CN109913564A - 一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针，还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针。本发明还涉及含有上述引物探针组合物的试剂盒及利用该试剂盒检测肺炎衣原体的方法。本发明根据肺炎衣原体(Cpn)的基因保守区域设计引物和探针，通过实时荧光定量PCR技术检测Cpn基因。本发明进行实时荧光定量PCR检测，大大提高了检测的灵敏度和特异性，同时减少检测时间，给Cpn感染性疾病的研究以及临床精准诊断Cpn感染性疾病带来很大的帮助。
Description
技术领域
本发明涉及于衣原体检测技术领域，尤其涉及一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物、试剂盒及方法。
背景技术
肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae，Cpn)是衣原体的其中一种，衣原体为革兰阴性病原体，是一类能通过细菌滤器、在细胞内寄生、有独特发育周期的原核细胞性微生物。衣原体是一种比细菌小但比病毒大的生物，是专性细胞内寄生的、近似细菌与病毒的病原体，具有两相生活环。它没有合成高能化合物ATP、GTP的能力，必须由宿主细胞提供，因而成为能量寄生物，多呈球状、堆状，有细胞壁，有细胞膜，属原核细胞，一般寄生在动物细胞内。
一般认为Cpn感染与鸟类及其他动物无关，人类是Cpn唯一储存宿主。人类Cpn感染呈世界性流行，不分地域、不受种族和年龄限制。人类Cpn感染一年四季均可能发生，不呈季节性特征，其流行可呈散发性或爆发性传播，尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所。
Cpn主要引起成人及青少年的非典型肺炎，亦可引起支气管炎、咽炎及扁桃体炎等急性呼吸道感染。据统计在引起肺炎的病因中是继肺炎链球菌、流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎的第三位主要病原体。老年人以肺炎多见，20岁以下的青少年，则多为支气管炎及上呼吸道感染。亦可引起支气管炎、支气管哮喘，原有支气管哮喘的患者感染Cpn后，可加重病情。少数可引起伤寒、虹膜炎、肝炎、心内膜炎、脑膜炎及结节性红斑等。
实验室检查：(1)血象血白细胞计数：多正常，重症患者可升高，血沉多增快；(2)病原学检查：是确诊本病的可靠方法；(3)微量免疫荧光试验(MIF)：是目前国际上标准的且是最常用的Cpn血清学诊断方法，除性病门诊患者和娼妓特定人群外，Cpn肺炎的MIF血清学诊断可使用Cpn单一抗原，即不需要同时检测沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体抗体；血清学诊断标准为：MIF试验IgG≥1：512和(或)IgM≥1：32，在排除类风湿因子(RF)所致的假阳性后可诊断为近期感染，双份血清抗体滴度4倍或以上升高也诊断为近期感染，1：16≤IgG<1：512为既往感染；(4)PCR法：检测CpnDNA，敏感性更高，且可和其他种衣原体区分。
由于上述的实验室检查方法灵敏度低、特异性差，耗时长的缺点，检查结果经常出现假阳性或假阴性，而导致疾病的误诊、漏诊。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的不足，本发明通过生物信息学方法，根据Cpn DNA片段高度保守区域设计出引物和探针组合，探索最佳反应条件，建立包含适宜组分的反应体系，在此基础上开发出一种高特异性和高灵敏度的实时荧光定量PCR方法，本发明利用上述引物探针组合物可同时针对Cpn基因组上特异目的DNA片段和内标DNA片段进行双重荧光PCR扩增。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：
本发明的第一个目的是提供一种用于检测Cpn的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针。
为了进一步优化上述技术方案，本发明采取的技术措施还包括：
进一步地，所述用于扩增目的DNA片段的引物和探针的设计过程如下：在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载Chlamydophila pneumoniae的参照序列(GenBank:NC_000922.1，序列全长1230230bp)，并使用免费开源的kers工具Jellyfish(http://www.cbcb.umd.edu/software/jellyfish/jellyfish-1.1.10.tar.gz)对全基因组序列进行连续切割，逐个碱基划动得到的序列长度为200的核苷酸序列库，从中优选重复较多(>＝2)的序列，比对到NCBI的NT数据库，最终得到高度保守序列Spec_i348214。以此目的序列为模板，设计特异性的引物和探针。
进一步地，所述引物探针组合物还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针。
进一步地，所述内标DNA片段的序列如SEQ ID No.7所示。
进一步地，所述探针的5'端标记荧光基团，所述探针的3'端标记淬灭基团；其中，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA。上述荧光基团和淬灭基团可为本领域常规使用的任一合适的基团。更进一步地，所述用于扩增目的DNA片段的探针与用于扩增内标DNA片段的探针标记的荧光基团不相同，更优选为用于扩增目的DNA片段的探针采用HEX荧光基团，用于扩增内标DNA片段的探针采用FAM荧光基团，所述淬灭基团均采用TAMRA。
上述引物及探针序列具体如下：
目的DNA片段的上游引物：5'-AAGTTCTAGGTGGGTCCTTGCTT-3'(SEQ ID NO：1)；
目的DNA片段的下游引物：5'-TGCGGTCAATACAGGAACTGCT-3'(SEQ ID NO：2)；
目的DNA片段的探针：5'-HEX-ACACCAGCACCGATGGCAGAACCTGCA-TAMRA-3'(SEQ IDNO：3)；
内标DNA片段的上游引物：5'-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3'(SEQ ID NO：4)；
内标DNA片段的下游引物：5'-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3'(SEQ ID NO：5)；
内标DNA片段的探针：5'-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3'(SEQ ID NO：6)
内标DNA片段的序列如下：TCACAAGCAGGAGTGTGCCAGGAGAAGGCCAAACCATCCAGTGCCGGTGGTTTGACCACGAGGAGTGCATCCTGCACGGAGTCACTGAGCTCGTGACCTCCACGCTGCTCGTCCCCTGCGCTATCGAGAGGGCACTCTCTGTGTCTCAGCTGGTGCCGCTGGCGCAGAGTGTTTTGGGCCCCTTAAAGCTCAGCATGGCTGGTTCTGGAGAGATGGAAAAGAGAAAGGATTTCCCCCATTTGGGTGCCTCGGGCATGTGGAGGAAGGTGGTCCGGCGAACGAAGCAGGGCTGCGTGAAGGGGATCTGATAACCCACGTCAACGGAGAGCCAGTCCATGG(SEQ ID NO：7)。
本发明的第二个目的是提供一种含有任一上述的引物探针组合物的用于检测Cpn的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括热启动酶和UNG酶。更进一步地，该试剂盒包括反应液A和反应液B，其中，反应液A中组分主要有以上两组用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的引物和两条探针，反应液B中组分主要有热启动酶和UNG酶；进一步地，反应液A中的组分包含：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 9.0，25℃)，0.1％Triton X-100，5mM MgCl2，0.32mM dNTP，0.4nM用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的引物，0.125nM用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的探针。反应液B含有2U/μl的Taq酶、0.4μg/μl的Taq酶抗体，0.2U/μl的Uracil-DNA Glycosylase(UNG酶，尿嘧啶-DNA糖基化酶)。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为Cpn标准菌株的菌悬液。
本发明的第三个目的是提供一种采用任一上述的试剂盒用于检测Cpn的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1)样本的采集及提取，其中，所述样本在提取过程中加入内标，所述内标DNA片段的序列如SEQ ID No.7所示；
步骤2)将提取的样本置于PCR反应体系中进行PCR扩增反应，所述PCR反应体系包括反应液A和反应液B；其中，所述反应液A包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针以及如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针；所述反应液B包括热启动酶和UNG酶；
步骤3)根据扩增产物的Ct值，进行结果判定，其中：
样本Ct<35且有明显S型扩增曲线，其结果为阳性；
样本Ct≥35且无明显S型扩增曲线，内标Ct<35且有明显S型扩增曲线，其结果为阴性；
样本Ct≥35且无明显S型扩增曲线，内标Ct≥35且无明显S型扩增曲线，其结果为无效。
进一步地，所述样本为鼻咽拭子。
进一步地，所述样本的提取步骤包括：鼻咽拭子中加适量的生理盐水，混匀；用枪头或吸管取适量样本至离心管中，10000～15000rpm离心3～10分钟；取内标DNA加入到样本处理液中，加入比例为1：30～70；去上清，沉淀中加入适量的样本处理液，充分混匀，85～120℃恒温处理5～15分钟；10000～15000rpm离心3～10分钟，获得样本提取液。
进一步地，所述PCR扩增反应程序为：50℃120s，95℃600s，1个循环；95℃15s，55℃45s，40个循环；37℃20s，1个循环。
进一步地，所述PCR反应体系的总体积为20μL，其中反应液A 16μl；反应液B 1μl；样本提取液3μL。
进一步地，所述方法还包括阴性对照和阳性对照，其具体为在阴性对照中，反应体系包括反应液A、反应液B和阴性质控品；在阳性性对照中，反应体系包括反应液A、反应液B和阳性质控品，其扩增程序均与样本的扩增程序相同。
本发明的第四个目的是提供一种任一上述的探针引物组合物在制备诊断Cpn感染性疾病的试剂中的应用。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明根据Cpn的基因保守区域设计引物和探针，提供一种Cpn实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)基因检测试剂盒，通过实时荧光定量PCR技术检测Cpn基因。本发明进行实时荧光定量PCR检测，大大提高了检测的灵敏度和特异性，同时减少检测时间，给Cpn感染性疾病的研究以及临床精准诊断Cpn感染性疾病带来很大的帮助。
附图说明
图1为本发明一实施例中实时荧光定量PCR扩增条件温度曲线图；
图2为本发明一实施例中阴性对照实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图3为本发明一实施例中阳性对照实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图4为本发明一实施例中内标DNA片段的实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图5为本发明一实施例中样本的实时荧光定量PCR扩增曲线图。
具体实施方式
本发明涉及一种用于检测Cpn的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针，还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针。本发明还涉及含有上述引物探针组合物的试剂盒及利用该试剂盒检测Cpn的方法。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为一较佳方式的检测Cpn的方法，其包括如下步骤：
(1)样品采集：
用鼻咽拭子取样，及时送检。共收集样本183例。所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。
(2)样本提取：
1)咽拭子中加1ml的生理盐水，涡旋震荡混匀；；
2)用枪头或吸管取1ml至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟；
3)取内标加入到样本处理液中，加入比例为1：50；
4)去上清，沉淀中加入50μl样本处理液，充分混匀，100℃恒温处理10分钟；
5)12,000g离心5分钟，备用。
(3)反应体系：
实时荧光定量PCR反应体系包括反应液A、反应液B、样本(或者阴性质控品、阳性质控品)。反应体系如下：
1)样本孔
| 组分名称 | 组成成分 | 加量 |
| 反应液A | 引物、探针 | 16μl |
| 反应液B | 热启动酶、UNG酶 | 1μl |
| 样本(DNA提取液) | DNA | 3μL |
| 总体积 | 20μL |
2)阴性对照孔
| 组分名称 | 组成成分 | 加量 |
| 反应液A | 引物、探针 | 16μl |
| 反应液B | 热启动酶、UNG酶 | 1μl |
| 阴性质控品 | 生理盐水 | 3μL |
| 总体积 | 20μL |
3)阳性对照孔
| 组分名称 | 组成成分 | 加量 |
| PCR反应液A | 引物、探针 | 16μl |
| PCR反应液B | 热启动酶、UNG酶 | 1μl |
| 阳性质控品 | 标准毒株的DNA | 3μL |
| 总体积 | 20μL |
(4)实时荧光定量PCR反应：
对应上述反应体系，将试剂盒中各成分分别加入PCR反应管中，进行实时荧光定量PCR扩增反应，PCR扩增条件温度曲线如图1所示，具体反应步骤如下：
50℃120s，1个循环；
95℃600s，1个循环；
95℃、15s，55℃、45s(收集荧光)，40个循环；
37℃、20s，1个循环。
(5)结果判定(根据Ct值)
上述实验结果如图2～图5所示，图2为本实施例中阴性对照PCR扩增曲线图，样本FAM通道无明显S型扩增曲线(实线曲线)，内参HEX通道有明显S型扩增曲线(虚线曲线)，结果判为阴性。图3为本实施例中阳性对照PCR扩增曲线图，样本FAM通道Ct值为28.1有明显S型扩增曲线(实线曲线)，内参HEX通道Ct值为30.5，有明显S型扩增曲线(虚线曲线)，结果判为阳性。图4和图5为本实施例中样本的PCR扩增曲线图，其中图4为实施例中内标DNA片段的实时荧光定量PCR扩增曲线图，图5为本实施例中样本的实时荧光定量PCR扩增曲线图，根据以上规则判定阴性和阳性。
由上述实施例可知，本发明利用重复性好、特异性好、灵敏度高、检测效率高的引物和探针组合，所涉及的试剂盒及检测方法可准确和快速的检测Cpn基因。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 深圳市儿童医院
<120> 一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物、试剂盒及方法
<130> IPI190704
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 目的DNA片段的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 1
aagttctagg tgggtccttg ctt 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 目的DNA片段的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcggtcaat acaggaactg ct 22
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 目的DNA片段的探针(Artificial Sequence)
<400> 3
acaccagcac cgatggcaga acctgca 27
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 内标DNA片段的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcatgtgga ggaaggtggt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 内标DNA片段的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 5
ccatggactg gctctccgtt 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 内标DNA片段的探针(Artificial Sequence)
<400> 6
acgcagccct gcttcgttcg ccg 23
<210> 7
<211> 339
<212> DNA
<213> 内标DNA片段(Artificial Sequence)
<400> 7
tcacaagcag gagtgtgcca ggagaaggcc aaaccatcca gtgccggtgg tttgaccacg 60
aggagtgcat cctgcacgga gtcactgagc tcgtgacctc cacgctgctc gtcccctgcg 120
ctatcgagag ggcactctct gtgtctcagc tggtgccgct ggcgcagagt gttttgggcc 180
ccttaaagct cagcatggct ggttctggag agatggaaaa gagaaaggat ttcccccatt 240
tgggtgcctc gggcatgtgg aggaaggtgg tccggcgaac gaagcagggc tgcgtgaagg 300
ggatctgata acccacgtca acggagagcc agtccatgg 339
Claims (10)
1.一种用于检测肺炎衣原体的引物探针组合物，其特征在于，包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述内标DNA片段的序列如SEQID No.7所示。
4.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5'端标记荧光基团，所述探针的3'端标记淬灭基团；其中，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA。
5.一种含有权利要求1或2所述的引物探针组合物的用于检测肺炎衣原体的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括热启动酶和UNG酶。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为Cpn标准菌株的菌悬液。
8.一种检测肺炎衣原体的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求5所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
步骤1)样本的采集及提取，其中，所述样本在提取过程中加入内标，所述内标DNA片段的序列如SEQ ID No.7所示；
步骤2)将提取的样本置于PCR反应体系中进行PCR扩增反应，所述PCR反应体系包括反应液A和反应液B；其中，所述反应液A包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针以及如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针；所述反应液B包括热启动酶和UNG酶；
步骤3)根据扩增产物的Ct值，进行结果判定，其中：
样本Ct<35且有明显S型扩增曲线，其结果为阳性；
样本Ct≥35且无明显S型扩增曲线，内标Ct<35且有明显S型扩增曲线，其结果为阴性；
样本Ct≥35且无明显S型扩增曲线，内标Ct≥35且无明显S型扩增曲线，其结果为无效。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：50℃120s，95℃600s，1个循环；95℃15s，55℃45s，40个循环；37℃20s，1个循环。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系的总体积为20μL，其中反应液A 16μl；反应液B1μl；样本提取液3μL。
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