CN105132418A

CN105132418A - 一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量rt-pcr检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN105132418A
Application number: CN201510586617.0A
Authority: CN
Inventors: 袁文
Original assignee: Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Current assignee: Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: CN105132418B

Abstract

本发明公开了一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测方法及其试剂盒，该方法可以实现在同一个待测样本中同时检测小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的存在，并能对两种病毒的负载水平进行定量。本发明还提供了一种用于小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒二重荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。本发明的检测方法及试剂盒操作简便快速，特异性高，检测效果敏感、可靠，检测灵敏度为1×10²拷贝/μl。

Description

一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量 RT-PCR 检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测方法，进一步涉及一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

小鼠脑脊髓炎病毒（Theiler’s murine encephalomyelitis virus，TMEV）属于微RNA病毒科，心病毒属(Cardiovirus）。核酸为负链单股RNA，基因组大小约8100bp。小鼠脑脊髓炎病毒在小鼠群中广泛存在，感染率达8%~35%。该病毒多数呈隐性感染，主要侵害小鼠中枢神经系统，导致脑脊髓炎，临床表现为后肢麻痹，偶尔波及前肢。近年研究发现，大鼠也可以自然感染TMEV病毒，大鼠乳鼠脑内接种TMEV病毒可以导致动物发生后肢瘫痪、被毛蓬乱和体重减轻等症状。TMEV不仅对实验动物本身造成危害，还对科学研究工作造成潜在干扰，是国标中SPF 级小鼠需要排除的病原体。

目前，TMEV感染诊断方法主要是免疫学检测方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫酶试验（IEA）和免疫荧光试验（IFA）等，但是这些方法中不能应用于免疫功能低下或免疫缺陷动物如SCID小鼠、裸小鼠和裸大鼠等的检测，因为它们不能产生正常的抗体反应，此外，抗体检测方法不适用于病毒早期感染的诊断。抗原检测方面常规病毒分离鉴定方法既复杂又繁琐，不利于日常检测。普通RT-PCR方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点，已成为TMEV病毒感染诊断的重要手段。

大鼠泰勒病毒（Rat theilovirus ，RTV)，也称为大鼠疑似泰勒病毒（Theiler’s-like virus of rats）或大鼠脑脊髓炎病毒（Rat encephalomyelitis virus），是近些年新发现一种感染大鼠的心病毒属病毒。RTV的理化特征与TMEV相似，而且RTV与TMEV之间有抗原交叉反应。最近研究报道表明RTV是目前大鼠流行的病毒之一，感染率为0.6%~54.4%。国外实验动物机构和国内一些CRO公司都把RTV列为日常健康监测中的一个常规检测项目。目前RTV的检测方法主要是ELISA方法，但是一些检测机构采用TMEV作为包被抗原进行大鼠RTV检测，因此不能鉴别是TMEV感染还是RTV感染。PCR检测也是RTV诊断的一种有效方法。

综上所述，TMEV和RTV主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法。免疫学方法主要是检测血清中是否存TMEV和RTV的特异性抗体，具体是用ELISA、IFA和MFIA等方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述两种病毒之间有抗原交叉性，其特异性难以保证，因此不能进行鉴别。核酸检测方法具有快速、灵敏、特异、直观等特点，消除了常规免疫学检测方法中非特异性因素的干扰及敏感性问题，可以对TMEV和RTV进行鉴别诊断。常用的核酸检测方法主要包括普通PCR方法和荧光定量PCR检测方法。普通PCR方法需要开盖对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化，而且容易产生气溶胶污染，导致出现假阳性。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明建立了能够同时对TMEV和RTV进行快速检测的技术，不仅可以做到对TMEV和RTV进行鉴别诊断和定量分析，而且可以简化操作程序、节约成本，对实验大小鼠的病原监测、流行病学调查及早期预警都具有重要的意义。

本发明的目的在于提供一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

本发明的另一目的在于提供一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR引物，引物的核苷酸序列如下所示：

TMEV-F：5’-AGCCCATCCAYGAYGARCTT-3’（SEQ ID NO:1），

TMEV-R：5’-CTGAAAAACCGACTGYACAGG-3’ （SEQ ID NO:2），

RTV-F：5’-CCARRCGTGTGTCCTATTTGC-3’（ SEQ ID NO:3），

RTV-R：5’-TCCATAGTAAGAAGATCCGCTGG-3’（ SEQ ID NO:4）。

一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。

进一步的，上述试剂盒还含有检测探针，其序列如下所示：

TMEV-P：5’- ATCGTGGTTACACCACTTTCSGCGAGTT -3’（SEQ ID NO:5），

RTV-P：5’-CAGCCATTGACAAAAGTTCCGACGGAAT-3’ （SEQ ID NO:6）；

或者为该些序列的核苷酸互补序列。

进一步的，上述探针序列5’端标记的荧光基团选自FAM、JOE 、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。

进一步的，上述试剂盒含有2×荧光定量RT-PCR buffe、dNTPs、逆转录酶、Taq酶、阳性质控品和阴性质控品。

进一步的，上述2×荧光定量RT-PCR buffer含有95～105mmol/L pH8.8～9.2的Tris-HCl、18～22mmol/L (NH₄)₂SO₄、7.5～8.5 mmol/L MgCl₂、95～105mmol/L KCl。

一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

1）提取待检样品中的病毒RNA；

2）二重荧光定量RT-PCR：以提取的RNA 为模板，使用权利要求2～6任一所述的试剂盒进行二重荧光定量PCR；

3）结果分析：根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct 值判定结果：

①阳性：当阴性对照无扩增曲线且阳性对照的Ct 值≤ 32.0 时，检测样本的Ct 值≤ 35.0 且曲线有明显的指数增长期时，样本判为阳性；

②可疑：检测样本Ct 值大于35.0 且小于40.0，重复一次实验，如果Ct 值仍小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；

③阴性：当阴性对照无扩增曲线且阳性对照的Ct 值≤ 32.0 时，检测样本无Ct 值且曲线无明显的指数增长期时，样本判为阴性；

上述方法用于非疾病的诊断。

进一步的，步骤2）中二重荧光定量RT-PCR的反应体系为：

2×荧光定量RT-PCR buffer 12.5 μL

逆转录酶 0.5μL

Taq酶 0.5μL

10 μmol/L TMEV-F 1 μL

10μmol/L TMEV-R 1μL

10μmol/L TMEV-P 0.5μL

10μmol/L RTV-F 1μL

10 μmol/L RTV-R 1μL

10 μmol/L RTV-P 0. 5μL

RNase free ddH₂O 2.5μL

RNA模板 4 μL

总体积 25 μL。

进一步的，步骤2）中二重荧光定量RT-PCR的反应程序为42℃ 10min，1 个循环；95℃ 30sec，1 个循环；95℃ 5sec，60℃ 40s，采集荧光信号，40 个循环。

本发明的有益效果是：

本发明提供的试剂盒可同时对小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒两种病毒进行快速检测，并能够对样品中病原体的核酸进行实时精确检测和定量分析，准确率高，操作简便，成本低，具有广泛的应用前景。

本发明提供的试剂盒由于引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高容易漏诊和误诊的问题，基于上述优点，该小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒检测试剂盒适合在各级实验动物质量检测机构中推广应用。

附图说明

图1 为二重荧光定量RT-PCR 检测方法中小鼠脑脊髓炎病毒检测的敏感性实验，从左到右依次为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10² 拷贝/μl 的标准品的扩增结果；

图2 为二重荧光定量RT-PCR检测方法中大鼠泰勒病毒检测的敏感性实验，从左到右依次为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10² 拷贝/μl的标准品的扩增结果；

图3 为二重荧光定量RT-PCR检测方法中小鼠脑脊髓炎病毒的特异性实验，由图可以看出，TMEV为阳性、RTV、MHV、RCV、MNV、Reo-3 、SV、PVM、HV及阴性质控品均为阴性；

图4 为二重荧光定量RT-PCR检测方法中大鼠泰勒病毒的特异性实验，由图可以看出，RTV为阳性、TMEV、MHV、RCV、MNV、Reo-3、SV、PVM、HV 及阴性质控品均为阴性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不局限于此。

实施例 1

1 特异性引物及探针的设计

本发明根据小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒核酸序列，分别设计用于检测小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的引物和探针；本发明通过对所设计的引物和探针做大量的实验筛选，筛选出一组灵敏性高和特异性强的引物和探针序列，其序列如下：

小鼠脑脊髓炎病毒：

上游引物：TMEV-F：5’-AGCCCATCCAYGAYGARCTT-3’

下游引物：TMEV-R：5’-CTGAAAAACCGACTGYACAGG-3’

荧光探针：TMEV-P：5’-FAM-ATCGTGGTTACACCACTTTCSGCGAGTT-BHQ1-3’，扩增片段长度为149bp。

大鼠泰勒病毒：

上游引物：RTV-F：5’-CCARRCGTGTGTCCTATTTGC-3’

下游引物：RTV-R：5’-TCCATAGTAAGAAGATCCGCTGG-3’

荧光探针：RTV-P：5’-JOE-CAGCCATTGACAAAAGTTCCGACGGAAT-BHQ1-3’ 扩增片段长度为104bp。

用于检测小鼠脑脊髓炎病毒的荧光探针报告基团为FAM，用于检测大鼠泰勒病毒的荧光探针报告基团为JOE，淬灭基团为BHQ1。

上述引物与探针序列中，Y、R、S为简并碱基，其中Y 代表碱基C 或T，R 代表碱基A 或G，S 代表碱基C或G。

2 样本采集

本发明方法及试剂盒适用样本类型包括盲肠内容物、粪便、小鼠脏器组织、细胞培养物、环境设施设备拭子等。样本采集应注意无菌操作，防止交叉污染。

（1）活体动物：活体动物采用安乐死方法进行处死，无菌剖检动物，采集动物的盲肠内容物、肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏和肠道，剪取100~200mg组织放入无菌样品EP管中，保存待检。

（2）粪便：采集动物新鲜粪便置入无菌样品管（含1～2ml 灭菌生理盐水或PBS），用无菌棉球将试管塞紧后，保存待检。

（3）细胞培养物：将细胞培养物反复冻融三次，细胞混悬液转移于15ml离心管中，12000r/min 离心10min，去细胞碎片，上清液转移到无菌Eppendorf 管中，保存待检。

（4）环境设施设备拭子：用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌试管（含0.4ml灭菌生理盐水或PBS），将试管塞紧后，保存待检。

3 标本的处理

（1）盲肠内容物：取约1g的盲肠内容物置于2ml Eppendorf管中，加入适量灭菌生理盐水或PBS，使用匀浆器充分匀浆1-2分钟，12,000 rpm离心10min，取上清液用于核酸抽提。

（2）粪便：取约1-2颗粪便置于2ml Eppendorf管中，加入适量灭菌生理盐水或PBS，使用匀浆器充分匀浆1-2分钟，12,000 rpm离心10min，取上清液用于核酸抽提。

（3）组织：剪取待检样品2.0g 于研钵中充分研磨，再加4ml灭菌生理盐水或PBS混匀，或置于组织匀浆器中，加入4ml灭菌生理盐水或PBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌5ml Eppendorf 管中3000r/min 离心10min，取上清液用于核酸抽提。

若采用TRIzol试剂抽提RNA，可以直接取50-100mg组织样品加入1ml TRIzol，使用电动匀浆器充分匀浆1-2分钟，之后按TRIzol操作说明进行RNA抽提。组织体积不能超过TRIzol体积的10%，否则匀浆效果会不好。

若采用其他商业抽提试剂盒如Qiagen公司的RNeasy Mini Kit，可以直接取≤30mg组织样品加入600μl裂解液RLT，使用电动匀浆器充分匀浆1-2分钟，之后按试剂盒操作说明进行RNA抽提。

4 阳性和阴性 质控品的制备

（1）TMEV-RNA阳性质控品的制备：提取小鼠脑脊髓炎病毒RNA，分别以TMEV-F和TMEV-R为引物，用PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒（Takara公司）进行RT-PCR：

反应体系为：Enzyme Mix 2μl，2×RT-PCR Buffer 25μl，上游引物TMEV-F (10μM ) 2.5μl，下游引物 TMEV-R (10μM) 2.5μl，RNA 5 μl，加RNase Free dH₂O至50μl。

反应条件：50℃ 30 min，94℃ 2 min，一个循环94℃ 30sec、55℃ 30sec、72℃30sec，共35个循环，最后72℃ 延伸7 min。PCR 产物经2％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段后克隆至pGEM-T Easy 载体，阳性克隆菌(pGEM-TMEV) 送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，pGEM-TMEV 菌中含有的PCR 产物大小为149bp，

将pGEM- TMEV 质粒，37℃ Sa1 I 单酶切4h，使质粒线性化，琼脂糖凝胶电泳及试剂盒回收纯化质粒DNA 线性化产物，用于体外转录，按T7 体外转录试剂盒Ribomax^TM Large Scale RNA Production Systems（Promega公司）说明加入反应试剂37℃作用2h，然后加DNase I 酶1μL，37℃消化转录产物中未转录的DNA15min，70℃灭活DNase I 酶15min，用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒（Qiagen公司）进行RNA提取。得到体外转录的TMEV-RNA，用微量紫外分光光度计测定RNA浓度，根据重组质粒pGEM-TMEV的大小计算质粒体外转录的RNA拷贝数。按照下面的公式计算RNA拷贝数。拷贝数(copies/μl) =6.022 ×10²³ (copies/mol) ×RNA 浓度(g/μl)/质量MW(g/mol)。其中，MW= RNA 碱基数×340 daltons/碱基，RNA碱基数=载体序列碱基数+插入序列碱基数。结果TMEV-RNA 浓度为2.09×10¹² copies /μl。调整TMEV-RNA的浓度到1×10¹²copies/ml。-80℃保存备用，

（2）RTV-RNA标准品的制备：RTV-RNA标准品的制备参照TMEV-RNA制备方法进行。RTV PCR扩增采用RTV-F和RTV-R引物进行扩增，产物大小为104bp。体外转录结果RTV-RNA 浓度为6.4×10¹¹ copies /μl。调整RTV-RNA的浓度到1×10¹¹copies/ml。-80℃保存备用，

（3）阴性质控品

阴性质控品为无菌双蒸水。

5 病毒 RNA 的提取

按Trizol 试剂（Invitrogen 公司）的说明书或按照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒（Qiagen 公司）的说明书步骤，从感染相应病毒的样品中提取RNA，作为荧光定量RT-PCR 反应的模板。

6 二重荧光定量 RT-PCR 扩增

每个测试反应体系（25μl）配制体系如下：

2×荧光定量RT-PCR buffer 12.5 μL

逆转录酶 0.5μL

Taq酶 0.5μL

10 μmol/L TMEV-F 1 μL

10μmol/L TMEV-R 1μL

10μmol/L TMEV-P 0.5μL

10μmol/L RTV-F 1μL

10 μmol/L RTV-R 1μL

10 μmol/L RTV-P 0. 5μL

RNase free ddH₂O 2.5μL

RNA模板 4 μL

总体积 25 μL。

同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品和阴性质控品4μl 进行扩增。

将各反应管放入定量PCR 仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类（检测TMEV的报告基团选择FAM，检测RTV的报告基团选择JOE，淬灭基团均选择none，设定循环条件：42℃ 10min，1 个循环；95℃ 30sec，1 个循环；95℃ 5sec，60℃ 40s，采集荧光信号，40 个循环。

7 结果分析和判定

（1）结果分析条件设定：

①设置基线（baseline）：根据机型不同，设置3-15 循环，6-15 循环，特殊情况可对基线适当调整。②设置阈值（threshold）：以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点。

（2）结果判断

下面对本发明检测试剂盒及其检测方法作进一步的效果检测。

一、敏感性实验

将上述阳性质控品，依次稀释为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹、1×10⁰拷贝/μl，根据上述的二重荧光定量RT-PCR检测方法进行敏感性实验。

结果证实本试剂盒检测灵敏度为：

对小鼠脑脊髓炎病毒灵敏度达到1.0×10²拷贝/μl ；

对大鼠泰勒病毒灵敏度达到1.0×10²拷贝/μl 。

二、特异性试验

根据上述的二重荧光定量RT-PCR检测方法，用小鼠脑脊髓炎病毒、大鼠泰勒病毒、二者双阳性以及其他病毒如小鼠肝炎病毒（MHV）、大鼠冠状病毒（RCV）、小鼠诺如病毒（MNV）、呼肠孤病毒III型（Reo-3）、仙台病毒（SV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、汉坦病毒（HV）以及阴性对照进行验证实验并对产物进行测序验证，结果证实，本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性或假阳性，吻合度为100%，

图3 为二重荧光定量RT-PCR检测方法中小鼠脑脊髓炎病毒的特异性实验，由图可以看出，TMEV为阳性、RTV、MHV、RCV、MNV、Reo-3、SV、PVM、HV及阴性质控品均为阴性；

图4 为二重荧光定量RT-PCR检测方法中大鼠泰勒病毒的特异性实验，由图可以看出，RTV为阳性、TMEV、MHV、RCV、MNV、Reo-3、SV、PVM、HV及阴性质控品均为阴性。

三、临床样品检测

待测样本为广东地区收集的155份大鼠样本（编号为1-155），提取大鼠盲肠内容物的RNA，按上述二重荧光定量RT-PCR检测方法进行检测，结果检出小鼠脑脊髓炎病毒3份（阳性率1.94%，编号为34、43和46），检出大鼠泰勒病毒9份（阳性率5.81%，编号为2、8、14、76、84、108、136、140和142），其他样本均未检出小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒。将155份样本用普通RT-PCR 方法进行验证，结果与本发明的方法一致，符合率为100%。进一步证明本发明方法的准确性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 广东省实验动物监测所

<120> 一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测方法及其

试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

agcccatcca ygaygarctt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

ctgaaaaacc gactgyacag g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

ccarrcgtgt gtcctatttg c 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

tccatagtaa gaagatccgc tgg 23

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工探针

<400> 5

atcgtggtta caccactttc sgcgagtt 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工探针

<400> 6

cagccattga caaaagttcc gacggaat 28

Claims

1.一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR引物，引物的核苷酸序列如下所示：

TMEV-F：5’-AGCCCATCCAYGAYGARCTT-3’（SEQ ID NO:1），

TMEV-R：5’-CTGAAAAACCGACTGYACAGG-3’ （SEQ ID NO:2），

RTV-F：5’-CCARRCGTGTGTCCTATTTGC-3’（ SEQ ID NO:3），

RTV-R：5’-TCCATAGTAAGAAGATCCGCTGG-3’（ SEQ ID NO:4）。

2.一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有检测探针，其序列如下所示：

TMEV-P：5’- ATCGTGGTTACACCACTTTCSGCGAGTT -3’（SEQ ID NO:5），

RTV-P：5’-CAGCCATTGACAAAAGTTCCGACGGAAT- 3’ （SEQ ID NO:6）；

或者为该些序列的核苷酸互补序列。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述探针序列5’端标记的荧光基团选自FAM、JOE 、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有2×荧光定量RT-PCR buffe、dNTPs、逆转录酶、Taq酶、阳性质控品和阴性质控品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述2×荧光定量RT-PCR buffer含有95～105mmol/L pH8.8～9.2的Tris-HCl、18～22mmol/L (NH₄)₂SO₄、7.5～8.5 mmol/L MgCl₂、95～105mmol/L KCl。

7.一种小鼠脑脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的二重荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）提取待检样品中的病毒RNA；

上述方法用于非疾病的诊断。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2）中二重荧光定量RT-PCR的反应体系为：

2×荧光定量RT-PCR buffer 12.5 μL

逆转录酶 0.5μL

Taq酶 0.5μL

10 μmol/L TMEV-F 1 μL

10μmol/L TMEV-R 1μL

10μmol/L TMEV-P 0.5μL

10μmol/L RTV-F 1μL

10 μmol/L RTV-R 1μL

10 μmol/L RTV-P 0. 5μL

RNase free ddH₂O 2.5μL

RNA模板 4 μL

总体积 25 μL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2）中二重荧光定量RT-PCR的反应程序为42℃ 10min，1 个循环；95℃ 30sec，1 个循环；95℃ 5sec，60℃ 40s，采集荧光信号，40 个循环。