JP5670634B2 - タンパク質性物質の粒子の製造方法 - Google Patents
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Description
タンパク質の性質
本発明の方法で使用されるタンパク質は、球状タンパク質、及び繊維タンパク質又は構造タンパク質を含む。
b)アルブミン分子中に存在する遊離スルフヒドリル基は、治療薬又はイメージング造影剤への選択的結合のための手段を与える;
c)アルブミン分子中に存在するペンダントアミノ基(特にリジン残基)及びまた多くのカルボキシル基を有する多くのアミノ酸残基は、アミド結合の形成を介してアルブミン分子間の効率的な共有結合を与える;
d)ペンダントアミノ基及び比較的多くのカルボキシル基を有する多くのアミノ酸残基はまた、体内への送達のための物質の結合部位を与えるのに有用である。
本発明の方法は適切な媒体(これは最も一般的には、水性媒体、好ましくは緩衝液)中で行われる。1つの適した緩衝液は、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)である。他の従来の媒体もまた使用される。
ゼロ長架橋剤は、架橋産物中に他の成分を添加することなく(すなわち、粒子は合成スペーサーを含まないが、その代わりに直接結合されるタンパク質分子を含む)、タンパク質分子間の架橋を促進するために使用される。種々のゼロ長架橋剤化学物質又は試薬が使用され、以下のものが例として提供されるが、これらに限定されることを意図していない。
a)1級又は2級アミンとアルデヒド基との還元アミノ化により作成される2級又は3級アミン結合;及び
b)1級アミンとカルボン酸との縮合により作成されるアミド結合。
a)カルボジイミド;
b)Woodward's試薬K(N−エチル−3−フェニルイソキサゾリウム−3’−スルホネート);及び
c)N,N−カルボニルジイミダゾール。
反応温度と反応時間は両方とも、生じるタンパク質粒子のサイズに影響を与える変数である。
タンパク質粒子の体内への送達のための物質の結合は、任意の多くの手段により行われ、特に物質の性質とタンパク質粒子の性質に依存する。しかし一般に結合は、タンパク質粒子と物質との共有結合、又はタンパク質粒子と結合成分(物質自体と化学的又は物理的結合を形成することができる)との共有結合の生成を含む。
1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−N,N’,N”,N'''−四酢酸(DOTA)
1,4,8,11−テトラアザシクロドデカン−N,N’,N”,N'''−四酢酸(TETA)
本発明の粒子又は結合体は、一般に医薬的に許容し得る媒体を含む製剤として体内に投与される。かかる製剤は、無菌の即時使用可能な溶液として医師に供給されるか、又は粒子もしくは結合体は凍結乾燥され、次に使用前に適当な溶液で復元される。例えば凍結乾燥タンパク質粒子は放射活性標識物の溶液と混合されて、使用前に液体媒体中の必要な結合体製剤が生成される。
以下の例と添付FMNを参照して、本発明の実施例を、例示のみを目的として詳細に説明する。
タンパク質粒子を生成するためのrHAの架橋
調製されたrHA(約20%(w/v)rHA、32mMオクタン酸塩、145mM Na+、15mg/l ポリソルベート80、pH7.0)を、記載の緩衝液で記載のrHA濃度に希釈した。記載の濃度でEDC又はEDC+NHSを加え、試料を混合し、室温(約20℃)で記載の時間インキュベートした。
過剰の反応物を除去するために、架橋したrHAをセファデックスクロマトグラフィーにより脱塩した。特に明記しない場合は脱塩は、0.9%(w/v) NaCl、15mM Na2HPO4、5mM NaH2PO4で行った。
適宜架橋rHAを約45℃で記載の時間インキュベートして熱処理し、次に適宜、繰り返し脱塩工程により処理した。
GPHPLCはTSKgelG3000SWXL 0.78×30cm分析カラムとガードカラムをPBSで1ml/分で流し、溶出液を280nmで追跡した。試料をPBSで適切に希釈し、10〜25μlを注入した。
Novex 4〜12%トリスグリシンゲル(Invitrogen Ltd, 3 Fountain Drive, Inchinnan Business park, Paisley PA4 9RF, United Kingdom)を製造業者の説明書に従って使用して、PBSで適切に希釈した試料を用いて未変性PAGEを行った。ゲルをGelCode Blue(Pierce Biotechnology, Inc. 3747 N Meridian Rd, PO Box 117, Rockford, IL 61105, USA)を用いて製造業者の説明書に従って染色した。
ブランクと試料を0.1Mトリス塩酸、0.01M EDTA(pH8)で1mlにして、A412を測定した。0.05Mリン酸ナトリウム(pH7)中の50μlの0.01M 5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)を加え、室温で10分後A412を測定した。チオール含量は、ε412=13600M-1cm-1を使用して計算した。
試料をPBSで1〜5mg/ml rHAに希釈し、0.2μmろ過した後、Malvern Zetasizer Nano Sを使用して低容量ディスポーザブルキュベットを用いて三重測定で分析した。分散光強度に基づく平均粒子サイズとサイズ分布の標準偏差とを、Malvern Dispersion Technology Software v4.10を使用して決定した。
試料を脱塩しPBSで適切に希釈後、タンパク質結合メソトレキセート(MTX)濃度を、既知濃度のMTX溶液との比較によりA373測定で決定した。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、0、15、30、及び45mM EDC、15mM EDC+5mM NHSを用いて2時間の反応時間で架橋を行った。生成物を図1に示すようにGPHPLCにより分析した。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、15mM EDC+5mM NHSを用いて2時間の反応時間で架橋を行った。架橋した生成物(タンパク質粒子を含む)を水で脱塩し、SnCl2、Na2HPO4、グルコース、及びPluronic F68を加えて調製し、凍結乾燥した。各段階の生成物をGPHPLCにより分析し、その結果を図2に示すが、これは、脱塩、調製、及び凍結乾燥がタンパク質粒子に大きな影響を与えないことを示す。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、0、15、30、45、75、105、及び150mM EDC、15mM EDC+5mM NHSを用いて2時間の反応時間で架橋を行った。生成物を未変性PAGEにより分析し、結果を図3に示す。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、15mM EDC+5mM NHSを用いて2時間の反応時間で架橋を行った。架橋した生成物(水で脱塩した)は、出発rHAの0.64モル/モルと比較して、0.04モル/モルの遊離チオールレベルを示した。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、15mM EDC+5mM NHSを用いて2時間の反応時間で架橋を行った。架橋した生成物を脱塩し、記載の時間熱処理し、遊離チオールアッセイのためにアリコートを取った。結果を図4に示す。明らかなように、熱処理時間16時間及びそれ以上で、遊離チオール含量は実質的にrHA出発物質の含量に戻った。
a)[EDC]、[NHS]と時間
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、EDC濃度が、15、30、75、150、及び300mMで、それぞれ0、1、5、及び20mM NHSを用いて架橋を行った。ゲルを形成しなかったすべての試料を、2時間と22時間の反応時間で未変性PAGEにより分析した−図5を参照。これは、より長い反応時間でより多量のタンパク質粒子が生成したことを示す。
PBSで希釈した10、20、50、及び100mg/ml rHAで、それぞれEDC濃度が、15、30、75、150、及び300mMで架橋を行った。ゲルを形成しなかったすべての試料を、2時間と22時間の反応時間で未変性PAGEにより分析した−図6を参照。
0.9%(w/v) NaCl、20mM MES、又は0.9%(w/v) NaCl、20mM EPPSもしくはPBSで希釈して、100mg/ml rHAを調製した。MES試料のアリコートをほぼpH5.5とpH6.5に調整した。EPPS試料のアリコートをほぼpH7.5とpH8.5に調整した。75mM EDCと15mM EDC+5mM NHSを用いて2時間の反応時間で架橋する前に、実際の出発pHを測定した。ゲルを形成しなかったすべての試料を未変性PAGEにより分析した−図7を参照。結果は、架橋は7未満のpH値でより効率的であることを示す。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、15mM EDC+5mM NHSと75mM EDCを用いて2時間の反応時間で架橋を行った。架橋した生成物を未変性PAGEと光散乱により、rHA出発物質と比較して分析した。未変性PAGEの結果を図8に示し、光散乱分析により測定した粒子サイズ分布を図9に示す。結果は、5mM NHSと15mM EDCのみの使用が、75mM EDC単独の使用と匹敵する結果を与えたことを示す。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、15mM EDC+5mM NHSと75mM EDCを用いて2時間の反応時間で架橋を行った。架橋した生成物を脱塩し、熱処理し、再度脱塩した。遊離チオールレベルは熱処理で、EDC+NHSについて0.03から0.54モル/モルに上昇し、EDC生成物について0.02から0.50モル/モルに上昇した。熱処理前と後の脱塩した生成物を未変性PAGE、GPHPLC、及び光散乱により、rHA出発物質と比較して分析した。
PBSで希釈した20、50、及び100mg/ml rHAで、それぞれ10mM EDC+5mM NHS、15mM EDC+5mM NHS、25mM EDC+5mM NHS、及び50mM EDC+5mM NHSを用いて2時間の反応時間で架橋を行った。ゲルを形成しなかったすべての試料を脱塩し、熱処理し、再度脱塩した。生成物の粒子サイズ分布を光散乱により分析した。結果を表1に示す。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、それぞれ15、25、及び35mM EDCでそれぞれ2、5、10、及び20mM NHSを用いて、2時間の反応時間で架橋を行った。ゲルを形成しなかったすべての試料を脱塩し、熱処理し、再度脱塩した。生成物の粒子サイズ分布を光散乱により分析した。結果を表IIに示す。
rHAについて記載した方法を使用して、組換えトランスフェリン(rTF)を架橋した。架橋はPBSで希釈した100mg/ml rTFで、15、25、及び35mM EDCでそれぞれ5mM NHSを用いて、1、2、又は4時間の反応時間で行った。ゲルを形成しなかったすべての試料を脱塩し、光散乱により分析した。結果を表IIIに示す。
アポリポタンパク質A−1(ApoA−1)を、PBS中の50mg/ml ApoA−1で、25mM EDCと5mM NHSを用いて、1、2、及び4時間の反応時間で架橋した。すべての試料を脱塩し、光散乱により分析し、出発ApoA−1と比較した。結果を表IVに示す。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、25mM EDC+5mM NHS、9.8mM MTX(6.5モル/モル rHA)を用いて、2時間の反応時間で、メソトレキセート(MTX)の存在下でのrHAの架橋を行った。架橋した生成物を脱塩し、タンパク質結合MTXについて分析し、光散乱により出発rHAと比較して分析した。生成物は2.3モル/モル rHAの濃度でMTXに結合し、平均直径が37.9nmで標準偏差が22.6nmであった。比較された、rHA出発物質は平均直径が8.24nmで標準偏差が2.44nmであった。
PBSで希釈した100mg/ml rHAで、25mM EDC+5mM NHSを用いて2時間の反応時間で、rHAの架橋を行った。架橋した生成物を脱塩し、22時間熱処理し、再度脱塩し、限外ろ過により20mg/ml rHAに濃縮した。
6mlの20mg/ml架橋rHA(実施例14参照)に0.4g DTPA無水物を30分かけて絶えず攪拌しながら、5M NaOHの添加によりほぼpH8を維持することにより、架橋rHAへのジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)の結合を行った。最後の添加後30分間攪拌を続け、試料を3M HClでpH7に調整し、0.9%(w/v) NaClで脱塩した。
PBSで希釈した100mg/ml rHA、0.1M WRKを用いて30分の反応時間で、Woodward's試薬K(WRK)を使用する架橋を行った。架橋した生成物をPBSで希釈し、光散乱により、出発rHAと比較して分析した。生成物は平均直径が13.5nmで標準偏差が5.76nmであった。比較してrHA出発物質は平均直径が8.42nmで標準偏差が2.87nmであった。
PBSで希釈した100mg/ml rHA、0.5M CDIを用いて、N,N−カルボニルイミダゾール(CDI)を使用する架橋を行った。反応は完了するまで行った。架橋した生成物をPBSで希釈し、光散乱により、出発rHAと比較して分析した。生成物は平均直径が50.7nmで標準偏差が26.0nmであった。比較してrHA出発物質は平均直径が8.42nmで標準偏差が2.87nmであった。
Claims (24)
- タンパク質粒子の製造方法であって、8mg/ml以上の濃度で液体媒体中に分散されたタンパク質分子が2〜100mMの濃度のゼロ長架橋剤の存在下で反応することを引き起こすか又は可能にして、互いに共有結合されている状態のタンパク質分子を含むタンパク質粒子を製造することを含んでなり、
前記タンパク質粒子が10nm〜200nmの平均粒子サイズを有しており、前記タンパク質分子が、アルブミン、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロイン、フィブリン、フィブロネクチン、トランスチレチン、フィブリノゲン、トロンビン、トランスフェリン、アポリポタンパク質A−1、ラクトフェリン、抗体又は融合タンパク質から成る群から選択される1又は複数のタンパク質であり、そして前記タンパク質粒子が、当該粒子を形成するタンパク質分子以外の物質を含まない、方法。 - 前記タンパク質粒子が可溶性粒子である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質分子がゼロ長架橋剤の存在下で1〜12時間反応することができる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記液体媒体が有機溶媒を含まない、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記液体媒体が界面活性剤を含まない、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質分子はアルブミン分子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質分子はトランスフェリン分子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質分子はアポリポタンパク質A−1分子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質分子はラクトフェリン分子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質分子は抗体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質分子は融合タンパク質である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 融合タンパク質はヒト血清アルブミンと別のタンパク質又はポリペプチドとの融合タンパク質である、請求項11に記載の方法。
- タンパク質分子は組換え産物である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質分子は組換えヒト血清アルブミン分子である、請求項13に記載の方法。
- タンパク質の濃度が、8mg/ml〜500mg/mlである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- ゼロ長架橋剤が、カルボジイミド、Woodward's試薬K、及びN,N−カルボニルイミダゾールよりなる群から選択される、請求項1〜15のいずれか1項に方法。
- ゼロ長架橋剤はカルボジイミドである、請求項16に記載の方法。
- カルボジイミドは1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドである、請求項17に記載の方法。
- ゼロ長架橋剤の濃度は、5mM〜100mMの範囲である、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 反応は、N−ヒドロキシスクシンイミド又はN−ヒドロキシスルホスクシンイミドの存在下で行われる、請求項17又は請求項18に記載の方法。
- N−ヒドロキシスクシンイミド又はN−ヒドロキシスルホスクシンイミドの濃度は、1mM〜50mMである、請求項20に記載の方法。
- 液体媒体は水性である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 水性液体媒体は緩衝液である、請求項22に記載の方法。
- 媒体のpHは3.0〜8.5の範囲である、請求項22又は請求項23に記載の方法。
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