KR20090039751A - 단백질성 물질의 입자를 제조하기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

단백질 입자는 8mg.mL-1 이상의 농도로 액체 매질에 분산된 단백질 분자들이 제로-길이 가교제의 존재하에서 반응하도록 야기 또는 허용하여, 함께 공유 결합된 단백질 분자들을 포함하는 단백질 입자를 생성함으로써 제조된다. 단백질 입자는 서브-마이크론 범위 내의 크기로 생성될 수 있으며, 이때 크기 및 크기 분포는 엄밀하게 한정된다. 입자는 많은 분야에서의 용도를 가지지만, 특히 치료제 및 다른 제제, 예컨대 영상 조영제를 신체에 송달하는데 유용하다.
단백질 입자

Description

단백질성 물질의 입자를 제조하기 위한 방법{PROCESS FOR PREPARING PARTICLES OF PROTEINACEOUS MATERIAL}
본 발명은 단백질성 물질의 입자를 제조하기 위한 방법, 및 크기 범위가 한정된 단백질성 물질의 입자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 제제의 예컨대 신체에 대한 송달을 위한 단백질성 물질의 입자의 용도에 관한 것이다. 이러한 제제는 치료제 또는 의학 영상 기술에 사용하기 위한 영상 조영제가 될 수 있다. 예를 들면, 의학 영상, 예컨대 골수 및 림프관 스캐닝에 사용하기 위해 입자를 방사성 동위원소로 표지할 수 있다. 단백질성 물질 자체가 치료상 이익을 가질 수 있으며, 이 경우 본 발명에 따른 입자의 형성은 체내에서 단백질성 물질의 송달 향상 또는 체류시간 연장을 가져올 수 있다.
림프계의 기능성 연구를 위한 콜로이드 물질의 용도가 잘 알려져 있다. 방사성 나노콜로이드는 일부 암의 전이 확산의 연구에서 '감시 림프절'의 확인을 포함하여, 골수 스캐닝, 염증 영상 및 림프 배수 조사를 위한 핵의학에 사용된다. 테크네튬-99m (99mTc) 콜로이드 알부민 제형 (예를 들면 95%의 입자가 직경이 ≤80nm인 상품명 NANOCOLL 및 평균 입자 크기가 500nm인 것으로 기재된 상품명 ALBURES로 판 매되는 것) 및 99mTc으로 표지된 여러가지 황화 콜로이드를 포함하는, 한정된 수의 제품만이 시중에서 입수가능하다.
시중의 제형간 입자 크기 및 입자 크기 분포의 차이는 흡수, 생체 분포 및 클리어런스와 같은 생체내에서 나타나는 차이의 기초이다. 예를 들면, 입자 크기는 입자가 림프절에 함입되는 효율에 영향을 미칠 것이다.
따라서, 크기가 서브-마이크론 범위인 입자(나노입자)를 엄밀하게 한정된 크기 및 크기 분포로 제조하는 것이 바람직하다.
그러므로, 본 발명의 목적은 평균 입자 크기 및 크기 분포가 엄밀하게 한정된 나노입자의 개선된 제조방법을 제공하는 것이다. 이러한 입자는 예컨대 핵영상 용도에 사용하기 위해 방사성의약품과 결합하였을 때, 신체에 치료제 또는 다른 제제의 송달, 또는 체내에서 단백질성 물질의 체류 시간 연장에 특히 유용할 수 있다.
단백질 입자는 소위 제로-길이 가교제(zero-length crosslinker)를 사용하여 함께 연결할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 이러한 화학 물질은, 예를 들면 US-A-2005/0036946에 개시되어 있으며, 이 문헌은 고체형 겔을 형성하기 위한 화학적으로 변성된 알부민의 가교를 설명한다. WO-A-00/67774는 단백질의 비특정 혼합물의 가교를 설명한다. 가교 이전에 단백질은 산성화, 비수성 용매의 첨가 및 상승된 온도로 가열에 의해 불용성으로 되고 변성된다. 생성물은 저속 원심분리에 의해 회수할 수 있고 주사를 허용하기 위해 균질화가 필요하며, 이것은 생성물이 불용성이고 입자 크기가 다소 크다는 것을 나타낸다. 마찬가지로, WO-A-97/36614는 4mg.mL-1의 농도에서 단백질 A의 가교를 개시한다. 유사하게, Winkelhake et al, Physiol Chem & Phys 10 (1978), 305-322는 5mg.mL-1의 농도에서 소혈청 알부민의 가교를 개시한다. 알부민의 가교는 생성물을 실란트로서 사용하는 WO-A-01/45761에도 설명되어 있으며, 이것은 생성물이 거시적 고체 구조의 형태를 가져야 한다는 것을 나타낸다.
발명의 개요
발명자들은 종래 기술에 개시된 것보다 고농도의 단백질에서 제로-길이 가교제의 사용이 단백질 나노입자의 형성을 유도하고, 적절한 반응 조건의 제어에 의해 얻어지는 입자의 평균 입자 크기 및 크기 분포를 엄밀히 제어할 수 있다는 것을 처음 발견하였다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 단백질 입자의 제조방법을 제공하며, 이 방법은 8mg.mL-1 이상의 농도로 액체 매질에 분산된 단백질 분자들이 제로-길이 가교제의 존재하에서 반응하도록 야기 또는 허용하여, 함께 공유결합된 단백질 분자들을 포함하는 단백질 입자를 생성하는 단계를 포함한다.
"입자"는 서로 공유결합된 복수의 단백질 분자들을 포함하는 결합체 또는 응집체를 의미한다. 입자는 적합한 매질에 분산되었을 때 식별가능한 분리상으로서 존재할 수 있거나, 또는 매질 내에서 이들의 존재가 육안으로 보이지 않을 수 있으며, 이 경우 입자는 가용성 입자로 간주될 수 있다. 따라서 용어 입자는 고체형 입자 및 통상의 용액과 유사한 형태로 존재하는 입자를 모두 포괄하도록 의도된다.
"제로-길이 가교제"는 단백질 분자 상의 기들의 반응을 이들 기 사이에 삽입되는 어떤 화학적 부분 또는 "스페이서" 없이 촉진하는 화합물을 의미한다.
본 발명의 방법에서 함께 공유결합되는 단백질 분자들은 단일 단백질의 분자가 가장 바람직하다. 대안적으로, 단백질 입자는 2개 이상의 상이한 단백질의 혼합물로부터 형성될 수 있다.
본 발명의 방법은 적합한 매질에서 행해지며, 가장 일반적으로는 수성 매질이다. 바람직하게는 매질은 버퍼 용액일 것이고, 따라서 본 방법은 버퍼 용액에 단백질 분자 및 제로-길이 가교제를 분산시키는 단계를 포함한다.
일반적으로 단백질 분자와 제로-길이 가교제의 반응 후 생성물을 정제한다. 통상적으로 정제는 과잉의 시약의 제거를 포함하며, 어느 공지된 방법, 예컨대 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 행할 수 있다. 열처리 단계가 어느 결합된 가교제를 가수분해하기 위해 포함될 수 있으며, 방출된 종은 그 후 공지된 방법, 예컨대 컬럼 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 단백질 입자의 평균 크기를 제어하는 방식으로 반응 조건을 제어할 수 있기 때문에 유리하다. 또한, 입자 크기 분포의 폭이 비교적 좁아서, 입자의 특성 중에서 균일도를 비교적 높게 할 수 있다.
한 적합한 입자 크기 측정방법은 광산란이고, 본원에서 입자 크기에 대한 언급은 이러한 방법으로 측정한 입자 크기를 말하는 것으로 이해할 수 있다. 예컨대, 입자 크기는 Malvern Zetasizer Nano S (Malvern Instruments Ltd, Enigma Business Park, Grovewood Road, Malvern, Worcestershire WR14 1XZ, United Kingdom 제품)를 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 기기에 의해 생성된 데이터는 입자 크기의 함수로서 산란광의 강도 환산에 의하여 가장 편리하게 표현된다. 평균 입자 크기 및 표준 편차는 제조자에 의해 공급되는 제공된 소프트웨어를 사용하여 자동으로 산출할 수 있다.
입자 크기 분포의 측정에 있어서, 피크는 {X(i),Y(i); i= i1..i2}으로 정의될 수 있고, 이때 Y(i)는 크기 부류 i의 강도 %이고, X(i)는 크기 부류이다. 곡선 아래의 총면적, 평균 입자 크기(μ) 및 표준 편차(σ)는 하기와 같다:
Figure 112009007723855-PCT00001
Figure 112009007723855-PCT00002
Figure 112009007723855-PCT00003
따라서, 본 발명의 제2 양태에 따르면, 단백질 분자 상의 관능기 사이의 공유결합에 의해 직접 함께 연결된 단백질 분자들을 포함하는 단백질 입자가 제공되며, 여기서 단백질 입자는 평균 입자 크기가 200nm 미만, 보다 바람직하게는 150nm 미만, 또는 100nm, 80nm, 50nm, 40nm, 30nm 또는 20nm 미만이다. 바람직하게는, 입자 크기 분포의 표준 편차는 평균 입자 크기의 100% 미만, 또는 80% 미만 또는 60% 미만이다. 입자 크기의 표준 편차는 평균 입자 크기의 50% 미만, 또는 40% 미만일 수 있다.
본 발명에 따른 입자는 평균 입자 크기가 5μm 이상, 또는 10μm, 20μm, 30μm, 40μm, 50μm, 70μm 이상 또는 100μm 이상일 수 있다.
언급할 수 있는 특정한 평균 입자 크기 범위는 (a) 소형 입자에 대하여 5nm 내지 50nm, 또는 10nm 내지 40nm, 10nm 내지 30nm, 또는 10nm 내지 20nm; (b) 중간 크기 입자에 대하여 10nm 내지 100nm, 또는 20nm 내지 80nm, 또는 20m 내지 50nm; 그리고 (c) 대형 입자에 대하여 50nm 내지 200nm, 또는 50nm 내지 150nm, 또는 50nm 내지 130nm이다.
200nm 보다 작은 입자 크기의 나노입자, 특히 평균 입자 크기가 130μm 미만인 것은 0.2μm 여과에 의해 살균할 수 있는 점에서 특히 유용하다. 이것은 물질의 현저한 손실없이 간단한 살균을 가능하게 하는 점에서 제조 및 공정상 중요한 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 입자는 입자가 형성되는 단백질 분자 및 어떤 치료제 또는 입자가 물리적으로 또는 화학적으로 결합되는 다른 제제 이외의 물질을 함유하지 않거나 또는 실질적으로 함유하지 않는 것이 특히 바람직하다. 특히, 입자는 함께 직접 연결된 단백질 분자들의 잔기를 단백질 분자 자체 상의 관능기 사이의 공유결합에 의해 포함하므로, 입자는 가교제 등으로부터 유래하는 중간 연결기 또는 스페이서기를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 간단하며 용매 또는 계면활성제를 필요로 하지 않는 단일상 반응을 포함한다. 입자의 평균 크기는 설정한 반응 조건하에서 재현가능한 소수의 변수, 평균 크기 및 크기 분포의 조정에 의해 용이하게 변화될 수 있다. 또한, 방법의 간단함은 규모 확대를 용이하게 한다. 본 발명의 방법은 가교제의 제로-길이 성질이 입자가 합성 스페이서를 함유하지 않는다는 것을 의미하는 점에서 추가적으로 유리하다. 그러므로 치료상 또는 기능상 이점이 없고 해가 될 수 있는 추가 성분 또는 추가 성분의 잔기의 존재를 방지한다.
다른 용도 중에서, 본 발명의 단백질 입자는 영상 조영제에 결합했을 때 의료 영상 용도로 특히 유용하다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면 의료 영상에 사용하기 위한 콘쥬게이트를 제공하며, 이 콘쥬게이트는 영상 조영제 또는 그것의 전구체에 콘쥬게이트되는 본 발명의 제1 양태의 방법에 의해 형성된 단백질 입자, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 단백질 입자를 포함한다.
"의학 영상"은 진단, 연구 또는 치료를 목적으로 사람 또는 동물 신체의 내부 영역을 시각화하는데 사용하는 어떤 기술을 의미한다. 이러한 기술은 X선 영상, 자기 공명 영상(MRI), 핵영상 및 양전자 방출 단층 촬영(PET), 그리고 초음파 기술도 포함하지만, 마지막으로 열거된 것은 본 발명과 관련하여 중요성이 적다. 이러한 기술을 향상시키는데 유용한 제제는 신체 내의 특정 장소, 기관 및 질병의 시각화를 가능하게 하고, 및/또는 영상 기술에 의해 발생된 영상의 품질을 일부 개선시키고 이들 영상의 개선된 또는 용이한 해석을 제공하는 물질이다. 이러한 제제는 본원에서 영상 조영제로서 언급되며, 이들 용도는 영상의 상이한 영역 사이의 "대비"를 증가시킴으로써 영상의 상이한 부분의 구별을 용이하게 한다. 따라서 용어 "영상 조영제"는 이러한 제제의 부재하에서도 발생될 수 있는 영상의 품질을 향상시키는데 사용하는 제제(경우에 따라, 예컨대 MRI에서), 및 영상의 발생을 위한 필요조건인 제제(경우에 따라, 예컨대 핵영상에서)를 포괄한다.
영상 조영제의 "전구체"는 그 자체가 영상 조영제로서 유효하지 않지만 사용 전에 어떤 다른 종과의 반응 또는 혼합에 의해 유효하게 될 수 있는 부분을 의미한다. 이러한 전구체의 예는 금속 이온과 물리적 결합을 형성하여 영상 조영제로서 기능하는 금속 킬레이트를 형성할 수 있는 금속-킬레이팅 부분이다.
본 발명에 사용할 수 있는 MRI 조영제는 금속 이온, 그 중에서도 가돌리늄을 포함한다. 이러한 이온은 단백질 입자에 공유 결합된 킬레이팅 부분을 통해 단백질 입자에 연결될 수 있다.
유사하게, 핵영상에 유용한 금속, 예컨대 99mTc, 201Tl 및 111In도 담체 물질에 직접 또는 간접적으로, 예컨대 킬레이팅 부분을 통해 연결될 수 있다. 골수 스캐닝 및 염증 스캐닝 용도, 및 특히 림프계의 스캐닝에 나트륨 퍼테크니테이트 (99mTc)를 사용한 표지화가 특히 유용하다.
유사한 방식으로, 본 발명의 단백질 입자는 신체에 치료제와 같은 다른 제제를 송달하는데 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 치료제에 콘쥬게이트된 본 발명의 제1 양태의 과정에 의해 형성된 단백질 입자, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 단백질 입자를 포함하는 콘쥬게이트를 제공한다.
본 발명에 따른 입자 또는 콘쥬게이트는 일반적으로 약학적으로 허용가능한 액체 매질를 포함하는 제형으로서 신체에 투여될 것이다. 그 매질은 일반적으로 수성 매질, 가장 일반적으로 적절한 부형제를 함유하는 수성 매질일 것이다. 이러한 부형제는 하나 이상의 장성 조절제, 보존제, 계면활성제 및 다른 종래의 약학적 부형제를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 정의한 바와 같은 단백질 콘쥬게이트를 포함하는 제형을 약학적으로 허용가능한 액체 매질와의 혼합물로 제공한다.
발명의 상세한 설명
단백질의 성질
본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있는 단백질은 구상 단백질 및 섬유상 또는 구조 단백질을 포함한다.
단백질은 가장 바람직하게는 단일의, 완전한 또는 실질적으로 완전한 단백질 분자이다.
단백질 분자는 대안적으로 완전한 단백질 분자의 단편이 될 수 있으며, 이것은 자연-발생 단백질 분자에서 발견되는 아미노산의 서열에 대응하는 아미노산의 서열을 포함하는 분자를 의미하고 길이가 짧다. 그러나 이러한 단편은 자연-발생 단백질 분자 길이의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 길이를 갖는 아미노산의 서열을 포함하는 것이 바람직하며, 이들은 자연-발생 단백질 분자의 상응하는 부분과 80%, 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는다.
또한 단백질 분자는 자연-발생 단백질의 유도체 또는 돌연변이가 될 수 있다.
구상 단백질의 예는 합성 또는 천연 혈청 단백질, 및 그것의 염 및 천연 또는 합성 유도체 (예컨대, 효소적으로, 화학적으로, 또는 다른 방법으로 변성, 절단, 축소 또는 가교, 산화 또는 가수분해된 유도체 또는 그것의 서브유닛)을 포함한다. 섬유상 또는 구조 단백질의 예는 합성 또는 천연 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 피브린 및 피브로넥틴, 및 그것의 천연 또는 합성 유도체를 포함한다. 혈청 단백질의 예는 알부민, 트랜스티레틴, 피브리노겐, 트롬빈 및 트랜스페린을 포함한다. 언급할 수 있는 다른 단백질은 아포리포단백질 A-1, 락토페린 및 항체를 포함한다. 또한 단백질은 융합 단백질, 즉 다른 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그것의 단편 또는 변형물)에 융합된 사람 혈청 단백질과 같은 제1 단백질(또는 그것의 단편 또는 변형물)을 포함하는 재조합 생성물이 될 수 있다. 융합 단백질은 일반적으로 제1 단백질 및 다른 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 인접한 DNA 를 사용하는 재조합 방법에 의해 제조된다. 알부민 융합 단백질의 예는 WO-A-90/13653, WO-A-01/79271 및 WO-A-060071에 개시되어 있으며, 각각은 본원에 참고자료로 포함된다. 트랜스페린 융합 단백질의 예는 WO-A-2004/020454, WO-A-2004/020405 및 WO-A-2006/096515에 개시되어 있으며, 각각은 본원에 참고자료로 포함된다.
하기 설명하는 이유에 근거하여 본 발명의 방법에 사용하기 위한 특히 바람직한 단백질은 알부민이다.
콘쥬게이트를 사람 신체에 투여하고자 하는 경우, 단백질은 사람 기원, 즉 실제로 사람으로부터 유도된 것이거나, 또는 사람 기원의 단백질과 구조가 동일(또는 실질적으로 동일)한 것이 바람직하다. 따라서 특히 바람직한 단백질은 사람 혈청 알부민이다. 특정 용도에 대하여, 비-사람 알부민, 특히 포유류 알부민, 예컨대 소 혈청 알부민, 말 혈청 알부민 및 개 혈청 알부민을 사용할 수 있다.
사람 혈청 알부민은 혈청-유래, 예컨대 헌혈된 혈액으로부터 얻을 수 있다. 그러나, 잠재적 오염물(혈액-유래 생성물에 존재할 수 있는 바이러스 또는 다른 해로운 물질)의 전염의 위험, 및 헌혈된 혈액으로부터 분리되는 물질과 관련된 공급의 잠재적 제한을 제거 또는 저감하기 위해서, 단백질, 예컨대 사람 혈청 알부민은 재조합 생성물인 것이 바람직하다. 이러한 재조합 단백질은 미생물(셀라인 포함), 또는 단백질을 발현하도록 형질변환 또는 트랜스펙트된 유전자 도입 식물 또는 동물로부터 유래될 수 있다.
따라서 본 발명에 사용하기 위한 현재 가장 바람직한 단백질은 재조합 사람 혈청 알부민(rHA)이다. rHA의 적합한 형태는 시중에서 Novozymes Delta Ltd, Nottingham, United Kingdom으로부터 얻을 수 있다.
rHA의 제조 방법은 일반적으로 당업자들에게 잘 알려져 있고, 예컨대 WO 96/37515 및 WO 00/44772에 설명되어 있다.
바람직한 rHA의 제조방법에 있어서, rHA 용액은 발효 배지에서 rHA-암호화 뉴클레오티드 서열로 형질변환된 진균을 배양함으로써 얻어진 진균 배양 배지로부터 유래된다. 진균은 rHA을 발현하고 이것을 배지로 분비한다. 그 다음 배양 상청액의 적절한 정제는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적합한 용액을 산출한다. 진균은 Aspergillus 종과 같은 사상균이어도 좋다. 바람직하게는, 진균은 이스트이다. 보다 바람직하게는, 진균은 Saccharomyces속(예컨대 S. cerevisiae), Kluyveromyces속(예컨대 K. lactis) 또는 Pichia속(예컨대 P. pastoris)이다.
rHA는 자유 SH(술피드릴 또는 티올)기를 갖는 실질적인 분자 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 이것은 후술하는 바와 같이 치료제 또는 영상 조영제에 대한 rHA 분자의 콘쥬게이션의 특히 유용한 수단을 제공한다.
알부민은 하기 이유에 근거하여 본 발명의 방법에 따른 단백질 입자의 제조를 위해 일반적으로 바람직한 단백질이다:
a) 알부민은 수성 매질에 매우 가용성임;
b) 알부민 분자에 존재하는 자유 술피드릴기는 치료제 또는 영상 조영제에 선택적으로 연결하기 위한 수단을 제공함;
c) 알부민 분자에 존재하는 펜던트 아미노기를 갖는 다수의 아미노산 잔기(구체적으로 리신 잔기), 및 다수의 카르복실기는 아미노 결합의 형성을 통해 알부민 분자 사이에 유효한 공유결합을 제공함; 및
d) 펜던트 아미노기를 갖는 다수의 아미노산 잔기 및 비교적 다수의 카르복실기는 신체에 대한 송달을 위한 제제를 위한 연결 부위를 제공하는데도 유용함.
본 발명에 유용하게 사용할 수 있는 다른 단백질은 보통 신장을 통한 배설로 인하여 혈류로부터 급속히 청소되는 것이다. 본 발명의 단백질 입자의 형성은 이러한 단백질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있다.
예컨대, 고밀도 리포단백질(HDL)(소위 "좋은 콜레스테롤")의 주요 단백질 성분인 자연-발생 아포리포단백질 A-1 (Apo A-1)이 이러한 단백질이다.
Apo A-1 리포단백질의 혈장 수준은 죽상동맥경화증이 있는 환자에서 감소한다. 죽상동맥경화증 환자를 이량체화된 Apo　A-1으로 치료하는 경우(그것의 혈액 풀 체류를 연장하기 위해서), 이들 플라크 수준은 현저히 감소하며, 이에 대응하여 심장 발작율도 감소한다.
Apo A-1의 정맥내 투여가 이전에 시도되어 왔지만 단백질은 비교적 작고 사구체 여과를 통해 신장으로부터 분비되므로 혈액 풀로부터 급속히 청소되며, 주입 직후 소변에 나타난다.
본 발명의 방법론에 의해서, 너무 커서 신장을 통해 혈액으로부터 배설될 수 없는 고분자량 나노입자를 만들 수 있고, 이것에 의해 중요한 혈장 단백질의 반감기가 연장된다. 알부민에 대하여 유사한 이유로, 본 발명에 사용되는 아포리포단백질 A-1은 재조합 생성물인 것이 바람직하다.
본 발명에 유용한 또 다른 단백질은 트랜스페린이다. 트렌스페린의 사용은 이것이 다수의 잠재적 연결 부위를 가지고 있고, 혈액 뇌관문을 통한 수송을 용이하게 할 수 있고, 재조합 생성물로서 제조할 수 있기 때문에 일부 용도에 유리하다 (예컨대, MacGillivray et al 2002, in Molecular and Cellular Iron Transport, Templeton (Ed), Marcel Dekker, Inc, p 41 및 Mason et al 1993, Biochemistry 32: 5472 참조). 알부민에 관해서, 트랜스페린은 재조합 트랜스페린(rTF)이 바람직하다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 유용한 다른 단백질은 락토페린 및 항체를 포함한다. 이들은 또한 재조합 생성물이 될 수 있다.
하기 주어진 여러가지 파라미터 및 반응조건의 설명은 알부민에 적용가능하지만, 상기 구체적으로 언급한 것(즉 Apo A-1, 트랜스페린, 락토페린, 항체) 및 그 밖의 것들을 포함하는 다른 단백질에도 적용가능하다.
가교 이전에, 단백질 분자는 액체 매질에 바람직하게는 적어도 10mg.mL-1, 또는 적어도 20mg.mL-1, 또는 적어도 50mg.mL-1의 농도로 분산된다. 단백질 농도의 상한은 사용하는 특정 단백질(들)의 용해도에 의해 결정될 수 있지만, 단백질 농도는 500mg.mL-1 이상이 될 수 있거나, 또는 최대 400mg.mL-1, 300mg.mL-1, 또는 200mg.mL-1가 될 수 있다. 단백질의 농도는 일반적으로 8mg.mL-1 내지 500mg.mL-1, 보다 많은 경우 10mg.mL-1 내지 200mg.mL-1, 또는 20mg.ml-1 내지 200 mg.mL-1, 예컨대 50mg.mL-1 내지 150mg.mL-1의 범위 내이다.
반응 매질의 성질
본 발명의 방법은 적합한 매질에서 행해지며, 이들은 가장 일반적으로 수성 매질, 바람직하게는 버퍼 용액이다. 한 적합한 버퍼는 인산 완충 식염수(PBS)이다. 다른 종래의 매질도 사용할 수 있다.
매질의 pH는 10.0 미만, 또는 9.0 또는 8.0 미만이 바람직하다. pH는 3.0 (또는 이하)만큼 낮을 수 있지만, 보다 일반적으로 4.0 또는 5.0 이상이다. 일반적으로, pH는 3.0 내지 10.0, 또는 3.0 내지 9.0, 또는 3.0 내지 8.0의 범위 내일 것이다. 많은 경우, pH는 3.0 내지 8.5, 보다 바람직하게는 4.5 내지 8.5, 또는 5.5 내지 8.5, 특히 5.5 내지 7.5의 범위 내이다.
제로-길이 가교제의 성질
제로-길이 가교제는 가교된 생성물에 다른 성분의 첨가 없이 단백질성 분자 사이에 가교를 촉진하는데 사용되며, 즉 입자는 합성 스페이서를 함유하지 않으며 대신 함께 직접 결합된 단백질 분자들을 포함한다. 다양한 제로-길이 가교 화학 물질 또는 시약을 사용할 수 있고, 하기에 예로서 제공되지만 완전하다고 의도되는 것은 아니다.
Bioconjugate Techniques (Hermanson, G.T. (1996), Academic Press) 에 따르면, 단백질에 적용가능한 2종류의 제로-길이 가교 화학이 있다:
a) 1차 또는 2차 아민을 알데히드기로 환원성 아민화함으로써 이루어지는 2차 또는 3차 아민 결합; 및
b) 1차 아민을 카르복실산으로 축합함으로써 이루어지는 아미드 결합.
이들 중 첫번째는 시스-디올을 함유하는 탄수화물쇄를 보유하는 글리코단백질에 적용할 수 있으며, 이것은 알부민을 포함하지 않지만 산화되어 알데히드기를 형성할 수 있다. 가교 화학의 두번째 종류 - 아미드 결합- 은 모든 단백질에 적용가능하고, 따라서 본 발명에 바람직하다.
아미드 결합의 형성에 사용할 수 있는 가교 시약의 3가지 종류는:
a) 카르보디이미드;
b) 우드워드 시약(Woodward reagent) K (N-에틸-3-페닐이속사졸륨-3'-술포네이트); 및
c) N,N-카르보닐디이미다졸이다.
카르보디이미드의 사용은 본 발명에서 바람직하다. 다수의 가능한 카르보디이미드, 예컨대 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드), CMC (1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드), DCC (디시클로헥실 카르보디이미드) 및 DIC (디이소프로필 카르보디이미드)가 있다. 그러나, DCC 및 DIC는 일반적으로 물에 대한 열등한 용해도 때문에 단백질의 가교에 적용가능하지 않다. 본 발명에 사용하기 위한 가장 바람직한 제로-길이 가교제는 EDC이다.
제로-길이 가교제의 농도는 500mM 미만이 바람직하고, 보다 바람직하게는 200mM 미만이고, 100mM 미만이어도 좋다. 제로-길이 가교제의 농도는 5mM 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10mM 이상이고, 20mM 이상이어도 좋다. 따라서 제로-길이 가교제의 농도는 바람직하게는 5mM, 10mM 또는 20mM 내지 100mM, 200mM 또는 500mM, 예컨대 5mM 내지 500mM 또는 보다 바람직하게는 20mM 내지 200mM 범위 내이다.
제로-길이 가교제가 카르보디이미드인 바람직한 실시형태에서, NHS (N-히드록시숙신이미드) 또는 술포-NHS (N-히드록시술포숙신이미드)를 카르보디이미드 반응에 첨가하여 보다 안정한 활성 카르복실 중간체를 생성하고, 따라서 반응 수율을 향상시킬 수 있다. 반응은 보다 효과적이고, 따라서 저농도의 제로-길이 가교제가 필요하다.
NHS 또는 술포-NHS가 사용되는 본 발명의 실시형태에 있어서, 제로-길이 가교제의 농도는 100mM 미만이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50mM 미만이다. 제로-길이 가교제의 농도는 2mM 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5mM 이상이다. 따라서 제로-길이 가교제의 농도는 바람직하게는 2mM 또는 5mM 내지 50mM 또는 100mM, 예컨대 2mM 내지 100mM, 보다 바람직하게는 5mM 내지 50mM 범위 내이다. NHS 또는 술포-NHS의 농도는 1mM 또는 2mM 이상, 그리고 50mM 또는 20mM 미만이다. 따라서 NHS 또는 술포-NHS의 농도는 바람직하게는 1mM 또는 2mM 내지 20mM 또는 50mM, 예컨대 1mM 내지 50mM, 보다 바람직하게는 2mM 내지 20mM의 범위 내이다.
EDC는 일반적으로 바람직한 제로-길이 가교제이고, 가장 바람직하게는 EDC를 NHS와 함께 사용한다.
반응 조건
반응 온도 및 반응 시간은 모두 변화할 수 있으며 얻어지는 단백질 입자의 크기에 영향을 미친다.
실제로, 반응을 행하는 온도는 반응 매질이 액체가 되어야 할 필요에 의해, 즉 매질의 어는점에 의해 하한으로, 그리고 단백질의 변성 온도에 의해 상한으로 제한될 것이다. 통상 반응 매질이 수성인 경우, 반응 온도는 편의상 10℃ 내지 40℃이다. 대부분의 경우 반응은 주위 실온에서 또는 근접해서, 즉 통상적으로 15℃ 내지 30℃, 예컨대 20℃ +/- 5℃에서 행할 수 있다.
반응 시간은 상당히 넓은 범위 내에서 변할 수 있지만, 통상적으로 1시간 내지 4, 6, 8, 10 또는 12시간, 예컨대 약 2시간이다.
생성물은 단백질 분자와 제로-길이 가교제의 반응 후 정제해도 좋다. 통상적으로 정제는 과잉의 시약 제거를 포함하며, 공지된 방법, 예컨대 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 행할 수 있다. 적합한 크로마토그래피 매질은 Sephadex G50이다.
제로-길이 가교제가 단백질 분자 내의 카르복실기와 반응한 후, 활성 카르복실이 자유 티올기(예컨대 알부민 분자 내에 존재)와 반응하여 티올에스테르를 형성할 수 있다는 것을 발견하였다. 티올기는 단백질 분자와 예컨대 치료제 또는 영상 조영제의 반응의 수단으로서 유용할 수 있으므로, 이러한 가수분해되는 티올에스테르에 적합하다. 이것은 열처리에 의해 달성할 수 있다.
열처리는 20℃ 내지 50℃의 온도에서 1, 2, 4 또는 8시간의 기간, 최대 10, 20, 30 또는 40시간 동안 행하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 상기 주어진 반응 조건과 파라미터의 조합을 사용할 수 있고, 가장 적절하거나 최적의 조건의 선택은 사용하는 물질의 정밀한 성질 및 생성되는 나노입자의 원하는 특성에 의해 결정된다. 그러나, 많은 실시형태에 있어서, 반응은 수성 매질에서 3.0 내지 8.5, 예컨대 5.5 내지 8.5 또는 5.5 내지 7.5의 범위 내의 pH에서 8mg.mL-1 내지 500mg.mL-1, 예컨대 10mg.mL-1 내지 200mg.mL-1의 단백질 농도로 카르보디이미드 가교제, 예컨대 EDC을 5 내지 500mM, 예컨대 20 내지 200mM의 농도로 사용하여 행한다. NHS 또는 술포-NHS를 사용하는 경우, 가교제의 농도는 예컨대 2mM 내지 100mM, 또는 5mM 내지 50mM로 낮아도 좋다.
조영제 또는 치료제에 단백질 입자의 연결
단백질 입자에 신체 송달을 위한 제제의 연결은 특히 제제의 성질 및 단백질 입자의 성질에 의존하여 많은 수단에 의해 행할 수 있다. 그러나 일반적으로 연결은 단백질 입자와 제제 사이, 또는 단백질 입자와 제제 그 자체와 화학적 또는 물리적 결합을 형성할 수 있는 연결 부분 사이에 공유 결합의 형성을 포함할 것이다.
금속, 예컨대 MRI 또는 핵영상에 사용하기 위한 금속의 연결, 또는 방사선 요법에 사용하기 위한 방사성 금속의 연결에 특히 적절한 한 바람직한 연결 방법은 금속을 결합할 수 있는 킬레이트제와 단백질 입자의 콘쥬게이션을 포함한다.
한 특히 바람직한 실시형태에서, 킬레이트제는 단백질 입자에 존재하는 아민기와 반응하여 킬레이트제를 단백질 입자에 연결하는 아미드 결합을 형성하는 카르복실기 또는 그것의 유도체를 함유한다. 그 다음 적절한 금속의 염의 용액을 첨가하여, 콘쥬게이트된 킬레이트제에 의한 금속의 킬레이트화를 유도한다.
사용할 수 있는 킬레이트제는 복수의 아민기를 포함하는 화합물의 아세트산 유도체를 포함한다. 예는 에틸렌디아민 테트라아세트산, 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 및 그것의 유도체, 예컨대 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 무수물을 포함한다. 유용한 다른 종류의 킬레이트제는 거대고리 킬레이트제를 포함한다. 거대고리 킬레이터의 예는:
1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N"-트리아세트산 (NOTA)
1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)
1,4,8,11-테트라아자비시클로테트라데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (TETA)이다.
단백질 입자에 대하여 킬레이트제를 연결하기 위한 다른 방법은 당업자들에게 명백할 것이다. 적합한 화학은 단백질 입자 및/또는 킬레이트제에 존재하는 아민, 티올, 카르보닐, 카르복실 또는 히드록실기를 통한 결합의 형성을 일반적으로 포함한다.
제제가 금속 킬레이트의 형태로 단백질 입자에 연결되는 경우, 킬레이트는 제조방법의 일부로서 형성될 수 있거나, 또는 대안적으로 금속은 나중에, 예컨대 사용 직전에 첨가할 수 있다. 특히 금속이 방사성 금속인 경우, 사용 직전에 제형에 첨가하는 금속 이온이 바람직할 수 있다.
마찬가지로, X선 조영제로서 사용하는 요오드-함유 화합물과 같은 유기제는 유기제와 단백질 입자 사이의 공유 결합의 형성에 의해 단백질 입자에 직접 연결될 수 있다. 단백질 입자에 대한 유기제의 연결 방법은 또한 당업자들에게 명백할 것이고, 단백질 입자 및/또는 유기제에 존재하는 아민, 티올, 카르보닐, 카르복실 또는 히드록실기를 통한 결합의 형성을 포함할 수 있다.
공급 및 투여
본 발명에 따른 입자 또는 콘쥬게이트는 일반적으로 약학적으로 허용가능한 매질를 포함하는 제형으로서 신체에 투여될 것이다. 이 매질은 가장 일반적으로 액체 매질이다. 이러한 제형은 무균, 사용가능한 용액으로서 당업자에게 공급할 수 있거나, 또는 입자나 콘쥬게이트를 냉동 건조한 다음 사용 전에 적합한 용액으로 재구성할 수 있다. 예컨대, 사용 전에 냉동 건조 단백질 입자를 방사성 표지의 용액과 혼합하여 요청되는 액체 매질 중의 콘쥬게이트의 제형을 생성할 수 있다.
본 발명에 따른 입자 및 제형은 다양한 경로로 투여할 수 있다. 예컨대 제형은 정맥내 또는 피하 투여로 투여할 수 있다. 또한 제형은 경구 또는 비강 흡입에 의해, 예컨대 분무액으로서 투여할 수 있다. 적절한 경우 제형을 카테터를 통해 질병 부위에 직접 송달할 수 있다. 다른 용도에 대하여 제형은 예컨대 피부에 적용에 의해 국소적으로 송달될 수 있다. 이러한 경우, 제형은 크림 또는 연고로서 적용할 수 있거나, 또는 피부에 적용하는 패치에 조합할 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자의 적용의 예는 하기를 포함한다.
입자는 막(예컨대 폐, 비강, 구강 등)을 통과하는 약물의 송달 향상에 유용할 수 있다. 특히, 예컨대 rHA의 나노입자는 트랜스시토시스에 의해 막을 통과하여 수송될 수 있다. 단백질의 미립자 형태는 단일의 분자보다 막을 통한 흡수 및 수송이 보다 용이하다. 또한, 나노입자를 이들에 (화학적으로) 부착된 하전된 또는 친수성 기로 제조하여 흡수를 향상시킬 수 있다.
또한 입자는 유전자 송달에 사용할 수 있다. 예컨대, 화학적 수단에 의해 DNA가 입자에 연결되어 DNA를 세포막 및 핵막을 통해 수송할 수 있다.
또한 입자는 백신 분자로 이루어진 입자에 의해 또는 항원을 예컨대 rHA로 이루어진 입자에 연결함으로써 백신에 대한 응답성을 향상시키는데 사용할 수 있다.
또한 입자의 사용은 종양에 대한 약물의 흡수를 증가시킬 수 있다. 예컨대, 종양 세포는 과잉-발현 gp60/SPARK에 알려져 있고 향상된 rHA 나노입자의 흡수를 나타낼 수 있다. 또한 이것은 (종양 세포의 외부로 직접 약물이 분출하는 것을 정지시킴으로써) 복수-약물 저항을 해결하기 위한 메커니즘을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 입자는 또한 상처에 대한 약물 또는 다른 유용한 제제의 송달에 유용할 수 있다.
본 발명에 따른 입자의 국소적 송달은 피부 표면, 특히 모공 등에 약물 또는 다른 활성물질 보유의 유리한 효과를 가질 수 있다. 또한, 표면 전하를 갖는 입자의 제조는 피부 밀착성을 향상시킬 수 있다.
또한 입자는 장기의 벽을 통해 또는 페이어스 패치를 통해 분자를 송달하는데 사용할 수 있으므로 경구 약물 송달에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 입자는 또한 비약학적 세팅, 예컨대 개인 위생 용품에서의 용도를 발견할 수 있다. 산업적 공정에서 효소의 송달과 같은 그 밖의 산업상 용도도 발견된다.
본 발명의 일반적인 바람직한 실시형태를 단지 예시로서 하기 실시예 및 첨부한 도면을 참조하여 보다 상세히 설명한다.
도 1은 실시예 1의 생성물에서 얻어진 겔침투 HPLC 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 2의 생성물에서 얻어진 겔침투 HPLC 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 3의 생성물에 대한 음성 PAGE 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 5에 설명한 가교된 생성물의 열처리 동안 자유 티올기의 증가를 나타낸다.
도 5는 실시예 6(a)의 생성물에 대한 음성 PAGE 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 6(b)의 생성물에 대한 음성 PAGE 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 6(c)의 생성물에 대한 음성 PAGE 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 7의 탈염 생성물에 대한 음성 PAGE 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 7의 탈염 생성물에 대하여 광산란에 의해 측정한 입자 크기 분포를 나타낸다.
도 10은 실시예 8의 생성물에 대한 탈염 크로마토그램을 나타낸다.
도 11은 실시예 8의 생성물에 대한 음성 PAGE 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예 8의 생성물에 대한 겔침투 HPLC 결과를 나타낸다.
도 13은 실시예 8의 생성물에 대하여 광산란에 의해 측정한 입자 크기 분포를 나타낸다.
일반적 방법
단백질 입자를 형성하기 위한 rHA의 가교
제형화된 rHA (약 20%(w/v) rHA, 32mM 옥타노에이트, 145mM Na+, 15mg.L-1 폴리소르베이트 80, pH7.0)를 지시된 버퍼를 사용하여 지시된 rHA 농도로 희석하였다. EDC 또는 EDC + NHS을 지시된 농도로 첨가하였고, 샘플을 실온(약 20℃)에서 지시된 시간 동안 혼합 및 인큐베이션하였다.
탈염
과잉의 반응물을 제거하기 위해서, 가교된 rHA를 Sephadex 크로마토그래피로 탈염하였다. 달리 지시되지 않는 한, 탈염은 0.9%(w/v) NaCl, 15mM Na2HPO4, 5mM NaH2PO4을 함유하는 인산 완충 식염수(PBS)에서 행하였다.
열처리
지시된 경우, 가교된 rHA을 지시된 시간 동안 약 45℃에서 인큐베이션에 의해 열처리한 다음, 지시된 경우 탈염 단계를 반복하였다.
겔침투 HPLC (GPHPLC)
GPHPLC는 TSKgel G3000SWXL 0.78×30cm 분석 컬럼을 사용하였고 가드는 280nm에서 용출 모니터링과 함께 PBS에서 1mL.min-1으로 작동하였다. 샘플을 PBS에 적절하게 희석하고 10-25μL 주입하였다.
음성 PAGE
PBS에 적절히 희석된 샘플로 제조자 지시에 따라 Novex 4-12% 트리스 글리신 겔 (Invitrogen Ltd, 3 Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley PA4 9RF, United Kingdom)을 사용하여 음성 PAGE를 행하였다. 겔은 제조자의 지시에 따라 GelCode Blue (Pierce Biotechnology, Inc, 3747 N Meridian Rd, PO Box 117, Rockford, IL 61105, USA)로 착색하였다.
자유 티올 분석
블랭크 및 샘플을 0.1M TrisHCl, 0.01M EDTA pH8과 함께 1mL가 되도록 하고 A412을 측정하였다. 0.05M 인산 나트륨 pH7 중의 50μL 0.01M 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)을 첨가하고 실온에서 10분 후 A412을 재측정하였다. 티올 함유량은ε412=13600M-1cm-1을 사용하여 산출하였다.
입자 크기 측정
작은 부피의 일회용 큐베트를 갖는 Malvern Zetasizer Nano S를 사용하여 3회 분석 이전에 샘플을 PBS을 사용하여 1-5mg.mL-1 rHA로 희석하고 0.2μm 여과하였다. Malvern Dispersion Technology Software v4.1을 사용하여 산란된 광 강도에 기초한 평균 입자 크기 및 크기 분포의 표준 편차를 측정하였다.
결합된 메토트렉세이트 분석
탈염 및 PBS에 샘플의 적절한 희석 이후에, 단백질-결합된 메토트렉세이트 (MTX) 농도를 공지된 농도의 MTX와 비교하여 A373 측정에 의해 결정하였다.
실시예 1
rHA의 가교 및 GPHPLC에 의한 분석 : 가교제 농도의 영향
0, 15, 30 및 45mM EDC, 15mM EDC + 5mM NHS와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA에서 2h 반응 시간 동안 가교를 행하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 GPHPLC에 의해 생성물을 분석하였다.
크로마토그램은 단량체 rHA 출발 물질(도 1a), 및 EDC의 농도 증가 및 NHS의 첨가에 따른 대형 종(단백질 입자)의 점진적 증가량의 용리를 나타낸다.
NB 크로마토그램 C의 시작시 용리하는 넓은 피크는 컬럼의 보이드 부피 이전에 발생하고, 따라서 샘플에 관련되지 않은 베이스라인 인공물이다.
실시예 2
rHA의 가교 및 GPHPLC에 의한 분석 : 후-가교 처리의 효과
15mM EDC + 5mM NHS와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA에서 가교를 행하였다. 가교된 생성물 (단백질 입자 함유)을 물에 탈염하고, SnCl2, Na2HPO4, 글루코스 및 Pluronic F68의 첨가에 의해 제형화하고 동결 건조시켰다. 각 단계에서의 생성물을 GPHPLC로 분석하였고, 결과를 도 2에 나타내며, 이것은 탈염, 제형화 및 동결-건조가 단백질 입자 상에 중요한 효과를 갖지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 3
rHA의 가교 및 음성 PAGE에 의한 분석
0, 15, 30, 45, 75, 105 및 150mM EDC, 15mM EDC + 5mM NHS와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA에서 2h 반응 시간으로 가교를 행하였다. 음성 PAGE에 의해 생성물을 분석하였고, 결과를 표 3에 나타낸다.
결과는 상기 검토한 GPHPLC 결과와 일치하며, 즉 이들은 EDC의 농도 증가 및 NHS의 조합에 따라 증가된 양의 적게 이동하는 종(단백질 입자)의 형성을 나타낸 다.
실시예 4
rHA의 가교 및 생성물의 자유 티올 함유량의 측정
15mM EDC + 5mM NHS와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA에서 2시간의 반응 시간으로 가교를 행하였다. 물에서 탈염된 가교된 생성물은 출발 rHA에 대한 0.64mol.mol-1 와 비교하여 0.04mol.mol-1의 자유 티올 수준을 나타내었다.
실시예 5
rHA의 가교 : 열처리 동안 생성물의 자유 티올 함유량의 의존
15mM EDC + 5mM NHS와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA에서 2시간 반응 시간으로 가교를 행하였다. 가교된 생성물을 탈염하고 지시된 시간 동안 열처리하였고 자유 티올 분석을 위해 분취물을 얻었다. 결과를 도 4에 나타낸다. 볼수 있는 바와 같이, 16시간 이상의 열처리 시간 동안 자유 티올 함유량은 rHA 출발 물질의 것으로 실질적으로 되돌아갔다.
실시예 6
반응 조건 변화의 효과
a) [EDC], [NHS] 및 시간
15, 30, 75, 150 및 300mM 농도의 EDC, 각각 0, 1, 5 및 20mM NHS와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA에서 가교를 행하였다. 겔을 형성하지 않은 모든 샘플 을 2 및 22h 반응 시간 후 음성 PAGE에 의해 분석하였으며 - 도 5 참조, 이것은 장시간의 반응 후 대량의 단백질 입자가 형성되었다는 것을 나타낸다.
b) [EDC], [rHA] 및 시간
각각 15, 30, 75, 150 및 300mM 농도의 EDC와 함께 PBS에 희석된 10, 20, 50 및 100mg.mL-1 rHA에서 가교를 행하였다. 겔을 형성하지 않은 모든 샘플을 2 및 22h 반응 시간 후 음성 PAGE에 의해 분석하였다 - 도 6 참조.
c) pH
0.9%(w/v) NaCl, 20mM MES 또는 0.9%(w/v) NaCl, 20mM EPPS 또는 PBS에 희석함으로써 100mg.mL-1 rHA을 제조하였다. MES 샘플의 분취물을 약 pH5.5 및 pH6.5로 조정하였다. EPPS 샘플의 분취물을 약 pH7.5 및 pH8.5로 조정하였다. 각 샘플과 75mM EDC 및 15mM EDC + 5mM NHS의 2h 반응 시간의 가교 전에 실제 출발 pH를 측정하였다. 겔을 형성하지 않은 모든 샘플을 음성 PAGE로 분석하였다 - 도 7 참조. 결과는 가교가 7 이하의 pH 값에서 보다 효과적이었다는 것을 나타낸다.
실시예 7
NHS 플러스 EDC 및 단독의 EDC을 사용하여 얻어진 결과의 비교
15mM EDC + 5mM NHS 및 75mM EDC와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA에서 2h 반응 시간으로 가교를 행하였다. 탈염 후, 음성 PAGE 및 광산란에 의해 가교된 생성물을 rHA 출발 물질과 비교하여 분석하였다. 음성 PAGE 결과를 도 8에 나타내고 광산란 분석에 의한 입자 크기 분포를 도 9에 나타낸다. 결과는 단지 15mM EDC 와 함께 5mM NHS의 사용이 단독의 75mM EDC 사용에 필적하는 결과를 얻었다는 것을 나타낸다.
실시예 8
NHS 플러스 EDC 및 단독의 EDC을 사용하여 얻어진 결과의 또 다른 비교
15mM EDC + 5mM NHS 및 75mM EDC와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA으로 2h 반응 시간으로 가교를 행하였다. 가교된 생성물을 탈염하고 열처리하고 다시 탈염하였다. 자유 티올 수준은 열처리시 EDC + NHS 생성물에 대하여 0.03에서 0.54mol.mol-1로, EDC 생성물에 대하여 0.02 에서 0.50mol.mol-1로 증가하였다. 탈염된 생성물 전- 및 후-열처리를 rHA 출발 물질과 비교하여 음성 PAGE, GPHPLC 및 광산란에 의해 분석하였다.
도 10은 탈염 크로마토그램을 나타낸다. 탈염을 260nm에서 모니터하였다. 열처리 이전에 도 10 중 위쪽의 상부 크로마토그램을 얻었다. 왼쪽 피크는 수집한 다음 열처리한 생성물에 해당하고; 오른쪽 피크는 자유 NHS에 해당한다. 아래쪽의 크로마토그램은 열처리 후 또 다른 자유 NHS가 발생하였다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 열처리 공정에 의해 NHS가 수집된 생성물로부터 방출되었다는 것을 나타낸다. 동일한 효과가 EDC만의 반응에서 나타났다(데이터는 나타내지 않음).
도 11은 음성 PAGE 결과를 나타내며, 도 12는 GPHPLC에 의해 얻어진 결과를 나타내며, 도 13은 광산란에 의해 얻어진 입자 크기 데이터를 나타낸다. 데이터는 열처리 단계가 평균 입자 크기의 미세한 감소(도 13) 및 이동성 증가(도 11)를 제 외하고 단백질 입자에 중요한 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다.
실시예 9
일정한 [NHS]에서 [rHA] 및 [EDC] 변화의 효과
10mM EDC + 5mM NHS, 15mM EDC + 5mM NHS, 25mM EDC + 5mM NHS 및 50mM EDC + 5mM NHS와 함께 PBS에 희석된 20, 50 및 100mg.mL-1 rHA에서 2h 반응 시간으로 가교를 행하였다. 겔을 형성하지 않은 모든 샘플을 탈염하고, 가열처리하고 다시 탈염하였다. 생성물의 입자 크기 분포를 광산란에 의해 분석하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[EDC] / mM [rHA] / mg.mL-1
20 50 100
평균 직경 / nm 표준 편차 / nm 평균 직경 / nm 표준 편차 / nm 평균 직경 / nm 표준 편차 / nm
10 11.0 4.26 12.8 5.28 15.3 7.11
15 12.1 4.66 15.7 7.18 20.6 9.74
25 15.1 6.43 25.3 13.3 48.3 24.2
50 25.4 12.6 73.9 35.0 측정 안함 측정 안함
비교해 보면, rHA 출발 물질은 8.38nm의 평균 직경 및 2.99nm의 표준 편차를 가졌다.
실시예 10
일정한 [rHA]에서 [EDC] 및 [NHS] 변화의 효과
2, 5, 10 및 20mM NHS와 각각 15, 25 및 35mM EDC와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA에서 2h 반응 시간으로 가교를 행하였다. 겔을 형성하지 않은 모든 샘플을 탈염, 열처리 및 다시 탈염하였다. 생성물의 입자 크기 분포를 광산란에 의해 분석하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[NHS] / mM [EDC] / mM
15 25 35
평균 직경 / nm 표준 편차 / nm 평균 직경 / nm 표준 편차 / nm 평균 직경 / nm 표준 편차 / nm
2 18.7 8.93 59.5 39.7 73.2 35.4
5 23.1 12.4 48.6 25.7 117 67.2
10 27.7 16.3 72.9 38.3 측정 안함 측정 안함
20 23.3 12.2 66.3 32.4 측정 안함 측정 안함
비교해 보면, rHA 출발 물질은 평균 직경이 평균직경 8.39nm이고 표준 편차는 2.96nm이었다.
실시예 11
재조합 트랜스페린의 가교
rHA에 대하여 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 재조합 트랜스페린 (rTF)을 가교시켰다. 15, 25 및 35mM EDC와 각각 5mM NHS와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rTF에서 1, 2 또는 4h 반응시간으로 가교를 행하였다. 겔을 형성하지 않은 모든 샘플을 탈염하고 광산란에 의해 분석하였다. 결과를 표 3에 나타낸다:
[EDC] / mM 반응 시간 / h
1 2 4
평균 직경 / nm 표준 편차 / nm 평균 직경 / nm 표준 편차 / nm 평균 직경 / nm 표준 편차 / nm
15 17.0 7.7 34.3 26.0 57.5 32.4
25 31.0 18.4 99.7 53.1 측정 안함 측정 안함
35 55.6 31.9 측정 안함 측정 안함 측정 안함 측정 안함
비교해 보면, rTF 출발 물질은 7.78nm의 평균직경 및 1.80nm의 표준 편차를 가졌다.
실시예 12
아포리포단백질 A-1의 가교
25mM EDC 및 5mM NHS와 함께 PBS 중의 50mg.mL-1 Apo A-1을 사용하여 1, 2 및 4h 반응 시간 동안 아포리포단백질 A-1 (Apo A-1)을 가교시켰다. 모든 샘플을 탈염하고 광산란에 의해 출발 Apo A-1와 비교하여 분석하였다. 결과를 표 4에 나타낸다:
반응 시간 / h 평균직경 / nm 표준 편차 / nm
1 21.8 10.8
2 44.9 33.7
4 57.6 33.4
비교해 보면, Apo A-1 출발 물질은 12.5nm의 평균직경 및 5.72nm의 표준 편차를 가졌다.
실시예 13
치료제(메토트렉세이트)를 함유하는 가교된 rHA 입자의 제조
25mM EDC + 5mM NHS, 9.8mM MTX (6.5mol.mol-1 rHA)와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA에서 2h 반응 시간으로 메토트렉세이트 (MTX)의 존재하의 rHA의 가교를 행하였다. 가교된 생성물을 탈염하고, 출발 rHA와 비교하여 단백질-결합 MTX에 대하여 분석하고, 광산란에 의해 분석하였다. 생성물은 2.3mol.mol-1 rHA 농도로 결합된 MTX을 함유하였고 37.9nm의 평균 직경 및 22.6nm의 표준 편차를 가졌다. 비교해 보면, rHA 출발 물질은 8.24nm의 평균 직경 및 2.44nm의 표준 편차를 가졌다.
실시예 14
가교 rHA 입자에 대한 치료제(메토트렉세이트)의 연결
25mM EDC + 5mM NHS와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA으로 rHA의 가교를 2h 반응 시간으로 행하였다. 가교된 생성물을 탈염하고, 22h 동안 열처리하고, 다시 탈염하고, 한외여과에 의해 20mg.mL-1 rHA로 농축하였다.
10mM MTX을 PBS 중의 20mM NHS 및 100mM EDC와 함께 실온에서 1h 동안 반응시킴으로써 NHS-활성 MTX을 제조하고, NaOH 및 HCl의 적절한 첨가에 의해 약 pH7으로 유지하였다. 최종 NHS-활성 MTX 농도는 9.8mM이었다.
동일한 양의 20mg.mL-1 가교 rHA 및 9.8mM NHS-활성 MTX (33mol.mol-1 rHA)을 혼합함으로써 가교 rHA에 대한 MTX 연결을 행하였다. 실온에서 1½h 및 3h 반응 후 샘플을 채취하고, 탈염하고, 단백질-결합 MTX에 대하여 분석하였다. 또한 출발 rHA와 비교하여 모든 가교 rHA 샘플을 광산란에 의해 분석하였다. 결과를 표 5에 나타낸다:
샘플 반응 시간 /h 단백질-결합 MTX /mol.mol-1 rHA 평균 직경 /nm 표준 편차 /nm
가교 rHA - - 48.7 23.4
MTX-표지된 가교 rHA 1½ 12.6 54.2 26.0
3 14.4 58.4 29.5
비교해 보면, rHA 출발 물질은 8.09nm의 평균직경 및 2.47nm의 표준 편차를 가졌다.
실시예 15
가교된 rHA 입자에 대한 조영제 (가드늄 킬레이트)의 연결
6mL 20mg.mL-1 가교 rHA(실시예 14)에 일정한 교반과 함께 30분의 시간에 걸쳐서 0.4g DTPA 무수물을 첨가함으로써 가교 rHA에 대한 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 연결을 행하고, 5M NaOH의 첨가에 의해 약 pH8로 유지하였다. 최종 첨가 후 30분 동안 교반을 계속하고, 3M HCl로 샘플을 pH7으로 조정하고, 0.9%(w/v) NaCl에서 탈염하였다.
단백질-결합 DTPA기를 자일레놀 오렌지 인디케이터의 존재하에서 0.1M GdCl3으로 적정하고, 1M NaOH의 첨가에 의해 pH 5.5-6.0로 유지하였다. 결합 DTPA 수준은 43mol.mol-1 rHA이었다. 또한 출발 rHA와 비교하여 모든 가교 rHA 샘플을 광산란에 의해 분석하였다. 결과를 표 6에 나타낸다:
샘플 평균직경 / nm 표준 편차 / nm
가교 rHA 48.1 23.8
DTPA-표지된 가교 rHA 67.6 36.9
DTPA-Gd-표지된 가교 rHA 62.4 31.8
비교해 보면, rHA 출발 물질은 7.77nm의 평균직경 및 2.15nm의 표준 편차를 가졌다.
실시예 16
우드워드 시약 K을 사용하는 rHA의 가교
0.1M WRK과 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA으로 우드워드 시약 K (WRK)을 사용하는 가교를 30min 반응 시간으로 행하였다. 가교된 생성물을 PBS에 희석하고 출발 rHA와 비교하여 광산란에 의해 분석하였다. 생성물은 13.5nm의 평균 직경 및 5.76nm의 표준 편차를 갖는다. 비교해 보면, rHA 출발 물질은 8.42nm의 평균 직경 및 2.87nm의 표준 편차를 가졌다.
실시예 17
N,N-카르보닐디이미다졸을 사용하는 rHA의 가교
0.5M CDI와 함께 PBS에 희석된 100mg.mL-1 rHA로 N,N-카르보닐디이미다졸 (CDI)을 사용하는 가교를 행하였다. 반응이 종료되도록 하였다. 가교된 생성물을 PBS에 희석하고 출발 rHA와 비교하여 광산란에 의해 분석하였다. 생성물은 50.7nm의 평균 직경 및 26.0nm의 표준 편차를 가졌다. 비교해 보면, rHA 출발 물질은 8.42nm의 평균 직경 및 2.87nm의 표준 편차를 가졌다.

Claims (32)

  1. 8mg.mL-1 이상의 농도로 액체 매질에 분산된 단백질 분자가 제로-길이 가교제의 존재하에서 반응하도록 야기 또는 허용하여, 함께 공유 결합된 단백질 분자들을 포함하는 단백질 입자를 생성하는 단계를 포함하는 단백질 입자의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단백질 분자는 알부민 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 단백질 분자는 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 피브린, 피브로넥틴, 트랜스티레틴, 피브리노겐, 트롬빈, 트랜스페린, 아포리포단백질 A-1, 락토페린, 항체 및 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 단백질 분자는 트랜스페린 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 단백질 분자는 아포리포단백질 A-1 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 단백질 분자는 락토페린 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 단백질 분자는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, 단백질 분자는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 융합 단백질은 사람 혈청 알부민과 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 융합체인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분자는 재조합 생성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 단백질 분자는 재조합 사람 혈청 알부민 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 농도는 8mg.mL-1 내지 500mg.mL-1, 보다 바람직하게는 10mg.mL-1 내지 200mg.mL-1, 또는 20mg.ml-1 내지 200 mg.mL-1, 가장 바람직하게는 50mg.mL-1 내지 150mg.mL-1의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 가교제는 카르보디이미드, 우드워드 제제 K 및 N,N-카르보닐디이미다졸로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 제로-길이 가교제는 카르보디이미드인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 카르보디이미드는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 가교제의 농도는 5mM 내지 500mM, 보다 바람직하게는 20mM 내지 200mM의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, N-히드록시숙신이미드 또는 N-히드록시술포숙신이미드의 존재하에서 반응을 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 가교제의 농도는 2mM 내지 100mM, 보다 바람직하게는 5mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, N-히드록시숙신이미드 또는 N-히드록시술 포숙신이미드의 농도는 1mM 내지 50mM, 보다 바람직하게는 2mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 매질은 수성인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 수성 액체 매질은 버퍼 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 매질의 pH는 3.0 내지 8.5, 보다 바람직하게는 4.5 내지 8.5, 또는 5.5 내지 8.5, 특히 5.5 내지 7.5의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 선행항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 단백질 입자.
  24. 선행항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 단백질 입자.
  25. 단백질 분자 상의 관능기 사이의 공유 결합에 의해 함께 직접 연결된 단백질 분자의 잔기를 포함하는 단백질 입자로서, 평균 입자 크기가 200nm 미만, 보다 바람직하게는 150nm 미만, 또는 130nm, 100nm, 80nm, 50nm, 40nm, 30nm, 또는 20nm 미만인 단백질 입자.
  26. 제 25 항에 있어서, 입자 크기 분포의 표준 편차가 평균 입자 크기의 100% 미만, 또는 80% 미만 또는 60% 미만, 또는 50% 미만, 또는 40% 미만인 것을 특징으로 하는 단백질 입자.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 입자는 평균 입자 크기가 5nm 내지 50nm인 것을 특징으로 하는 단백질 입자.
  28. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 입자는 평균 입자 크기가 10nm 내지 100nm인 것을 특징으로 하는 단백질 입자.
  29. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 입자는 평균 입자 크기가 50nm 내지 200nm인 것을 특징으로 하는 단백질 입자.
  30. 영상 조영제 또는 그것의 전구체에 콘쥬게이트된 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 형성된 단백질 입자, 또는 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 단백질 입자를 포함하는 의학 영상에 사용하기 위한 콘쥬게이트.
  31. 치료제에 콘쥬게이트된 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 형성된 단백질 입자, 또는 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 단백질 입자를 포함하는 콘쥬게이트.
  32. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 형성된 단백질 입자, 또는 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 단백질 입자, 또는 제 30 항 또는 제 31 항에 따른 콘쥬게이트를 약학적으로 허용가능한 매질와의 혼합물로 포함하는 제형.
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