CN105331741A - 一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的hrm检测方法及引物 - Google Patents

一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的hrm检测方法及引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法及引物。该方法操作简单：只需PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量，全部操作过程只需3小时，根据仪器配制一次可完成72/100或96/384孔板的PCR产物检测；费用低，不需要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1.6元；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

Description

一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法及引物
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法及引物。
背景技术
小鼠脑脊髓炎病毒（Theiler’smurineencephalomyelitisvirus，TMEV）属于微RNA病毒科，心病毒属(Cardiovirus）。核酸为负链单股RNA，基因组大小约8100bp。小鼠脑脊髓炎病毒在小鼠群中广泛存在，感染率达8%～35%。该病毒多数呈隐性感染，主要侵害小鼠中枢神经系统，导致脑脊髓炎，临床表现为后肢麻痹，偶尔波及前肢。近年研究发现，大鼠也可以自然感染TMEV病毒，大鼠乳鼠脑内接种TMEV病毒可以导致动物发生后肢瘫痪、被毛蓬乱和体重减轻等症状。TMEV不仅对实验动物本身造成危害，还对科学研究工作造成潜在干扰，是国标中SPF级小鼠需要排除的病原体。
目前，TMEV感染诊断方法主要是免疫学检测方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫酶试验（IEA）和免疫荧光试验（IFA）等，但是这些方法中不能应用于免疫功能低下或免疫缺陷动物如SCID小鼠、裸小鼠和裸大鼠等的检测，因为它们不能产生正常的抗体反应，此外，抗体检测方法不适用于病毒早期感染的诊断。抗原检测方面常规病毒分离鉴定方法既复杂又繁琐，不利于日常检测。普通RT-PCR方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点，已成为TMEV病毒感染诊断的重要手段。
大鼠泰勒病毒（Rattheilovirus，RTV)，也称为大鼠疑似泰勒病毒（Theiler’s-likevirusofrats）或大鼠脑脊髓炎病毒（Ratencephalomyelitisvirus），是近些年新发现一种感染大鼠的心病毒属病毒。RTV的理化特征与TMEV相似，而且RTV与TMEV之间有抗原交叉反应。最近研究报道表明RTV是目前大鼠流行的病毒之一，感染率为0.6%～54.4%。国外实验动物机构和国内一些CRO公司都把RTV列为日常健康监测中的一个常规检测项目。目前RTV的检测方法主要是ELISA方法，但是一些检测机构采用TMEV作为包被抗原进行大鼠RTV检测，因此不能鉴别是TMEV感染还是RTV感染。PCR检测也是RTV诊断的一种有效方法。
综上所述，TMEV和RTV主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法。免疫学方法主要是检测血清中是否存TMEV和RTV的特异性抗体，具体是用ELISA、IFA和MFIA等方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述两种病毒之间有抗原交叉性，其特异性难以保证，因此不能进行鉴别。核酸检测方法具有快速、灵敏、特异、直观等特点，消除了常规免疫学检测方法中非特异性因素的干扰及敏感性问题，可以对TMEV和RTV进行鉴别诊断。常用的核酸检测方法主要包括普通PCR方法和荧光定量PCR检测方法。普通PCR方法需要开盖对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化，而且容易产生气溶胶污染，导致出现假阳性。荧光定量PCR检测方法需要设计荧光标记探针，价格比较昂贵，限制了该方法的推广应用。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法及引物。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物P1：ATTTGAAAGCAATGGTTAGC（SEQIDNO：1）；
下游引物P2：GATCGAGAGGATGTTCATCTAA（SEQIDNO：2）。
一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测试剂盒，所述试剂盒含有上述引物。
一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以核酸为模板，用上述引物对P1和P2以及荧光饱和染料，进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
优选的，RT-PCR扩增反应体系如下：
模版RNA1～5μl
PrimeScript1stepEnzymeMix0.8μl
上游引物P1（10μmol/L）1μl
下游引物P2（10μmol/L）1μl
2×1StepBuffer10μl
LCgreen染料1μl
加RNAfreeddH2O补足至20μl。
优选的，扩增反应程序如下：
50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性20sec、55℃退火20sec、72℃延伸20sec，循环40次；72℃终延伸5min；HRM分析设定的熔解速率为0.3℃/sec。
一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）将样品核酸反转录获得cDNA，以cDNA为模板，用上述引物对P1和P2以及荧光饱和染料，进行二次扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
优选的，二次扩增反应体系如下：
cDNA2μl
PremixExTaq10μl
上游引物P1（10μmol/L）1μl
下游引物P2（10μmol/L）1μl
LCgreen染料1μl
加RNAfreeddH2O补足至20μl。
优选的，二次扩增反应程序如下：
94℃预变性3min；94℃变性20sec、55℃退火20sec、72℃延伸20sec，循环40次；72℃终延伸5min；HRM分析设定的熔解速率为0.3℃/sec。
优选的，步骤3）中HRM分析的具体分析方法为：以小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品曲线相似，则判定为小鼠脑脊髓炎病毒；以大鼠泰勒病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和大鼠泰勒病毒阳性标准品曲线相似，则判定为大鼠泰勒病毒。
优选的，步骤3）中HRM分析的具体分析方法为：以小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品曲线相似，同时其Tm值为80.27±0.78℃，则判定为小鼠脑脊髓炎病毒；以大鼠泰勒病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和大鼠泰勒病毒阳性标准品曲线相似，同时其Tm值为83.30±1.32℃，则判定为大鼠泰勒病毒。
本发明的有益效果是：
（1）本发明首次建立了一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法以及引物，该方法操作简单：只需PCR反应之前加入荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量，全部操作过程只需3小时，根据仪器配制一次可完成72/100或96/384孔板的PCR产物检测；费用低，不需要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1.6元；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
（2）本发明所设计的引物特异性好，只能特异性扩增出小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒，与其他大小鼠病毒如小鼠肝炎病毒（MHV）、大鼠冠状病毒（RCV）、小鼠诺如病毒（MNV）、呼肠孤病毒III型（Reo-3）、仙台病毒（SV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、汉坦病毒（HV）、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、小鼠细小病毒MVM株（MVM）、小鼠细小病毒MPV株（MPV）、大鼠细小病毒KRV株（KRV）、大鼠细小病毒H-1株（H-1）、鼠痘病毒（Ect）、小鼠腺病毒（Mad）、多瘤病毒（Poly）、小鼠巨细胞病毒（MCMV）无交叉反应。
（3）本发明方法灵敏度高，可以检测到1.0×101copies/μl的TMEV和RTV质粒标准品。
（4）本方法不需要进行PCR产物的分离，真正实现了闭管操作，避免污染；同时对PCR产物无损害，检测后还可以进行后续分析，如测序和凝胶电泳等。
附图说明
图1是TMEV和RTV质粒标准品PCR的电泳图，泳道1、2、3为TMEV质粒标准品，泳道4、5、6为RTV质粒标准品，泳道7、8为阴性对照，泳道M为DL2000DNAMarker；
图2是TMEV和RTV模拟峰型化熔解曲线图；
图3是TMEV和RTV质粒标准品标准化熔解曲线图；
图4是TMEV和RTV质粒标准品峰型化熔解曲线图；
图5是TMEV和RTV质粒标准品差异化熔解曲线图；
图6是TMEV和RTV临床样品标准化熔解曲线图；
图7是TMEV和RTV临床样品峰型化熔解曲线图；
图8是TMEV和RTV临床样品差异化熔解曲线图；
图9是TMEV和RTVPCR-HRM方法特异性试验；
图10是TMEV和RTVPCR-HRM方法中TMEV检测的敏感性试验；
图11是TMEV和RTVPCR-HRM方法中RTV检测的敏感性试验。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不局限于此。
实施例1特异性引物的设计
本发明设计可以同时检测TMEV和RTV的引物；并对所设计的引物做大量的实验筛选，筛选出一对特异性强的引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物P1：ATTTGAAAGCAATGGTTAGC（SEQIDNO：1）；
下游引物P2：GATCGAGAGGATGTTCATCTAA（SEQIDNO：2）。
实施例2质粒标准品的PCR-HRM分析
（1）TMEV和RTV质粒标准品的制备：
分别提取小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的RNA，以P1和P2为引物，用PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒（Takara公司）进行RT-PCR扩增：
反应体系为：EnzymeMix2μl，2×RT-PCRBuffer25μl，上游引物P1(10μM)2.5μl，下游引物P2(10μM)2.5μl，RNA5μl，加RNaseFreeddH2O至50μl。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃2min，一个循环94℃30sec、55℃30sec、72℃30sec，共35个循环，最后72℃延伸7min。
PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒（天根公司）回收目的片段后克隆至pGEM-TEasy载体（Promega公司），获得重组质粒pGEM-TMEV和pGEM-RTV，采用PCR方法进行鉴定后，将阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，测序结果表明pGEM-TMEV和pGEM-RTV重组质粒中插入片段大小均为202bp，分别为小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒核苷酸序列。
（2）TMEV和RTV质粒标准品标定：
采用质粒抽提试剂盒（天根公司）提取重组质粒DNA，用微量紫外分光光度计测定质粒DNA浓度。根据下面的公式计算拷贝数。拷贝数(copies/μl)=6.022×1023(copies/mol)×质粒DNA浓度(g/μl)/质量MW(g/mol)。其中，MW=DNA碱基数×660daltons/碱基，DNA碱基数=载体序列碱基数+插入序列碱基数。根据计算结果调整TMEV和RTV质粒标准品的浓度为1×1010copies/μl，采用纯水10倍梯度稀释得到浓度为1×109～1×100copies/μl质粒标准品溶液。
（3）质粒标准品的PCR-HRM扩增：
PCR反应体系：
PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性20sec、55℃退火20sec、72℃延伸20sec，循环40次；72℃终延伸5min，HRM分析设定的熔解速率为0.3℃/sec。
TMEV和RTV质粒标准品PCR的电泳图结果图见图1,泳道1、2、3为TMEV质粒标准品，泳道4、5、6为RTV质粒标准品，泳道7、8为阴性对照，泳道M为DL2000DNAMarker。
（4）质粒扩增产物的模拟HRM分析：
TMEV和RTV质粒标准品经测序并验证后，利用在线软件进行模拟HRM分析，由图2可见，TMEV和RTV的HRM曲线差异明显，TMEV和RTV能有效区分开来。
（5）TMEV和RTV质粒标准品扩增产物的HRM分析:
用Rotor-GeneQ分析仪（Qiagen公司）进行PCR扩增产物和HRM分析。TMEV和RTV质粒标准品的HRM分析结果如图3～5所示。图3、图4、图5分别为质粒标准品标准化熔解曲线图、峰型化熔解曲线图和差异化熔解曲线图。标准化熔解曲线图是由原始熔解曲线图经过标准化处理后得到，最大限度的消除了由于起始模板浓度不同而造成荧光信号值的差异，由图3可见TMEV和RTV均有各自独有的溶解曲线特征。峰型化熔解曲线图是对标准化熔解曲线图进行导数化处理后得到，峰型化熔解曲线图明显地反映了TMEV和RTV的差异，由图4可知TMEV质粒标准品的Tm为80.13，而RTV质粒标准品的Tm为83.73。为了更好的区分TMEV和RTV，对熔解曲线图进行差异化处理，即把TMEV的信号变化设为零，并与RTV进行比较，图5更加明显地反映了TMEV和RTV溶解曲线的差异。从三种不同形式的熔解曲线图上可看出TMEV和RTVHRM曲线差异明显，可达到鉴别TMEV和RTV目的。
因此，以TMEV和RTV质粒标准品为模板的扩增产物的HRM图与模拟图一致，能够鉴别TMEV和RTV。
实施例3临床样品的PCR-HRM检测
（1）待检样品中RNA的提取：
本发明的待检样品为广东地区收集的大小鼠的脾脏和盲肠内容物，用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取样品中的TMEV和RTV基因组RNA。
（2）一步法RT-PCR扩增：
利用PrimeScriptonestepRT-PCRKitVer.2试剂盒对提取的基因组RNA进行一步法RT-PCR扩增。
反应体系如下：
一步法RT-PCR扩增反应程序如下：
50℃30min；94℃预变性3min；94℃变性20sec、55℃退火20sec、72℃延伸20sec，循环40次；72℃终延伸5min；HRM分析设定的熔解速率为0.3℃/sec。
（3）两步法扩增：
以步骤（1）中提取的RNA作为模板反转录获得cDNA。反转录体系和程序如下：10μl反转录体系包括RNA5μl，5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）2μl，RNaseFreeddH2O3μl；37℃孵育15min，85℃失活反转录酶5sec。产物-20℃保存。然后以cDNA作为模板，进行二次扩增。
二次扩增反应体系如下：
二次扩增反应程序如下：
94℃预变性3min；94℃变性20sec、55℃退火20sec、72℃延伸20sec，循环40次；72℃终延伸5min；HRM分析设定的熔解速率为0.3℃/sec。
（4）HRM分析：
一步法获得结果，利用Rotor-GeneQ分析仪(Qiagen公司)进行PCR扩增和HRM分析，结果如图6～8所示。根据图6～8的结果，并对照TMEV和RTV阳性标准品的曲线进行分析，初步判定11株为TMEV，4株为RTV。图6、图7和图8分别为标准化熔解曲线图、峰型化熔解曲线图和差异化熔解曲线图。从3种不同形式的熔解曲线图上可看出TMEV和RTV的HRM图相互分开，已达到鉴别两种病毒的目的。峰型化熔解曲线图和差异化熔解曲线图更加明显地反应出了TMEV和RTV所扩增序列的差异。以上3种不同形式的熔解曲线图是由Rotor-GeneQsoftwareversion2.1.0软件完成。
由图2～8可见，临床样品的HRM曲线、质粒标准品的HRM曲线和模拟HRM曲线的峰形基本相同，具有很好的符合性。尽管11株TMEV在Tm值有细微差异，但是熔解曲线基本一致；同样4株RTV的Tm值有细微差异，但熔解曲线也基本一致。
利用TMEV和RTV两步扩增法获得的产物进行同样的HRM分析，结果与上述一致。
另外，对该15份样品的扩增产物进行测序，与Genebank中已发表TMEV和RTV序列进行比较，做进化分析，确定11株为TMEV，4株为RTV，分析结果与本发明方法检测的结果完全一致，说明本发明方法的准确性高，可达100%。
实施例4大规模实验
以实施例3的加样体系及PCR反应条件，对80份经测序验证为TMEV阳性临床样本进行检测，统计分析Tm值，由于实际检测中熔解曲线Tm受多方面因素的影响会有些变化，包括核酸片段本身、反应试剂盐离子浓度及饱和荧光染料浓度微弱变化，故介定一个宽的Tm范围，以Tmavg±3×SD作为TMEV阳性参考值。结果显示：临床样品的HRM曲线和质粒标准品的HRM曲线的峰形基本相同，具有很好的符合性。此外，80份TMEV阳性样本的Tm平均值（Tmavg）为80.27，标准差（SD）为0.26。因此将Tm=80.27±0.78（79.49～81.05）作为TMEV的阳性参考值。
同样，以实施例3的加样体系及PCR反应条件，对126份经测序验证为RTV阳性临床样本进行检测，统计分析Tm值，以Tmavg±3×SD作为RTV阳性参考值。结果显示：临床样品的HRM曲线和质粒标准品的HRM曲线的峰形基本相同，具有很好的符合性。此外，126份RTV阳性样本的Tm平均值（Tmavg）为83.30，标准差（SD）为0.44，因此将Tm=83.30±1.32（81.98～84.62）作为RTV的阳性参考值。
因此，本发明的判定标准为：以小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品曲线相似，同时其Tm值为80.27±0.78℃，则判定为小鼠脑脊髓炎病毒；以大鼠泰勒病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和大鼠泰勒病毒阳性标准品曲线相似，同时其Tm值为83.30±1.32℃，则判定为大鼠泰勒病毒。
对实施例3的15份样品的Tm数值进行分析，结果符合上述判定标准的范围。
综上所述TMEV和RTV具有各自特异性的HRM曲线，且该HRM曲线具有很好的稳定性，通过简单对比以及Tm的数值范围，即可快速鉴别TMEV和RTV。
实施例5特异性试验
根据上述的PCR-HRM方法，用小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）、大鼠泰勒病毒（RTV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、大鼠冠状病毒（RCV）、小鼠诺如病毒（MNV）、呼肠孤病毒III型（Reo-3）、仙台病毒（SV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、汉坦病毒（HV）、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、小鼠细小病毒MVM株（MVM）、小鼠细小病毒MPV株（MPV）、大鼠细小病毒KRV株（KRV）、大鼠细小病毒H-1株（H-1）、鼠痘病毒（Ect）、小鼠腺病毒（Mad）、多瘤病毒（Poly）、小鼠巨细胞病毒（MCMV）的DNA或cDNA作为模版进行PCR-HRM扩增，验证引物的特异性。
结果如图9所示，图9中可以看出所设计的引物只能扩增出TMEV和RTV特异熔解峰，没有能扩增出其它病毒，表明所设计的引物有较高的特异性。
实施例6敏感性实验
将TMEV和RTV质粒标准品，依次稀释为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μl，按上述的PCR-HRM方法进行敏感性实验。结果见图10-11。
图10为TMEV和RTVPCR-HRM方法中TMEV检测的敏感性试验，从上到下依次为1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101copies/μl的标准品的扩增结果；并且其Tm数值的范围为80.11～80.50，符合上述判定标准的范围。
图11为TMEV和RTVPCR-HRM方法中RTV检测的敏感性试验，从上到下依次为1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101copies/μl的标准品的扩增结果；并且其Tm数值的范围为83.65～83.74，符合上述判定标准的范围。
结果表明本发明的PCR-HRM方法灵敏度为：对小鼠脑脊髓炎病毒TMEV灵敏度达到1.0×101copies/μl；对大鼠泰勒病毒RTV灵敏度达到1.0×101copies/μl。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>广东省实验动物监测所
<120>一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法及引物
<130>
<160>2
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工引物
<400>1
atttgaaagcaatggttagc20
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工引物
<400>2
gatcgagaggatgttcatctaa22

Claims (10)

1.一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物P1：ATTTGAAAGCAATGGTTAGC（SEQIDNO：1）；
下游引物P2：GATCGAGAGGATGTTCATCTAA（SEQIDNO：2）。
2.一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以核酸为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2以及荧光饱和染料，进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，RT-PCR扩增反应体系如下：
模版RNA1～5μl
PrimeScript1stepEnzymeMix0.8μl
上游引物P11μl
下游引物P21μl
2×1StepBuffer10μl
LCgreen染料1μl
加RNAfreeddH2O补足至20μl。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，扩增反应程序如下：
50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性20sec、55℃退火20sec、72℃延伸20sec，循环40次；72℃终延伸5min；HRM分析设定的熔解速率为0.3℃/sec。
6.一种快速鉴别小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的HRM检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）将样品核酸反转录获得cDNA，以cDNA为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2以及荧光饱和染料，进行二次扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，二次扩增反应体系如下：
cDNA2μl
PremixExTaq10μl
上游引物P11μl
下游引物P21μl
LCgreen染料1μl
加RNAfreeddH2O补足至20μl。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，二次扩增反应程序如下：
94℃预变性3min；94℃变性20sec、55℃退火20sec、72℃延伸20sec，循环40次；72℃终延伸5min；HRM分析设定的熔解速率为0.3℃/sec。
9.根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于：步骤3）中HRM分析的具体分析方法为：以小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品曲线相似，则判定为小鼠脑脊髓炎病毒；以大鼠泰勒病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和大鼠泰勒病毒阳性标准品曲线相似，则判定为大鼠泰勒病毒。
10.根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于：步骤3）中HRM分析的具体分析方法为：以小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和小鼠脑脊髓炎病毒阳性标准品曲线相似，同时其Tm值为80.27±0.78℃，则判定为小鼠脑脊髓炎病毒；以大鼠泰勒病毒阳性标准品作为阳性对照，若待检测样本的曲线和大鼠泰勒病毒阳性标准品曲线相似，同时其Tm值为83.30±1.32℃，则判定为大鼠泰勒病毒。
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