CN101881770A

CN101881770A - 猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法

Info

Publication number: CN101881770A
Application number: CN2009100149994A
Authority: CN
Inventors: 周顺; 纪卫宁; 崔尚金; 李俊; 王金宝; 袁小远
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS; Qingdao Agricultural University; Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS; Qingdao Agricultural University; Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2009-05-08
Filing date: 2009-05-08
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2029-05-08
Also published as: CN101881770B

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法，该方法是利用基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白，采用酶联免疫原理和膜层析技术制成，快速检测猪血液或血清中的抗体。该测试纸条可广泛用于临床猪圆环病毒病的检测。与其他病毒无交叉反应，与ELISA、中和试验两种方法检测的符合率分别为98.63％和95.83％。与ELISA相比，重组抗原免疫胶体金具有明显的优势：安全性好，无需培养病毒本身，避免了因操作病毒造成的病毒扩散；可以大批量制备，工艺简单，生产成本低廉；抗原成分稳定均一，操作简便省力，不用仪器，检测结果特异性高，重复性好。整个实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。

Description

猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法

技术领域

本发明涉及一种兽医生物技术领域的诊断技术，具体地说是猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是引起断奶猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的病原，已广泛受到了人们的重视。随着对PCV2及其致病性的研究的深入，近来发现PCV2还与猪的繁殖障碍、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、皮炎与肾病综合征(porcine dermatisand nephropathy syndrome，PDNS)、幼龄仔猪的先天性震颤等疾病有关。近年来，我国规模化猪场PCV2感染以及由此引起的疾病愈来愈普遍，给我国养猪生产造成了较大的经济损失。

目前，公知的猪圆环病毒2型抗体快速检测试剂盒(ELISA法)，系采用酶联免疫技术检测样品(血清)中猪圆环病毒2型抗体的方法。即：采用猪圆环病毒2型经纯化、浓缩制成的抗原包被微孔板，在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有猪圆环病毒2型特异性抗体，则将与微孔板上抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与微孔板上抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加TMB或OPD底物液，与酶反应形成有色产物，加入终止液反应后，用酶标仪固定波长(450nm或630nm)测定各反应孔中的OD值。ELISA适合大批样品的检测，成为了一种常规的检测方法。但是，该方法抗原的制备过程必须经过病毒的细胞培养、病毒纯化等繁琐模式，特异性不高、稳定性差，而且成本高；检测时需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，检测操作人员需要经过专业培训；操作过程相对比较复杂；检测所需要时间比较长；检测所需费用高。

发明内容

本发明的目的是为了克服当前技术在推广使用中存在的缺陷，提供一种猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法。

本发明的目的是针对目前我国猪圆环病毒病普遍存在，给养猪业带来严重经济损失及缺乏现场操作简便的试剂盒的现状，提供一种提供一种不需要特定仪器设备辅助的检测试剂，并能有效地降低检测成本，能够应用于大规模现地检样的诊断方法。

本发明的猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法是通过以下技术方案实现的：

利用基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白，采用酶联免疫原理和膜层析技术制成快速检测猪血液或血清中的抗体。猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维膜(NCM)和吸水垫和PVC板。按照正确地顺序固定在PVC板上。PVC板一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维膜，另一端粘附吸水垫，其特征在于结合垫包被了基因工程表达的猪圆环病毒2型ORF2蛋白-胶体金结合物，将表达蛋白包被在硝酸纤维膜作为检测线(T)，将兔抗猪圆环病毒2型抗体包被在硝酸纤维膜作为对照线(C)。可广泛用于临床猪圆环病毒病的检测。与其他病毒无交叉反应，与ELISA、中和试验两种方法检测的符合率分别为98.63％和95.83％，整个实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。

一、基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白制备

1材料和方法：

1.2ORF2基因氨基端(737-421nt)的扩增

参照PCV2JXL序列，设计并合成1对引物，以重组质粒pMDT-PCV为模板，扩增ORF2基因的氨基端(737-421nt)部分片段。

CapL 5’ AGC AAG CTT CTT TCG TTT TC3’，

PCVF 5’GGG AAT TCA ACC TTA ATC TTC CTT A 3’

上游引物下划线为HindIII序列，核酸位置739nt；下游引物下划线为EcoRI序列，位于423nt。

PCR反应条件为，94℃热启动5分钟，94℃变性60秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分钟。扩增产物即为PCV_737-421，经1％琼脂糖电泳。

1.2ORF2基因氨基端片段在pMD-18T中的克隆

将扩增产物PCV_737-421利用胶回收试剂盒(上海华顺生物工程公司)大量回收，按照产品说明书，利用T-A原理，与pMD-18T载体连接。转化DH5α感受态大肠杆菌，涂布于含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB片板，12小时后挑取典型白色单菌落少量培养，提质粒DNA。通过BamHI和EcoRI双酶切鉴定重组克隆，命名为pMDT-PCV_737-421。

1.3ORF2基因氨基端(737-421nt)在pGEX-6p-1中的克隆

原核表达载体pGEX-6p-1(Amersham Pharmacia Biotech)是上游带有谷胱甘肽S转移酶(GST)部分基因的高效表达载体。用BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pMDT-PCV_737-421，得到2条条带，分别为载体2.7kb和插入片段0.3kb，回收其中0.3kb。用BamHI和EcoRI双酶切pGEX-6p-1，与带有相同粘端的PCV_737-421连接。转

化大肠杆菌BL21感受态菌，氨苄青霉素抗性筛选。挑取单菌落少量培养基过夜培养，小提质粒DNA，通过限制性内切酶鉴定重组质粒。得到重组克隆命名为pGEX-PCV_737-421。

1.4ORF2基因羧基端(421-37nt)在pGEX-6p-1中的克隆

本实验须利用pMDT-Cap重组克隆中分别位于引物和载体序列的EcoRI和SalI位点，用EcoRI和SalI双酶切DNA pMDT-Cap，得到2条带，分别为3.0kb和0.4kb，其中3.0kb来自2.7kb的载体带与ORF2基因的氨基端737-421部分之和。0.4kb条带，即为ORF2基因的羧基端(421-37nt)部分PCV_421-37。大量回收，与同样用EcoRI和SalI双酶切的pGEX-6p-1载体连接，转化大肠杆菌BL21感受态菌，常规筛选重组克隆，得到pGEX-PCV_421-37。

1.5pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37的诱导表达

按照载体说明书(GST Gene Fusion System，第3版)进行。将分别含有重组质粒pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37的新鲜大肠杆菌单菌落在2×YTA培养基中37℃振荡培养过夜，次日按1％体积比转接5ml新鲜培养基，37℃继续培养。当菌液OD₆₀₀值达0.6-0.8时，加入无菌IPTG溶液，使终浓度为0.1mmol/L。诱导3-4小时后停止培养，取1ml离心收集菌体，PBS(pH7.4)洗涤，用80μl PBS悬浮菌体，与20μl 5×SDS裂解缓冲液混合，煮沸变性5分钟。利用BioRAD公司的蛋白质电泳装置进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶的丙烯酰胺浓度为10％。将只含载体的大肠杆菌同样诱导做阴性对照。0.25％考马斯亮兰染色。

1.6pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37表达蛋白免疫鼠血清的制备

分别大量诱导表达上述重组菌，将菌体用原培养液1/10体积的PBS重悬，超声波破碎至液体清澈，与5×SDS上样缓冲液煮沸变性5分钟，进行常规SDS-PAGE。电泳结束后，在考马斯亮蓝染液中染色2小时，再经脱色至背景清晰。用去离子水尽量洗去胶上的脱色液，再置胶于一干净玻片上，用干净刀片切下目的条带，放在1.5ml EP管中，尽量少混杂无关蛋白。-20℃冻存。免疫前，在冷冻状态下尽量碾碎胶条，用适量PBS重悬，至胶粒可通过10号注射器针头为宜，即为制备好的免疫原。

选择健康活泼的青年雌性BALB/c小鼠，分别腹腔注射上述制备的免疫物质，每只每次0.5ml，每次免疫间隔2-3周。各免疫5只小鼠，2免后每次免疫前框下窦采血约100μl，析血清，对PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)，观察有无特异性荧光染色。

1.7pGEX-PCV_421-37表达蛋白与PCV感染猪多抗血清的ELISA反应性

将pGEX-PCV_421-37和pPRO-Rep重组菌大量诱导表达后，同上制备免疫原。按常规方法进行ELISA。用碳酸盐缓冲液(pH9.6)分别以1∶40、1∶80、1∶160、1∶200稀释后包被酶标板，每个稀释度3个重复孔，4℃过夜。弃去孔内的液体，同时用洗涤液PBST(0.01mol/LPBS+0.05％Tween20)洗3次，每次5分钟，拍干。每孔加100μl封闭液(含5％脱脂乳的PBST)37℃封闭2小时，同上洗涤。将PCV2阳性猪血清(中国农业大学动物医学院杨汉春教授提供)和分别用PBS按1∶250、1∶500、1∶750、1∶1000、1∶1500稀释，各稀释度重复3次，每孔加50μl，同时设SPF猪阴性血清对照(中国农科院哈尔滨兽研所崔尚金副研究员提供)和PBS空白对照，37℃作用2小时，洗涤，拍干。加用PBS配制的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，每孔50μl，37℃孵育1.5小时，洗涤，拍干。加底物液，每孔加新鲜配制的底物缓冲液50-100μl(10ml磷酸盐-柠檬酸缓冲液)与9mg邻苯二胺混合后，临时加30％H₂O₂0.15ml)，37℃10-30分钟静止避光显色。当阴性孔即将显色时，以50μl 2mol/L H₂SO₄终止反应，在酶联免疫阅读仪上492nm波长下读取OD值。结果判定：若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。

2)制备兔猪圆环病毒2型高免血清用猪圆环病毒2型抗原，采用多点注射法免疫阴性家兔3只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血，分离血清，纯化后得兔抗猪圆环病毒2型IgG。

3)胶体金颗粒制备将氯化金(中国医药集团上海化学试剂公司)配制成0.01％水溶液，取100ml煮沸2min后，边搅拌边加入柠檬酸三钠(1％)2ml，煮沸至溶液颜色变成酒红色后，继续煮沸至适宜浓度(OD₅₃₅＝0.9312)，冷却后加入双蒸馏水恢复到原体积，置4℃保存。

4)胶体金标记ORF2蛋白制备及纯化将待标记蛋白倍比稀释，分别取100μl加入1ml胶体金中，10min后加入10％NaCl 100μl，4℃静止1h。取胶体金颜色没有发生改变的最高稀释倍数为准，在此基础上加30％为最佳标记量。取一定量调配好的胶体金用0.2mol/L K₂CO₃调至pH＝9.0，按最佳标记量加入表达抗原，室温作用20min，加入Tris-HCl(pH 8.0，20mmol/L)配制的BSA，使终浓度为1％，4℃放置2h后使用。将金标抗原3000r/min离心30min，取上清，60000g离心60min，沉淀用0.02mol/L pH7.2含0.1％BSA的PBS溶解，恢复到原体积。再超离1次，沉淀用少许上述PBS溶解，使OD₅₃₅nm＝1.5。0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。

5)试纸条的组成用喷膜机将胶体金标记蛋白复合物喷涂在胶体金结合垫上，将表达ORF2蛋白和兔抗猪圆环病毒2型IgG依次间隔4mm喷在硝酸纤维膜(NCM，上海华舜生物工程有限公司)上，分别作为检测带和质控带，将包被好的NCM放入含3％BSA的pH7.2，0.01M PBS中，过夜，封闭其余蛋白结合位点。倒掉封闭液，用pH7.2，0.01M PBS，洗2次，每次5min，37℃干燥1h备用。将硝酸纤维膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫等一次粘在PVC板上，即，将玻璃纤维连接在NCM上端，边缘并附着在NCM上；棉浆垫附着在玻璃纤维上，与NCM衔接；吸水滤纸板连接在NCM下端，边缘并附着在NCM上。将粘好的PVC材料切成60mm长、4mm宽的试纸条。即制成猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条。将试纸条密封于铝箔袋中，4℃保存。

(四)附图说明

图1是PCV_737-421重组克隆的PCR鉴定图；图中的数字分别表示：

1：DNA Marker DL 2000；

2：以pMDT-PCV_737-421为模板；

3：以pGEX-PCV_737-421为模板；

4：水对照。

图2pGEX-PCV_737-421限制性内切酶PCR鉴定图；图中的数字分别表示：

1：DNA Marker DL 15 000；

2：pGEX-PCV_737-421BamHI/SalI双酶切；

3：pGEX-6p-1BamHI/SalI双酶切；

图3：pGEX-PCV_421-37限制性内切酶PCR鉴定图

1：DNA Marker DL 15 000

2，3：EcoRI/SalI双酶切

4：EcoRI单酶切

图4pGEX-PCV_421-37的SDS-PAGE结果PCR鉴定图，图中箭头所指分别为

1：蛋白标准分子量，97、66、43、35、20、14kDa；

2：pGEX-6p-1载体中29kDa的GST蛋白；

3：pGEX-PCV_421-37中GST-PCV_421-37融合蛋白；

图5pGEX-PCV_737-421的SDS-PAGE结果PCR鉴定图；

1，2：pGEX-PCV_737-421经IPTG诱导后产生的GST-PCV_737-421蛋白(箭头所指)

3，4：未诱导的重组菌

图6是本发明试纸条的正面示意图；

图7是本发明试纸条的A-A向断面结构示意图；

图8是T、C两条带显色为阳性的检测结果示意图；

图9是C一条带显色为阴性的检测结果示意图；

图10是T、C两条带未显色为无效的检测结果示意图。

附图标记说明：吸水垫1；硝酸纤维膜2；含有胶体金标记抗原的玻璃纤维膜3；金标抗原保护膜4；反应支持物PVC板5：

在硝酸纤维膜上T区表示包被基因工程猪伪狂犬表达gE蛋白；C区表示包被兔抗猪伪狂犬IgG。

具体实施方式

2结果

1.3pMDT-PCV_737-421、pGEX-PCV_737-421重组克隆的构建

利用PCR从重组质粒pMDT-PCV中扩增了PCV2ORF2基因的氨基端部分片段。扩增结果显示，获得一条特异性的条带，与标准分子量比较，大约0.3kb，符合理论值大小。见图1，根据T-A原理将其回收产物与pMD18T连接后，通过BamHI和SalI双酶切质粒DNA，电泳出现2条带，分别为2.7kb和0.3kb，表明已成功将PCV_737-421插入克隆载体。再利用BamHI和SalI将PCV_737-421亚克隆入表达载体pGEX-6p-1，酶切产物经1％琼脂糖电泳显示，出现4.9kb的载体带和0.3kb的外源条带，表明构建成功重组表达质粒pGEX-PCV_737-421(见图2)。

2.2pMDT-PCV_737-421的序列分析

由于在获得PCV_737-421片段时是通过PCR扩增得来，为避免碱基错配需要测定序列。分析测序结果，重组DNA的最大读码框覆盖了整个序列，中间未出现无义突变，与亲本毒JXL株同源性达100％。核苷酸序列如下，起始密码子ATG以斜线表不：

PCV_737-421：

BamHI

GGATCCGATATGACGTATCTAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAGATTAAGGTTGAATTC

EcoRI

2.3pGEX-PCV_421-37重组克隆的构建

通过EcoRI和SalI双酶切含有完整PCV2ORF2基因的重组克隆pMDT-Cap，将其小片段与同样处理的表达载体pGEX-6p-1连接并转化宿主菌。通过EcoRI和SalI双酶切鉴定，得到4.9kb和0.4kb的2条带；经EcoRI单酶切获得5.3kb的条带。表明已成功构建pGEX-PCV_421-37重组克隆，见图3。

2.4pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37的诱导表达

将2种重组菌诱导表达，对菌体蛋白进行SDS-PAGE分析。与标准蛋白比较，以含载体pGEX-6p-1的大肠杆菌作为阴性对照，其诱导产物中明显出现了由载体编码的融合蛋白GST的29kDa条带，而在含pGEX-PCV_421-37(图4)和pGEX-PCV_737-421(图5)的重组菌菌体中，各出现一条位于43kDa和35kDa之间的额外条带。根据序列分析结果可知，PCV_737-421实际有324bp，编码蛋白实际分子量为13.9kDa，PCV_421-37有363bp，氨基酸实际分子量为15.2kDa，与载体所含GST(29kDa)融合表达后，外源蛋白的分子量均大约为40kDa。

2.5表达蛋白抗鼠血清的制备及IFA结果

将表达蛋白分别免疫小白鼠3次后，框下窦采血，析血清。用PBS 1∶20稀释，与PCV2JXL感染PK15细胞做IFA，暗视野下可见胞浆和胞膜特异性荧光，成空心圆型，偶尔也出现于胞核。用病毒接种细胞与1∶20稀释的正常BALB/c小鼠血清做IFA，或以PBS代替一抗与正常细胞作用，均无荧光出现，表明抗血清中含有抗病毒特异性抗体。见图6

2.6重组表达蛋白与PCV2感染猪血清的ELISA反应性

将pGEX-PCV_421-37和pPRO-Rep重组菌体蛋白经超声波破碎后，包被酶标板，与阳性血清和阴性血清做ELISA试验。通过比较OD₄₉₂时的P/N值，结果发现HRP标记羊抗鼠抗体的最佳作用浓度为1∶3000，而不同浓度的重组蛋白在与同一份1∶1000稀释的血清反应时，Cap部分基因(PCV_421-37)蛋白在1∶50、Rep蛋白在1∶50稀释时P/N值分别达到最高2.11、1.57，表明pGEX-PCV_421-37的反应原性较好，而Rep蛋白的表达量虽高，但免疫原性较差，几乎不具有区分抗体阳性血清的能力。

通过对的包被浓度进行摸索，结果在抗原1∶80稀释时，血清1∶750稀释时的反应孔显色最深，而在1∶1000时P/N比值最大，各自的P/N比值分别达4.29、4.80。上述结果表明pGEX-PCV_421-37蛋白与病毒多抗血清的反应原性较强。ELISA结果见表1。

表1 重组蛋白不同稀释度时与不同血清反应的OD₄₉₀值与P/N值

实施例：

本发明的猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条，其结构是由吸水垫1、硝酸纤维膜2、含有胶体金标记抗原的玻璃纤维膜3、金标抗原保护膜4、反应支持物PVC板5组成，其中，硝酸纤维膜2设置在反应支持物PVC板5的中间，硝酸纤维膜2上设置有两个显色区T和C，其中T区中包被有基因工程猪伪狂犬表达gE蛋白；C区包被有兔抗猪伪狂犬IgG，在硝酸纤维膜2T区的左端部上表面，设置有含有胶体金标记抗原的玻璃纤维膜3，含有胶体金标记抗原的玻璃纤维膜3上表面设置有金标抗原保护膜4，硝酸纤维膜2的右端C区的上表面设置有吸水垫1。

本发明产品的用法及用途

1)操作方法在检测前先将样本和试纸条放在室温条件下放置一段时间(10分钟)，使其恢复至室温；从铝箔袋中取出检测试纸条；在椭圆形加样孔内加入3-5滴(100-200ul)待检猪血液或血清样品；将试纸条平放在桌面上，在室温下静置20分钟判定结果。

2)结果判断

无效：如图10所示，在对照区(C)和检测区(T)都不出现色线；

阴性：如图9所示，在对照区(C)出现一条色线，在检测区(T)不出现色线；

弱阳性：在对照区(C)出现一条颜色较深的紫红色线，而在检测区(T)出现一条颜色很浅的紫红色线；

阳性：如图8所示，在对照区(C)和检测区(T)各出现一条颜色较深的紫红色线，样品中的抗体表达水平越高，检测区(T)色线颜色越深。

3)试纸条用途检测猪圆环病毒2型感染产生的抗体。

SEQUENCE LISTING

<110>曹莹莹

<120>猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

agcaagcttc tttcgttt 18

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

gggaattcaa ccttaatctt cctta 25

<210>3

<211>324

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>重组质粒

<400>3

ggatccgata tgacgtatct aaggaggcgt taccggagaa gaagacaccg cccccgcagc 60

catcttggcc agatcctccg ccgccgcccc tggctcgtcc acccccgcca ccgttaccgc 120

tggagaagga aaaatggcat cttcaacacc cgcctctccc gcaccttcgg atatactatc 180

aagcgaacca cagtcaaaac gccctcctgg gcggtggaca tgatgagatt caatattaat 240

gactttcttc ccccaggagg gggctcaaac ccccgctctg tgccctttga atactacaga 300

ataaggaaga ttaaggttga attc 324

Claims

1.猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法，其特征在于，利用基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白，采用酶联免疫原理和膜层析技术制成快速检测猪血液或血清中的抗体，猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和PVC板，按照顺序固定在PVC板上，PVC板一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维膜，另一端粘附吸水垫，其特征在于结合垫包被了基因工程表达的猪圆环病毒2型ORF2蛋白-胶体金结合物，将表达蛋白包被在硝酸纤维膜作为检测线(T)，将免抗猪圆环病毒2型抗体包被在硝酸纤维膜作为对照线(C)，制备步骤如下：

一、基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白制备

1)材料和方法：

1.1ORF2基因氨基端737-421nt的扩增：

CapL 5’AGC AAG CTT CTT TCG TTT TC3’，

PCVF 5’GGG AAT TCA ACC TTA ATC TTC CTT A 3’

上游引物下划线为HindIII序列，核酸位置739nt；下游引物下划线为EcoRI序列，位于423nt；

PCR反应条件为，94℃热启动5分钟，94℃变性60秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分钟，扩增产物即为PCV_737-421，经1％琼脂糖电泳；

1.2ORF2基因氨基端片段在pMD-18T中的克隆：

将扩增产物PCV_737-421利用胶回收试剂盒大量回收，利用T-A原理，与pMD-18T载体连接，转化DH5α感受态大肠杆菌，涂布于含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB片板，12小时后挑取典型白色单菌落少量培养，提质粒DNA。通过BamHI和EcoRI双酶切鉴定重组克隆，命名为pMDT-PCV_737-421；

1.3ORF2基因氨基端737-421nt在pGEX-6p-1中的克隆：

原核表达载体pGEX-6p-1是上游带有谷胱甘肽S转移酶GST部分基因的高效表达载体，用BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pMDT-PCV_737-421，得到2条条带，分别为载体2.7kb和插入片段0.3kb，回收其中0.3kb，用BamHI和EcoRI双酶切pGEX-6p-1，与带有相同粘端的PCV_737-421连接，转化大肠杆菌BL21感受态菌，氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落少量培养基过夜培养，小提质粒DNA，通过限制性内切酶鉴定重组质粒，得到重组克隆命名为pGEX-PCV_737-421；

1.4ORF2基因羧基端421-37nt在pGEX-6p-1中的克隆：

利用pMDT-Cap重组克隆中分别位于引物和载体序列的EcoRI和SalI位点，用EcoRI和SalI双酶切DNA pMDT-Cap，得到2条带，分别为3.0kb和0.4kb，其中3.0kb来自2.7kb的载体带与ORF2基因的氨基端737-421部分之和，0.4kb条带，即为ORF2基因的羧基端421-37nt部分PCV_421-37，大量回收，与同样用EcoRI和SalI双酶切的pGEX-6p-1载体连接，转化大肠杆菌BL21感受态菌，常规筛选重组克隆，得到pGEX-PCV_421-37；

1.5pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37的诱导表达：

按照载体说明书GST Gene Fusion System，第3版进行，将分别含有重组质粒pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37的新鲜大肠杆菌单菌落在2×YTA培养基中37℃振荡培养过夜，次日按1％体积比转接5ml新鲜培养基，37℃继续培养，当菌液OD₆₀₀值达0.6-0.8时，加入无菌IPTG溶液，使终浓度为0.1mmol/L。诱导3-4小时后停止培养，取1ml离心收集菌体，PBS(pH7.4)洗涤，用80μl PBS悬浮菌体，与20μl 5×SDS裂解缓冲液混合，煮沸变性5分钟。利用BioRAD公司的蛋白质电泳装置进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶的丙烯酰胺浓度为10％，将只含载体的大肠杆菌同样诱导做阴性对照，0.25％考马斯亮兰染色；

1.6pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37表达蛋白免疫鼠血清的制备：

分别大量诱导表达上述重组菌，将菌体用原培养液1/10体积的PBS重悬，超声波破碎至液体清澈，与5×SDS上样缓冲液煮沸变性5分钟，进行常规SDS-PAGE，电泳结束后，在考马斯亮蓝染液中染色2小时，再经脱色至背景清晰，用去离子水尽量洗去胶上的脱色液，再置胶于一干净玻片上，用干净刀片切下目的条带，放在1.5ml EP管中，尽量少混杂无关蛋白，-20℃冻存，免疫前，在冷冻状态下尽量碾碎胶条，用适量PBS重悬，至胶粒可通过10号注射器针头为宜，即为制备好的免疫原；

选择健康活泼的青年雌性BALB/c小鼠，分别腹腔注射上述制备的免疫物质，每只每次0.5ml，每次免疫间隔2-3周，各免疫5只小鼠，2免后每次免疫前框下窦采血约100μl，析血清，对PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)，观察有无特异性荧光染色；

1.7pGEX-PCV_42-37表达蛋白与PCV感染猪多抗血清的ELISA反应性：

将pGEX-PCV_421-37和pPRO-Rep重组菌大量诱导表达后，同上制备免疫原，按常规方法进行ELISA，用碳酸盐缓冲液pH＝9.6分别以1∶40、1∶80、1∶160、1∶200稀释后包被酶标板，每个稀释度3个重复孔，4℃过夜，弃去孔内的液体，同时用洗涤液PBST洗3次，每次5分钟，拍干，每孔加100μl封闭液37℃封闭2小时，同上洗涤，将PCV2阳性猪血清和分别用PBS按1∶250、1∶500、1∶750、1∶1000、1∶1500稀释，各稀释度重复3次，每孔加50μl，同时设SPF猪阴性血清对照和PBS空白对照，37℃作用2小时，洗涤，拍干，加用PBS配制的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，每孔50μl，37℃孵育1.5小时，洗涤，拍干，加底物液，每孔加新鲜配制的底物缓冲液50-100μl与9mg邻苯二胺混合后，临时加30％H₂O₂0.15ml，37℃静止10-30分钟，避光显色，当阴性孔即将显色时，以50μl 2mol/LH₂SO₄终止反应，在酶联免疫阅读仪上492nm波长下读取OD值，结果判定：若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则直接用肉眼观察结果；

2)制备兔猪圆环病毒2型高免血清

用猪圆环病毒2型抗原，采用多点注射法免疫阴性家兔3只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血，分离血清，纯化后得兔抗猪圆环病毒2型IgG；

3)胶体金颗粒制备

将氯化金配制成0.01％水溶液，取100ml煮沸2min后，边搅拌边加入1％柠檬酸三钠2ml，煮沸至溶液颜色变成酒红色后，继续煮沸至适宜浓度OD₅₃₅＝0.9312，冷却后加入双蒸馏水恢复到原体积，置4℃保存；

4)胶体金标记ORF2蛋白制备及纯化

将待标记蛋白倍比稀释，分别取100μl加入1ml胶体金中，10min后加入10％NaCl 100μl，4℃静止1h。取胶体金颜色没有发生改变的最高稀释倍数为准，在此基础上加30％为最佳标记量，取一定量调配好的胶体金用0.2mol/L K₂CO₃调至pH＝9.0，按最佳标记量加入表达抗原，室温作用20min，加入Tris-HCl(pH 8.0，20mmol/L)配制的BSA，使终浓度为1％，4℃放置2h后使用。将金标抗原3000r/min离心30min，取上清，60000g离心60min，沉淀用0.02mol/L pH7.2含0.1％BSA的PBS溶解，恢复到原体积。再超离1次，沉淀用少许上述PBS溶解，使OD₅₃₅nm＝1.5。0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用；

5)试纸条的组成

用喷膜机将胶体金标记蛋白复合物喷涂在胶体金结合垫上，将表达ORF2蛋白和兔抗猪圆环病毒2型IgG依次间隔4mm喷在硝酸纤维膜NCM上，分别作为检测带和质控带，将包被好的NCM放入含3％BSA的pH7.2，0.01M PBS中，过夜，封闭其余蛋白结合位点，倒掉封闭液，用pH7.2，0.01M PBS，洗2次，每次5min，37℃干燥1h备用，将硝酸纤维膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫等一次粘在PVC板上，即，将玻璃纤维连接在NCM上端，边缘并附着在NCM上；棉浆垫附着在玻璃纤维上，与NCM衔接；吸水滤纸板连接在NCM下端，边缘并附着在NCM上，将粘好的PVC材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即制成猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条，将试纸条密封于铝箔袋中，4℃保存；

6)扩增核苷酸序列

由于PCV_737-421片段是通过PCR扩增得来，分析测序结果是重组DNA的最大读码框覆盖了整个序列，中间未出现无义突变，与亲本毒JXL株同源性达100％，因此核苷酸序列表示如下，起始密码子ATG以斜线表示：

PCV_737-421：

BamHI

EcoRI。

2.猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条，其特征在于，包括吸水垫、硝酸纤维膜、含有胶体金标记抗原的玻璃纤维膜、金标抗原保护膜、反应支持物PVC板，其中，硝酸纤维膜设置在反应支持物PVC板的中间，硝酸纤维膜上设置有两个显色区T和C，其中T区中包被有基因工程猪伪狂犬表达gE蛋白；C区包被有兔抗猪伪狂犬IgG，在硝酸纤维膜T区的左端部上表面，设置有含有胶体金标记抗原的玻璃纤维膜，含有胶体金标记抗原的玻璃纤维膜上表面设置有金标抗原保护膜，硝酸纤维膜的右端C区的上表面设置有吸水垫。