CN1552733A - 心肌肽素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种心肌肽素的制备方法，其特征在于将不包括人的健康哺乳动物的心室肌洗净、切碎，加灭菌蒸馏水匀浆，匀浆液反复冷冻、解冻3－4次，加热至65－95℃过滤除渣，用板框过滤器过滤得到粗滤液，再用中空纤维柱超滤，得到精滤液，用超滤膜超滤，经反渗透浓缩，得分子量小于10000Da的心肌肽素溶液，过滤除菌、冷冻干燥得到成品。本发明的制备方法简单、产品分子量适中、纯度高、稳定性好，储存480－540天时除外观色泽变为微黄色外，其它项目无改变。
Description
技术领域
本发明涉及一种心肌肽素的制备方法。具体地说，本发明涉及从除人类以外的健康哺乳动物的心脏中提取心肌肽素的制备方法，属于生化技术领域。
背景技术
“心肌保护”近年来一直是心脏内、外科研究的热点。最近资料表明，缺血缺氧的心肌细胞内发生许多变化，包括细胞内钙超载，自由基产生，膜损害，ATP(adenosine triphosphate，ATP)水平下降，氧耗竭等。
心脏外科手术的日臻完善及普及，为众多患者解除了痛苦，提高了人们的生活质量。随着人们对心肌保护要求的不断提高，基础与临床研究也越来越深入。临床心脏外科的心肌保护包括：术前、术中及术后心肌保护，但心肌保护的重点仍集中在体外循环过程中预防心肌的缺血再灌注损伤方面。对此，基础与临床的科学工作者进行了深入的多方位的研究，主要包括：(1)心脏灌注：主要集中在灌注的方式，例如：顺灌、逆灌、同时灌、间断或是持续灌，是否加用血细胞滤过器等。(2)灌注液的温度：主要有常温、低温等。(3)灌注液的组份：如加用氧自由基清除剂(超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽，抑肽酶、葛根素等)。以上这些措施都在一定程度上改善了心肌缺血—再灌注损伤的病理改变。国外亦有将磷酸激酶(护心通，意大利欧辉药厂)置于灌注液中或服用曲美他嗪(万爽力，法国施维雅药厂)而使心肌在病理条件下改善代谢，从细胞、亚细胞结构、氧自由基、能量代谢、钙离子(Ca2+)超负荷等方面阐述了某些研究发现。但是这些研究或把重点孤立地放在补充能量方面，或是把预防损伤与机体自身的防御机制脱离开来，从而导致了心肌保护的临床效果不尽人意，因此，研究开发更有效的药物保护心肌是十分必要的。
为了干预心肌缺血及保护心肌，近20年来研究了许多药物，如β-受体阻滞剂，钙拮抗剂，转换酶抑制剂，各种氧自由基清除剂等，但其对心肌的保护效果临床尚不肯定。现有治疗心肌缺血的药物，还没有一种能绝对减少心肌梗死，对抗心肌缺血。八十年代后期，人们观察到果蝇幼虫经短期高热处理，其唾液腺细胞多丝染体“膨松”方式发生改变，显示这一区域基因转录被激活，并称此为热休克效应(heatshock reaction，HSR，Anna Rev Biochem 1986，55：1151)。以后相继发现经热休克预处理的实验动物，能明显对抗缺血/再灌注所致的心肌损伤。1986年Marry将此现象称为“缺血预适应”(ischemia precondition，IP)，进一步的研究发现这种现象与热休克诱导心肌细胞合成一组新的蛋白质—热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)或称应激蛋白(stress protein，SP)有关。这些相继的研究报告，表明心肌自身具有强大的内源性保护机制；以后又发现从原核生物到真核生物，从植物、动物到人，无论培养细胞还是整个机体，热休克处理时都有HSPs合成表达，并表现出如下特点：(1)除热休克可诱导HSP合成外，尚有许多因素，如缺血、缺氧、乙醇、重金属盐、心肌压力负荷、药物及大多数疾病状态都可诱导HSP合成，并可出现“交叉耐受现象”；(2)HSP结构上有高度保守性，如果蝇和酵母菌HSP70有72％氨基酸顺序相同，人类HSP70基因与果蝇HSP70基因有73％同源，HSP90有78％同源。这些结构上的相似，保证了功能上的相同性(Burdon：Biochem，J.1986，240：313)；(3)HSP对心肌的保护作用具有最佳时间范围，又称“机会窗”(window ofopportunity)，超出一定期限就失去其保护作用(Perdriget：Curr Surg 1989，23)；(4)HSP存在于整个生物界，存在于高等动物机体的各种细胞。HSPs的诱导不仅增强心肌功能恢复，且也增强心肌内皮功能的恢复，延长心脏停跳时间。上述发现应用于心脏移植的供体保护、缺血心肌的救治、体外循环心脏停跳液的制备等，可突破传统药物束缚，从加强诱导体内细胞本身抗损伤潜能出发，提供一种具有里程碑意义的新途径。
Pennica等人(1995)相继在心肌细胞中克隆出cardiotrophin-1(CT-1)基因，并在E scherichia coli中表达。研究表明，CT-1是一种具有免疫调节及诱导生长作用的细胞因子，其天然存在于心肌细胞中，能够使心肌细胞对抗缺氧、高温的损害，并且具有抑制心肌细胞凋亡的作用。深入的研究发现，CT-1在培养的心肌细胞及活体内可诱导HSP表达，这种诱导作用是与一种称为gp130的细胞表面多肽有关，其激活gp130后，通过NF-IL-6/NF-IL--6β及酪氨酸激酶途径而使HSP70、HSP90及HSP小分子物质的表达得到加强，从而增强心肌细胞耐受缺氧及高温的能力。研究还表明，CT-1可以促进心肌细胞结构蛋白的合成，增长细胞的长轴使收缩更加有力。基因重组的Myotrophin的研究是心肌细胞刺激因子的另一课题。Parames(1997)证明，Myotrophin促进心肌细胞生长与蛋白激酶-c有关。Myotrophin及Cardiotrophin可能是心肌细胞中功能相似，但激活细胞生长途径不同的细胞因子，都显示了保护心肌细胞，促进生长的功能。
现有的各类心血管病治疗药物，除转换酶抑制剂具有阻滞生长因子产生，抑制蛋白质合成，减轻心肌肥厚(Hypertrophy)的作用外，其它药物均无直接调节心肌生长、分化、修复的作用。近年来，国外已开始重视使用药物方法诱导心肌自身的保护能力，如转导基因促进心肌细胞再生等的研究，Cardiotrophin及Myotrophin的研究。另一方面，通过细胞外信号触发各种传递机制，调控心肌、血管细胞的增殖或重构。但是所有这些研究都处于动物试验或临床前研究阶段。
上述研究清楚地证明：在体外循环心肌保护方法尚未完善的情况下，设计一种对机体无损害，又能于术前、术中及术后保护心肌的药物，对探索心肌缺血及再灌注损伤的防治，提供新的思路和途径，将有重要意义。
ZL94102798公开了一种心肌细胞生长刺激肽及其制备方法，选取健康幼年哺乳动物的心脏，采用机械方式捣碎、-20℃深冻-溶解后加热60-100℃，再-20℃深冻-溶解后离心3000rpm，经负压截留柱-除菌-分装-冻干-包装，得到分子量小于20000道尔顿的多肽类活性物质。
ZL94102799公开了一种具有刺激原代培养的心肌细胞的DNA合成和蛋白质合成的心肌细胞生长刺激肽(GMGSP)，是从健康幼年哺乳动物的心脏中制备提取，在pH2-9范围内稳定；在加热95-100℃10分钟，60-70℃30分钟下生物活性不改变；在多种蛋白水解酶，37℃2小时条件下生物活性丧失；在水溶液22℃-30℃条件下可形成聚合体但生物活性改变不明显；在加入3％-8％甘露醇冻干密封条件下，室温贮存1.5年，4℃贮存2年，-20℃贮存3年，生物活性不改变；HPLC分析表明：所述GMGSP由四个组分组成，各组分相对峰及保留时间分别为：10.4％(2.88分)，6.4％(3.93分)，36.3％(5.09分)，7.3％(7.41分)，每个组分均具有生物活性；经SDS-PAGE分析显示的两条带分子量分别为8500Da，10800Da，HPLC分析数均分子量9800Da，重均分子量10500Da，2个组分均有生物活性。
但上述专利技术对该生物活性肽只是粗略进行了分离、提纯以及简单的活性测试，对其具体成分、用途及效果没有详细说明。
发明内容
本发明目的在于提供一种改良的心肌肽素的制备工艺，所述制备工艺简单、产品分子量适中、纯度高、稳定性好，储存480-540天时除外观色泽变为微黄色外，其它项目无改变。
本发明提供了一种心肌肽素的制备方法，其特征在于将不包括人的健康哺乳动物的心室肌洗净、切碎，加灭菌蒸馏水匀浆，匀浆液反复冷冻、解冻3～4次，加热至65～95℃过滤除渣，用板框滤器过滤得到粗滤液，再用中空纤维柱超滤，得到精滤液，用超滤膜超滤，截留重均分子量小于10000Da的心肌肽素溶液，最后经过滤除菌，冷冻干燥得成品。
本发明所述健康哺乳动物为不包括人的健康哺乳动物包括猪、牛、羊、兔、马等，优选幼年哺乳动物，包括乳猪、乳牛、乳羊、乳兔、乳马等，最优选乳猪。
其中所述灭菌蒸馏水的加入量为哺乳动物的心室肌的0.5～4倍；所述匀浆的转速为1000～5000rpm/min；
所述冷冻为在低于-5℃的温度下冷冻24～72小时，优选的为在-20℃～-30℃下冷冻36～48小时；所述加热方式为采用隔水加热或直接加热，温度为70～90℃，时间为不超过2小时，优选的为采用隔水加热，温度为75℃～80℃，时间为不超过1小时。
本发明用板框滤器过滤得到粗滤液，用中空纤维柱超滤后得到分子量小于12kDa的精滤液；再用超滤膜超滤截流得到分子量小于10kDa的精滤液；其中所述板框滤器属于生物制药常规设备，选用小于10μ中速滤纸，优选小于或等于5μ中速滤纸，比如广州医药器械研究所生产的型号为XAS03-172/8的板框滤器；中空纤维柱可选用规格为F60的，能过滤分子量小于12kDa的液体，比如瑞士金宝公司的中空纤维柱；超滤膜规格为5-10kDa，比如Millipore公司的产品，以Millipore公司的反渗透浓缩柱浓缩，。
本发明可对截留的心肌肽素溶液经过质量检查，冷冻干燥前一般先灌装，所述的过滤除菌和灌装为本领域技术人员所公知的。
本发明所述的冷冻干燥采用常用的冷冻干燥设备：冷冻干燥机；具体过程为：5～40分钟使干燥室内搁板温度达到-15～-20℃，优选20～30分钟内达到-18～-20℃，再经20～40分钟，使制品温度达到-25～-35℃，优选25～35分钟内达到-30～-35℃。保持1～3小时将冷凝器内温度降到-40～-50℃，再抽真空，真空度达到90～100KPa时，连通干燥室与冷凝器，停止干燥箱的制冷，当干燥箱的真空度为10～15Pa时开始升温，升温速度为2～5℃/min，升温至5～15℃，保温3～6小时，优选以3～4℃/min速度升温到8～12℃，持续4～5小时。继续以8～16℃/min速度升温至15～25℃，持续3～8小时，优选以10～12℃/min速度升温到18～22℃，持续4～6小时。继续以7～15℃/min速度升温至30～35℃，持续1～4小时，优选以9～12℃/min速度升温到33～35℃，持续1.5～2小时。继续以4～8℃/min速度升温至50～60℃，持续1～3小时，优选以5～7℃/min速度升温到54～58℃，持续1.5～2小时。进入降温阶段，10～30min内使温度降至40-50℃，持续8-15小时，优选15～20min内使温度降至45～48℃，持续9～12小时，得到外观合格的心肌肽素冻干品，取出制品封口。
本发明心肌肽素是从不包括人的健康哺乳动物的心脏中提取的多肽，其多肽含量为75％～90％，游离氨基酸为6％～15％，核糖核酸含量小于2％，脱氧核糖核酸含量小于7.5％，重均分子量小于10000道尔顿。
所述心肌肽素优选的重均分子量为2000～8000道尔顿，最优选的重均分子量为2000～5000道尔顿。
所述心肌肽素在pH3-8范围内生物活性稳定，对蛋白酶K敏感，85℃10min生物活性不改变，在冷冻或冻干条件下稳定。
所述心肌肽素等电聚焦电泳显示2-6条染色带，优选等电聚焦电泳显示2条带，
其中pI为10.92带着色较深者。
所述心肌肽素在紫外吸收光谱190-210nm处有一稳定的最大吸收峰，优选在紫外吸收光谱200±2nm处有一最大吸收峰者。
采用磺基水杨酸法鉴定显示所述心肌肽素中不含有蛋白质。
本发明的心肌肽素活力至少为2.2。
本发明所述心肌肽素经FPLC分析，心肌肽素主要有5个组份峰，相对百分面积相加为90％～95％，经活性检查，5个组份峰均能促进原代培养心肌细胞及缺氧再给氧心肌细胞琥珀酸脱氢酶活力，其中P1峰活性较强。
本发明所述心肌肽素中还可包括赋形剂，其重量比组成为：
心肌肽素15～20
赋形剂100～375，
优选为18～20∶200～375。
赋形剂可为甘露醇、海藻糖、乳糖、蔗糖或其它冻干用辅料，优选为甘露醇。
为了除热源目的，本发明所述心肌肽素中还可包括活性炭，其含量在0.1％左右。
采用上述制备方法，经板框滤器过滤、中空纤维柱超滤和超滤膜超滤的过滤方式，反渗透浓缩后可得到本发明所需的小于10000道尔顿心肌肽素，与背景技术中ZL 94102798相比，工作时间短，产品的处理量多，得到产品的浓度高，活性大，不易产生热原。
由于在制备过程中采用了中空纤维柱超滤及超滤膜超滤的精滤方式，得以除去大分子蛋白，因此不易产生过敏反应，心肌肽素可直接作用于心肌细胞，促进心肌在多种损伤因素下损伤的修复，如缺血、药物中毒等；促进蛋白质合成、降低氧自由基损伤、降低钙超载、诱导内源性保护、提高心肌代谢功能的药物，为减轻心脏手术中心肌的损伤，促进损伤的修复提供一条新的途径。
采用本发明的制备方法所得心肌肽素与专利ZL94102798和ZL94102799公开的心肌细胞生长刺激肽(GMGSP)比较，具有明显高的体外生物活性，本发明所述心肌肽素活性单位是心肌细胞生长刺激肽的3-5倍，体内药效对比数据显示，其对心肌缺血—再灌流损伤所致心肌磷酸肌酸激酶释放及乳酸脱氢酶活性与游离脂肪酸和丙二醛含量具有明显有利影响。
心肌肽素的主要药效学研究结果如下：
1.心肌肽素能明显减轻心肌缺血—再灌流所致的心肌超微结构损伤，使其接近或恢复正常(图6-12黑白照片，表13)。
2.心外膜心电图显示心肌肽素能明显对抗猫心肌缺血所致的ST段升高，减少心肌缺血范围(表14-15)。
3.心肌肽素能明显减低心肌缺血—再灌流损伤所致心肌磷酸肌酸激酶释放及乳酸脱氢酶活性与游离脂肪酸和丙二醛含量的增高(表16-21)。
4.心肌肽素能降低心肌耗氧量(表22)。
5.心肌肽素5、10mg/kg可明显降低心肌梗塞猪心外膜心电图的ST、减少NST，并缩小心肌梗塞范围，对急性心肌缺血猪出现的心律失常、室颤所致死亡有一定的治疗作用，而对血压、心率无明显影响(表23、图13)。
附图说明
图1心肌肽素HPLC分子量图谱
图2心肌肽素FPLC分离纯化图谱
图3心肌肽素等电点测定图谱
图4心肌肽素紫外扫描图谱
图5心肌肽素HPLC鉴别图谱
图6心肌肽素对缺血—再灌注所致的心肌超微结构损伤影响实验之正常对照组
图7心肌肽素对缺血—再灌注所致的心肌超微结构损伤影响实验之生理盐水对照组
图8心肌肽素对缺血—再灌注所致的心肌超微结构损伤影响实验之损伤对照组
图9心肌肽素对缺血—再灌注所致的心肌超微结构损伤影响实验之心肌肽素10mg/kg组，能明显减轻心肌缺血—再灌流所致的心肌超微结构损伤
图10心肌肽素对缺血—再灌注所致的心肌超微结构损伤影响实验之心肌肽素5mg/kg组，能减轻心肌缺血—再灌流所致的心肌超微结构损伤
图11心肌肽素对缺血—再灌注所致的心肌超微结构损伤影响实验之心肌肽素1mg/kg组
图12心肌肽素对缺血—再灌注所致的心肌超微结构损伤影响实验之普洛萘尔2mg/kg组
图13心肌肽素5、10mg/kg可明显降低心肌梗塞猪心外膜心电图的ST、减少NST
图14心肌肽素产品工艺流程图
具体实施方式
下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实施例1
本实验例涉及心肌肽素溶液的理化性质、纯度、含量和活性实验
一.心肌肽素的理化性质、纯度、含量
采用本发明所述的制备方法得到的心肌肽素为小分子活性多肽，在pH3-8范围内生物活性稳定，对蛋白酶K敏感，85℃10min生物活性不改变，在冷冻或冻干条件下稳定；经HPLC分析，重均分子量小于10000Da(图1)，优选重均分子量2000-8000Da。
表1 不同pH条件作用下、不同时间对心肌肽素活性的影响(MTT法)(x±s，n＝8)
心肌肽素活性OD值(x±s)
分组 30μg/ml 5μg/ml
正常对照组 0.691±0.032**
阿霉素损伤组 0.274±0.011
不同pH处理组
3.0 30min 0.331±0.014** 0.320±0.015**
60min 0.314±0.007** 0.309±0.010**
4.0 30min 0.315±0.008** 0.307±0.015**
60min 0.334±0.015** 0.311±0.007**
5.0 30min 0.364±0.022** 0.379±0.019**
60min 0.364±0.017** 0.353±0.023**
6.0 30min 0.341±0.023** 0.344±0.011**
60min 0.332±0.015** 0.327±0.016**
7.0 30min 0.320±0.018** 0.358±0.023**
60min 0.327±0.010** 0.328±0.012**
8.0 30min 0.339±0.008** 0.332±0.022**
60min 0.308±0.01**5 0.309±0.010**
9.0 30min 0.313±0.006** 0.289±0.020
60min 0.279±0.017 0.274±0.013
注：**与损伤组比较 P＜0.01
从表1可看出在pH3-8范围内心肌肽素生物活性稳定。
经FPLC分析，心肌肽素主要有5个组份峰，相对百分面积相加为90％-95％。活性检查，5个组份峰均能促进原代培养心肌细胞及缺氧再给氧心肌细胞琥珀酸脱氢酶活力(表2)，其中P1峰活性较强(图2)。心肌肽素多肽含量占75-90％，游离氨基酸占6-15％，尚有微量核酸和微量元素。等电聚焦电泳显示有2条染色带，其中pI为10.92带着色较深(图3)。
表2 心肌肽素各组分对心肌细胞酶活力的影响(MTT法)(n＝8，x±s)
- OD值(x±s)
分组 5μg/ml t值
正常对照组 0.344±0.014** 9.93
阿霉素损伤组 0.272±0.015
P1 0.318±0.004** 6.344
P2 0.295±0.012** 3.39
P3 0.309±0.012** 5.45
P4 0.317±0.017** 5.61
P5 0.303±0.014** 4.27
心肌肽素组 0.298±0.005** 3.47
注：**与阿霉素组比较，P＜0.01
从表2中可以看出5个组份峰均能促进阿霉素损伤原代培养心肌细胞琥珀酸脱氢酶活力。
1.多肽的鉴别：取心肌肽素含量为2.5mg/ml的心肌肽素溶液1ml，加水2ml溶解，加双缩脲试剂2ml【双缩脲试剂制备方法：取硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.75g与酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O)3g，加水约250ml溶解，在搅拌下加10％氢氧化钠试液150ml，并加水稀释到500ml，贮存于塑料瓶中。】，混匀，显兰紫色，即为含有多肽；经6批次检查，本发明的心肌肽素均显兰紫色，即含有多肽。
2.含量测定
(1)半微量凯氏定氮法
心肌肽素溶液，批号960419，960422，960423；注射用心肌肽素，960501，960502，960503，临用时用水溶解至所需浓度。
试剂 硫酸：化学纯，比重1.84；消化剂：硫酸铜(CuSO4.5H2O)1份与硫酸钾(K2SO4)10份共同研细混匀即成；12.5mol/L氢氧化钠溶液；2％硼酸吸收液；10％钨酸钠；0.33mmol/L硫酸；混合指示剂：0.2％(W/V)溴甲酚绿酒精溶液5份与0.1％(W/V)甲基红酒精溶液2份混合配成；0.01mol/L盐酸。
计算公式：
测定法 照氮测定法(见中国药典1995年版二部附录VII D第二法)测定。
无机氮：精密量取供试品5ml，加水3ml，加入10％钨酸钠1ml，0.33mmol/L硫酸1ml，摇匀，静置30分钟，过滤。精密量取过滤液5ml及氢氧化钠试液5ml，加入蒸馏瓶中，照总氮项下同法蒸馏测定。
总氮量：取注射用心肌肽素一瓶，准确加水4ml溶解，精密量取2.0ml；精密量取心肌肽素溶液2.0ml，分别照总氮测定法测定。
有机氮量＝总氮量-无机氮量
注：(1)在测定无机氮时，由于供试品在蒸馏过程中容易产生泡沫，将氢氧化钠带入冷凝管，流入收集液中，使测定结果偏高，应在蒸馏前加入10％钨酸钠及0.33mmol/L硫酸去除有机物，取滤液测定无机氮。
(2)供试品以多肽物质为主要成份，由于在生产过程中可能会带入无机物产生无机氮而影响测定结果。本法在测定总氮后，测定无机氮，以总氮量减去无机氮量作为有机氮量。
结果与分析
不同批号心肌肽素溶液及制剂的氮含量(见表3)。
表3.不同批号供试品氮测定结果
| 心肌肽素溶液(mg氮/ml) 注射用心肌肽素(mg氮/瓶) | |
| 批号 | 960419 960422 960423 960501 960502 960503 |
| 总氮 | 1.788 1.926 1.628 3.816 4.250 4.100 |
| 有机氮 | 1.589 1.743 1.460 3.612 3.919 3.722 |
| 无机氮 | 0.199 0.183 0.168 0.204 0.331 0.378 |
表3显示，心肌肽素溶液有机氮含量在1.46-1.74mg/ml之间，注射用心肌肽素有机氮含量在3.61-3.92mg/瓶范围。平均含量分别为1.60mg氮/ml和3.75mg氮/瓶。
(2)福林--酚法(Folin-phenol)
心肌肽素溶液，批号960419，960422，960423；注射用心肽素，批号960501，960502，960503；临用时用水溶解成适宜浓度。对照品：牛血清白蛋白(中国药品生物制品检定所)批号9607。
仪器 7221型分光光度计，上海。
试剂配制：
4％碳酸钠溶液 取碳酸钠(Na2CO3·10H2O)4g加水溶解并稀释至100ml，摇匀。0.2mol/L氢氧化钠溶液取氢氧化钠(NaOH)0.8g，加水溶解并稀释100ml，摇匀。1％硫酸铜溶液取硫酸铜(CuSo4·5H2O)1g加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。2％酒石酸钾溶液取酒石酸钾(K2C4H4O6·1/2H2O)2g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀。
碱性铜试液 临用前取试液1和2各25ml，试液3和4各0.5ml，混匀。
酚试液取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g，置1500ml烧瓶中，加水700ml、85％磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管(用软木塞或锡纸包裹的橡皮塞)微沸回流10小时，取下冷凝管，加入硫酸锂(Li2SO4)150g，全溶后，再加水50ml及溴液数滴，摇匀，煮沸15分钟，驱除过量的溴。冷却至室温，加水稀释至1000ml，过滤，滤液即为贮备液，贮于棕色瓶中，置冰箱内保存。临用时，取贮备液用水作倍量稀释，即得。
标准曲线绘制
对照品溶液的制备 精密称取干燥的牛血清白蛋白对照品(中国药品生物制品检定所提供)100mg，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得。
标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8及1.0ml，分别置具塞试管中，并各管加水使成1.0ml，每管各加碱性铜溶液5.0ml，摇匀，室温放置10分钟。再依次快速加入酚试剂0.5ml，立即摇匀，置水浴(35℃)中保温30分钟。取出，冷却至室温，以对照品溶液0.0ml管作空白，照分光光度法(中国药典1995年版二部附录IV A)在660nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘制标准曲线。
测定法 取本品，分别加水溶解或稀释并定量转移至50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密吸取10.0ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密吸取1.0ml置具塞试管中，照标准曲线制备项下自“加碱性铜试液”起到测定吸收度，在标准曲线上查得相应浓度，计算，即得。
结果与分析
所测结果见表4。
所测结果心肌肽素溶液每1ml含多肽在2.6-2.8mg范围；注射用心肌肽素每瓶含9.2-9.9mg。为保证溶液及制剂含量恒定，我们规定心肌肽素溶液多肽含量应大于每毫升2.5mg，注射心肌肽素每瓶多肽含量在9.0-11.0mg。
表4 三种含量测定方法的测定结果比较
测定方法
双缩脲法 福林-酚法 定氮法(多肽有机氮)
溶液(mg/ml)
960419 1.65 2.7 1.58
960422 1.85 2.8 1.74
960423 2.00 2.6 1.46
制剂(mg/瓶)
960501 3.26 9.9 3.61
960502 3.63 9.2 3.92
960503 3.73 9.2 3.72
注：*双缩脲法由全自动生化分析仪测定
从表10中可以看出三种测定方法不一致，结果出入较大。考虑到福林-酚法的反应原理是芳香族氨基酸的酚基反应，特异性较好，操作简便。选用特定的对照品及每次测定均绘制标准曲线可克服非线性关系，我们选用福林-酚法测定心肌肽素溶液和注射用心肌肽素的多肽含量。
(3)组成比例分析
该制品主要由多肽组成，分别测定其有机氮含量，由总有机氮含量减去游离氨基酸有机氮含量即为多肽有机氮含量。
3.1试剂与方法同前(见定氮法)。
3.2结果
3.2.1 3个批号的注射用心肌肽素游离氨基酸含氮量见表5。
表5.注射用心肌肽素游离氨基酸含氮量
| 注射用心肌肽素 | |
| 批号 | 960501 960502 960503 |
| 游离氨基酸总氮量g/L | 0.257 0.285 0.286 |
3.2.2注射用心肌肽素有机氮含量与游离氨基酸含氮量比较(见表6)
表6.总氮量与游离氨基酸含氮量比较
| 注射用心肌肽素 | |
| 批号 | 960501 960502 960503 |
| 多肽有机氮g/L | 3.612 3.919 3.722 |
| 游离氨基酸氮g/L | 0.257 0.285 0.286 |
| 游离氨基酸含氮量占总有机氮量百分比(％) | 6.643 6.823 7.135 |
从表5，6可以看出，注射用心肌肽素游离氨基酸含氮量仅占供试品含氮量的6.643％-7.135％，表明供试品多肽占总氮量的绝大部分。鉴于该品多肽是生物学活性的主要成份以及考虑到生产工艺的稳定可控，我们规定注射用心肌肽素多肽比例应达到75％-90％。
3.紫外扫描分析：
日本岛津2201型紫外分光光度计，照分光光度法(中国药典1995年版二部附录IV A)测定。
结果显示，心肌肽素溶液在199.8-201.2nm处有最大吸收峰，注射用心肌肽素在200.4-201.8nm处显示最大吸收峰(图4)。表明3批溶液与3批制剂紫外扫描图谱一致，供试品主要成分为多肽，心肌肽素制取工艺稳定。
表7 心肌肽素的紫外扫描吸收波长
批号 吸收波长(nm)
溶液(mg/ml)
960422 200.4
960423 199.8
960419 201.2
制剂(mg/瓶)
960501 200.4
960502 201.8
960503 201.6
4.蛋白质的鉴别：取本发明心肌肽素含量2.5mg/ml的心肌肽素2ml，加20％磺基水杨酸溶液1ml，不产生混浊，心肌肽素三批溶液及制剂测定结果显示均不含蛋白质。用磺基水杨酸法检查蛋白质，既可以对可能混入的蛋白质进行监测，同时亦可证明双缩脲法所显示的兰紫色是多肽而不是其它物质。
5.分子量及肽色谱图检查：HPLC法测定分子量
HP1050液相色谱仪
色谱条件：流动相：硫酸钠(0.1mol/L)-磷酸二氢钠(0.05mol/L)-叠氮钠(0.05％)，用NaOH调pH至6.8；流速：0.35ml/min；柱：TOSOH TSK G2000sw 7.5mm×300mm；柱温：25℃；检测波长：280nm；进样量：10μl。
分别取细胞色素C(MW＝12400)，抑肽酶(MW＝6700)及维生素B12(MW＝1355)适量，分别用流动相制成适宜浓度的对照品溶液。取供试品注射用心肌肽素1瓶，多肽含量10mg，用流动相制成每1ml含5mg的供试品溶液。分别取对照品溶液和供试品溶液，按色谱条件注入色谱仪，分别测定其保留时间。用最小二乘法作对照品的回归方程，相关系数不得小于0.99。按下式绘制标准曲线及计算供试品分子量。
IgMW＝A+BtR
IgMW＝6.8405-0.1219tR γ＝-0.9990
式中MW为分子量，A为常数，B为斜率，tR为保留时间(分钟)。
结果见表8、9。
表8 注射用心肌肽素色谱峰相对百分面积的保留时间
| 批号 | 色谱峰保留时间(min) |
| P1 P2 P3 P4 P5 | |
| 960501 | 30.5 31.8 32.8 35.0 38.7 |
| 960502 | 30.5 31.2 32.8 35.0 38.7 |
| 960503 | 31.2 32.7 35.0 38.7 |
| X | 30.7 31.5 32.7 35.0 38.7 |
表9 注射用心肌肽素的峰位分子量
| 批号 | 分子量(道尔顿) |
| P1 P2 P3 P4 P5 | |
| 960501 | 6023 4588 3665 2233 969 |
| 960502 | 6027 5261 3688 2234 971 |
| 960503 | 5165 3709 2236 875 |
| X | 5736 4519 3676 2234 971 |
X＝6.7444-0.09696×Y＝-0.9937
注射用心肌肽素的分子量分布范围在922-6027Da，最大分子量范围在5214-6027Da(图1)，显示该供试品为小分子多肽，分子量小于10000道尔顿，不易产生过敏反应。
6.核酸：注射用心肌肽素，每瓶含多肽10mg。加蒸馏水4ml溶解，再加入等体积苯酚抽提一次。取上清测定DNA含量。将此上清加双倍体积无水冷乙醇及1/20体积的10mol/L乙酸铵，置-80℃，30min，12000rpm×20min，弃上清，将沉淀溶于4ml蒸馏水中。此样品用于测定RNA含量。
(1)RNA含量测定
标准曲线的制备：
取试管6支，按下表加入试剂
| 加入量ml | ||||||
| 加入物 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| RNA标准液 | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 蒸馏水 | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 地衣酚试剂 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
将各管混匀，置沸水法中加热20min，取出，冷水冷却至室温，用分光光度计在670nm波长下，以“0”号管调零，测定各管吸光度。以RNA含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
样品RNA含量测定：
取试管4支，分别标以“空白管”和“测定管”。在空白管中加入蒸馏水1.0ml，在测定管中加入RNA样品溶液1.0ml，然后每管加入地衣酚试剂3.0ml，混匀，置沸水中20min，取出，冷水浴冷却至室温，用分光光度计在670nm波长下，以空白管调零，测定样品管吸光度，在标准曲线上查出RNA含量取平均值。
(2)DNA含量测定
标准曲线的制备：
取试管6支，按下表加入试剂
| 加入量ml | ||||||
| 加入物 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| RNA标准液 | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| DH2O | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 二苯胺试剂 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
将各管混匀，置60℃水浴中加热60min，取出，冷水冷却至室温，用分光光度计，在595nm波长下，以“0”号管调零，测定各管吸光度。以DNA含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
样品DNA含量测定：
取试管3支，分别标以“空白管”和“测定管”(3支)，在空白管中加入蒸馏水1.0ml，在测定管中加入DNA样品溶液1.0ml，然后每管加入二苯胺试剂3.0ml，混匀，置60℃水浴中加热60min取出，置冷水浴冷却至室温。用分光光度计在595nm波长下以空白管调零，测定样品管吸光度。在标准曲线上查出DNA含量，取平均值。
结果显示：注射用心肌肽素每瓶含RNA不超过200μg(2％)；DNA不超过750μg(7.5％)。
7.活力
采用原代心肌细胞培养法。
受试药物：注射用心肌肽素批号为960501，960502，960503，960101，多肽含量为10mg/瓶。
实验结果：(结果见表10)。
表10 心肌肽素活力测定
t值(n＝6)
批号 t值
960501 5.8
960502 3.2
960503 7.9
960101 7.8
8.HPLC法鉴别注射用心肌肽素
仪器：HP1100，Module liquid chromatograph No DE 70300954
色谱条件：流动相：甲醇∶水＝10∶90
柱：ymc-park ODS-A A-302 150mm×4.6mm I.D S-5μm 120A No041543847(W)
柱温：26℃。检测波长：254nm。流速：0.8ml/min。进样量：10μl。
测定法：取供试品，每瓶加流动相10ml，待完全溶解后，供试验用。
供试品批号分别为960101、960501、960502、960503、961101、961103、971201、980301。
结果显示：10批供试品主要显示4-5个主峰，相对百分峰面积大于85％，各主峰保留时间十分相近(见图7、表11，12)。
表11 各主峰保留时间
保留时间(min)
主峰 101 501 502 503 1101 1102 1103 201 301
P1 1.922 1.901 1.920 1.915 1.925 1.924 1.949 1.954 1.990
P2 2.506 2.504 2.500 2.502 2.643 2.639 2.640 2.638 2.638
P3 2.654 2.651 2.646 2.645
P4 3.156 3.144 3.134 3.128 3.124 3.114 3.117 3.115 3.115
P5 4.240 4.203 4.181 4.159 4.148 4.128 4.133 4.129 4.107
表12 各主峰相对百分峰面积
百分面积％
主峰 101 501 502 503 1101 1102 1103 201 301
P1 18.3 12.3 13.4 15.7 13.4 13.5 11.4 14.4 16.1
P2 10.6 11.7 9.2 12.4 5.2 5.2 5.1 5.8 4.7
P3 10.4 13.3 11.1 8.8
P4 37.4 45.4 47.8 38.6 43.8 43.4 47.3 46.8 42.2
P5 13.2 8.8 9.6 15.9 22.8 22.6 22.9 18.5 23.6
将4℃贮存3年至11个月的供试品在前述色谱条件进行分析，10个批号的供试品的保留时间十分接近，选主峰1、4、5相对保留时间的比例(3个峰的相对百分面积相加大于66％)作为鉴别指数。经计算主峰1、4、5相对保留时间比例应为1∶1.61∶2.14(±0.1)。
实施例2
本发明对所述的心肌肽素进行了主要药效学的试验，在整体和离体心肌缺血及缺血—再灌注模型上观察了心肌肽素对心肌形态学指标、生理指标及生化指标的影响以及对心肌耗氧量的影响。研究结果如下：
1.心肌肽素对缺血—再灌注所致的心肌超微结构损伤的影响
参考文献方法，结扎大鼠冠状动脉LAD 5min后，舌下静脉注射心肌肽素或对照药，心肌缺血10min后松开结扎线，再灌30min，同时记录II导联ECG。再灌结束后自腹主动脉取血，取出心脏，以生理盐水经主动脉灌流冲冼干净后，再以6％戊二醛0.1M二甲胂酸钠缓冲液灌流并固定2h，取左前壁缺血心肌，切成1mm3的小块浸入4％戊二醛0.1M二甲胂酸钠缓冲液中固定，以备制作电镜标本。经锇酸固定后，系列丙酮脱水，618环氧树脂包埋及聚合后切片，每只动物切4个包埋块。每组动物随机拍照20张，底片倍率均为12000，观察超微结构改变，按线粒体、心肌纤维及其它成分损伤的病变种类及严重程度分级定值。实验共分7组，分别为假手术(P-O)组；缺血—再灌注(I-R)组；缺血—再灌组+生理盐水或心得安(I-R+N.S，I-R+Pro)组；缺血—再灌注+心肌肽素(I-R+MTP)3个剂量组。
表13 心肌肽素对缺血—再灌注大鼠心肌电镜半定量组织学的影响(n＝20，x±s)
组别 剂量 病变值±SD
(mg/Kg)
假手术 - 0.36±0.46
缺血—再灌注 - 1.97±1.4ΔΔΔ
缺血—再灌注+生理盐水 - 2.68±1.3*
缺血—再灌注+心肌肽素 1.0 1.85±1.6*
5.0 0.73±0.96***
10.0 0.33±0.42***
缺血—再灌注+心得安 2.0 0.71±0.84***
注：与假手术对照组比较，ΔΔΔP＜0.01；与缺血—再灌注组比较，*P＞0.05，***P＜0.01
通过试验可发现心肌肽素能明显减轻心肌缺血—再灌流所致的心肌超微结构损伤，使其接近或恢复正常(见图6-12)。
2.心肌肽素对心肌缺血的影响
参考文献方法并作改正，猫开胸暴露心脏后剪开LAD处心包，用塑料套管压迫法造成急性心肌缺血10min，松开30min，将带有5组(每组3根)电极的布片缝于缺血心肌心包处，记录每组I、II、III导联心外膜电图，同时行股动脉插管记录动脉血压。取缺血1′、4′、7′及再灌1′、5′、10′、20′和持续阻断1′、5′、10′、15′、20′、30′、40′、50′、60′为记录时间点。以ST段抬高或下降的毫伏数代表ST段改变。每只猫阻断5次，第四次阻断前5min静脉给不同的药物，第五次持续阻断LAD，于持续阻断后20min，30min，40min静脉给予不同剂量的心肌肽素，心得安于持续阻断30min后给药。分别统计各组第3、4、5次阻断时∑ΔST及∑NST。实验分为缺血-再灌注组(I-R)；缺血-再灌注+生理盐水组(I-R+N.S)；缺血-再灌注+心肌肽素2.0，5.0，10.0mg/kg组(I-R+MTP 2.0，5.0，10.0mg/kg)；及缺血-再灌注+心得安组2.0mg/kg(I-R+Pro)共6组。
表14.心肌肽素预防性给药对猫心外膜电图缺血期∑ΔST及∑NST的影响(x±s)
组别 剂量 n ∑ΔST ∑NST
(mg/Kg) (mV) (个)
缺血—再灌注组 - 10 109±32 28.9±5.2
缺血—再灌注+生理盐水组 - 10 115±24* 31.1±5.1*
缺血—再灌注+心肌肽素组 2.0 6 70.8±16*** 19.5±4.8***
5.0 6 37.8±12*** 9.33±3.9***
注：与缺血—再灌注组比较，*P＞0.05；***P＜0.01
表15.心肌肽素治疗性给药对猫心外膜电图∑ΔST及∑NST的影响(x±s)
组别 剂量 n ∑ΔST ∑NST
(mg/Kg) (mV) (个)
缺血组 - 12 40.5±10 11.1±2.1
缺血+生理盐水组 - 12 40.0±12* 11.2±1.5*
缺血+心肌肽素组 2.0 6 29.9±2.9*** 8.67±2.2**
5.0 6 25.6±5.7*** 7.33±1.5***
10.0 6 19.7±4.0*** 6.17±1.2***
缺血+心得安组 2.0 6 22.8±6.4*** 6.17±1.5***
注：与缺血—再灌注组比较，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01
通过心外膜心电图显示心肌肽素能明显对抗猫心肌缺血所致的ST段升高，减少心肌缺血范围。
3.心肌肽素对心肌缺血—再灌流损伤所致心肌磷酸肌酸激酶释放及乳酸脱氢酶活性与游离脂肪酸和丙二醛含量的影响
(1)参考文献方法制作心肌缺血—再灌注损伤动物模型，舌下静脉注射MTP或维拉帕米(verapamil，Ver)后5min结扎大鼠冠状动脉左前降支10min，再灌注30min，以多导生理仪连续观察并记录II导联ECG，再灌结束后取左心血2ml，心脏经主动脉灌流后取左室心尖部心肌，4℃保存，48h内检测。实验分组：实验分为假手术对照组(pseudo-operation，P-O)；缺血—再灌注组(ischemia-reperfution，I-R)；缺血—再灌注+生理盐水组(I-R+N.S)；缺血—再灌注+心肌肽素0.5、2.0、10.0mg/Kg组(I-R+MTP)及缺血—再灌注+维拉帕米1.0mg/Kg(I-R+Ver)等7组，每组8-10只动物。
表16.心肌肽素预防性给药对缺血—再灌注大鼠心肌及血浆CPK活性的影响(x±s)
组别 剂量 n 心肌CPK 血浆CPK
(mg/Kg) (u/100mgpro) (u/100ml)
假手术 10 980±63 164±64
缺血—再灌注 10 522±65ΔΔΔ 374±54ΔΔΔ
缺血—再灌注+生理盐水 8 501±59* 337±48*
缺血—再灌注+心肌肽素 0.5 8 732±98*** 210±50***
2.0 8 904±95*** 157±31***
10.0 8 976±95*** 134±24***
缺血—再灌注+维拉帕米 1.0 8 886±115*** 192±60***
缺血—再灌注+心肌细胞生长刺激肽 5.0 8 830±97*** 199±35***
注：与假手术对照组比较，ΔΔΔP＜0.01；与缺血—再灌注组比较，*P＞0.05，***P＜0.01
表17.心肌肽素预防性给药对缺血—再灌注大鼠心肌及血浆LDH活性的影响(x±s)
组别 剂量 n 心肌LDH 血浆LDH
(mg/kg) (u/mg pro) (u/ml)
假手术 - 10 76.7±19 40.9±9.5
缺血—再灌注 - 10 110±27ΔΔΔ 120±20ΔΔΔ
缺血—再灌注+生理盐水 - 8 112±19* 116.2±12*
缺血—再灌注+心肌肽素 0.5 8 97.1±12* 93.9±17***
2.0 8 76.3±22*** 59.7±12***
10.0 8 64.8±17*** 52.6±13***
缺血—再灌注+维拉帕米 1.0 8 75.1±23*** 46.7±8.8***
缺血—再灌注+心肌细胞生长刺激肽 5.0 8 83.0±17*** 60.9±15***
注：与假手术对照组比较，ΔΔΔP＜0.01，与缺血—再灌注组比较，*P＞0.05，***P＜0.01
表18.心肌肽素预防性给药对缺血—再灌注大鼠心肌及血浆MDA含量的影响(x±s)
组别 剂量 n 心肌MDA 血浆MDA
(mg/kg) (nmol/100mg pro) (nmol/ml)
假手术 10 68.3±8.4 22.3±1.8
缺血—再灌注 10 135±10ΔΔΔ 63.6±11ΔΔΔ
缺血—再灌注+生理盐水 8 127±15* 58.4±11*
缺血—再灌注+心肌肽素 0.5 8 73.1±13*** 38.1±6.2***
2.0 8 60.5±10.4*** 27.7±5.5***
10.0 8 49.8±9.4*** 25.5±5.1***
缺血—再灌注+维拉帕米 1.0 8 66.6±19.8*** 24.9±6.6***
缺血—再灌注+心肌细胞生长刺激肽 5.0 8 65.2±9.7*** 32.2±5.3***
注：与假手术对照组比较，ΔΔΔP＜0.01；与缺血—再灌注组比较，*P＞0.05，***P＜0.01
表19 心肌肽素对缺血—再灌注大鼠血清FFA含量的影响(n＝8，x±s)
组别 剂量 FFA
(mg/Kg) (mol/100ml)
假手术 - 60.6±7.8
缺血—再灌注 - 129±26ΔΔΔ
缺血—再灌注+生理盐水 - 121±10*
缺血—再灌注+心肌肽素 1.0 85.4±5.0***
5.0 77.7±7.1***
10.0 71.4±11***
缺血—再灌注+心得安 2.0 77.1±6.4***
缺血—再灌注+心肌细胞生长刺激肽 5.0 79.2±6.7***
注：与假手术对照组比较，ΔΔΔP＜0.01；与缺血—再灌注组比较，*P＞0.05，***P＜0.01
采用本发明所述的制备方法所得心肌肽素与专利ZL94102798和ZL94102799公开的心肌细胞生长刺激肽(GMGSP)比较，具有明显高的体外生物活性，本发明所述心肌肽素活性单位是心肌细胞生长刺激肽的3-5倍，体内药效对比数据显示，其对心肌缺血—再灌流损伤所致心肌磷酸肌酸激酶释放及乳酸脱氢酶活性与游离脂肪酸和丙二醛含量具有明显有利影响(见表16-19)。
(2)参考文献方法制作离体大鼠Langendorff′s心脏缺氧—复氧损伤动物模型，以高Ca2+，低K+并持续充入混合气体的K-H液进行Langendorff′s灌流，将两根铂丝分别勾于心尖和左房根部，记录心电图。LAD结扎10min，松开15min，给药组在结扎前5min至松开后5min均以含相应浓度药物的K-H液灌流。分别收集结扎前、结扎后8min及松开后2min的流出液测定有关指标。灌流结束后取左室前、后壁心肌，4℃保存，48h内检测CPK、LDH及MDA。实验分为假手术对照组(pseudo-operation，P-O)；缺氧—复氧组(anoxia-reoxygenation，A-R)；缺氧—复氧+心肌肽素10、50、100μg/ml(终浓度，A-R+MTP)组及缺氧—复氧+维拉帕米1.0μg/Kg(A-R+Ver)等6组，每组10只动物。
表20.心肌肽素对离体大鼠心肌缺血—再灌流时冠脉流出液CPK活性的影响(n＝10，x±s)
冠脉流出液CPK(U/L)
组别 剂量
(μg/ml) 缺血前 缺血期 再灌期
假手术 - 15.3±1.5 16.5±1.8 17.1±2.0
缺血—再灌流 - 16.3±2.3Δ 24.8±2.7ΔΔΔ 35.4±4.3ΔΔΔ
缺血—再灌流
+心肌肽素 10 16.1±2.6* 20.7±1.7*** 22.7±2.3***
50 15.6±1.7* 17.9±2.7*** 19.0±2.3***
100 15.5±2.7* 15.3±2.1*** 16.5±2.4***
缺血—再灌流
+维拉帕米 1 16.3±2.0* 16.2±2.8*** 16.0±1.8***
注：与假手术对照组比较，ΔP＞0.05，ΔΔΔP＜0.01；与缺血—再灌流组比较，*P＞0.05，***P＜0.01
表21.心肌肽素对离体大鼠心肌缺血—再灌流冠脉流出液LDH活性的影响响(n＝10，x±s)
冠脉流出液LDH(U/L)
组别 剂量
(μg/ml) 缺血前 缺血期 再灌期
假手术 - 11.8±0.79 12.6±1.1 11.8±0.69
缺血—再灌流 - 11.7±0.83Δ 17.3±1.9ΔΔΔ 24.7±1.7ΔΔΔ
缺血—再灌流
+心肌肽素 10 12.0±0.58* 13.4±1.1*** 15.3±1.4***
50 11.8±0.53* 12.9±1.1*** 13.4±0.76***
100 11.2±0.55* 12.2±0.79*** 12.9±0.93***
缺血—再灌流
+维拉帕米 1 11.4±0.78* 13.0±0.62*** 14.3±0.95***
注：与假手术对照组比较，ΔP＞0.05，ΔΔΔP＜0.01；与缺血—再灌流组比较，*P＞0.05，***P＜0.01
通过试验表明心肌肽素能明显减低心肌缺血—再灌流损伤所致心肌磷酸肌酸激酶释放及乳酸脱氢酶活性与游离脂肪酸和丙二醛含量的增高。
4.心肌肽素对心肌耗氧量的影响
狗戊巴比妥钠麻醉，气管插管，人工呼吸，用RM-86型多导生理仪监测心电图与主动脉压。左侧开胸，暴露心脏，从心尖插管至左心室，左室压及压力变化速度(±dp/dt max)。为了解冠脉循环与心肌O2代谢的变化，分离狗的冠状动脉左旋支，用电磁流量计测冠脉流量，计算冠脉阻力。从狗的颈外静脉插管至冠状，同时抽取动脉血与冠状窦血，用血气分析仪(ABL-3型，丹麦)测定血O2含量，计算心肌O2摄取率与心肌耗O2量。实验过程中保持狗的动脉血pHCO2与O2分压在正常范围。MTP剂量为2，5，10mg/kg，二个剂量间隔30min。给药后连续记录各项参数，直至基本恢复到对照值。给药后2，5，10，30min取动脉血与冠状窦血，测血气含量，计算心肌O2摄取率与心肌耗O2量，观察MTP对心肌O2代谢的影响。
表22.静注心肌肽素对狗心肌耗氧量与心肌氧利用率的影响(给药后变化值％)
时间 心肌耗氧量 心肌氧利用率
(min) (MVO2) (O2ext)
心肌肽素2mg/kg(N＝8)
2 -23.0±26 -4.00±13
5 -21.0±13*** 0±8.0
10 -18.0±14 -2.00±6.0
20 -9.00±12 -2.00±12
心肌肽素5mg/kg(N＝7)
2 -36.0±24** -5.00±13
5 -26.0±21** 6.00±8.0
10 -19.0±15** 6.00±6.0*
20 -8.00±10 -14.0±35
心肌肽素10mg/kg(N＝6)
5 -22.0±25 9.00±5***
10 -21.0±14** 2.00±5.0
20 -8.00±4.0* 3.00±4.0
30 -10.0±7.0* -6.00±15
普萘洛尔2mg/kg(N＝6)
2 -31.0±13* -3.00±1.0
5 -30.0±13*** 3.00±7.0
10 -33.0±10*** 3.00±8.0
30 -32.0±14*** 3.00±9.0
与给药前比较：*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01
5.心肌肽素对心肌梗塞的影响
体重20.9±4.0kg成年健康小型猪，雄性，耳静脉注射3％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉。气管插管接SC-3型电动呼吸机行人工正压呼吸。左侧第III肋间开胸，暴露心脏，分离冠状动脉前降支(距心尖大约1/3位置处)，于其下穿0#丝线，以备结扎；在结扎线下心肌表面放置20个点的多点固定式心外膜电极，心肌电信号经ZYS1-I型数控心外膜扫描仪、AB-601G生物电放大器记录于RM-6300型八导生理记录仪的RTA-1200型热阵记录仪上，标准电压1mV＝1mm，自动定时标测20个点的心外膜心电图变化。股动脉插管至腹主动脉，经TP-400T型压力换能器接AP-641G血压放大器测量平均动脉压(MBP)；四肢皮下插入针状电极，经AC-601G心电放大器测量标准II导联心电图(ECGII)，并将ECG电讯号输入AT-601G心率计，测量心率(HR)。股静脉插管用于给药及补液。
实验分4组，共用动物25头，溶剂对照组在静脉输注甘露醇120mg/kg时，有5头因室颤死亡，存活5头，其余各组每组5头，经股静脉分别输注心肌肽素5、10mg/kg，阳性药维拉帕米0.25mg/kg，给药体积均为2ml/kg，输注速度均为2ml/min。手术完毕待各项指标稳定后描记心外膜心电图，随后结扎前降支，5min后记录心外膜心电图作为给药前对照，然后静脉输注给药，记录给药后5、10、15、20、25、30、45、60、90、120、180min的ECGII、MBP、HR及20个点的心外膜心电图ST段升高值，并求得总和(ST)，以此作为衡量心肌缺血程度的指标。将心外膜心电图ST段升高超过2mV的点定为缺血点，计算总缺血点数(NST)，以此作为心肌缺血范围的指标。给药后3h放血处死动物，迅即取出心脏，剪下心室，洗净残留血液，将结扎部位以下心室按5mm厚冠状切片，室温下1％TTC避光染色30min，再将5片心肌正反两面的缺血区及非缺血区描记于透明胶片上，剪取白色梗塞区胶片称重，除以10面心室肌胶片重，计算梗塞区占结扎线下心室重量的百分比。
实验分组、给药剂量及给药方式
组别 药物 输注剂量 输注速度
(mg/kg) (ml/min)
溶剂对照组 甘露醇 120 2
受试物低剂量组 心肌肽素+甘露醇 5+120 2
受试物高剂量组 心肌肽素+甘露醇 10+120 2
阳性药物对照组 维拉帕米 0.25 2
表23 静脉输注心肌肽素对猪心肌梗塞范围的影响
药物 剂量 动物数 梗塞范围
(mg/kg) (n) (％)
溶剂对照 - 5 19.4±3.02
心肌肽素 5 5 11.8±3.13*
心肌肽素 10 5 10.2±3.2**
维拉帕米 0.25 5 12.5±3.4*
注：与溶剂对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
试验证明，心肌肽素5、10mg/kg可明显降低心肌梗塞猪心外膜心电图的ST、减少NST，并缩小心肌梗塞范围，对急性心肌缺血猪出现的心律失常、室颤所致死亡有一定的治疗作用，而对血压、心率无明显影响。
实施例3
取1公斤健康乳猪心室肌洗净、切碎，加1公斤灭菌蒸馏水以3000rpm/min转速匀浆，匀浆液在-20℃冷冻24小时，解冻后反复3次，隔水加热至75℃，用型号为XAS03-172/8的板框滤器(购自广州医药器械研究所)过滤除渣，选用10u中速滤纸，得到粗滤液，粗滤液用中空纤维柱(规格为F60，购自瑞士金宝公司)超滤，得到分子量为12Kd精滤液，用超滤膜(规格为10Kd，Millipore公司)超滤，截留分子量为9500Da的心肌肽素溶液150ml，以Millipore公司的反渗透浓缩柱浓缩产品。
所述心肌肽素的溶液经过质量检查至符合质量标准，然后过滤除菌、灌装、再经冷冻干燥，所用设备为冷冻干燥机，20分钟使干燥室内搁板温度达到-20℃，再经30分钟，使制品温度达到-35℃；保持2小时将冷凝器内温度降到-50℃，再抽真空，真空度达到100KPa时，连通干燥室与冷凝器，停止干燥箱的制冷，当干燥箱的真空度为15Pa时开始升温，升温速度为3℃/min，升温至15℃，保温3小时，继续以10℃/min速度升温至22℃，持续5小时；继续以10℃/min速度升温至35℃，持续2小时；继续以5℃/min速度升温至50℃，持续1小时。进入降温阶段，20min内使温度降至40℃，持续10小时，即得到外观合格的心肌肽素冻干品，取出制品封口。
所述心肌肽素经分析，多肽含量为85％，游离氨基酸为8％，核糖核酸含量1％，脱氧核糖核酸含量6％，分子量9500道尔顿。
实施例4
取1公斤健康乳牛心室肌洗净、切碎，加1公斤灭菌蒸馏水以5000rpm/min转速匀浆，匀浆液在-30℃冷冻48小时，解冻后反复4次，隔水加热至90℃，用型号为XAS03-172/8的板框滤器(购自广州医药器械研究所)过滤除渣，选用8u中速滤纸，得到粗滤液，粗滤液用中空纤维柱(规格为F60，购自瑞士金宝公司)超滤，得到分子量为12Kd精滤液，用超滤膜(规格为5Kd，Millipore公司)超滤，截留分子量为5000Da的心肌肽素溶液150ml，以Millipore公司的反渗透浓缩柱浓缩产品。
所述心肌肽素的溶液经过质量检查至符合质量标准，然后过滤除菌、灌装、再经冷冻干燥，所用设备为冷冻干燥机，40分钟使干燥室内搁板温度达到-18℃，再经20分钟，使制品温度达到-25℃；保持1小时将冷凝器内温度降到-40℃，再抽真空，真空度达到95KPa时，连通干燥室与冷凝器，停止干燥箱的制冷，当干燥箱的真空度为12Pa时开始升温，升温速度为2℃/min，升温至10℃，保温5小时，继续以16℃/min速度升温至25℃，持续3小时；继续以15℃/min速度升温至30℃，持续1小时；继续以8℃/min速度升温至60℃，持续2小时。进入降温阶段，30min内使温度降至46℃，持续8小时，即得到外观合格的心肌肽素冻干品，取出制品封口。
所述心肌肽素经分析，多肽含量为78％，游离氨基酸为15％，核糖核酸含量2％，脱氧核糖核酸含量5％，分子量5000道尔顿。
实施例5
取1公斤健康乳兔心室肌洗净、切碎，加1公斤灭菌蒸馏水以1000rpm/min转速匀浆，匀浆液在-10℃冷冻72小时，解冻后反复3次，隔水加热至85℃，用型号为XAS03-172/8的板框滤器(购自广州医药器械研究所)过滤除渣，选用5u中速滤纸，得到粗滤液，粗滤液用中空纤维柱(规格为F60，购自瑞士金宝公司)超滤，得到分子量为11Kd精滤液，用超滤膜(规格为3Kd，Millipore公司)超滤，截留分子量为2000Da的心肌肽素溶液150ml，以Millipore公司的反渗透浓缩柱浓缩产品。
所述心肌肽素的溶液经过质量检查至符合质量标准，然后过滤除菌、灌装、再经冷冻干燥，所用设备为冷冻干燥机，10分钟使干燥室内搁板温度达到-15℃，再经25分钟，使制品温度达到-30℃；保持2.5小时将冷凝器内温度降到-45℃，再抽真空，真空度达到90KPa时，连通干燥室与冷凝器，停止干燥箱的制冷，当干燥箱的真空度为10Pa时开始升温，升温速度为5℃/min，升温至5℃，保温6小时，继续以8℃/min速度升温至15℃，持续8小时；继续以7℃/min速度升温至32℃，持续4小时；继续以4℃/min速度升温至55℃，持续3小时。进入降温阶段，10min内使温度降至50℃，持续15小时，即得到外观合格的心肌肽素冻干品，取出制品封口。
所述心肌肽素经分析，多肽含量为90％，游离氨基酸为6％，核糖核酸含量1％，脱氧核糖核酸含量3％，分子量2000道尔顿。
实施例6
同实施例3，不同的是截留分子量为4000Da的心肌肽素溶液，经过质量检查至符合质量标准，然后过滤除菌、灌装、按照以下配方：
心肌肽素 20mg
甘露醇 375mg
活性炭 0.005mg
注射用水 加至5ml
装瓶，置于冷冻干燥机中，按30分钟内使干燥室内搁板温度达到-20℃，再经40分钟，使制品温度达到-35℃，保持3小时将冷凝器内温度降到-50℃，再抽真空，真空度达到95Kpa时，连通干燥室与冷凝器，停止干燥箱的制冷，当干燥箱的真空度为15Pa时开始升温，升温速度为3℃/min，升温至10℃，保温4小时。继续以12℃/min速度升温到20℃，持续5.5小时。继续以12℃/min速度升温到30℃，持续1.5小时。继续以6℃/min速度升温到60℃，持续2小时。进入降温阶段，20min内使温度降至48℃，持续9小时。得到外观合格的心肌肽素冻干品，取出制品封口。
冷冻干燥得到心肌肽素含量2.0mg/ml成品。所述心肌肽素经分析，多肽含量为80％，游离氨基酸为12％，核糖核酸含量2％，脱氧核糖核酸含量6％，分子量4000道尔顿。
实施例7
同实施例3，不同的是原料采用健康乳马的心室肌，截留分子量为8000Da的心肌肽素溶液，所得心肌肽素经分析，多肽含量为84.5％，游离氨基酸为6％，核糖核酸含量2％，脱氧核糖核酸含量7.5％，分子量8000道尔顿。
实施例8
同实施例3，不同的是心肌肽素溶液中还含有海藻糖，组分配比为：心肌肽素15mg/ml，海藻糖200mg/ml。
实施例9
同实施例3，不同的是原料采用健康猪的心室肌，心肌肽素溶液中还含有乳糖，组分配比为：心肌肽素18mg/ml，乳糖250mg/ml。
实施例10
同实施例6，不同的是截留分子量为1000Da的心肌肽素溶液，其中心肌肽素溶液组分为：
心肌肽素 16mg
蔗糖 300mg
活性炭 0.005mg
注射用水 加至5ml
所得心肌肽素经分析，多肽含量为82％，游离氨基酸为12％，核糖核酸含量2％，脱氧核糖核酸含量4％，分子量1000道尔顿。
实施例11
心肌肽素初步稳定性试验
1.注射用心肌肽素影响因素试验、加速试验的结果表明，在去除外包装、湿度＞75％及温度＞37℃条件下外观色泽迅速变黄。水份增加，活力降低。
2.室温留样考察结果显示，480～540天时除外观色泽变为微黄色外，其它项目无改变，在4℃条件下贮存，各考察项目无变化。表明注射用心肌肽素在湿度45％～90％及室温条件下至少贮存150天，外观性状、含量及活力无改变，在4℃条件下，至少可贮存480天。
Claims (10)
1.一种心肌肽素的制备方法，其特征在于将不包括人的健康哺乳动物的心室肌洗净、切碎，加灭菌蒸馏水匀浆，匀浆液反复冷冻、解冻3～4次，加热至65～95℃过滤除渣，用板框滤器过滤得到粗滤液，再用中空纤维柱超滤，得到精滤液，用超滤膜超滤，截留重均分子量小于10000Da的心肌肽素溶液，以反渗透浓缩柱浓缩，最后经过滤除菌，冷冻干燥得成品。
2.根据权利要求1所述的心肌肽素的制备方法，其特征在于所述不包括人的健康哺乳动物包括猪、牛、羊、兔、马。
3.根据权利要求2所述的心肌肽素的制备方法，其特征在于所述哺乳动物优选幼年哺乳动物，包括乳猪、乳牛、乳羊、乳兔、乳马等，最优选为乳猪。
4.根据权利要求1所述的心肌肽素的制备方法，其特征在于所述灭菌蒸馏水的加入量为哺乳动物的心室肌的0.5～4倍；所述匀浆的转速为1000～5000rpm/min。
5.根据权利要求1所述的心肌肽素的制备方法，其特征在于所述冷冻为在低于-5℃的温度下冷冻24～72小时，优选的为在-20℃～-30℃下冷冻36～48小时；所述加热方式为采用隔水加热或直接加热，温度为70～90℃，时间为不超过2小时，优选的为采用隔水加热，温度为75℃～80℃，时间为不超过1小时。
6.根据权利要求1所述的心肌肽素的制备方法，其特征在于所述板框滤器选用小于10μ中速滤纸，优选小于或等于5μ中速滤；用中空纤维柱超滤后得到分子量小于12kDa的精滤液；用超滤膜超滤截流得到分子量小于10kDa的精滤液，以反渗透浓缩柱浓缩。
7.根据权利要求1所述的心肌肽素的制备方法，其特征在于冷冻干燥过程为：5～40分钟使干燥室内搁板温度达到-15～-20℃，优选20～30分钟内达到-18～-20℃，再经20～40分钟，使制品温度达到-25～-35℃，优选25～35分钟内达到-30～-35℃。保持1～3小时将冷凝器内温度降到-40～-50℃，再抽真空，真空度达到90～100KPa时，连通干燥室与冷凝器，停止干燥箱的制冷，当干燥箱的真空度为10～15Pa时开始升温，升温速度为2～5℃/min，升温至5～15℃，保温3～6小时，优选以3～4℃/min速度升温到8～12℃，持续4～5小时。继续以8～16℃/min速度升温至15～25℃，持续3～8小时，优选以10～12℃/min速度升温到18～22℃，持续4～6小时。继续以7～15℃/min速度升温至30～35℃，持续1～4小时，优选以9～12℃/min速度升温到33～35℃，持续1.5～2小时。继续以4～8℃/min速度升温至50～60℃，持续1～3小时，优选以5～7℃/min速度升温到54～58℃，持续1.5～2小时。进入降温阶段，10～30min内使温度降至40-50℃，持续8-15小时，优选15～20min内使温度降至45～48℃，持续9～12小时，得到外观合格的心肌肽素冻干品。
8.根据权利要求1所述的心肌肽素的制备方法，其特征在于在冷冻干燥时可加赋形剂，其重量比组成为：
心肌肽素15～20
赋形剂100～375，
优选为18～20∶200～375，赋形剂可为甘露醇、海藻糖、乳糖、蔗糖或其它冻干用辅料，优选为甘露醇。
9.根据权利要求1所述的心肌肽素的制备方法，其中所述的心肌肽素的多肽含量为75％～90％，游离氨基酸为6％～15％，核糖核酸含量小于2％；脱氧核糖核酸含量小于7.5％，分子量小于10000道尔顿。
10.根据权利要求9所述的心肌肽素的制备方法，其中所述心肌肽素的分子量为1000～10 000Da；所述心肌肽素在等电聚焦电泳中显示2-6条染色带，其中pI为10.92带着色较深；所述心肌肽素在紫外吸收光谱中190-210nm处有一稳定的最大吸收峰，优选在紫外吸收光谱200±2nm处有一最大吸收峰者；所述心肌肽素活力至少为2.2；所述心肌肽素中不含有蛋白质；所述心肌肽素经FPLC分析，心肌肽素主要有5个组份峰，相对百分面积相加为90％～95％。优选等电聚焦电泳显示2条带，其中pI为10.92带着色较深者。
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2003
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