보존 영역(conserved region)을 증폭하는 역전사(RT-PCR) 실시간(q-PCR) 분석법(assay)을 사용한다. 본 분석법은 특정 바이러스 주(예를 들면, 사람, 조류, 돼지 플루)와 무관하게, 인플루엔자 바이러스 RNA 분자 또는 전체 바이러스 입자의 정량을 허용한다. 본 발명 방법은 진단 분석법으로서 또는 백신 생산 공정의 모니터링에 있어서 구체적으로 적용가능하다.

여러가지 형태의 인플루엔자 백신이 현재 이용가능하다. 백신은 일반적으로 생바이러스나 아니면 불활성화된 바이러스에 기초한다. 불활성화된 백신은 전체 비리온, '분할(split)' 비리온, 또는 정제된 표면 항원에 기초할 수도 있다(자세한 내용은 명백히 참고되는 WO 2008/068631 참조). 인플루엔자 백신은 전형적으로 3가이고 두개의 인플루엔자 A 주 및 하나의 인플루엔자 B주를 함유한다. 인플루엔자 백신에 대한 전통적인 난 기재 생산 방법이외에, 다른 세포 배양물 기재 제조방법들이 더 최근에 기술되었다(예를 들면, Vaccines, eds. Plotkin & Orenstein; 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0에서 제 17장 및 제 18장; Wilschut; Mc Elhaney, Palache in "Influenza"; 2. Edition; Elsevier 2006; ISBN 0-7234-3433-6 Chapter 9 참조).

인플루엔자 백신 생산 방법(예를 들면, 품질 관리 공정을 위한 것) 내에서 핵산 기재 검출 방법의 적용은 이제까지 제한되었다. 이것은 백신 생산에 사용된 인플루엔자 주들은 계절에 따라 변한다는 사실과, 따라서 모든 계절에 대해, 주에 특이적인 검출 분석법이 개발되는 것이 필요할 것이라는 사실에 기인한다.

본 발명은 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 주 (기원, 예를 들면, 사람, 조류, 돼지 플루와 무관함)의 게놈 내의 보존 영역을 분석하는 신규한 핵산 분석법을 제공한다. 그러므로 이들 분석법은 여러가지 인플루엔자 주를 분석하기에 적합하다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 RNA를 검출하는 신규한 방법을 기술한다. 본 방법은 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스 게놈 내의 보존 영역, 바람직하게는 매트릭스(M) 단백질을 코딩하는 영역을 분석한다. 인플루엔자 A M 유전자 및 인플루엔자 B M 유전자의 정렬에 사용된 GenBank로부터의 M 유전자 뉴클레오티드 서열은 각각 표 3 및 표 4에 나타낸다.

분석을 위해, 핵산 분석법이 행해진다. 바람직한 분석법은 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction: RT-PCR)이다. 그러나, 균등한 RNA 증폭법도 또한 당업자에게 알려진 바와 같이 적용가능하다(US-5409818에서와 같은 Nucleic Acid Sequence Based Amplification 또는 NASBA™; 3SR™; US-5399491에서와 같은 Transcription Mediated Amplification 또는 TMA™ 등). 핵산 분석법은 바람직하게는 실시간 분석법(예를 들면 "qPCR"; Taqman™, Lightcycler™; Scorpion™ 등)으로서 실행된다.

바람직한 "일단계 RT-실시간 PCR" 의 상세한 설명

특히 바람직한 구체예에서, 일단계 RT-실시간 PCR 분석법이 사용된다("일단계 RT-qPCR"). 당업자는 이러한 "일단계 RT qPCR" 분석법을 행하는 것에 정통하다. 당업자는 이러한 증폭을 위한 상세한 반응 조건을 찾는 방법을 알고 있다. 따라서 역전사 반응(RT) 및 증폭 반응(qPCR)은 별도 용기에서 보다는 같은 용기(예를 들면, 단일 튜브 또는 바이알)에서 수행될 수 있다.

바람직하게는, 상업적으로 이용가능한 RT-PCR 키트, 예를 들면 Qiagen QuantiTect™ 바이러스 키트 또는 Invitrogen Super Script™ III Platinum™ 키트가 사용된다. 발생된 형광 신호는 당업계에서 알려진 바와 같이, 각각의 시간 사이클러 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있다.

본 발명 핵산 분석법은 발생된 형광 신호를 당업계에서 알려진 바와 같이 표준 핵산의 각각의 신호와 비교함으로써 정량될 수 있다. 이러한 표준으로서, 각각의 바이러스 영역의 인비트로 전사(IVT)의 일련의 희석이 바람직하게 적용된다. 적합한 IVTs는 필요에 따라 발생시킬 수 있고 또는 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면 Panomics™는 "Ifn-A" (282개 뉴클레오티드) 및 "Ifn-B" (276개 뉴클레오티드) 단일 스트랜드 RNA 분자(10ng/ml).

바람직하게는, RT-q PCR은 이하 표 1에서 나타낸 바와 같이 프라이머 및 프로브 서열을 사용하여 수행된다. 그러나, 당업자는 M 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈에 대해서 또는 인플루엔자 게놈 내의 다른 보존 영역에 대한 추가의 균등한 프라이머 및 프로브를 설계하는 방법을 알고 있다. 당업자는 이하 표에 나타낸 Taqman 프로브가 균등한 Lightcycler 프로브 또는 다른 실시간 프로브 시스템에 의해 치환될 수 있다는 것을 알고 있다.

특정 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 7의 프라이머는 인플루엔자 바이러스 A의 검출을 위해 SEQ ID NO 3의 프로브와 조합한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO 11 및 SEQ ID NO 1의 프라이머들을 인플루엔자 B 바이러스의 검출을 위해 SEQ ID NO 9의 프로브와 조합한다.

실시예(이하 참조)는 본 발명의 일단계 RT qPCR 분석법이 다른 기원으로부터의 인플루엔자 바이러스들을 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.

바람직한 구체예: 천연 바이러스의 검출

특정 바람직한 구체예에서, 본 발명 분석법은 샘플 내에서 천연 바이러스 입자의 양을 결정하기 위해 사용된다. 이것은 백신 생산 방법을 모니터링하는데 특히 유용하다(이하의 상세한 내용 참조). 유리 바이러스 RNA 또는 핵단백질-연관 RNA 및 바이러스 입자 내의 RNA 간의 차별화는 증폭에 앞서 샘플로부터 유리 RNA를 제거함으로써 달성될 수 있다. 이것은 당업계에 알려진 바와 같이, 예를 들어서 RNase 처리에 의해 행해질 수 있다. 바람직한 방법은 다음과 같다:

(a) 비리온, 바이러스 RNA 및 핵단백질의 샘플을 취한다(예를 들면 21μl 부피).

(b) RNase와 인큐베이션시킨다. 예를 들면, 1시간 동안 RNase A/T1 (15U/7.5U)의 혼합물을 사용한다).

(c) 샘플을 희석한다. 예를 들면, 샘플의 사전희석(1:100-1:10000)을 qPCR (C_t 15-33)의 선형 범위에서 신뢰할만한 정량분석 결과을 얻기 위해 피페팅 로봇을 사용하여 수행한다;

(d) 핵산을 추출한다. 예를 들면, 자기 비드를 사용함에 의한 완전 자동화된 vRNA 추출;

(e) qPCR. qPCR은 피펫팅 로봇에 의해 설정될 수 있다. 샘플 중의 mL 당 카피 수의 계산은 UV-정량된 인비트로 전사된 RNA(IVT)의 표준 곡선에 관계된다.

따라서 본 발명은: (a) 샘플로부터 비비리온(non-virion) 캡슐화 RNA를 제거하는 단계(예를 들면 RNase 분해(digestion)에 의함); (b) 샘플에서 나머지 RNA를 증폭 및 정량하는 단계(예를 들면 여기 개시된 바와 같음); (c) 단계 (b)의 결과를 사용하여 샘플에서의 천연 바이러스 입자의 양을 계산하는 단계를 포함하는 샘플에서 천연 바이러스 입자의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 본 방법은 특히 백신 제조 동안에 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대해 특히 유용하다.

단계 (b)는 정량분석 PCR(예를 들면 RT-PCR)을 수반할 수 있다. 단계 (b)의 결과는 단계 (c) 계산의 일부로서 표준 RNA에 의해 발생된 신호와 비교될 수 있다. 단계 (a) 및 (b)의 사이에, 비리온은 그것들의 RNA를 방출하도록 처리될 수도 있고, 또는 이 방출은 PCR 공정이 수행됨에 따라 고유하게 일어날 수도 있다.

인플루엔자 백신 제조에서 본 발명의 바람직한 용도

본 발명 분석법은 난 기재 또는 세포 배양물 기재 인플루엔자 백신 제조에 특히 유용하다(검토를 위해, Wilschut; Mc Elhaney, Palache in "Influenza"; 2. Edition; Elsevier 2006; ISBN 0-7234-3433-6 Chapter 9 참조). 본 발명은 특히 초기 공정 단계들에서 바이러스 수율을 모니터링 및 정량하기 위해 백신 제조 동안에 다른 단계들에서 사용될 수 있다. 본 발명 방법은 원칙적으로 여러가지 형태의 인플루엔자 백신 (예를 들면, 생바이러스, 불활성화된 전체 비리온, '분할' 비리온, 정제된 표면 항원; 자세한 내용은 출원인이 명백하게 참고한 WO 2008/068631 참조)의 제조에 유용하다. 이들 제조 방법에서, 비리온은 바이러스 함유 유체, 예를 들면 알란토인 유체 또는 세포 배양물 상청액에서 성장시키고 그로부터 수집된다. 비리온의 정제를 위해, 여러가지 방법들, 예를 들면 비리온을 붕괴하기 위해 세제를 포함하는 선형 수크로스 기울기 용액을 사용하는 존(zonal) 원심분리가 적용가능하다. 그 다음 선택적 희석 후 정용여과(diafiltration)에 의해 항원들을 정제할 수도 있다. 분할 비리온은 정제된 비리온을 세제(예를 들면 에틸에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, Triton X-100, Triton N-101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, Tergitol NP9, 등)로 처리하여 서브비리온 제제를 생산함으로써 얻어지며, '트윈 에테르(Tween-ether)' 분할 공정을 포함한다. 인플루엔자 바이러스를 분할하는 방법은, 예를 들면, 당업계에 잘 알려져 있다(검토를 위해 WO 2008/068631 참조). 분할 인플루엔자 백신의 예들은 BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품들이다. 본 발명의 방법은 또한 생 백신의 제조에 사용될 수도 있다. 이들 백신에서 바이러스는 약독화될 수도 있다. 생바이러스 백신은 MedImmune's FLUMIST™ 제품 (3가 생바이러스 백신)을 포함한다. 정제된 인플루엔자 바이러스 표면 항원 백신은 표면 항원 적혈구응집소를 포함하고, 전형적으로는, 또한 뉴라미니다제를 포함한다. 이들 단백질을 정제된 형태로 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 인플루엔자 서브유닛 백신이다. 불활성화된 항원의 또 다른 형태는 비로솜(핵산 없는 바이러스 유사 리포좀성 입자)이다. 비로솜은 바이러스의 세제로의 용해화와 이어서 뉴클레오캡시드의 제거 및 바이러스 당단백질을 함유하는 멤브레인의 복원에 의해 제조될 수 있다. 비로솜을 제조하는 대안의 방법은 과잉량의 인지질에 바이러스성 멤브레인 당단백질을 첨가하여 그것들의 멤브레인에 바이러스성 단백질을 갖는 리포솜을 제공하는 것을 수반한다.

세포 배양물 기재 인플루엔자 백신 제조에서 본 발명의 특히 바람직한 용도

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 세포 배양물 기재 인플루엔자 백신 제조에서 사용된다. 적합한 셀라인은 예를 들면, WO 2008/068631에 기술되어 있다. 인플루엔자 바이러스를 성장시키기 위한 가장 바람직한 셀라인은 MDCK 셀라인이다. 원래의 MDCK 셀라인은 ATCC로부터 CCL-34로서 입수되나, 이 셀라인의 유도체 및 다른 MDCK 셀라인도 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, WO97/37000에서 MDCK 셀라인이 개시되어 있는데 이것이 현탁 배양물에서의 성장을 위해 채택되었다('MDCK 33016', DSM ACC 2219로서 기탁됨). 유사하게, WO01/64846은 혈청없는 배양물에서 현탁액에서 성장하는 MDCK-유도된 셀라인을 개시한다('B-702', FERM BP-7449로서 기탁됨). WO2006/071563은 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF1O1' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103' (PTA-6503)를 포함하는 비종양원성 MDCK 세포를 개시한다. WO2005/113758은 'MDCK.5F1' 세포(ATCC CRL-12042)를 포함하는 감염에 높은 민감성을 갖는 MDCK 셀라인을 개시한다. 이들 MDCK 셀라인 중 어떤 것도 사용될 수 있다.

세포 배양물 기재 백신 생산 방법은 보통 다음 단계들을 포함한다: 각 1가 벌크를 위한 출발물질은 MDCK 작업 셀 뱅크(WCB)의 단일 바이알이다. 세포들은 생산 동안에 세포 성장을 최적화하기 위해 화학적으로 정의된 배지에서 전파시킨다. WCB는 스핀너 플라스크와 이어서 더 큰 발효 용기에서 스케일업에 의해 확장된다. 시드 바이러스가 첨가되고 발효장치에서 바이러스 전파는 2 내지 4일의 기간에 걸쳐 수행된다. 감염 사이클의 말기에, 바이러스 현탁액을 원심분리하고 여과하여 배양 수집물로부터 잔류 천연 세포를 제거한다. 원심분리된 여과된 벌크라 칭하는 분류된 바이러스 수집물이 발효 공정의 끝이다. 분류된 바이러스 수집물은 스테인레스강 저장 용기에서 24시간까지의 시간 동안 실온(16-25°C)에서 저장될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 크로마토그라피 및 한외-/정용여과 단계에 의해 정제되고, 베타-프로피오락톤(BPL)에 의해 불활성화되고 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)에 의해 붕괴되어 바이러스 표면 항원 HA 및 NA를 가용화한다. 약물 물질 생산 방법은 최종 벌크로 하여 1가 벌크를 얻기 위한 농축물의 여과로 끝난다. 최종적으로, 1가 벌크는 배합되어 다가 벌크로 될 수 있고(전형적으로 3가 벌크) 그것들의 마지막 용기, 예를 들면 시린지로 충전된다. DNA의 어떤 발암 활성을 최소화하기 위해, 최종 백신에서 잔류 셀라인 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 실시이다(상세한 내용은 WO 2008/068631 참조).

본 발명은 이 공정 내의 다른 지점들에서 적용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법은 초기 공정 단계(발효, 수집, 불활성화까지)에서 바이러스 수율의 모니터링 및/또는 정량을 위해 사용되는 것이 특히 바람직하다. 본 발명 분석법은 최신 기술의 방법(단일 방사 확산(SRD))에 보충 또는 대안의 방법들로서 적용될 수 있다.

본 발명 방법은 신속하고(~4시간 내; SRD ~3일 내의 결과) 높은 샘플 산출량으로 적용을 허용한다. 방법은 특정 시약(예를 들면 주(strain) 특이적 항체)와 무관하다. 본 발명 분석법은 SRD의 감도가 너무 낮거나(정제 및 농축 전) 또는 SRD 결과가 신뢰할만하지 못한 경우(수집시에/바이러스 입자 연관 HA가 측정되지 않는 경우)에 구체적으로 적용가능하다.

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 바이러스를 수집하는 최적 시간을 결정하기 위해, 발효의 동안에 바이러스 로딩을 정량하기 위해 사용된다.

더욱 구체적으로 바람직한 구체예에서, 핵산 분석은 바이러스 샘플의 RNase 분해(digestion)가 선행된다. 유리 바이러스 RNA 및 천연 바이러스 입자 간에 구별하는 것과 따라서 천연 바이러스 입자를 정량하는 것이 가능하다.

백신 조성물 및 백신 투여

본 발명은 또한 상기한 본 발명의 제조 방법에 의해 생산된 백신을 제공한다. 이러한 백신은 전형적으로 주면역원으로서 HA를 함유하며, 백신 투여량은 전형적으로 SRD에 의해 측정된, HA 수준을 참고하여 표준화된다. 현존하는 백신은 전형적으로 주당 약 15μg of HA를 함유하나, 더 낮은 투여량이 예를 들면 어린이를 위해, 유행병 상황에서, 또는 어주번트를 사용할 때 사용될 수 있다. 더 높은 투여량(예를 들면 3× 또는 9× 투여량)이 사용된 것과 같이, 1/2(즉 주당 7.5μg HA), 1/4 및 1/8과 같은 부분 투여량이 사용되었다. 따라서 백신은 인플루엔자 주당 0.1 내지 150μg의 HA, 바람직하게는 0.1 내지 50μg, 예를 들면 0.1-20μg, 0.1-15μg, 0.1-10μg, 0.1-7.5μg, 0.5-5μg 등을 포함할 수 있다. 구체적인 투여량은 주당 예를 들면 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 3.75, 약 1.9, 약 1.5 등을 포함한다. 생 백신에 대해, HA 함량 보다는 중간(median) 조직 배양물 감염 투여량(TCID50)에 의해 투여(dosing)가 측정되며, 주당 10⁶ 내지 10⁸ (바람직하게는 10^6.5-10^7.5)의 TCID50이 전형적이다.

본 발명으로 생산된 인플루엔자 주는 야생형 바이러스, 또는 변형된 HA에서 발견되는 바와 같이 자연 HA를 가질 수도 있다. 예를 들면, 바이러스가 조류 종에서 고도로 병원성이도록 야기하는 결정기(예를 들면 HA1/HA2 절단 부위 둘레의 과염기성(hyper-basic) 영역)를 제거하기 위해 HA를 변형시키는 것은 공지이다. 소위 "역 유전학(reverse genetics)"의 사용은 이러한 변형을 용이하게 한다.

백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 주는 계절에 따라 변한다. 대유행 기간 중, 백신은 전형적으로 두개의 인플루엔자 A주 (H1N1 및 H3N2) 및 하나의 인플루엔자 B주를 포함하며, 3가 백신이 전형적이다. 본 발명은 또한 유행병 바이러스 주(즉, 백신 수용자 및 일반 사람 집단이 면역반응을 겪지 않은(immunologically naive) 주, 특히 인플루엔자 A 바이러스의 주), 예를 들면 H2, H5, H7 또는 H9 서브타입 주 및 또한 H1 서브타입 주에 대한 백신 생산에 사용될 수도 있고, 유행병 주에 대한 인플루엔자 백신은 1가일 수도 있고 또는 유행병 주에 의해 보충된 정상적인 3가 백신에 기초할 수도 있다. 그러나, 계절과 백신에 포함된 항원의 성질에 따라, 본 발명은 또한 HA 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H1O, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16, 및/또는 NA 서브타입 Nl, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9 중 한가지 이상에 대한 백신 생산에 사용될 수도 있다.

대유행 기간 중 주에 대한 백신의 생산에 적합할 뿐만아니라, 본 발명의 조성물은 유행병 주에 대한 백신의 생산에 특히 유용하다. 유행병 출현을 야기할 가능성을 제공하는 인플루엔자 주의 특징은: (a) 그것이 현재 유행하는 사람 주에서 혈구응집소와 비교하여 새로운 혈구응집소, 즉 10년 이상동안 사람 집단에서 분명하지 않거나(예를 들면 H2), 또는 사람 집단에서 이전에는 전혀 보여지지 않은 것(예를 들면, 일반적으로 조류 집단에서만 발견된 H5, H6 또는 H9), 따라서 사람 집단이 주(strain)의 혈구응집소에 면역반응을 겪지않을 것을 함유하며; (b) 그것은 사람 집단에서 수평적으로 전염될 수 있고; (c) 그것은 사람에게 병원성이다. H5 혈구응집소 타입을 갖는 바이러스는 H5N1 주와 같은 유행병 인플루엔자에 대해 면역화하기에 바람직하다. 다른 가능한 주는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 그리고 어떤 다른 출현하는 잠재적으로 유행병 주 및 또한 H1N1 주를 포함한다.

본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는 하나 이상의(예를 들면 1, 2, 3, 4 또는 그 이상) 인플루엔자 바이러스 주로부터의 항원(들)을 포함할 수 있다. 백신이 인플루엔자의 하나 이상의 주를 포함하는 경우에, 다른 주들은 전형적으로 따로따로 성장되고 바이러스를 수집하고 항원을 제조한 후 혼합된다. 따라서 본 발명 방법은 하나 이상의 인플루엔자 주로부터의 항원을 혼합하는 단계를 포함할 수도 있다. 두개의 인플루엔자 A 바이러스 주와 하나의 인플루엔자 B 바이러스 주로부터의 항원을 포함하는 3가 백신이 전형적이다. 두개의 인플루엔자 A 바이러스 주와 두개의 인플루엔자 B 바이러스 주로부터의 항원을 포함하거나, 또는 세개의 인플루엔자 A 바이러스 주와 하나의 인플루엔자 B 바이러스 주로부터의 항원을 포함하는 4가 백신도 또한 유용할 수 있다(WO2008/068631).

본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 약학적으로 허용가능하다. 그것들은 보통 항원에 추가하여 성분들을 포함하며, 예를 들면 그것들은 전형적으로 하나 이상의 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 이하에서 기술되는 바와 같이, 어주번트가 또한 포함될 수 있다. 이러한 성분들의 충분한 논의는 참고문헌 (명백히 참고되는 WO2008/068631)에서 이용가능하다. 본 발명의 조성물은 유리하게는 조성물을 수용하는 환자에서 유발된 면역반응(체액성 및/또는 세포성)을 향상시키는 기능을 할 수 있는 어주번트를 포함할 수도 있다. 바람직한 어주번트는 수중유 에멀션을 포함한다. 여러가지 이러한 어주번트는 공지이고, 그것들은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하고, 오일(들) 및 계면활성제(들)는 생분해성(대사가능) 및 생체적합성이다. 오일은 스쿠알렌을 포함할 수도 있다. 에멀션 중의 오일 방울은 일반적으로 직경이 5μm 미만이고, 이상적으로는 미크론이하 직경을 가지며, 이들 작은 크기는 마이크로플루이다이저로 달성되어 안정한 에멀션을 제공한다. 220nm 미만의 크기를 갖는 방울들이 여과멸균시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 잠재적인 어주번트는 WO2008/068631 (14페이지 이하; 명백히 참고됨; 예를 들면 MF59™)에 상세히 기술되어 있다. 본 발명의 조성물을 위한 적합한 용기(또는 키트 구성요소)는 멸균 바이알, 시린지(예를 들면 일회용 주사기), 코 스프레이 등을 포함한다. 이러한 용기는 WO2008/068631 (31페이지, 명백히 참고됨)에 상세히 기술되어 있다.

본 발명은 본 발명에 따라 제조된 백신을 제공한다. 이들 백신 조성물은 사람 환자에게 투여하기에 적합하고, 본 발명은 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다(WO 2008/068631; 32페이지 이하에 상세히 기술됨, 명백히 참고됨).

서열 및 키트

본 발명의 일부는 또한 표 1에 개괄한 프라이머 및 프로브 서열(SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 11)이다. SEQ ID NO: 8은 두개의 축퇴 염기를 포함하고 따라서 4개의 별도 및 개별 올리고뉴클레오티드 서열로서 존재할 수도 있다.

인플루엔자 A에 대해: 전방 프라이머들은 SEQ ID NOs: 5, 2 및 7을 포함하고; 역 프라이머는 SEQ ID NO: 4이고; 유용한 프로브는 SEQ ID NO: 3이다. 인플루엔자 B에 대해: 역 프라이머는 SEQ ID NOs: 8, 10 및 1을 포함하고; 전방 프라이머는 SEQ ID NO: 11이고; 유용한 프로브는 SEQ ID NO: 9이다. SEQ ID NO: 6는 인플루엔자 A에 대한 추가의 전방 프라이머이다. 용어 '전방(forwards)'은 단지 편의상 사용되며 매트릭스 단백질에 대한 ATG-함유 코딩 스트랜드와 같은 개념을 갖는 프라이머를 말한다. 인플루엔자 바이러스는 네거티브 스트랜드 게놈을 갖기 때문에 전방 및 역이라는 용어는 바이러스 게놈 RNA 세그먼트에 대한 혼성화를 언급할 때 반전될 수도 있다.

본 발명의 더 이상의 구체예는 SEQ ID NOs 4 및 7의 프라이머의 SEQ ID NO 3 (인플루엔자 A)의 프로브와의 특정 조합과, SEQ ID NOs 11 및 1의 프라이머의 SEQ ID NO 9 (인플루엔자 B)의 프로브와의 특정 조합이며, 구체적으로 키트의 형태이다. 키트는 추가의 구성요소들, 예를 들면 완충제, 폴리머라제 및 증폭을 위한 추가의 반응 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 더 이상의 부분은 상기 서열의 사용, 그리고 특히 진단 용도의 백신 생산 방법 내에서 바이러스의 정량을 위한 인플루엔자 바이러스의 검출을 위한 조합물 및 키트이다.

추가의 유용한 프라이머는 SEQ ID NOs: 12, 13, 14 및 15이다. 추가의 유용한 프로브는 SEQ ID NOs: 16 및 17이다. SEQ ID NOs: 14 및 15는 SEQ ID NO: 16과 조합하여 사용될 수 있다. SEQ ID NO 17은 SEQ ID NOs: 4 및 7과 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 프로브(예를 들면 SEQ ID NOs: 3 및 9)는 예를 들면 5' 6-카르복시플루오레세인 (6FAM) 표지 및/또는 3' 'BlackBerry Quencher' (BBQ) 표지로 표지될 수도 있다.

본 발명은 또한 SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 이들 핵산은 80개 미만 뉴클레오티드, 예를 들면 50개 미만 뉴클레오티드, 또는 30개 미만 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단일 스트랜드이어야 한다. 그것들은 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브로서 유용할 수 있다. 핵산은 관련 SEQ ID NO와 같은 3' 잔기를 가질 수도 있다. 즉, 그것은 서열 5'-X-Y-3'을 포함할 수도 있는데, 여기서 Y는 SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 11로부터 선택된 서열이고; X는 1개 이상의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다. 5'-X-Y-3'서열을 갖는 핵산은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 핵산에 혼성화할 수 있다.

도 1은 감염 동안에 측정된, 공지의 감염 바이러스 동역학과 qPCR 바이러스 입자 측정치의 상관관계를 나타낸다. x-축은 감염후의 시간들을 가리킨다. y-축은 로그 스케일에 대한 qPCR에 의해 산정된 mL당 카피의 수를 나타낸다. 도면은 qPCR의 곡선이 낮은 m.o.i에서 표준 감염 바이러스 역가 동역학에 대응한다는 것을 예시한다. 특히, 바이러스 소산물은 16-24 시간 후 상청액에서 측정가능하고 최대 감염도는 48시간 후 보여진다. 각 선은 다른 실험을 나타낸다.
도 2는 투과전자현미경에 의해 산정된 바이러스 입자 대 본 발명에 따라 qPCR에 의해 산정된 바이러스 입자의 수의 상관관계를 나타낸다. x-축은 mL당 TEM 바이러스 입자 카운트의 수를 나타내고 y-축은 qPCR에 의해 산정된 mL 당 카피의 수를 나타낸다.

다른 인플루엔자 서브타입의 검출

인플루엔자 바이러스 주는 동물 인플루엔자에 대한 독일 국가 기준 센터 (Frierich Loeffier Institute, Riems)로부터 얻어진다. 주들은 MDCK 33016PF 세포에서 배양되고 통과 1 및 2의 상청액을 Qiagen QuantiTect™ 바이러스 키트 또는 Invitrogen Super Script(TM) III Platinum™ 키트를 사용하여 본 발명의 RT-PCR법을 사용하여 분석한다. 사용된 프라이머 및 프로브는 표 1에 나타낸 것들이다.

QuantiTect™ 바이러스 키트를 사용할 때 다음의 온도 프로파일이 실행된다:

- 형광 신호의 측정: 60 ℃

- 온도변화 속도 2 ℃/초

- RT 단계: 5O ℃ 20분 동안

- Taq 활성화 95 ℃ 5분 동안

- 주된 실행: 45 사이클: 94 ℃ 15초 동안; 60 ℃ 45초 동안(2-단계 공정) 또는 45 사이클: 94 ℃ 15초 동안; 60 ℃ 30초 동안; 72 ℃ 30초 동안(3-단계 공정).

Super Script(tm) III Platinum™ 키트를 사용할 때 다음의 온도 프로파일이 실행된다:

- 형광 신호의 측정: 60 ℃

- 온도변화 속도 2 ℃/초

- RT 단계: 50 ℃ 15분 동안

- Taq 활성화 95 ℃ 2분 동안

- 주된 실행: 45 사이클: 94 ℃ 15초 동안, 60 ℃ 45초 동안

형광 신호는 각각의 실시간 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 신호들은 발생된 형광 신호를 IVT의 일련의 희석의 각각의 신호와 비교함으로써 정량된다. 도 2에 나타낸 결과들은 모든 시험한 인플루엔자 바이러스 서브타입이 프라이머 및 프로브의 같은 세트로 확인되었음을 증명한다. 이것은 본 발명의 방법이 몇가지 다른 인플루엔자 서브타입을 검출할 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 표 7에 나타낸 인플루엔자 주들을 또한 시험하였다.

본 발명 방법의 감도를 산정하기 위해 A/Bayern/7/95 인플루엔자 주 또는 B/Baden Wurttemberg/3/06 인플루엔자 주를 함유하는 샘플의 일련의 희석을 행한다. 샘플들을 본 발명의 방법에 따라(상기한 바와 같이) QuantiTect™ 바이러스 키트 또는 Super Script(tm) III Platinum™ 키트를 사용하여 또는 제조업자의 프로토콜에 따라 Cepheid™ 인플루엔자 바이러스 A/B 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 qPCR을 시킨다. 형광 신호를 각각의 실시간 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 신호들을, 발생된 형광 신호를 IVT의 일련의 희석의 각각의 신호와 비교함으로써 정량한다. 결과를 표 5 및 표 6에 나타낸다. 인플루엔자 A 주에 대해, 바이러스 입자들은 본 발명의 방법을 사용할 때 여전히 1 : 1000000의 희석까지 검출가능하고 이때 Cepheid 키트는 바이러스 입자를 단지 1 : 100000의 희석까지 검출할 수 있음을 나타낸다. 인플루엔자 B 주에 대해, 바이러스 입자는 여전히 1 : 1000000의 희석까지 검출가능하고 이때 Cepheid 키트는 바이러스 입자를 단지 1 : 10000의 희석까지 검출할 수 있다. 본 발명 방법은 따라서 종래 기술의 방법보다 훨씬 더 민감하다.

샘플에서 인플루엔자 바이러스 입자의 정량

인플루엔자 바이러스 입자는 도 1에 개괄한 것과 같이 샘플에서 측정된다. 간단히는, 21μl 샘플을 15U of RNase A 및 7.5U의 T1의 혼합물을 사용하여 RNase를 시킨다. 샘플을 한시간 동안 RNase 혼합물과 함께 인큐베이션시킨다. 사전처리된 샘플을 1: 100 내지 1: 10000의 비율로 희석하여 qPCR이 선형 범위의 결과를 제공하는 희석을 얻는다. 샘플을 본 발명의 방법에 따라 qPCR을 시킨다. 결과를 인비트로 전사된 RNA (IVT)를 사용하여 표준곡선을 비교한다. 결과(도 1에 예시)는 qPCR 카피 수의 얻어진 곡선이 낮은 MOI에서 표준 감염성 바이러스 역가 동역학에 대응함을 나타낸다. 구체적으로, 바이러스 소산물은 16-24 시간 후 상청액에서 측정가능하고 최대 감염성 역가는 48시간후 관찰된다.

본 발명에 따라 투과 전자 현미경 및 qPCR에 의해 산정된 바이러스 입자

얻어진 인플루엔자 주는 A/Bayern/7/95, A/New Caledonia/20/99, A/Hong Kong/8/68, B/Lee/40 및 A/Puerto Rico/8/34는 ABI 온라인으로부터 얻어진다. 바이러스 입자의 수는 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 산정된다. 이 목적으로, 바이러스 입자는 피복된 구리 그리드에 도포되고 공기중 건조시킨다. 다음에 재료를 2.5% (v/v) 글루타르알데히드로 정착시키고, 세척하고 2% (w/v) 수성 우라닐 아세테이트 및 2% (w/v) 인텅스텐산(PTA) pH 6.5로 염색한다. 샘플에서 바이러스 입자의 수는 TEM에 의해 결정된다. TEM에 의해 계수된 바이러스 입자의 수를 본 발명에 따라qPCR에 의해 산정된 바이러스 입자의 수와 비교한다. 결과(도 2 참조)는 본 발명 방법이 여러가지 다른 인플루엔자 주에 대해 샘플에서 바이러스 입자의 수를 정확히 결정한다는 것을 나타낸다.

본 발명은 단지 예로써만 기술되었고 본 발명의 범위와 개념 안에 있으면서 수정들이 행해질 수 있음이 이해될 것이다.

<110> NOVARTIS AG <120> GENERIC ASSAYS FOR DETECTION OF INFLUENZA VIRUSES <130> p054248wo <150> US 61/215,704 <151> 2009-05-08 <150> US 217,045 <151> 2009-05-26 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 1 gcagatagag gcaccaatta gtg 23 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 2 caggccccct caaag 15 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence <400> 3 aggtgacagg attggtcttg tctttagcc 29 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 4 gcgtctacgc tgcagtcc 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 5 cttctaaccg aggtcgaaac g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 6 gaccaatcct gtcacctctg ac 22 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 7 caggccccct caaagc 16 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Y = C or T <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> R = A or G <400> 8 gtgctttytg tatatcagtt argc 24 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence <400> 9 agatggagaa ggcaaagcag aactagc 27 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 10 gatagaggca ccaattagta 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 11 gtttggagac acaattgcct acc 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 12 ctgtttggag acacaattgc 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Y = C or T <400> 13 gtgctttytg tatatcag 18 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 14 tgggaaatcc agagtgtgaa tcact 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> R = A or G <400> 15 cgttccattg tctgaactag rtgtt 25 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence <400> 16 ccacaatgta ggaccatgag cttgctgt 28 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 17 aggtgacaag attggtcttg tctttagcc 29

Claims (16)

1. 인플루엔자 게놈 내의 보존 영역을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 RNA를 검출하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 보존 영역은 M 단백질에 대해 부분적으로 또는 완전히 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 방법은 SEQ ID NO 3 또는 SEQ ID NO 9를 포함하는 앰플리콘을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 일단계 RT-qPCR을 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 표 1(SEQ ID NOs 1-11)의 프라이머 또는 프로브 중 적어도 하나가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 다음 단계들, 즉
   a) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 적용하는 단계,
   b) 발생된 신호를 표준 RNA에 의해 발생된 신호와 비교하는 단계,
   c) 바이러스 RNA의 양을 결정하는 단계를 행하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 RNA의 양을 정량하는 방법.
7. 다음 단계들, 즉
   a) 유리 바이러스 RNA를 샘플로부터 제거하는 단계,
   b) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따르는 방법을 적용하는 단계,
   c) 발생된 신호를 표준 RNA에 의해 발생된 신호와 비교하는 단계,
   d) 천연 바이러스 입자의 양을 결정하는 단계를 행하는 것을 특징으로 하는샘플에서 천연 바이러스 입자의 양을 정량하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 단계 (a)에서 RNA를 RNase 처리에 의해 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기술된 방법을 적용하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 백신의 제조방법.
10. 제 9 항에 있어서, 방법은 세포 배양물 기재 생산 방법의 발효 단계 내에서 적용되며, 바이러스 입자의 양은 바이러스를 수집하기 위한 최적 시간을 결정하기 위해 정량하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 다음 단계들, 즉
    ㆍ 세포를 발효 용기에서 전파시키는 단계;
    ㆍ 종 바이러스를 첨가하는 단계;
    ㆍ 바이러스 전파를 제 7 항의 방법을 사용하여 모니터링하는 단계;
    ㆍ 바이러스 현탁액을 원심분리 및 여과하는 단계;
    ㆍ 바이러스를 크로마토그래피 및 한외/정용여과 단계에 의해 정제하고, 불활성화하고, 붕괴하여 바이러스 표면 항원 HA 및 NA를 용해화시키는 단계;
    ㆍ 항원을 여과하여 1가 벌크를 얻는 단계; 그리고
    ㆍ 선택적으로, 1가 벌크를 다가 벌크(전형적으로 3가 벌크)로 배합하고 최종 용기에 채우는 단계를 행하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 백신의 세포 배양물 기재 생산 방법.
12. 제 9 항 또는 제 10 항에 따르는 방법에 의해 생산된 인플루엔자 백신.
13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기술된 방법을 적용하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자의 진단방법.
14. 표 1(SEQ ID NOs 1-11)에 나타낸 프라이머 및 프로브 올리고뉴클레오티드.
15. 제 14 항의 프라이머 또는 프로브 중 적어도 하나와, 선택적으로 추가의 구성요소들, 예를 들면 핵산 증폭을 행하기 위한 시약, 및 증폭을 행하는 지침서를 포함하는 키트.
16. 인플루엔자 백신 생산 또는 인플루엔자 진단을 위한 제 13 항의 올리고뉴클레오티드 및 제 14 항의 키트의 사용.

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