CN104004857A - 一种快速区分不同基因型犬细小病毒的pcr-hrm引物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法，该方法为先从样品中提取病毒DNA；以病毒DNA为模板，利用所设计的特异性引物对和荧光饱和染料进行扩增反应获得扩增产物；最后对扩增产物进行HRM分析，确定犬细小病毒的基因型。本发明操作简单，只需PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1.6RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及病毒基因分型的方法，具体涉及一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法。
背景技术
犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）为单链小 DNA 病毒，是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎的主要病原。1977 年，Eugster 和 Nairn 首次从患出血性肠炎的病犬的粪便中分离到犬细小病毒，并命名为CPV-2。自Eugster等人首次分离获得 CPV-2以来， CPV抗原性随时间的推移而不断发生改变，不断有新的CPV基因型和抗原型出现，并在世界范围内广泛传播流行。目前已知的CPV基因型包括CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c，而原始型 CPV-2基因型已被新出现的抗原变异株取代。CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c三种基因型核酸序列差异主要体现在VP2 基因序列上2个单核苷酸多肽性（SNP）位点上，第一个SNP位点为A4062G，分别对应CPV-2a（AAT）和CPV-2b(GAT)。第二个SNP位点为T4064A, 分别对应CPV-2b（GAT）和CPV-2c(GAA)。
传统的各种基因分型方法都存在各自的不足之处，如病毒分离与鉴定方法需借助3种不同单克隆抗体才能完成分型，费时费力不易快速区分犬细小病毒不同基因型；血凝抑制试验方法对犬细小病毒梯度要求较高，一般梯度大于1：64才可用相应单克隆抗体来鉴别，而梯度小于1：32则需通过在MDCK或F81细胞上扩增后方能用单克隆抗体来检测；而普通PCR 方法特异性不高，荧光定量PCR方法（MGB探针）虽然能准确区分犬细小病毒不同基因型，但同时需要两对探针价格昂贵，限制其在生产中的实际应用等等。
传统的CPV分型方法有病毒分离与鉴定（VI）、血凝抑制试验（HI）、普通PCR方法、限制性片段长度多态性（RFLP）方法、MGB探针方法和测序等，其中病毒分离与鉴定方法需借助3个不同型单克隆抗体才能完成分型，费时费力不易快速鉴别CPV不同亚型；血凝抑制试验方法对CPV病毒梯度要求较高，一般梯度大于1：64才可用相应单克隆抗体来鉴别，而梯度小于1：32则需通过在MDCK或F81细胞上扩增后方能用单克隆抗体来检测；PCR方法利用CPV-2b序列引物3ˊ末段碱基错配方式区分CPV-2a和CPV-2b型，此方法虽然能区分CPV-2a和CPV-2b型，但特异性不高容易同时扩增出两个型。此外，新出现的CPV变异株表明3ˊ末段碱基错配法保守性差，易受到病毒核酸序列突变影响，因此普通PCR方法很难对CPV进行准确分型；限制性片段长度多态性方法能够区分CPV-2b和CPV-2c型,但区分不了CPV-2a和CPV-2b型，因为MboⅡ酶对CPV-2a和CPV-2b酶切结果相同，此方法只能在用单克隆抗体确认为CPV-2b的前体下才能鉴别CPV-2b和CPV-2c基因型；MGB探针方法虽然能够区分CPV不同基因型，但同时合成两个或以上探针，价格昂贵不易在临床检测中使用；测序方法虽然准确率高，但价格偏高所需时间长，一般要24小时才能完成。
上述方法均未能克服操作复杂、费时、费用高等缺点，在临床实践中的应用受限。因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的犬细小病毒基因分型方法。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠且检测成本低廉，有利于在临床实践中推广应用。
本发明的目的在于提供一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物。
本发明的另一目的在于提供一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：CCAGAAGGAGATTGGATTCA（SEQ ID NO：1）或其核苷酸互补序列，
引物P2：TTAATGCAGTTAAAGGACCAT（SEQ ID NO：2）或其核苷酸互补序列。
一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒DNA；
2）以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对和荧光饱和染料进行扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。
进一步的，步骤2）中的扩增反应体系为：
Premix Ex-Taq 5μl
引物P1 0.4μl
引物P2 0.4μl
模板 0.8μl
LC green染料 1μl
ddH2O 至10μl。
进一步的，步骤2）中的扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸8min；90℃变性1min，30℃杂交2min，68℃到80℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
进一步的，骤3）中所述HRM分析的具体分析过程为：1）若HRM曲线中存在Tm值为73.48±0.10℃的曲线，说明该样品含有基因型为CPV-2a型的犬细小病毒；
2）若HRM曲线中存在Tm值为72.94±0.05℃的曲线，说明该样品中含有基因型为CPV-2b或CPV-2c的犬细小病毒；
3）在上述2）种情况下，往扩增产物中加入以CPV-2b DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物的PCR产物后，再进行HRM曲线分析：
a. 若Tm值为72.94±0.05℃的曲线形状不发生变化，说明该样品含有CPV-2b基因型犬细小病毒不含有CPV-2c型病毒；
b. 若Tm值为72.94±0.05℃的曲线形状发生变化，产生了杂合子曲线，说明该样品含有CPV-2c型犬细小病毒。
本发明的有益效果是：
1）本发明首次建立了一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法，操作简单：只需 PCR 反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间； 费用低，不需要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB ；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
2）本发明的PCR-HRM引物，简并性好，对3种亚型的犬细小病毒均有很好地的扩增性，有助于提高PCR 的效率，减少病毒鉴别分型的时间。
3）本发明的PCR-HRM引物特异性好，除可以与3种亚型的犬细小病毒结合，不与其他常见犬类病毒DNA结合，特异性扩增犬细小病毒DNA，有利于提高本发明对基因型分析的正确性。
附图说明
图1为不同基因型犬细小病毒的HRM高分辨率熔解曲线；
图2为不同基因型犬细小病毒的杂合子HRM高分辨率熔解曲线；
图3为实际样品检测中不同基因型犬细小病毒的HRM高分辨率熔解曲线；
图4为实际样品检测中不同基因型犬细小病毒的杂合子HRM高分辨率熔解曲线；
图5为特异性实验图。
具体实施方式
一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：CCAGAAGGAGATTGGATTCA（SEQ ID NO：1）或其核苷酸互补序列，
引物P2：TTAATGCAGTTAAAGGACCAT（SEQ ID NO：2）或其核苷酸互补序列。
一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒DNA；
2）以DNA为模板，用上述的引物对和荧光饱和染料进行扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。
优先的，步骤2）中的扩增反应体系为：
Premix Ex-Taq 5μl
引物P1 0.4μl
引物P2 0.4μl
模板 0.8μl
LC green染料 1μl
ddH2O 至10μl。
优选的，步骤2）中的扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸8min；90℃变性1min，30℃杂交2min，68℃到80℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
优选的，步骤3）中所述HRM分析的具体分析过程为：
1）若HRM曲线中存在Tm值为73.48±0.10℃的曲线，说明该样品含有基因型为CPV-2a型的犬细小病毒；
2）若HRM曲线中存在Tm值为72.94±0.05℃的曲线，说明该样品中含有基因型为CPV-2b或CPV-2c的犬细小病毒；
3）在上述2）种情况下，往扩增产物中加入以CPV-2b DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物的PCR产物后，再进行HRM曲线分析；
a. 若Tm值为72.94±0.05℃的曲线形状不发生变化，说明该样品含有CPV-2b基因型犬细小病毒不含有CPV-2c型病毒；
b. 若Tm值为72.94±0.05℃的曲线形状发生变化，产生了杂合子曲线，说明该样品含有CPV-2c型犬细小病毒。
实施例1
（1）PCR-HRM引物
经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2对PCR-HRM法区分不同基因型犬细小病毒的效果最好，其碱基序列如下所示。
P1 :5'- CCAGAAGGAGATTGGATTCA -3' （SEQ ID NO：1），
P2:5'- TTAATGCAGTTAAAGGACCAT -3'（SEQ ID NO：2）。
其中，引物P1在犬细小病毒VP2基因第4014～4033位点上，引物P2在犬细小病毒VP2基因第4138～4158位点上 (该基因在Genbank 中的登录号为M38245 ) 。
（2）标准质粒样品的构建及其PCR-HRM分析
1）犬细小病毒DNA的提取：
用试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0提取病料样品中的犬细小病毒DNA。病料样品可以是全血、粪便、直肠面拭子等易于获得且对动物体无严重伤害的样品。
2）标准质粒样品的制备：
为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准质粒，保存各基因型质粒序列（经序列测定正确），之后扩增保存的质粒序列进行HRM分析作为标准对照。标准质粒样品的制备步骤如下：
取经过测序确定分别为CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c基因型的犬细小病毒毒株，以P1和P2为引物分别进行PCR扩增，纯化；并用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的DNA连接至pMD-18T载体中，
载体连接反应体系（10μl）：
反应条件：16℃，4h以上。
取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5μl，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min。加入400μl LB液体培养基，37℃ 200r/min-220r/min振荡培养45min后，以恢复质粒的抗性。4℃ 4000r/min离心5min，弃去上清400μl，将剩余的100μl菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h－16h，至单菌落出现。用灭菌牙签挑取单菌落于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中12h－16h，并用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒提取质粒。
通过上述方法，分别获得含CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c基因型犬细小病毒的目的基因片断的质粒，作为后续研究的阳性对照样品。
3）阳性质粒样品的PCR-HRM操作步骤
分别以上述获得的三种阳性质粒样品为DNA模板，分别进行PCR-HRM扩增反应和分析；
PCR反应体系：10μl
PCR -HRM 程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸8min，90℃变性1min，30 ℃杂交2min，68℃到80℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
4）阳性质粒样品PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。犬细小病毒质粒样品3种不同基因型的HRM（高分辨率熔解曲线，High Resolution Melting curve）结果如图1、图2所示。
从图1的标准化熔解曲线图显示，根据Tm值的差异可明显地区分出CPV-2a基因型，因为CPV-2a 基因型Tm比CPV-2b和CPV-2c 小0.56℃；而CPV-2b 和CPV-2c 两个基因型Tm差值较小只有0.15℃，不易直接通过Tm值来区分二者（图1）。
为了更好地区分CPV-2b 和CPV-2c 基因型， 本发明用已知基因型的CPV-2b 的PCR 产物（PCR体系和条件与上述3）中所述的一样）按1：1（体积比）比例分别加入至CPV-2c和CPV-2b的PCR-HRM产物中，再进行杂合子熔解曲线分析。杂合子熔解曲线图显示（图2），加入已知基因型（CPV-2b）的PCR 产物后由于CPV-2c样品与加入的CPV-2b PCR产物基因型不同形成杂合子，从而改变了CPV-2c基因型原有的熔解曲线形状。而对于CPV-2b样品，所加入的PCR产物基因型与CPV-2b相同，即都是CPV-2b基因型，未能形成杂合子，熔解曲线形状无变化（图2）。因此，通过形成杂合子与否的方法区分CPV-2b和CPV-2c的基因型。
（3）实际样品的PCR-HRM分析
1）从样本中提取病毒DNA：方法同上述（2）中 DNA提取方法；
2）以提取的病毒DNA为模板，进行PCR-HRM的扩增反应：
扩增反应体系为：
Premix Ex-Taq 5μl
引物P1 0.4μl
引物P2 0.4μl
模板 0.8μl
LC green染料 1μl
ddH2O 至10μl。
扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸8min；90℃变性1min，30℃杂交2min，68℃到80℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。
本发明检测了30份实际样品，PCR-HRM的结果如图3、图4所示。
从图3所示的熔解曲线图上可看出，30份实际样品中19份样品熔解曲线形状与所建立的标准质粒样品CPV-2a相同，其Tm值明显小于其它样品（图3），19份样品均为CPV-2a基因型。而其它样品熔解曲线聚在一起很难通过Tm值来区分。
为了更好地区分CPV-2b 和CPV-2c基因型，对剩余11份未知样品进行杂合子熔解曲线分析，即把已建立的好的标准质粒样品CPV-2b的PCR产物按1：1（体积比）比例分别加入至11份未知样品再进行熔解曲线分析。杂合子熔解曲线分析结果显示（图4），加入已知CPV-2b 基因型样品后3份样品熔解曲线形状发生改变，而8份样品熔解曲线未发生改变，表明11份未知样品中有3份样品为CPV-2c基因型，8份样品为CPV-2b基因型（图4）。由于临床样品中不同基因型犬细小病毒同时存在的几率小，本发明未考虑临床混合感染样品的基因分型。
（4）特异性实验
下面对本发明建立的PCR-HRM法作特异性检测。
分别提取其他常见犬病毒DNA，如提取犬瘟热（Canine distemper virus, CDV）、犬腺病毒-2（Canine adenovirus type 2，CAV-2）和犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus, CPIV）的DNA分别作为PCR模板，以上述（3）中的PCR方法分别进行PCR反应，将PCR产物后进行凝胶电泳分析，并与CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c的PCR产物进行对比分析，电泳结果如图5所示。
图5中的M为Marker（DL1000 DNA marker），泳道1-7分别为1：CPV-2a，2：CPV-2b， 3：CPV-2c，4：CDV，5: CAV-2，6: CPIV，7: 阴性对照，凝胶电泳结果显示，犬细小病毒阳性样品（CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c）在150bp左右有目的条带，而其它样品均未出现电泳条带，表明所设计的引物特异性高适合用于HRM分析。
<110> 广州博至生物科技有限公司，广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物和方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
ccagaaggag attggattca 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
ttaatgcagt taaaggacca t 21
Claims (5)
1.一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：CCAGAAGGAGATTGGATTCA（SEQ ID NO：1）或其核苷酸互补序列，
引物P2：TTAATGCAGTTAAAGGACCAT（SEQ ID NO：2）或其核苷酸互补序列。
2.一种快速区分不同基因型犬细小病毒的PCR-HRM方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒DNA；
2）以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对和荧光饱和染料进行扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）中的扩增反应体系为：
Premix Ex-Taq 5μl
引物P1 0.4μl
引物P2 0.4μl
模板 0.8μl
LC green染料 1μl
ddH2O 至10μl。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）中的扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸8min；90℃变性1min，30℃杂交2min，68℃到80℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述HRM分析的具体分析过程为：1）若HRM曲线中存在Tm值为73.48±0.10℃的曲线，说明该样品含有基因型为CPV-2a型的犬细小病毒；
2）若HRM曲线中存在Tm值为72.94±0.05℃的曲线，说明该样品中含有基因型为CPV-2b或CPV-2c的犬细小病毒；
3）在上述2）种情况下，往扩增产物中加入以CPV-2b DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物的PCR产物后，再进行HRM曲线分析;
a. 若Tm值为72.94±0.05℃的曲线形状不发生变化，说明该样品含有CPV-2b基因型犬细小病毒不含有CPV-2c型病毒；
b. 若Tm值为72.94±0.05℃的曲线形状发生变化，产生了杂合子曲线，说明该样品含有CPV-2c型犬细小病毒。
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