CN103409562B - 一种区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的pcr-rflp方法 - Google Patents
一种区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的pcr-rflp方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR-RFLP方法，该方法是利用NS基因序列酶切位点差异来进行区别的，包括DNA的提取，PCR扩增得到NS基因片段，EcoRⅠ酶切后进行RFLP分析。本发明鉴定方法简单，效率和准确率较高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用NS基因序列酶切位点差异区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的聚合酶联反应（PCR）-限制性片段长度多态性（RFLP）方法。
背景技术
鹅细小病毒( Goose parvovirus，GPV) 是感染禽类的主要自主复制型细小病毒，由我国学者方定一于1956年首先在江苏省扬州地区发现（方定一．小鹅瘟的介绍[J]．中国兽医学杂志，1962，8：19-20；万春和，朱海侠，黄瑜，等．一株鹅细小病毒全基因特征分析[J]．中国动物传染病学报，2011，1,9（4）：19-24．]，以后在许多国家也分离到该病毒，世界禽类学会为纪念匈牙利学者Derzsy的先进工作而将此病命名为Derzsy’s病（张云，耿宏伟，郭东春，等．鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析[J]．中国预防兽医学报，2008，30（6）：415-419．）。鹅细小病毒属于细小病毒科、细小病毒属，只有一个血清型。该病主要侵害30d以内的雏鹅和雏番鸭，引起以急性肠炎及肝、肾、心等实质脏器败血性病变，尤其是小肠部位的纤维性、栓塞性病变，是目前危害养鹅业健康发展的最严重的传染病之一，造成了严重的经济损失，引起国内外学者的广泛重视。
雏番鸭细小病毒病（MDPD）又叫病雏番鸭细小病毒感染、雏番鸭“三周病”，是雏番细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）引起的一种急性、败血性传染病，其特点是具有高度传染性和死亡率。主要发生于3周龄以内的雏番鸭，病变的主要特征是肠道严重发炎，肠黏膜坏死，脱落，肠管肿脓、出血。本病可造成雏番鸭大批死亡，即使耐过也成僵鸭。
目前，关于鹅细小病毒和番鸭细小病毒病原学检测的PCR方法和荧光定量方法均有相关报道。其中关于鹅细小病毒和番鸭细小病毒病原学检测的PCR方法都是根据鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组特征分别设计引物进行PCR扩增。鹅细小病毒对雏鹅和雏番鸭均易感，在临床上对番鸭感染细小病毒的检测时，由于鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组NS基因同源性较高，PCR实验结果可能会造成假阳性扩增，需结合测序比对分析才能明确。
目前，国内外还没有针对鹅细小病毒和番鸭细小病毒NS基因差异的PCR-RFLP方法相关报道，但该属其他类型病毒如犬细小病毒已见有相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用NS基因序列酶切位点差异区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR- RFLP方法。该方法能有效区分鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染（或共感染），为番鸭健康养殖提供技术保证。
本发明根据鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组中NS基因特征，设计一组引物能同时对鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行阳性扩增，根据番鸭细小病毒扩增PCR产物中有特异性的EcoRⅠ酶切位点，而鹅细小病毒扩增PCR产物中没有EcoRⅠ酶切位点来对建立一种对鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行快速检测的PCR-RFLP方法。
本发明采用以下技术方案：
一种区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR-RFLP方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组DNA；
（2）用引物P1和P2同时对鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行PCR扩增，得到相应的NS基因片段；
（3）取PCR产物经EcoRⅠ酶切后进行RFLP分析。
其中，PCR引物需满足如下要求：
（1）该PCR产物需选择鹅细小病毒和番鸭细小病毒NS基因中的保守区域进行设计，以便能一个PCR反应能对鹅细小病毒基因组DNA和番鸭细小病毒基因组DNA均能阳性扩增；
（2）该PCR产物需选择鹅细小病毒和番鸭细小病毒NS基因中的保守区域进行设计时必须跨过番鸭细小病毒NS基因中973位的EcoRⅠ酶切位点，以便对胶回收产物能够进行限制性片段长度多态性分析。
根据以上要求，所述的步骤（2）的扩增引物P1和P2的序列为：
上游引物P1：5’- CAAAATAAGACCGTGACT -3’，
下游引物P2：5’- ACAGGAGTAGGTTCAATACAAACA -3’。
其中，所述的步骤（2）PCR扩增产物经胶回收大小为810bp。
其中，所述的步骤（3）EcoRⅠ酶切位点位于番鸭细小病毒基因组NS基因序列的973位，番鸭细小病毒可被EcoRⅠ酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段，大小为530bp和280bp；而鹅细小病毒基因组NS基因中没有EcoRⅠ酶切位点，鹅细小病毒经EcoRⅠ酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。
本发明的有益效果：鉴定方法简单，效率和准确率较高。使用本方法对本临床送检12份疑似水禽细小病毒（鹅细小病毒和番鸭细小病毒）进行PCR- RFLP检测，其中鹅细小病毒4株、番鸭源鹅细小病毒6株，番鸭细小病毒2株，其中1份样品还存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒共感染。根据建立的PCR- RFLP方法，可在5小时内对确定感染的水禽细小病毒类型，同时还能对鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行正确分析。
附图说明
图1为鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行快速检测的PCR-RFLP方法的电泳图。M为DL2000 DNA Marker,1为番鸭细小病毒PCR胶回收产物，2为鹅细小病毒PCR胶回收产物，3为经EcoRⅠ酶切番鸭细小病毒PCR胶回收产物，4为经EcoRⅠ酶切鹅细小病毒PCR胶回收产物。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、毒株：
鹅细小病毒和番鸭细小病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。
2、引物设计与合成
根据鹅细小病毒和番鸭细小病毒NS基因特征设计引物P1和P2，其中引物P1和P2序列为：上游引物P1：5’- CAAAATAAGACCGTGACT -3’，下游引物P2：5’- ACAGGAGTAGGTTCAATACAAACA -3’。
3、PCR扩增
以常规方法提取鹅细小病毒和番鸭细小病毒基因组DNA。用所设计的特异性引物P1和P2进行PCR扩增，扩增片段大小约810 bp。
扩增体系为50μL，其中2×GoTaq Master Green Mix 25μL、上下游引物（20μM/mL）各1μL、DNA模板1μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为94℃预变性5min，随后进行94℃ 50s、53℃ 35s、72℃ 50s，进行35个循环后， 72℃延伸10min。
4、RFLP分析
PCR反应结束后，将鹅细小病毒和番鸭细小病毒PCR产物分别经胶回收试剂盒纯化后进行EcoRⅠ酶切。酶切体系为50μL，其中10×H Buffer 2μL，胶回收产物10μL，EcoRⅠ酶2μL、补充灭菌去离子水至终体积20μL。混匀后，经37℃水浴1小时，加入2μL10×Loading Buffer终止，进行琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析鹅细小病毒和番鸭细小病毒类型。
5、临床应用
使用本方法对临床送检12份疑似水禽细小病毒（鹅细小病毒和番鸭细小病毒）进行PCR- RFLP检测，其中鹅细小病毒4株、番鸭源鹅细小病毒6株，番鸭细小病毒2株，其中1份样品还存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒共感染。根据建立的PCR- RFLP方法，可在5小时内对确定感染的水禽细小病毒类型，同时还能对鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染类型和感染情况进行准确分析。
Claims (1)
1. 一种区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR-RFLP 方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）从检测样品中提取病毒的基因组DNA；
（2）用上游引物P1 ：5’- CAAAATAAGACCGTGACT -3’，下游引物P2 ：5’- ACAGGAGTAGGTTCAATACAAACA -3’， 同时对鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行PCR 扩增，得到相应的NS基因片段，大小为810bp；
（3）取PCR 产物经EcoR Ⅰ酶切后进行RFLP 分析：EcoR Ⅰ酶切位点位于番鸭细小病毒基因组NS 基因序列的973位，番鸭细小病毒可被EcoR Ⅰ酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段为2 段，大小为530bp 和280bp ；而鹅细小病毒基因组NS 基因中没有EcoR Ⅰ酶切位点，鹅细小病毒经EcoR Ⅰ酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150325 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |