CN105219885A - 可避免假阴性的手足口病毒CoxA16恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

可避免假阴性的手足口病毒CoxA16恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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张璜
邓梓欣
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Abstract

本发明公开了可避免假阴性的手足口病毒CoxA16恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法。包含检测引物组及内标引物组。所述检测引物组是根据手足口病毒CoxA16？CAA基因设计的，其序列如SEQ？ID？NO.1-6所示；所述内标引物组是根据手足口病毒CoxA16？CAB基因设计的，其序列如SEQ？ID？NO.7-12所示。除了上述引物组外，所述手足口病毒CoxA16的恒温检测试剂盒中还包括：DNA聚合酶、反应液、反转录酶、内标靶标片段、阳性对照和阴性对照。本发明的检测引物、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、适合现场检测等优点，并且可有效防止假阴性的发生，适于推广应用。

Description

可避免假阴性的手足口病毒CoxA16恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及手足口病毒CoxA16的恒温检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
手足口病是一种全球性传染病，大部分国家和地区历年来都有该病流行的报道。其主要是由肠道病毒引起的常见传染病，主要通过粪口途径和密切接触等方式传播。据流行病学调查显示5岁以下的儿童是该病发病的高危人群，占发病总数的90%以上，其中3岁以下婴幼儿是重症发病的高危人群，成人感染患病几率极低。手足口病疫区分布广泛，没有严格的地区性，全球各地均有疫情爆发。手足口病在热带地区四季均可发病，在亚热带、温带地区以夏季为主，冬季的发病较为少见。根据国内外相关文献报道，能引起手足口病的肠道病毒种类很多，其中最主要的是肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇A16型（CoxA16）。
手足口病毒CoxA16属于细小RNA病毒科肠道病毒A组（HEVA），该病毒无包膜，病毒颗粒为二十面体了立体对称的球形结构，直径约为23-30nm；基因组为单股正链RNA，衣壳由60个亚单位组成，后者由VP1、VP2、VP3、VP4四种外壳蛋白拼装成五聚体结构，VP1或3’-VP1区是其基因分型和进化分析最常用的区域。CoxA16感染一般不会引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种中枢系统相关的疾病，但可能会引起心肌炎、心肌病以及呼吸道感染、结膜炎、发热性皮疹、疱疹性咽颊炎、急性弛缓性麻痹等疾病。因此CoxA16作为手足口病的另一重要的病原体也应予以一定的重视。
肠道病毒鉴定的基本方法是使用血清型特异性的中和抗血清进行的中和实验。但是这种方法由于要进行细胞培养、病毒分离以及血清中和等实验，所以其流程费时、操作繁琐、且敏感性、检出率偏低。补体结合实验和酶联免疫吸附实验是手足口病免疫学检测的常用方法，但前者在检测中假阳性偏高；后者因为肠道病毒血清型多而不能涵盖所有常见肠道病毒的型别。
以核酸为基础的PCR技术及恒温扩增技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于手足口病毒CoxA16检测。但检测样品复杂，因目前检测方法对假阴性的检测结果没有采取监控手段，故存在漏检的可能，但手足口病毒CoxA16危害严重，漏检造成的危害无法估量，此外，PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种可鉴别假阴性检测结果的快速、高通量且对仪器要求不高的手足口病毒CoxA16检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。恒温扩增技术具有检测时间短，易于操作等优点，本发明在恒温扩增技术基础上加入内标基因，可提供一种有效鉴别检测结果为假阴性检测方法，有利于手足口病毒CoxA16的准确、及时发现，更加有利于恒温检测方法在检测中的推广应用及提高检测的准确度。
本发明在样品管检测的时候同时设立一个内标基因检测管，该内标检测管及检测方法具有以下特点：1）内标基因与实际样品的检测不在同一管中进行检测，2）该内标基因的扩增靶标与样品检测管中的扩增靶标不同，3）内标基因的扩增靶标的核酸浓度在该内标基因的检测线附近，可识别轻微的反应抑制。正常情况下因内标检测管在加入样品提取液的同时加入有低浓度的内标靶标片段，所以内标检测管检测检测结果为阳性，如内标管检测结果为阴性，提示样品提取液中含有抑制因子或其他原因，导致内标检测管不能进行扩增反应，同样样品检测管也可能因抑制因子或其他原因导致不能进行正常扩增检测，造成样品检测管检测结果为假阴性，因此该方法可根据内标管的检测结果辅助判断样品检测结果可能为假阴性结果。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种用于检测手足口病毒CoxA16的反转录恒温荧光引物组合物。
本发明的另一个目的在于提供一种手足口病毒CoxA16的反转录恒温荧光检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供一种手足口病毒CoxA16的反转录恒温荧光检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
用于检测手足口病毒CoxA16的反转录恒温荧光检测引物组合物，其包含一组检测引物和一组内标引物，其中，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
CAA-F3：5’-AATGCTAGTGACAAGAATCTCA-3’；
CAA-B3：5’-GTTTGGCTACGACAAATGTG-3’；
CAA-FIP：5’-AAACCGGCACGGCTAAAGAAGTGTTGAACCATCACTCCA-3’；
CAA-BIP：5’-AGCATCATTACAATGCCCACCAATATCCCATCAAGTCAATGTCC-3’；
CAA-LF：5’-ATTCCCAATGGCTGTCTCC-3’；
CAA-LB：5’-GGTACACAGAACACAGATGGT-3’。
所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
CAB-F3：5’-GTTGAGTACATTGTCAGGTCA-3’；
CAB-B3：5’-CTAGCAGCCGTTGGTATC-3’；
CAB-FIP：5’-GGGTCATGGTCGGGTATTCGGCACGAGACGACATTCTT-3’；
CAB-BIP：5’-TTGAGTGTTGCTCCCGACGTCACTTGTGCGTTACGAC-3’；
CAB-LoopF：5’-TTATCGACCGCAGTGACTG-3’；
CAB-LoopB：5’-GGACAGGTAGTCACCGTTG-3’。
一种手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测试剂盒，检测试剂盒包括如上所述的检测引物组和内标引物组。
作为优选的，所述检测引物组及内标引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。
作为优选的，所述的手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测试剂盒中还包括以下成分：（1）反应液；（2）DNA聚合酶；（3）RNA反转录酶；（4）内标靶标片段；（5）阳性对照和阴性对照。
作为优选的，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。
作为优选的，所述RNA反转录酶为AMV反转录酶。
作为优选的，所述反应液含有：6mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
作为优选的，所述阳性对照为含有手足口病毒CoxA16CAA基因片段的T载体克隆，阴性对照为超纯水，内标靶标片段为含有手足口病毒CoxA16CAB基因片段的T载体克隆。
一种手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测方法，包括如下步骤：
（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；
（2）利用权利要求1的恒温荧光检测引物组合物对待检样品RNA进行反转录恒温扩增；
（3）结果判断：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据CAA基因检测结果和内标基因CAB检测结果进行判断：
CAA基因检测结果为阳性内标基因CAB检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
CAA基因检测结果为阴性内标基因CAB检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
CAA基因检测结果为阳性内标基因CAB检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
CAA基因检测结果为阴性内标基因CAB检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取RNA进行检测。
恒温扩增的25μl反应体系含有：CAA-F30.2μM，CAA-B30.2μM，CAA-FIP1.6μM，CAA-BIP1.6μM，CAA-LF0.8μM，CAA-LB0.8μM，CAB-F30.2μM，CAB-B30.2μM，CAB-FIP1.6μM，CAB-BIP1.6μM，CAB-LoopF0.8μM，CAB-LoopB0.8μM，反应液12.5μl，BstDNA聚合酶8U，AMV反转录酶0.8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl。
恒温扩增的程序为：63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min。
本发明的有益效果是：
本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性，及时发现检测中的假阴性结果，可有效防止因假阴性检测结果引起各种事故。
（1）快速高效：整个扩增只用30～60min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
（2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
（3）高特异性：本发明根据手足口病毒CoxA16设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
（4）高灵敏度：最低检测极限可达到102copies/ml；
（5）鉴定简便：可通过观察扩增曲线判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
（6）提高检测的准确性：本发明的检测试剂盒内含内标基因，可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，有效预防因抑制等原因造成的检测结果为假阴性的情况发生，为目前无法判断检测结果是假阴性结果的情况提供一种新的反转录恒温荧光检测方法，提高检测的准确性。
附图说明
图1手足口病毒CoxA16内标基因的最低检出限为102copies/ml；
图1中，1：107；2：106；3：105；4：104；5：103；6：102；7：阴性对照；
图2手足口病毒CoxA16内标基因的最低检出限为102copies/ml的复核；
图2中，1：102；2：阴性对照；
图3特异性实验，对CoxA1、CoxA2、CoxA4、CoxA5、CoxA6，CoxA7、CoxA9、CoxA10、CoxA11、CoxA12、CoxA13、CoxB1、CoxB2、CoxB3、CoxB5、Echo3、Echo6、Echo11、Echo19、EV71等病毒RNA均无非特异性扩增；
图3中，1：CoxA16；2：内标基因；3：CoxA1；4：CoxA2；5：CoxA4；6：CoxA5；7：CoxA6；8：CoxA7；9：CoxA9；10：CoxA10；11：CoxA11；12：CoxA12；13：CoxA13；14：CoxB1；15：CoxB2；16：CoxB3；17：CoxB5；18：Echo3；19：Echo6；20：Echo11；21：Echo19；22：EV71；23：阴性对照；
图4无抑制因子的实际样品检测；
图4中，1：阳性对照；2：样品1；3：样品2；4：内标基因；5：阴性对照；
图5有抑制因子的实际样品检测；
图5中，1：阳性对照；2：103；3：102；4：阴性对照；5：101；6：含抑制因子的GoxA16；7：含抑制因子的内标基因。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1手足口病毒CoxA16恒温荧光检测试剂盒的建立
手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测试剂盒，包括检测引物组、内标引物组、反应液、BstDNA聚合酶、AMV反转录酶、阳性对照、阴性对照和内标。
（1）检测引物组：以手足口病毒CoxA16CAA基因为靶基因，进行引物的设计，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
CAA-F3：5’-AATGCTAGTGACAAGAATCTCA-3’；
CAA-B3：5’-GTTTGGCTACGACAAATGTG-3’；
CAA-FIP：5’-AAACCGGCACGGCTAAAGAAGTGTTGAACCATCACTCCA-3’；
CAA-BIP：5’-AGCATCATTACAATGCCCACCAATATCCCATCAAGTCAATGTCC-3’；
CAA-LF：5’-ATTCCCAATGGCTGTCTCC-3’；
CAA-LB：5’-GGTACACAGAACACAGATGGT-3’。
（2）内标引物组：以CAB基因为内标基因，进行引物的设计，所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
CAB-F3：5’-GTTGAGTACATTGTCAGGTCA-3’；
CAB-B3：5’-CTAGCAGCCGTTGGTATC-3’；
CAB-FIP：5’-GGGTCATGGTCGGGTATTCGGCACGAGACGACATTCTT-3’；
CAB-BIP：5’-TTGAGTGTTGCTCCCGACGTCACTTGTGCGTTACGAC-3’；
CAB-LoopF：5’-TTATCGACCGCAGTGACTG-3’；
CAB-LoopB：5’-GGACAGGTAGTCACCGTTG-3’。
（3）反应液：6mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
（4）阳性对照为含有手足口病毒CoxA16CAA基因片段的T载体克隆，其制备方法为：以分离鉴定的手足口病毒CoxA16的cDNA基因组为模板，利用的外引物（SEQIDNO:1和SEQIDNO:2）进行扩增，所得基因扩增片段序列如SEQIDNO:13所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
（5）内标为含有部分CBB基因片段的T载体克隆，以分离鉴定的手足口病毒CoxA16的cDNA基因组为模板，利用外引物（SEQIDNO:7和SEQIDNO:8）进行扩增，所得基因扩增片段序列如SEQIDNO:14所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为内标。
（6）阴性对照为超纯水。
实施例2手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测方法
利用实施例1的手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测试剂盒对样品进行检测，步骤如下：
（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA。
（2）利用权利要求1的引物组合物对待检样品RNA进行反转录恒温扩增：
恒温扩增的25μl反应体系含有：CAA-F30.2μM，CAA-B30.2μM，CAA-FIP1.6μM，CAA-BIP1.6μM，CAA-LF0.8μM，CAA-LB0.8μM，CAB-F30.2μM，CAB-B30.2μM，CAB-FIP1.6μM，CAB-BIP1.6μM，CAB-LoopF0.8μM，CAB-LoopB0.8μM，反应液12.5μl，BstDNA聚合酶8U，AMV反转录病毒0.8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl；
恒温扩增的程序为：63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min。
（3）结果判断：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据检测结果和内标基因CAB检测结果进行判断：
CAA基因检测结果为阳性内标基因CAB检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
CAA基因检测结果为阴性内标基因CAB检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
CAA基因检测结果为阳性内标基因CAB检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
CAA基因检测结果为阴性内标基因CAB检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取RNA进行检测。
实施例3灵敏度实验
将手足口CoxA16病毒RNA进行10倍梯度稀释，作为模板进行灵敏度实验，用实施例2的方法进行检测，通过灵敏度实验确定内标基因的最低检出限102copies/ml（如图1所示），并对最低检出限予以复核（图2），将内标浓度定为最低检出限的浓度。
实施例4特异性实验
用实施例2的方法分别对CoxA1、CoxA2、CoxA4、CoxA5、CoxA6，CoxA7、CoxA9、CoxA10、CoxA11、CoxA12、CoxA13、CoxB1、CoxB2、CoxB3、CoxB5、Echo3、Echo6、Echo11、Echo19、EV71等病毒RNA均无非特异性扩增。
实施例5实际样品检测
取不含抑制因子的样品及不含抑制因子的样品同时进行实验，并增加灵敏度实验予以辅助判断结果，检测方法及结果如下：
（1）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：CAA-F30.2μM，CAA-B30.2μM，CAA-FIP1.6μM，CAA-BIP1.6μM，CAA-LF0.8μM，CAA-LB0.8μM，反应液12.5μl，，BstDNA聚合酶8U，AMV反转录酶0.8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
（2）恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：CAB-F30.2μM，CAB-B30.2μM，CAB-FIP1.6μM，CAB-BIP1.6μM，CAB-LoopF0.8μM，CAB-LoopB0.8μM，反应液12.5μl，BstDNA聚合酶8U，AMV反转录酶0.8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，内标基因2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：将上述反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪（如ABI7500）中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。根据CAA基因检测结果和内标基因CAB检测结果进行判断。
检测结果见图4（为不含抑制因子的样品检测结果图）及图5（含抑制因子的样品检测结果及灵敏度对照图），内标基因及样品检测结果为阳性，检测结果正常，且试剂盒各浓度梯度均能检出，出峰时间正常，但含抑制因子的内标基因及样品检测结果均为阴性，提示检测结果可能为假阴性检测结果，样品中可能含有抑制因子或其他原因引起检测结果异常，需重新实验并排查原因，做进一步的确认。通过上述实验证明该方法可有效的鉴别检测结果是否为假阴性。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
SEQUENCELISTING
<110>广东省第二人民医院，广州迪澳生物科技有限公司
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
gttgagtacattgtcaggtcaaactgaacgtttggctgcctatggccagcacgagacgac60
attcttgatgccagtcactgcggtcgataaaacttatatcgaatacccgaccatgacccg120
gttgagtgttgctcccgacggaagcgcgcgcggacaggtagtcaccgttgtgggtcgtaa180
cgcacaagtgaaatttaccctgagggaggcttatggtaataataatttggggcagtattg240
gataccaacggctgctag258

Claims (10)

1.用于检测手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测引物组合物，其包含一组检测引物和一组内标引物，其中，所述检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
CAA-F3：5’-AATGCTAGTGACAAGAATCTCA-3’；
CAA-B3：5’-GTTTGGCTACGACAAATGTG-3’；
CAA-FIP：5’-AAACCGGCACGGCTAAAGAAGTGTTGAACCATCACTCCA-3’；
CAA-BIP：5’-AGCATCATTACAATGCCCACCAATATCCCATCAAGTCAATGTCC-3’；
CAA-LF：5’-ATTCCCAATGGCTGTCTCC-3’；
CAA-LB：5’-GGTACACAGAACACAGATGGT-3’；
所述内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
CAB-F3：5’-GTTGAGTACATTGTCAGGTCA-3’；
CAB-B3：5’-CTAGCAGCCGTTGGTATC-3’；
CAB-FIP：5’-GGGTCATGGTCGGGTATTCGGCACGAGACGACATTCTT-3’；
CAB-BIP：5’-TTGAGTGTTGCTCCCGACGTCACTTGTGCGTTACGAC-3’；
CAB-LoopF：5’-TTATCGACCGCAGTGACTG-3’；
CAB-LoopB：5’-GGACAGGTAGTCACCGTTG-3’。
2.一种手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组和内标引物组。
3.根据权利要求2所述的手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物组及内标引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。
4.根据权利要求2所述的手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：（1）DNA聚合酶；（2）反应液；（3）反转录酶；（4）内标靶标片段；（5）阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述反转录酶为AMV反转录酶。
6.根据权利要求4所述的手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，所述恒温荧光反应液含有：6mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mMMgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
7.根据权利要求4所述的手足口病毒CoxA16的反转录恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，阳性对照为含有手足口病毒CoxA16CAA基因片段的T载体克隆，阴性对照为超纯水，内标靶标片段为含有手足口病毒CoxA16CAB基因片段的T载体克隆。
8.一种手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测方法，包括如下步骤：
（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；
（2）利用权利要求1的恒温荧光引物组合物对待检样品RNA进行反转录恒温扩增；
（3）结果判断：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据CAA基因检测结果和内标基因CAB检测结果进行判断：
CAA基因检测结果为阳性内标基因CAB检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
CAA基因检测结果为阴性内标基因CAB检测结果全为阳性时，检测结果为阴性；
CAA基因检测结果为阳性内标基因CAB检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
CAA基因检测结果为阴性内标基因CAB检测结果全为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取RNA进行检测。
9.根据权利要求8所述的手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测方法，其特征在于，恒温扩增的25μl反应体系含有：CAA-F30.2μM，CAA-B30.2μM，CAA-FIP1.6μM，CAA-BIP1.6μM，CAA-LF0.8μM，CAA-LB0.8μM，CAB-F30.2μM，CAB-B30.2μM，CAB-FIP1.6μM，CAB-BIP1.6μM，CAB-LoopF0.8μM，CAB-LoopB0.8μM，反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，AMV反转录酶0.8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl。
10.根据权利要求8所述的手足口病毒CoxA16的恒温荧光检测方法，其特征在于，恒温扩增的程序为：63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min。
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