CN114606230B

CN114606230B - 一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114606230B
Application number: CN202210312597.8A
Authority: CN
Inventors: 董嘉文; 李林林; 陈修邓; 张俊勤; 廖明; 陆巧芬; 孙敏华; 曹建伟; 黄允真; 沈书文; 吴晓斌
Original assignee: Jiangmen Animal Disease Prevention And Control Center; Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangmen Animal Disease Prevention And Control Center; Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114606230A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用，该试剂盒基于SEQ ID NO:3所示的探针和SEQ ID NO:1～2所示的引物对构成。基于该检测试剂盒的检测方法检测速度快且高通量，对于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒具有较好的特异性，对于新型鸭呼肠孤病毒的最低检测限可达到17.8copies，对于新型鹅呼肠孤病毒的最低检测限可达到35.3copies。该检测方法对于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的监测和防控具有极为重要的意义。

Description

一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用。

背景技术

新型鸭呼肠孤病毒病由新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)引起，其发病表现为软脚，肝脾等脏器上出现斑块状出血和坏死，肾脏肿大、出血、表面有黄白色条斑。新型鸭呼肠孤病毒病是一种高发病率、高致死率的急性、烈性、病毒性传染病。该病除麻鸭易感性略差以外，其它品种鸭均可发病。

新型鹅呼肠孤病毒(NGRV)是2020年由发明人课题组首次在发病鹅上分离鉴定得到的，该病毒引起以肝、脾等器官出现点状白色灶性坏死为主要病变特征的传染性疾病。经过序列和系统发育分析可知，新型鹅呼肠孤病毒(NGRV)与番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的全基因氨基酸序列的同源性高达90％，NGRV病毒株与其它水禽源呼肠孤病毒聚集在同一分支上，NGRV可能是由不同的水禽源呼肠孤病毒重组产生，但该病毒仍然属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属(Huang Y,Zhang J,Dong J,et al.Isolation and characterization of a newgoose orthoreovirus causing liver and spleen focal necrosis in geese,China[J].Transboundary and Emerging Diseases,2021.)。

由于水禽源呼肠孤病毒存在重组的可能性，新型鹅呼肠孤病毒可能是由新型鸭呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒重组而来，因此，尽管新型鹅呼肠孤病毒当下只感染鹅，但不排除该病毒会跨越品种传播到鸭子或其他水禽上。而且新型鹅呼肠孤病毒检测的手段尚未完善，缺乏对其有效的监控。因此，建立一种能够有效鉴别新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测方法具有非常重要的现实意义。

目前已报道的用于检测水禽源呼肠孤病毒病原的方法主要有：病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、普通PCR以及荧光定量PCR等，但目前并未有能够有效针对新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的快速检测和鉴别方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用，该检测方法仅基于一对检测引物对和一条探针即可准确的区分新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒，其相比与测序等常规方法的检测分型成本低，应用价值更广阔，对新型鸭呼肠孤病毒病和新型鹅呼肠孤病毒病的监测和流行病学调查等方面具有重要意义。

本发明的第一个方面，提供一组引物对，该引物对同时靶向扩增出新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒。

在本发明中，发明人设计得到的引物对可同时靶向扩增出新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒，因此，可仅在只使用一对引物对的基础上同时检测新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒，降低了潜在的引物过多存在交叉干扰的问题，而且，该引物对无法扩增出其他水禽病毒病病原，如鹅细小病毒(GPV)、坦布苏病毒(TMUV)、鹅圆环病毒(GoCV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)和鹅星状病毒(GAstV)，从而具有较好的特异性。

在本发明的一些实施方式中，基于上述引物对扩增得到的新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒扩增产物中，存在着一个多态性位点(SNP)。

在本发明的一些优选实施方式中，所述多态性位点(SNP)为T15C。

在本发明的一些实施方式中，新型鸭呼肠孤病毒参考NCBI登录号NO.JX47826，毒株为NDRV-J18。当然，本领域技术人员也可以使用其他新型鸭呼肠孤病毒，由于其扩增片段位于保守序列区，因此，使用其他的新型鸭呼肠孤病毒并不影响上述引物序列的扩增效果。

在本发明的一些实施方式中，新型鹅呼肠孤病毒参考GRV-GD2020(该毒株公开于发明人已发表的文章：Huang Y,Zhang J,Dong J,et al.Isolation andcharacterization of a new goose orthoreovirus causing liver and spleen focalnecrosis in geese,China[J].Transboundary and Emerging Diseases,2021)。当然，本领域技术人员也可以使用其他新型鹅呼肠孤病毒，由于其扩增片段位于保守序列区，因此，使用其他的新型鹅呼肠孤病毒并不影响上述引物序列的扩增效果。

在本发明的一些实施方式中，所述引物对的核苷酸序列为：

引物F：5'-CAGACATATGATGACCTC-3'；

引物R：5'-CAACGTAMCCATTTAGTG-3'。

本发明的第二个方面，提供一条探针。所述探针靶向新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒中的一段基因序列，在所述基因序列中，新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒存在一个T15C的多态性位点。

在本发明的一些实施方式中，所述探针的核苷酸序列为：

探针P：5'-TTAACTGTCAAGCCTTGGCGA-3'。

在本发明中，发明人发现该探针能够准确靶向新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒中的T15C的多态性位点，从而可以准确的区分新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒。

在本发明的一些实施方式中，所述探针P的3'和5'端均标记有报告基团。

在本发明的一些实施方式中，所述探针序列5’端标记的荧光基团选自FAM、HEX、VIC、CY5、TET中的一种，所述探针序列3’端标记的淬灭基团选自BHQ和TAMRA系列中的一种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述探针P的5'端标记荧光基团FAM，3'端标记猝灭基团BHQ1。

当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理选择其他的报告基团进行替换。

本发明的第三个方面，提供一种检测试剂，所述检测试剂中含有本发明第一个方面所述的引物对和本发明第二个方面所述的探针。

在本发明中，发明人发现上述检测试剂能够准确的鉴别新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒，对于新型鸭呼肠孤病毒的检测限可达到17.8copies/μL，对于新型鹅呼肠孤病毒的检测限可达到35.3copies/μL，具有较高的灵敏度。

在本发明的一些实施方式中，新型鹅呼肠孤病毒参考GRV-GD2020。当然，本领域技术人员也可以使用其他新型鹅呼肠孤病毒，由于其扩增片段位于保守序列区，因此，使用其他的新型鹅呼肠孤病毒并不影响上述引物序列的扩增效果。

本发明的第四个方面，提供本发明第三个方面所述的检测试剂在制备用于鉴别新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒中的应用。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂盒中还包括阴性对照、阳性对照和PCR扩增试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述阴性对照包括无菌水。

在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增试剂包括常规的扩增用buffer、荧光染料等。当然，本领域技术人员可以合理选择其他常规PCR扩增试剂进行替换，以获得最佳的扩增效果。

在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照为基于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的扩增片段通过重组的方式获得的阳性质粒。

在本发明的一些实施方式中，用于扩增所述扩增片段的引物对为：

F2：5’-TCAGACATATGATGACCTCAT-3’(SEQ ID NO：4)；

R2：5’-TCTTCTAYCACTCCACGCACTA-3’(SEQ ID NO：5)。

所用扩增反应体系如表1所示。

反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸25s；循环35次，72℃再延伸8min。

采用基因重组方式，将扩增得到的核酸片段(如SEQ ID NO:6和7所示)分别克隆至PMD18T Vector中，得到新型鸭呼肠孤病毒阳性质粒pD和新型鹅呼肠孤病毒阳性质粒pR。

当然，本领域技术人员也可以采用其他方式获得含有新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的阳性样本作为阳性对照。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂盒的使用方法为：

(1)使用权利要求5中所述的检测试剂扩增检测样品；

(2)对扩增产物进行熔解曲线分析，确定样品中的病毒类型；

其中，所述病毒类型的判定标准为：

若检测样品的熔解温度与新型鸭呼肠孤病毒阳性对照的ΔTm值的绝对值小于0.26℃时，则判定为新型鸭呼肠孤病毒；

若检测样品的熔解温度与新型鹅呼肠孤病毒阳性对照的ΔTm值的绝对值小于0.34℃，则判定为新型鹅呼肠孤病毒；

若未出现扩增，则其即不是新型鸭呼肠孤病毒也不是新型鹅呼肠孤病毒。

在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的体系为：

在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应程序为：50℃反转录30min，94～95℃预变性2～5min；94～95℃变性18～20s，50℃退火15～18s，72℃延伸15～18s；循环45～50次。

在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，50℃退火15s，72℃延伸15s；循环45次。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中所述熔解曲线分析程序为：95℃变性10s，37℃退火60s，37℃到97℃以0.2℃/s的速率，5次/℃连续采集探针荧光信号，进行熔解曲线分析。

本发明的有益效果是：

1)本发明首次建立了一种快速区分新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的荧光检测方法、引物及探针，操作简单：只需一条探针即可实现新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的鉴别检测；检测速度快且高通量；全部操作过程可在2.5小时内完成，极大缩短了新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒鉴别检测所需时间。

2)本发明的PCR引物对F/R，对新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒可特异性扩增，有助于提高PCR的效率；探针P可特异性与新型鹅呼肠孤病毒核酸位点杂交，特异性较好；引物F/R和探针P，均不与其他常见水禽病毒病核酸结合，有利于提高本发明对结果分析的正确性。

3)本发明一种快速区分新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的荧光检测方法的最低检测限分别可达到17.8copies和35.3copies，灵敏度较高。

附图说明

图1为新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒基因的扩增片段的凝胶成像图，其中，Marker为DL2000。

图2为标准化样品荧光检测方法熔解曲线图，其中以pD、pR为阳性标准品，水为阴性对照。

图3为荧光检测方法特异性试验熔解曲线图，pD、pR为阳性标准品，选取鹅细小病毒(GPV)、坦布苏病毒(TMUV)、鹅圆环病毒(GoCV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)和鹅星状病毒(GAstV)作为特异性对照，水为阴性对照。

图4为荧光检测方法灵敏度试验熔解曲线图，分别以pD、pR标准质粒做10倍倍比稀释，得到1.78×10⁰至1.78×10⁹copies/μL和3.53×10⁰至3.53×10⁹copies/μL各10个稀释度。

图5为荧光检测方法临床样品检测熔解曲线图，临床样品为21份鸭/鹅内脏组织，以pD、pR为阳性标准品，水为阴性对照。

图6为阳性样品测序探针区比对结果图，pD和pR为标准质粒，其他为临床样品。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

引物及探针的设计与构建

发明人基于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒设计得到了大量的引物和探针，其中，新型鸭呼肠孤病毒NCBI登录号NO.JX47826，毒株为NDRV-J18，新型鹅呼肠孤病毒参考Huang Y,Zhang J,Dong J,et al.Isolation and characterization of a newgoose orthoreovirus causing liver and spleen focal necrosis in geese,China[J].Transboundary and Emerging Diseases,2021.中的GRV-GD2020。在对设计得到引物和探针进行筛选后，发现下述引物对F、R，及探针P在基于荧光法鉴定或区分新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的效果最好，其具体的核苷酸序列如下所示：

引物F：5'-CAGACATATGATGACCTC-3'(SEQ ID NO：1)；

引物R：5'-CAACGTAMCCATTTAGTG-3'(SEQ ID NO：2)。

探针P：5'-TTAACTGTCAAGCCTTGGCGA-3'(SEQ ID NO：3)。

其中，上述探针P的3'和5'端均标记有报告基团。在本实施例中，探针P的5'端标记荧光基团FAM，3'端标记猝灭基团BHQ1。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理选择其他的报告基团进行替换。

标准样品的制备

在下述实施例中，为了验证本发明实施例中的检测方法的可行性与可靠性，需同时制备标准阳性样品，为后续的本发明实施例中的检测方法的建立、灵敏度、特异性试验等提供阳性对照参考。

在本实施例中，发明人分别以新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的核苷酸序列为模板，使用下述引物对F2和R2进行扩增。

其中，F2和R2的核苷酸序列如下所示：

F2：5’-TCAGACATATGATGACCTCAT-3’(SEQ ID NO：4)；

R2：5’-TCTTCTAYCACTCCACGCACTA-3’(SEQ ID NO：5)。

基于上述引物对F2和R2，使用Premix Ex-Taq扩增体系(如表1所示)对上述新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒基因进行扩增，分别扩增得到长度为357bp的核酸片段。

其中，新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒基因的扩增片段的凝胶成像图如图1所示。

新型鸭呼肠孤病毒扩增片段的核苷酸序列具体为：

5’-TCAGACATATGATGACCTCATTTCAGCGCTGAAATTAACTGTCAAGCCCTGGCGACCGTTGCGATCTGGCGCTCAAGATGCTATCACGGCCGTGCAACTGTTCTTTCCACTAAATGGGTACGTTGAACCACTGTTCATGCTCGAAAAGGAGGTGAGCTATGAAGATTTTGAAGCATGGCTATCGCCAATTCTATCTGCCTTGGCTGACCAATTCTTGCGTCGGTATCCCATCGCCTCATACCATGGCCGTTTAGTGAATCCTTTGCTAGCGAACGCCATTGTAGCTGCGTTTTTGTCAAACGCGCCATATGCGCACGCCATTGAGCATCTCTTCTTAGTGCGTGGAGTGATAGAAGA-3’(SEQ IDNO：6)。

新型鹅呼肠孤病毒基因扩增片段的核苷酸序列具体为：

5’-TCAGACATATGATGACCTCATCGCGGCTCTGAAGTTAACTGTCAAGCCTTGGCGACCGTTGCGATCTGGCGCCCAAGATGCTATCACGGCCGTGCAACTGTTCTTTCCACTAAATGGTTACGTTGAACCACTGTTCATGCTCGAAAAGGAGGTGAGTTATGAAGATTTCGAAGTGTGGTTATCACCAATTTTATCGGCTTTGGCCGACCAATTTCTACGTCGGTATCCTATCGCCTCGTACCATGGCCGTCTCGTGAATCCTCTGCTAGCGAATGCCATTGTGGCTGCGTTTTTGTCAAATGCGCCATATGCGCACGCTATTGAGCATCTTTTCTTAGTGCGTGGAGTGGTAGAAGA-3’(SEQ IDNO：7)。

表1

试剂	使用量
		1×Premix Ex-Taq	10.0μL
10μM F2和R2	各1.0μL
		新型鸭呼肠孤病毒基因或新型鹅呼肠孤病毒基因	2.0μL
ddH<sub>2</sub>O	6.0μL
		总计	20.0μL

采用基因重组方式，将扩增得到的核酸片段分别克隆至PMD18T Vector(购自TAKARA公司)中，得到新型鸭呼肠孤病毒阳性质粒pD和新型鹅呼肠孤病毒阳性质粒pR，并分别作为新型鸭呼肠孤病毒阳性对照品和新型鹅呼肠孤病毒阳性对照品用于后续的试验及试剂盒组装。

一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测方法

基于上述实施例中的引物对F、R，及探针P构建下述表2中的反应体系。

表2

试剂	使用量
		PrimeScript 1Step Enzyme Mix	0.5μL
2×1Step Buffer	5.0μL
		10μM引物F	0.1μL
10μM引物R	0.5μL
		10μM探针P	0.5μL
检测样品	1.0μL
		ddH<sub>2</sub>O	2.4μL
总计	10μL

其中，PrimeScript 1Step Enzyme Mix和1Step Buffer均购自南京诺维赞生物科技有限公司。

PCR扩增反应程序如下：

50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，50℃退火15s，72℃延伸15s；循环45次。

熔解曲线分析程序如下：

95℃变性10s，37℃退火60s，37℃到97℃以0.2℃/s的速率，5次/℃连续采集探针荧光信号，进行熔解曲线分析。

在本实施例中，PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪进行分析。以上述新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒阳性标准样品为检测样品进行检测，熔解曲线分析结果如图2所示。

图2为上述实施例中的阳性标准样品荧光检测方法熔解曲线图，从图中可以发现，pD和pR标准样品的熔解曲线相互分开，两种阳性标准样品熔解温度(Tm)的不同，表明上述实施例中设计得到的引物F、R及探针P适合用于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的熔解曲线分析。

上述检测方法的实际检测效果

(1)特异性实验：

分别选取常见的水禽病毒病病原作为检测对象，测试上述检测方法的特异性。

其中，所用水禽病毒病病原具体为：鹅细小病毒(GPV)、坦布苏病毒(TMUV)、鹅圆环病毒(GoCV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)和鹅星状病毒(GAstV)。同时，分别以pD和pR标准样品为阳性对照，以无菌水为阴性对照，使用上述实施例中的PCR扩增反应体系和熔解曲线分析方法进行分析。

结果如图3所示。

从图3可以看出，上述实施例中的检测方法只能特异性扩增出新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒阳性标准样品并形成熔解峰，而其它水禽相关病毒，如鹅细小病毒(GPV)、坦布苏病毒(TMUV)、鹅圆环病毒(GoCV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)和鹅星状病毒(GAstV)，都没有扩增出特异熔解峰。上述结果表明引物F、R及探针P特异性较好，可以用于新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的分型荧光检测。

(2)灵敏度实验：

以上述实施例中的阳性标准品pD和pR作为检测样品，其中，对该检测样品进行10倍梯度稀释，形成1.78×10⁰至1.78×10⁹copies/μL(pD的检测浓度)以及3.53×10⁰至3.53×10⁹copies/μL(pR的检测浓度)各10个梯度浓度。

以无菌水为阴性对照，使用上述实施例中的PCR扩增反应体系和熔解曲线分析方法进行分析。

熔解曲线峰型化图如图4所示。

图4为阳性质粒pD和pR的荧光检测方法灵敏度试验熔解曲线图。从图中可以看出，使用上述检测方法随着检测样品中核酸浓度的降低呈现明显的下降的荧光信号，当质粒个数低至17.8copies/μL(pD的检测浓度)和35.3copies/μL(pR的检测浓度)时，FAM通道仍可以检测到相应荧光信号。从而说明上述检测方法的检测限可以达到17.8copies/μL(pD的检测浓度)和35.3copies/μL(pR的检测浓度)，具有较高的灵敏度。

(3)临床样品的实际检测效果：

为了能够进一步验证上述检测方法的实际检测效果，发明人以实际患病水禽样本作为检测对象，使用上述检测方法进行检测。

具体检测步骤如下：

A.样品的处理：

在本实施例中，以患病鸭/鹅内脏组织作为检测样品，从中提取病毒核酸，其中，提取方法采用商品化试剂盒提取其基因组RNA。

B.以提取的样本基因组核酸为模板，采用上述实施例中的检测方法进行荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析；同时以阳性标准品pD和pR作为阳性对照。

C.使用熔解曲线分析结果：

熔解曲线分析程序如下：

在本实施例中，PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪进行分析。

在本实施例中，共检测了21份临床样品，熔解曲线分析结果如图5所示。

从图5的临床样品荧光检测方法熔解曲线图上可看出，以pD标准样品熔解曲线作为对照时，待检样品和阳性对照pD之间熔解峰△Tm值的绝对值小于0.26℃时，判定为新型鸭呼肠孤病毒；待检样品和阳性对照pR熔解温度的△Tm值的绝对值小于0.34℃时，则判定为新型鹅呼肠孤病毒。而在检测的21份临床样品中，可判别出，其中4份临床样品为新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)，8份临床样品为新型鹅呼肠孤病毒(NGRV)。

为了确定检测结果的准确性，发明人再次使用上述实施例中的F2和R2，基于表1中所述的反应体系进行PCR扩增，发现上述4份新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)检出样品和8份临新型鹅呼肠孤病毒(NGRV)检出样品的PCR扩增产物大小均为357bp，进行电泳凝胶回收，并送测序公司测序。

测序后发现上述检测方法检测结果为新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)阳性的8份临床样品，其测序结果显示8份样品的探针区与上述探针P一致。检测结果为新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)阳性的4份临床样品，其探针区存在SNP位点T15C，结果与上述实施例中建立的检测方法分型结果一致(图6)。但两者相比，测序方法耗时更长，检测程序更复杂，无法做到高通量。因此，上述方法具有更高的应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

江门市动物疫病预防控制中心

<120> 一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagacatatg atgacctc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caacgtamcc atttagtg 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttaactgtca agccttggcg a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcagacatat gatgacctca t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcttctayca ctccacgcac ta 22

<210> 6

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagacatat gatgacctca tttcagcgct gaaattaact gtcaagccct ggcgaccgtt 60

gcgatctggc gctcaagatg ctatcacggc cgtgcaactg ttctttccac taaatgggta 120

cgttgaacca ctgttcatgc tcgaaaagga ggtgagctat gaagattttg aagcatggct 180

atcgccaatt ctatctgcct tggctgacca attcttgcgt cggtatccca tcgcctcata 240

ccatggccgt ttagtgaatc ctttgctagc gaacgccatt gtagctgcgt ttttgtcaaa 300

cgcgccatat gcgcacgcca ttgagcatct cttcttagtg cgtggagtga tagaaga 357

<210> 7

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcagacatat gatgacctca tcgcggctct gaagttaact gtcaagcctt ggcgaccgtt 60

gcgatctggc gcccaagatg ctatcacggc cgtgcaactg ttctttccac taaatggtta 120

cgttgaacca ctgttcatgc tcgaaaagga ggtgagttat gaagatttcg aagtgtggtt 180

atcaccaatt ttatcggctt tggccgacca atttctacgt cggtatccta tcgcctcgta 240

ccatggccgt ctcgtgaatc ctctgctagc gaatgccatt gtggctgcgt ttttgtcaaa 300

tgcgccatat gcgcacgcta ttgagcatct tttcttagtg cgtggagtgg tagaaga 357

Claims

1.一种用于鉴别新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含引物和探针；

所述引物同时靶向扩增出新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒；

所述引物为：

引物F：5'-CAGACATATGATGACCTC-3'；

引物R：5'-CAACGTAMCCATTTAGTG-3'；

所述探针靶向新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒中的一段基因序列，在所述基因序列中，新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒存在一个T15C的多态性位点；

所述探针为：

探针P：5'-TTAACTGTCAAGCCTTGGCGA-3'。

2.权利要求1所述的检测试剂在制备用于鉴别新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒的使用方法为：

(1)使用权利要求1中所述的检测试剂扩增检测样品；

(2)对扩增产物进行熔解曲线分析，确定样品中的病毒类型；

其中，所述病毒类型的判定标准为：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述扩增的体系为：

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述扩增的反应程序为：50℃反转录30min，94～95℃预变性2～5min；94～95℃变性18～20s，50℃退火15～18s，72℃延伸15～18s，循环45～50次。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述熔解曲线分析程序为：95℃变性10s，37℃退火60s，37℃到97℃以0.2℃/s的速率，5次/℃连续采集探针荧光信号，进行熔解曲线分析。