MXPA05000766A - Suministro gastrointestinal de material genetico acoplado a un agente transportador. - Google Patents

Suministro gastrointestinal de material genetico acoplado a un agente transportador.

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MXPA05000766A
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genetic material
dna
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alginate
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Abstract

La presente invencion esta dirigida a una composicion para la distribucion amplia, la expresion sistemica y el suministro sostenido, de un agente terapeutico; y a un proceso para administrar un agente terapeutico a traves de una trayectoria gastrointestinal natural. Mas en particular, la invencion describe una composicion para la administracion de terapia oral con genes, y a un procedimiento para su produccion y su uso.

Description

SU MINISTRO GASTROI NTESTI NAL D E MATERIAL G ENÉTICO ACOPLADO A U N AG ENTE DE TRANSPORTE CAM PO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la administración de un agente activo a un org anismo mediante la administración oral; particularmente a la admin istración eficaz de un agente activo/terapéutico acoplado a un agente de transporte; y muy particularmente a la distribución amplia, la expresión sistémica y el suministro sostenido de un agente terapéutico mediante la administración oral cuando se acopla eficazmente a un portador de polipéptidos .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia genética ofrece una alternativa a las modalidades de tratamiento actualmente disponibles para una variedad de condiciones, particularmente genéticas y padecimientos adquiridos que afectan un rango de células y tejidos . Existen planteamientos ex vivo basados en la implantación de células autólogas modificadas genéticamente. Son conocidos diversos protocolos de terapia genética in vivo basados en vectores virales, aunq ue existen diversos temas relacionados con la seguridad. Se ha intentado el suministro oral de genes con poco éxito, básicamente debido a la intensa deg radación del ADN en el estómago y el tracto gastrointestinal. Los intentos en la terapia genética oral mediante el uso de form ulaciones liposomales como protector ha tenido éxito limitado, porq ue la eficacia de sum inistro es relativamente baja. Aunque se han intentado diversos métodos , con un ojo hacia la distribución del ADN mediante la administración oral , lo que han producid o expertos en la materia anteriores es un proceso y un dispositivo el cual permite la distribución am plia del ADN por todos los órganos y tejidos mediante la administración oral, por lo que se lleva a cabo una expresión de proteína persistente y eficaz.
BREVE DESCRI PCIÓN DE LA INVENCIÓN Quong ef al, en un artícu lo titulado "ADNA Protection from Extracapsular Nucleases, within Chitosan or Poly-L-lysine-coated Alginate Beads" (" Protección de ADNA derivado de nucleasas extracapsulares, en cuentas de alginato recubiertas con q uitosan o poli-L-lisina") (Biotechnology and Bioengineering , Vol . 60, No . 1 , 1 0/98, páginas 124-1 34) descri be la inmovilización de ADN en una matriz de alg inato utilizando sea una fuente interna o externa de calcio seguido por recubrimiento de membrana con quitosan o poli-L-lisina (PLL) . El trabajo realizado por Quong et al. concluyó que el recubrimiento de PLL proporciona una protección acentuada de ADN contra la DNasa in vitro cuando se compara con las cuentas no recubiertas. Ward et al. (Blood , 1 5 de Abril de 2001 , Volumen 97, Número 8, Páginas 2221 -2229) se refiere a las formas intravenosas de terapia genética capaz de una circulación sistém ica. Los complejos de poIi(L-lisina-) (P LL) han sido seleccionados para diversas líneas celulares in vitro por la unión covalente de ligantes seleccionados como objetivo a la PLL, dando como resultado la expresión transgénica. Ward caracteriza estos complejos por tener poco uso in vivo dado que tienen vidas medias pobremente circulatorias. Ward teoriza además que dado que los complejos activan el complemento humano in vitro y estimulan el sistema inmunológico, esto muy probablemente de cuenta de su vida media pobre in vivo. Consecuentemente, esta obra falla en describir cualquier forma de distribución amplia transgénica o expresión (de proteínas, anticuerpos o los productos codificados similares) mediante esta metodología. othbard et al. (Nature Medicine, Volumen 6, Número 11, Noviembre 2000, págs. 1253-1257) describe la conjugación de arginina y ciclosporina-A para formar un compuesto útil para atravesar el estrato córneo e ingresar consecuentemente a la epidermis. El proceso descrito es útil para formar un conjugado el cual, a diferencia de la ciclosporina-A sola, es capaz de alcanzar linfocitos T dérmicos e inhibir la inflamación cutánea. La referencia falla en enseñar o sugerir la conjugación del ADN en arginina, ni en cualquier manera contemplan la ingestión oral de una arginina conjugada de cualquier clase. Wender et al. (PNAS, 11/21/2000, vol. 97, no. 24, 13003-13008) describe los derivados peptoides de poliguanidina los cuales preservan el espaciamiento de estructura principal 1,4 de las cadenas laterales de oligómeros de arginina para ser transportadores moleculares eficaces como se evidencia por la captación celular. Aunque se sugiere que estos peptoides podrían servir como transportadores eficaces para el suministro molecular de drogas, candidatos de droga, y agentes en células, la referencia es empero silente en cuanto al concepto de suministro oral mediante esta ruta, y no describe la formación de un complejo entre el ingrediente activo, por ejemplo, ADN o una droga, y los derivados peptoides de poliguanidina. Uno de los presentes inventores es co-autor de una serie de artículos relacionados con la terapia genética. En un artículo en Human Gene Therapy, (6:165-175 (Febrero de 1995) Al-Hendy et al.) se describe la terapia genética somática no autóloga mediante el uso de mioblastos encapsulados que segregan la hormona de crecimiento de ratón en ratones enanos Snell deficientes de la hormona de crecimiento. Las microcápsulas de alginato-poli-l-lisina-alginato inmunoprotectoras se utilizaron para proteger células alogénicas recombinantes del rechazo subsecuente a su implante. No se contempla ni sugiere la terapia genética oral. En Blood, Vol. 87, No. 12, 15 de Junio de 1996, págs. 5095-5103, Hortelano et al describen el suministro del Factor Humano IX por el uso de mioblastos recombinantes encapsulados. Las gotitas de una mezcla celular de alginato se recogieron en una solución de cloruro de calcio. Después del contacto, se gelificaron las gotitas. Subsecuentemente, la capa exterior de alginato se degradó con hidrobromuro de poli-L-lisina (PLL) y después con otra capa de alginato. El núcleo restante libre de alginato se disolvió después mediante citrato de sodio para entregar microcápsulas con un membrana de alginato-PLL-alginato con contenido de células. Se describe una tecnología similar en Awrey et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 52, págs. 472-484 (1996), Peirone et a/., "Encapsulation of Various Recombinant mammalian Cell types in different alginate microcapsules" ("Encapsulación de diversos tipos celulares mamíferos recombinantes en diferentes microcápsuias de alginato"), Journal of Biomedical Materials Research 42(4):587-596, 1998), y en Haemophilia (2001), 7, 207-214. Las referencias ni describen ni sugieren el uso de dispositivos de inmuno-aislamiento para el suministro de terapia genética mediante una ruta oral. En un artículo por Chang et al., Tibtech/Trends in Biotechnology, 17(2); Febrero de 1999, titulado "The in Vivo Delivery of Heterologous Proteins by Microencapsulated Recombinant Cells" ("El suministro in vivo de las proteínas heterólogas por células recombinantes microencapsuladas"), el uso de E-coli microencapsulado diseñado para expresar el gen de ureasa de Klebsiella aerogens se administró oralmente. Se describe que el paso de las bacterias vivas por el tracto gastrointestinal se encontró que permite el despeje de la urea, disminuyendo así los niveles de urea de plasma. Esta descripción no es sugestiva del uso de la terapia genética oral para dar como resultado una diseminación amplia del ADN mediante una trayectoria oral. Brown et al., "Preliminary characterization of Novel Amino Acid Based Polymeric Vesicies as Gene and Drug Delivery Agents" ("Caracterización preeliminar de vesículas poliméricas basadas en aminoácidos novedosos como agentes genéticos y de suministro de drogas") (Bioconjugate Chem.2000, 11, 880-891) enseña la formación de una matriz polimérica anfifílica que utiliza poli-L-lisina con modificación de glicol de polietileno, como medio de suministro genético a una célula in vivo. La descripción se refiere a la transferencia de ADN en células vivas cuando se incorpora en vesículas de PLL-PEG. La descripción falla en enseñar la administración oral, ni la combinación de un protector del tracto Gl, tal como alginato, en combinación con un polipéptido adecuado para su uso como un agente de transporte de ADN de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. Leong et al., "Oral Gene Delivery With Chitosan-DNA Nanoparticles Generates Immunologic Protection in A Murine Model Of Peanut Allergy" ("Suministro oral con genes con nanopartículas de quitosan-ADN genera protección ¡nmunológíca en un modelo murino de alergia al maní") (Nature Medicine, Volumen 5, Número 4, Abril de 1999, págs. 387-391) describe las nanopartículas de quítosan/ADN sintetizadas al complejar el ADN de plásmido con quitosan para la ingestión oral a fin de tratar la respuesta alérgica al antígeno de maní. La referencia falla en mostrar la distribución amplia, porque el teñido mostró solamente la expresión genética en el estómago y el intestino delgado. La Patente de E.U. No. 6,217,859 describe una composición para la administración oral a un paciente para la eliminación de químicos o aminoácidos indeseables ocasionados por enfermedad. La composición comprende microorganismos entrampados o encapsulados capaces de eliminar los químicos o aminoácidos indeseables. Las cápsulas pueden comprender una variedad de polímeros, elastómeros, y lo similar, inclusive los cuales son compuestos de quitosan-alginato y alginato-polilisina-alginato. La Patente de E.U. No. 6,177,274 se refiere hacia un compuesto para un suministro de genes seleccionados como objetivo que consiste en poli(L-lisina) injertada con glicoi de polietileno (PEG) y un residuo de selección como objetivo. Los portadores de genes poliméricos de esta invención son capaces de formar complejos estables y solubles con ácidos nucléicos, los cuales a su vez son capaces de transformar eficazmente las células. La referencia falla en sugerir o describir un complejo que incluye ADN, ni el uso de tal complejo para el suministro oral del mismo. La Patente de E.U. No. 6,258,789 se refiere a un método para suministrar una proteína segregada en el torrente sanguíneo de un sujeto mamífero. En el método descrito, las células epiteliales intestinales de un sujeto mamífero se alteran genéticamente para incorporar operativamente un gen el cual expresa una proteína que tenga un efecto deseado. El método de la invención comprende la •administración de una formulación con contenido de ADN al tracto gastrointestinal, preferentemente por una ruta oral. La proteína recombinante expresada se segrega directamente en el torrente sanguíneo. De interés particular es el uso del método de la invención para proporcionar durante corto plazo, por ejemplo, dos a tres días, suministro de productos genéticos al torrente sanguíneo. La Patente de E.U. No.6,255,289 describe un método para la alteración genética de células de la glándula secretoria, particularmente células de la glándula pancreática y salival, a fin de incorporarse operativamente a un gen que expresa una proteína la cual tiene un efecto terapéutico deseado en un sujeto mamífero. La proteína expresada se segrega directamente en el tracto gastrointestinal y/o torrente sanguíneo para obtener los niveles sanguíneos terapéuticos de la proteína tratando consecuentemente al paciente en necesidad de la proteína. Las células de glándula secretoria transformadas proporcionan curas terapéuticas a largo plazo para las enfermedades asociadas con una deficiencia en una proteína particular o que son sensibles al tratamiento por la sobreexpresión de una proteína. La Patente de E.U. No. 6,225,290 describe un proceso en el que las células epiteliales intestinales de un sujeto mamífero se alteran genéticamente para incorporar operativamente un gen el cual expresa una proteína la cual tiene un efecto terapéutico deseado. La transformación celular intestinal se realiza por la administración de una formulación compuesta básicamente de ADN puro. Las rutas de administración oral u otras rutas intragastrointestinales proporcionan un método para la administración, mientras que el uso de ácido nucléico puro evita las complicaciones asociadas con el uso de vectores virales para realizar la terapia genética. La proteína expresada se segrega directamente en el tracto gastrointestinal y/o el torrente sanguíneo para obtener niveles sanguíneos terapéuticos de la proteína tratando así al paciente en necesidad de la proteína. Las células epiteliales intestinales transformadas proporcionan curas terapéuticas a corto plazo o posiblemente a largo plazo (por ejemplo, de corto plazo son de hasta aproximadamente 2-4 días, mientras que a largo plazo, mediante la incorporación en vellosidades intestinales se teoriza que dura posiblemente semanas o meses) para enfermedades asociadas con una deficiencia en una proteína particular o que son sensibles al tratamiento por la sobreexpresión de una proteína. Sin embargo, se observa que la expresión se encuentra limitada al tracto gastrointestinal, relegando consecuentemente la distribución de la entidad expresada al torrente sanguíneo, donde se vuelve problemática la respuesta inmunogénica y la neutralización resultante de dicha entidad mediante el sistema inmunológico. La Patente de E.U. No. 5,837,693 se refiere al suministro intravenoso de polipéptidos de hormona por expresión de la glándula salival. Las células de glándula secretoria, particularmente las células de glándula pancreática y salival, se alteran genéticamente para incorporar operativamente un gen el cual expresa una proteína que tiene un efecto terapéutico deseado en un sujeto mamífero. La proteína expresada puede segregarse directamente en el tracto gastrointestinal y/o el torrente sanguíneo. Las células de la glándula secretoria transformadas pueden proporcionar curas terapéuticas para enfermedades asociadas con una deficiencia en una proteína particular o que sean sensibles al tratamiento por la sobreexpresión de una proteína. La Patente de E.U. No. 5,885,971 se refiere a terapia genética por la expresión de la glándula secretoria. Las células de la glándula secretoria, particularmente las células de la glándula pancreática y salival, se alteran genéticamente para incorporar operativamente un gen que exprese una proteína que tiene un efecto terapéutico deseado en un sujeto mamífero. La proteína expresada puede segregarse directamente en el tracto gastrointestinal y/o torrente sanguíneo para obtener niveles sanguíneos terapéuticos de la proteína tratando consecuentemente al paciente en necesidad de la proteína. Las células de glándula secretoria transformadas proporcionan curas terapéuticas a largo plazo para enfermedades asociadas con una deficiencia en una proteína particular o que son sensibles al tratamiento por la sobreexpresión de una proteína. La Patente de E.U. No. 6,004,944 se refiere al suministro de proteínas mediante expresión de la glándula secretoria. Las células de glándula secretoria, particularmente células pancreáticas, hepáticas, y salivales, se alteran genéticamente para incorporar operativamente un gen el cual expresa una proteína que tiene un efecto terapéutico deseado en un sujeto mamífero. La proteína expresada puede segregarse directamente en el torrente sanguíneo para obtener niveles terapéuticos de la proteína tratando consecuentemente al paciente en necesidad de la proteína. Las células de glándula secretoria transformadas pueden proporcionar terapias de largo plazo o corto plazo para enfermedades asociadas con una deficiencia en una proteína particular o que son sensibles al tratamiento por la sobreexpresión de una proteína.
La Patente de E.U. No. 6,008,336 se refiere a ácidos nucléicos compactados y a su suministro a células. Los ácidos nucléicos se compactan, substancialmente sin agregación, para facilitar su captación por las células seleccionadas como objetivo de un organismo al cual se administra el material compactado. Los ácidos nucléicos pueden alcanzar un efecto clínico como resultado de la expresión genética, hibridación a ácidos nucléicos endógenos cuya expresión es indeseable, o integración de sitio específico de manera que se reemplaza un gen seleccionado como objetivo, se modifica o elimina. La selección como objetivo puede acentuarse por medio de un residuo de unión celular seleccionado como objetivo. El ácido nucléico preferentemente se compacta a un estado condensado. En una modalidad, los complejos de ácido nucléico son esencialmente consistentes de una sola molécula de cADN de doble cepa y una o más moléculas de polilisina, en los que dicha molécula de cADN codifica al menos una proteína funcional, donde dicho complejo se compacta a un diámetro que es menor del doble del mínimo diámetro teórico de un complejo de dicha molécula individual de cADN y un número suficiente de moléculas de polilisina para proporcionar una tasa de carga de 1:1, en forma de esfera condensada, donde los complejos de ácido nucléico se asocian con un lípido. La Patente de E.U. No.6,287,817 describe un conjugado de proteína consistente en un anticuerpo dirigido en el plgR y A-i AT los cuales pueden transportarse específicamente desde la superficie basolateral de células epiteliales hasta la superficie apical. Este planteamiento proporciona la capacidad de suministrar una proteína terapéutica directamente a la superficie apical del epitelio, seleccionando como objetivo el plgR con un ligante apropiado. La Patente de E.U. No. 6,261,787 expone una molécula bifuncional consistente en una molécula terapéutica y un ligante el cual une específicamente un receptor transcitótico; dicha molécula bifuncional puede transportarse específicamente desde la superficie basolateral de las células epiteliales a la superficie apical. Este planteamiento proporciona la capacidad de suministrar una molécula terapéutica directamente a la superficie apical del epitelio, seleccionando como objetivo el receptor transcitótico con un ligante apropiado. La Patente de E.U. No. 5,877,302 se refiere hacia los ácidos nucléicos compactados y su suministro a células. Los ácidos nucléicos se compactan, substancialmente sin agregación, para facilitar su captación por células seleccionadas como objetivo de un organismo al cual se administra el material compactado. Los ácidos nucléicos pueden alcanzar un efecto clínico como resultado de la expresión genética, la hibridación a los ácidos nucléicos endógenos cuya expresión es indeseable, o integración de sitio específico de manera que se reemplaza, modifica o elimina un gen seleccionado como objetivo. La selección como objetivo puede acentuarse por medio de un residuo de unión celular, por ejemplo, polilisina. El ácido nucléico preferentemente se compacta hasta un estado condensado. La Patente de E.U. No. 6,159,502 se refiere a un sistema de suministro oral para micropartícuias. Existen complejos y composiciones descritos para el suministro oral de una substancia o substancias a la circulación o sistema de drenaje linfático de un huésped. Los complejos de la invención comprenden una micropartícuia acoplada al menos a un portador, siendo el portador capaz de habilitar el complejo para transportarse a la circulación o sistema de drenaje linfático mediante el epitelio mucosa! del huésped, y la micropartícuia entrampando o encapsulando, o siendo capaz de entrampar o encapsular, la(s) substancia(s). Los ejemplos de portadores adecuados son proteínas de unión mucosal, adhesinas bacterianas, adhesinas virales, subunidades de unión de toxina, lectinas, Vitamina B12 y análogos o derivados de vitamina B12 que poseen actividad de unión al factor intrínseco de Castle. Esta invención difiere de la presente descripción porque requiere el entrampamiento o encapsulación, que ni asegura ni habilita la distribución amplia, expresión sistémica, o suministro sostenido que son características novedosas de la invención recientemente descrita. La Patente de E.U. No. 6,011,018 describe la transcripción regulada de genes seleccionados como objetivo y otros eventos biológicos. La dimerización y oligomerización de proteínas son mecanismos de control biológico general que contribuyen a la activación de los receptores de membrana celular, factores de transcripción, proteínas de fusión vesicular, y otras clases de proteínas intra- y extracelulares. Los poseedores de patentes han desarrollado un procedimiento general para la dimerización regulada (inducible) o la oligomerización de proteínas intracelulares. En principio, cualesquier dos proteínas de objetivo pueden inducirse a fin de asociar por tratamiento las células u organismos que las cosechan con ligantes sintéticos, permeables a células. Se considera que la asociación de proteínas intracelulares reguladas con estos ligantes sintéticos, permeables a células ofrece nuevas capacidades en la investigación biológica y la medicina, en particular, en la terapia genética. Utilizando las técnicas de transferencia genética para introducir estos receptores artificiales, se indica que uno puede encender o apagar las trayectorias de señalización que conducen a la sobreexpresión de proteínas terapéuticas administrando oralmente "dimerizadores" o "des-dimerizadores" activos respectivamente. Dado que las células provenientes de diferentes recipientes pueden configurarse para tener la trayectoria sobreexpresan diferentes proteínas terapéuticas para su uso en una variedad de padecimientos, los dimerizadores tienen el potencial de servir como "drogas universales". Pueden verse también como reemplazos orgánicos, permeables a las células, para agentes terapéuticos antidetección o para proteínas que de otra manera requerirían la inyección intravenosa o la expresión intracelular (por ejemplo, el receptor LDL o la proteína CFTR). Lo que hace falta en la materia es una composición oralmente suministrable capaz de alcanzar: a) un suministro y distribución amplios de un agente terapéutico tal como ADN, a esencialmente todas las células del sujeto seleccionado como objetivo, b) una capacidad para proporcionar una expresión sostenida (por ejemplo, no transitoria) de un residuo terapéutico por dicho agente terapéutico (sea ubicuamente o de manera específica en un tejido), a partir de una sola administración, mediante la captación celular virtuaimente en todos los órganos y sistemas celulares por todo el cuerpo, y c) sin producir una respuesta inmune no deseada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una composición y proceso no invasivo para la administración de un agente terapéutico. Más particularmente, la invención describe una composición para su uso en la administración de terapia genética oral y un proceso para su producción y uso. Diversos obstáculos han evitado un protocolo de terapia genética oral. El primer obstáculo ha sido la intensa degradación del ADN ingerido. Proteger este ADN de otra manera puro de la destrucción cuando se coloca en el tracto gastrointestinal, por ejemplo, mediante el uso de quitosan, colágeno, alginato o lo similar, permite la absorción limitada de ADN mediante el tracto gastrointestinal, a pesar de que tenga un alcance limitado de suministro y mala expresión. Con objeto de lograr una distribución y eficacia máximas mediante la administración oral, se ha determinado que el ADN requiere una cubierta protectora. Por ejemplo, el alginato es un medio para proporcionar protección en el tracto gastrointestinal. Adicionalmente, se requiere un agente de transporte, el cual es capaz de transportar el ADN por trayectorias naturales, y sin producir una respuesta inmunogénica no deseada o indeseable durante el transporte. El agente de transporte, en su sentido amplio, puede ser cualquier compuesto que contenga un grupo amina que sea capaz de acoplarse con el ADN (u otro agente terapéutico) de manera eficaz para producir una distribución eficaz y amplia y una captación celular subsecuente al paso mediante dicha trayectoria natural gastrointestinal. Tal acoplamiento del agente terapéutico y el agente de transporte permite consecuentemente la absorción, distribución y expresión amplia y eficaz de los mismos. En una modalidad particularmente preferida, el agente de transporte es preferentemente un polipéptido o una modificación del mismo, por ejemplo, de un aminoácido, pero puede ser cualquier compuesto que tenga un grupo amina y un grupo acídico los cuales permitirán eficazmente la distribución in vivo. El agente de transporte es necesario con objeto de alcanzar una distribución eficaz y amplia del producto terapéutico, por ejemplo, ADN in vivo. Consecuentemente, en una modalidad preferida, las formulaciones descritas en la presente acoplarán el ADN al compuesto amino, por ejemplo, mediante una unión electrostática, mientras que protegen el ADN de la degradación en el tracto gastrointestinal, por ejemplo, con un alginato o un compuesto protector equivalente. Tal formulación puede ejemplificarse ilustrativamente como un alginato degradado con poli-L-lisina, tal como en forma de una nanopartícula. Aunque los presentes inventores han mostrado que la expresión limitada es posible simplemente protegiendo el ADN en el tracto Gl mediante el uso de gelatina o alginato, sin PLL, o incluso mediante la administración de ADN puro, la efectividad es claramente mucho menor, y por lo tanto es muy preferida la inclusión de un agente protector y un agente de transporte (por ejemplo, alginato/PLL). Con objeto de elaborar microcápsulas de ADN, el ADN se mezcla primeramente con alginato o un compuesto que tiene propiedades similares para proporcionar protección de tracto de Gl para el ADN, entonces las cápsulas se forman físicamente con alginato-ADN al interior, y posteriormente el agente de transporte, por ejemplo, PLL, se agrega para degradar las cuentas de alginato, de manera tal que ocurre la conjugación o acoplamiento entre el agente de transporte y el ADN, aunque el agente de transporte no encapsula específicamente el agente terapéutico. Ausente la presencia del agente de transporte, por ejemplo, PLL, nuestros experimentos indican que no existe distribución o suministro amplios no que existe una expresión sistémica o sostenida. Esto evidencia la teoría de que ocurre una interacción o acoplamiento del agente de transporte y el agente terapéutico en las cápsulas, explicando consecuentemente la eficacia de las microcápsulas descritas en la presente en la distribución de ADN a todos los órganos principales. La expresión de tejido específico de genes terapéuticos puede lograrse utilizando elementos reguladores genéticos de tejido específico (mejoradores) que restringen la expresión genética a órganos específicos. Mediante el uso juicioso de mejoradores, el grado de expresión puede personalizarse para cumplir las necesidades específicas. Por ejemplo, mediante el uso de ß actina, se logra una expresión amplia de un mejorador ubicuo. Alternativamente, el uso de elementos reguladores genéticos de tejido específico (mejoradores), se ilustran, pero no se limitan al mejorador de albúmina (expresión de hígado), quinasa de creatina muscular (MCK) para la expresión muscular, y queratinocita (expresión cutánea) proporcionan la capacidad de expresar la proteína en una porción particularmente deseada del cuerpo. De acuerdo con lo anterior, un objetivo de la presente invención es proporcionar el suministro sistémico de una unidad de transcripción completa, por ejemplo, ADN o ARN, o componentes los cuales permiten una unidad de transcripción completa en las células, por ejemplo, cADN FIX acoplado a un mejorador adecuado y señal de poliadenilación, a virtualmente todas las células de un organismo, por una trayectoria oral. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la expresión controlable (por ejemplo, ubicuo o de tejido específico) de los residuos terapéuticos mediante dicha unidad de transcripción completa en conjunto con la selección de mejorador juicioso. Un objetivo aún adicional de la presente invención es proporcionar el suministro de ADN y ARN a una variedad de órganos, incluyendo pero sin limitarse a corazón, músculo, pulmones, piel, riñon, hígado, cerebro y bazo, en conjunto con la expresión apropiado de residuos terapéuticos, como se desea. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método para el tratamiento, por terapias con genes, de enfermedades genéticas heredadas (por ejemplo, hemofilia, Distrofia Muscular de Duschenne, Fibrosis Cística, diabetes, etc.), así como también enfermedades adquiridas, para enfermedades infecciosas, para las cuales son obtenibles tanto la prevención como tratamiento, por ejemplo, cáncer, SI DA y lo similar, mediante el suministro de genes terapéuticos, o drogas, por ejemplo, por el suministro directamente a un sitio de tumor, por ejemplo, mediante el uso de residuos de selección como objetivos. Otros objetivos y ventajas de esta invención se volverán aparentes a partir de la siguiente descripción tomada en conjunto con los dibujos acompañantes en los que se exponen, mediante la ilustración y el ejemplo, algunas modalidades de esta invención. Los dibujos constituyen una parte de esta especificación e incluyen modalidades a manera de ejemplo de la presente invención e ilustran diversos objetos y características de los mismos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En los dibujos acompañantes, los cuales ilustran una modalidad a manera de ejemplo de la presente invención: La Figura 1 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en el hígado; La Figura 2 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en el riñon; La Figura 3 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión en el pulmón; La Figura 4 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en el corazón; La Figura 5 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en el músculo; La Figura 6 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión en la piel; La Figura 7 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en los vasos; La Figura 8 representa un análisis gráfico de una prueba in vitro de Tiempo Tromboplastina Parcial Activada (APTT); La Figura 9 es una representación gráfica de amplificación de PCR y análisis de órganos de ratones alimentados con ADN de GFP y se sacrificaron el día 42 después de la ingestión; La Figura 10 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el duodeno; La Figura 11 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el yeyuno; La Figura 12 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el íleo; La Figura 13 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el colon; La Figura 14 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el hígado; La Figura 15 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el bazo; La Figura 16 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el riñon; La Figura 17 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el pulmón; La Figura 18 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el corazón; La Figura 19 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el músculo; La Figura 20 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el páncreas; La Figura 21 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el cerebro; La Figura 22 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en las gónadas; La Figura 23 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en la piel; La Figura 24 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en los vasos; La Figura 25 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en la médula ósea; La Figura 26 es una representación gráfica que muestra los niveles de hGH en los ratones tratados; La Figura 27 ilustra que los anticuerpos anti-hGH no se detectaron después de la producción hGH; La Figura 28 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión de tejido específico en el hígado utilizando un mejorador de albúmina; La Figura 29 es una gráfica de barras que compara el nivel de hGH alcanzado utilizando tecnologías alternativas; La Figura 30 es un análisis gráfico en el transcurso del tiempo de niveles de hGH alcanzados utilizando tecnologías alternativas; La Figura 31 es ilustrativa de la presencia de hGH en diversos órganos alcanzada utilizando tecnologías alternativas; La Figura 32 representa gráficamente la ganancia de peso atribuible a niveles de hGH alcanzados utilizando tecnologías alternativas.
DESCRIPCIÓN D ETALLADA DE LA INVENCIÓN Los objetivos primarios de esta invención es la administración oral de un agente de transporte, ejemplificado como, pero sin limitarse a, un portador de aminoácidos, por ejemplo, poli-l-lisina, poliarginina y poliornitina, para propósitos de realizar un compuesto, el cual aunque no se limita al ADN, se ejemplificará empero como tal para propósitos de ilustración en la presente, mediante el tracto gastrointestinal y permitiendo su distribución amplia y expresión sistémica y sostenida por todo el cuerpo. Con objeto de que el compuesto, por ejemplo, el ADN, sea distribuibie por el tracto gastrointestinal con el más alto grado posible de eficacia, debe protegerse de la degradación de enzimas y pH bajo a medida que pasa por el estómago y el intestino delgado. En una modalidad preferida, esto se realiza por el uso de compuestos protectores, ilustrativos de los cuales son el alginato, gelatina (la cual es básicamente colágeno) y lo similar. El papel del alginato, gelatina y colágeno para proteger la formulación clave (ADN-complejo de aminoácidos) por el estómago es muy importante para asegurar la integridad del ADN (facilitando así el logro de una eficacia de suministro), pero también puede realizarse con formulaciones alternativas tales como quitosan, metacrilato, o alternativamente, uno o más sistemas convencionales de suministro oral utilizados por la industria farmacéutica, por ejemplo, cápsulas, geles degradables, etc. Los presentes inventores han determinado que el ADN no acoplado recto (Anaked@), si se encuentra protegido adecuadamente con gelatina (colágeno) o lo similar, se toma también por la pared intestinal y se expresa en algunos tejidos, pero no todos los tejidos. Sin embargo, es importante distinguir que en este caso: a) la eficacia del suministro y expresión de ADN puro es extremadamente baja y b) no es de larga duración, lo cual se encuentra en acuerdo con intentos de perfeccionar el suministro oral del ADN descrito en la técnica anterior. Consecuentemente, aunque los presentes inventores han logrado un éxito limitado ausente un acoplamiento eficaz para un agente de transporte, esto sigue siendo una modalidad no preferida de la presente invención. Adicionalmente, aunque la ruta gastrointestinal preferida, y más eficaz es mediante el suministro oral, de hecho el suministro rectal se encuentra contemplado por los presentes inventores como una ruta alternativa para la administración mediante la trayectoria gastrointestinal. Como hemos notado anteriormente, ya se ha descrito la encapsulación del ADN en microcápsulas de alginato-poli-L-lisina, sin embargo los anteriores expertos en la materia fallaron en apreciar la importancia de acoplar el agente terapéutico con el agente de transporte, por ejemplo, mediante unión electrostática, de manera eficaz para producir una distribución amplia y eficaz y una captación celular subsecuente al paso mediante dicha trayectoria gastrointestinal natural. Aunque hemos ejemplificado una modalidad la cual utiliza unión electrostática, preferentemente mediante el uso de aminoácidos cargados positivamente los cuales se unen a un agente terapéutico cargado negativamente tal como el ADN, se contemplan técnicas de unión alternativas para su uso en la presente invención. Cualquier agente de transporte se considera útil en el contexto de la presente invención siempre que se acople con un agente terapéutico de manera eficaz para producir una distribución eficaz y amplia y una captación celular subsecuente al paso mediante dicha trayectoria gastrointestinal natural. Los agentes de transporte alternativos contemplados por ser útiles dentro del contexto de esta invención pueden incluir, pero no se limitan a, aminoácidos que tienen una carga eléctrica alterada, compuestos o aminoácidos modificados químicamente, o moléculas sintetizadas que tienen los agrupamientos funcionales necesarios para hacer un uso ventajoso de las trayectorias de transporte naturales descritas en la presente. Los anteriores expertos en la materia tales como Aggarwal ef al (Canadian Journal of Veterinary Research, 1999, 63:148-152 y athiowitz et al., Nature, Vol 386, Marzo de 1997, págs. 410-414) enseñan el uso de microesferas biodegradables y adhesivas biológicamente respectivamente, como un medio para el suministro oral de drogas de agentes con contenido de material genético tales como ADN. Ninguno de estos expertos reconoció o persiguió el uso de un agente de transporte como se detalla por la presente invención, ni reconocieron el valor de acoplar un agente terapéutico al mismo a fin de facilitar el suministro y expresión amplios, sistémicos y sostenidos los cuales son sellos del concepto de la presente invención. En cambio, aunque no se logra la distribución, suministro, eficacia o expresión deseables, los anteriores expertos en la materia requirieron empero de la encapsulación del agente terapéutico, un requisito que se supera mediante la invención enseñada en la presente. Mathiowitz et al. utilizaron polianhídridos de una combinación de ácidos fumárico y sebácico para encapsular un ADN de plásmido (ß-galactosidasa). Sin embargo, como se evidencia en la Figura 5 del artículo, la cuantificación de la actividad de ß-galactosidasa en extractos de tejido no mostró ninguna actividad significativa en estómago o hígado, sino una actividad mensurable dentro del intestino. Esto es indicativo de una incapacidad de la tecnología de Mathiowitz para evidenciar el transporte por el intestino a fin de habilitar el suministro y/o la expresión en otros órganos. Con objeto de determinar la efectividad relativa de las modalidades de Aggarwal se realizó un estudio comparativo entre una formulación de acuerdo con las partículas de la presente invención (alginato-PLL-ADN) (en lo sucesivo referidas como formulaciones de alginato) y las microcápsulas de alginato-PLL elaboradas por gelificación interna como se describe en Aggarwal y en lo sucesivo referidas como cápsulas de cánola (elaboradas utilizando aceite de cánola).
Una sola dosis de 100 microgramos de un plásmido de ADN con contenido del cADN de hormona del crecimiento humano en una nanopartícula de alginato-DNA-PLL de acuerdo con la presente invención se administró oralmente a ratones C57BL/6. Un segundo grupo de ratones (n = 3) recibió el mismo plásmido en cápsulas de cánola. Observe que cada uno de estos ratones recibió 300 microgramos de ADN, en lugar de 100 microgramos determinados en la formulación de alginato (tres veces más ADN). Un grupo de control de ratones no recibió nada. Los ratones se desangraron los días 0, 3 y 5 (para comparar la expresión hasta el día 5, reproduciendo consecuentemente los resultados como se determina por Aggarwal et al.). El nivel de la hormona del crecimiento humano (hGH) en suero de ratón el día 5 después del tratamiento se determinó por ELISA (UBI Inc., NY). Los ratones que recibieron la formulación de alginato tuvieron comparativamente niveles altos de hGH en el suero. En cambio, la hGH no se detectó el día 5 en ratones que recibieron cápsulas de cánola, a pesar de que los ratones que recibieron esta formulación se les administró tres veces más ADN que los ratones que recibieron la formulación de alginato. Como se esperaba, los ratones de control no tuvieron hGH detectable en el suero. Estos datos, como se observa en la Figura 29 muestran que la eficacia de la formulación de alginato es mucho mayor que las cápsulas de cánola.
Refiriéndose ahora a la Figura 30, esta gráfica representa gráficamente el nivel de hGH en el suero de ratón los días 3 y 5. Los ratones a los que se les administró cápsulas de cánola tuvieron una hGH muy modesta pero detectable el día 3. Sin embargo, este suministro fue transitorio, y el hGH fue indetectable el día 5. Esto es consistente con el documento de Aggarwal ef al., donde es necesario alimentar ratones diariamente durante tres días con objeto de detectar el hGH circulante el día 5. La naturaleza transitoria del suministro de hGH es consistente con la captación de ADN por el intestino, en lugar de la distribución del ADN sistémicamente, como se enseña por la presente invención. En cambio, los ratones a los que se les administró la formulación de alginato mostraron niveles altos de hGH el día 3, que continúan incrementándose el día 5. Esto es consistente con todos nuestros datos anteriores, indicando que la formulación de alginato conduce a una expresión genética sostenida, no transitoria. Consecuentemente, la captación y expresión del ADN es diferente con ambas formulaciones. La tendencia diferente del suministro de hGH con ambas formulaciones sugeriría que ambas formulaciones se toman por rutas y/o mecanismo(s) diferentes. Con referencia a la Figura 31, el día 5, los ratones se sacrificaron y se determinó la presencia de hGH en los diversos órganos. Los niveles altos de hGH se registraron en los órganos descritos en esta gráfica en ratones que recibieron la formulación de ADN de alginato. En cambio, ninguno de los ratones que recibieron las cápsulas de cánoia tuvieron hGH detectable en cualquiera de los órganos anteriores, incluso aunque estos ratones recibieron tres veces más ADN que el grupo anterior. Estos resultados son consistentes con nuestros datos anteriores que muestran una distribución sistémica amplia de ADN en órganos principales después de la administración de la formulación de alginato. Estos resultados son consistentes también con la falta de distribución sistémica de ADN utilizando formulaciones descritas en la técnica anterior. Finalmente, estos resultados resaltan también la diferencia obvia en la eficacia entre ambas formulaciones. Como evidencia adicional de la eficacia del suministro de acuerdo con la presente invención, se determinó una comparación de ganancia de peso debido a la presencia de niveles eficaces de hGH y es el tema de la Figura 32. Se sabe que el suministro de la hormona del crecimiento humano induce la ganancia de peso. Sin embargo, los experimentos de terapia genética que suministran hGH han demostrado solamente una ganancia de peso después de que se suministran niveles muy altos de hGH (niveles eficaces). Todos los ratones se pesaron el día 0, antes del tratamiento, y durante los 5 días del experimento. Los ratones que se alimentaron con cápsulas de cánoia no ganaron más peso que los ratones de control (p<0.145). En cambio, los ratones que se alimentaron con formulación de alginato ganaron peso en cantidades de hasta un 109.7% de incremento el día 5. La diferencia en la ganancia de peso entre los ratones alimentados con formulación de alginato y los ratones que recibieron cápsulas de cánola fue estadísticamente significativa (p<0.05). Los anteriores expertos en la materia han utilizado ADN unido a la PLL, pero no ha sido eficaz para suministrar genes en animales debido a que fallan en reconocer la importancia del suministro oral. Los anteriores expertos en la materia han utilizado ADN administrado oralmente protegido con quitosan, pero fallaron en unir el ADN a un agente de transporte y de distribución, tal como polipéptidos, fallando consecuentemente en producir una distribución amplia. Los anteriores expertos en la materia han utilizado también el suministro oral de ADN (segmentos cortos de oligonucleótidos de ADN que no incluyen un gen completo o secuencias reguladoras genéticas completas), incluido en microcápsulas en alginato-PLL, aunque no se acoplan o conjugan con el agente de transporte (como se requiere por la presente invención), con la intención de recuperar ADN proveniente de heces fecales y determinar consecuentemente si el ADN ha mutado por el intestino. Estos expertos en la materia fallaron en reconocer o sugerir si el ADN podría captarse por el intestino y expresarse, y por lo tanto fallaron en reconocer el producto o proceso descrito en la presente de suministro oral con genes. Por lo tanto, el suministro oral de ADN para la distribución amplia, en conjunto con la expresión sistémica y sostenida de terapéuticos no se ha alcanzado hasta ahora. Más aún, además del ADN, se contemplan agentes terapéuticos adicionales de transporte similares, ejemplos no limitantes de los cuales son el ARN, el cual tiene interés comercial debido a su capacidad de desactivar la transcripción/traducción de proteínas indeseables; y ribozimas, las cuales se definen como ARN catalítico que tiene la capacidad de reconocer, unir y desdoblar una secuencia específica de ARN celular tal como la de un virus, la cual podría suministrarse como un medio para tratar enfermedades infecciosas, tales como el SIDA.
Microcápsulas de ADN: En la formación de las diversas especies de la invención como se describe en lo sucesivo, se comprende que aquellas moléculas útiles como agentes de transporte exhibirán la capacidad para formar moléculas cargadas, por ejemplo, cadenas laterales positivas o negativas, a fin de permitir la inhibición, por ejemplo, conjugación, del agente activo con el agente de transporte.
Microcápsulas de ADN - Ejemplo 1 En una modalidad particular, aunque sea no limitante, la formación de plásmidos de ADN con contenido de una codificación de cADN para un transgen y elementos reguladores genéticos apropiados tales como un mejorador se realiza como se explica a continuación. Se mezcla una suspensión de ADN con alginato de potasio al 1.5% (Kelmar, Kelco Inc., Chicago, EUA) en una jeringa y se extrude mediante una aguja 27 G con una bomba de jeringa (39.3 ml/h). Un chorro de aire concéntrico a la aguja creó gotitas finas de la mezclas de ADN/alginato que se recogen en una solución de CaCI2 al 1.1%. Después del contacto, se gelifican las gotitas de alginato/AD . Después de que se extruden las microcápsulas, se someten a los enjuagues como se indica en la lista a continuación. La capa exterior de alginato se degrada química con hidrobromuro de poli-L-lisina (PLL, Sigma, St. Louis, EUA) con Mr en un rango de 15,000-30,000 durante 6 minutos, y después con otra capa de alginato. Finalmente, el núcleo de alginato libre restante puede disolverse con citrato de sodio durante 3 minutos, para entregar microcápsulas con una membrana de alginato-PLL-alginato con contenido de ADN al interior. El protocolo de microcápsulas convencionales utiliza un enjuague de citrato de 6 minutos. Con 3 minutos de citrato incrementamos la concentración de alginato remanente en el núcleo de la cápsula. Este procedimiento parece tener un efecto en el acoplamiento de ADN. Los enjuagues (a menos que se indique de otra manera, los pasos de enjuague se realizan sin tiempo de incubación intermedio): -cloruro de calcio al 1.1% -cloruro de calcio al 0.55% -cloruro de calcio al 0.28% -CHES (ácido 2-(Ciclohexilamino)etanosulfónico) al 0.1% durante aproximadamente 3 minutos -cloruro de calcio al 1.1% -PLL al 0.05% durante aproximadamente 6 minutos -CHES (ácido 2-(Ciclohexilamino)etanosulfónico) al 0.1% -cloruro de calcio al 1.1% -cloruro de sodio al 0.9% -alginato de potasio al 0.03% durante aproximadamente 4 minutos -cloruro de sodio al 0.9% -0.055M de citrato de sodio durante aproximadamente 3 minutos (el protocolo de microcápsulas convencionales es de 6 minutos) -cloruro de sodio al 0.9% Microcápsulas de ADN - Ejemplo 2 Se mezcla un volumen de 300 µ? de plásmido de ADN a una concentración de 1 µg/ml con 6 mi de alginato de calcio al 1.5%. Las cuentas de alginato se degradan, por ejemplo, con Poli-L-Lisina (PLL) dando como resultado microcápsula que contienen ADN-alginato en su interior. Las microcápsulas se mezclan subsecuentemente con un volumen 1:1 de una solución de gelatina al 50% para obtener una mezcla homogénea que puede administrarse.
Partículas de ADN-alqinato-PLL: Se mezcla un volumen de 100 µ? de plásmido de ADN a una concentración de 1 pg/ml con 50 µ? de alginato de calcio al 3%, y se mezcla a 4°C durante 3 horas con agitación suave. Se agrega un volumen de 50 µ? de poli-L-Lisina. La mezcla se revuelve durante 30 segundos y se mezcla a 4°C durante una hora adicional con agitación suave. Finalmente, se agregan 50 µ? de una solución de gelatina al 50% a la mezcla para obtener una mezcla homogénea que puede administrarse.
Partículas de ADN-PLL-alginato: En un ejemplo a manera de ejemplo, no limitante, de formación de microcápsulas de ADN-PLL-Alginato, se mezcla un volumen de 100 µ? de plásmido de ADN a una concentración de 1 pg/ml con 50 µ? de poli-L-lisina, y se mezcla a 4°C durante 3 horas con agitación suave. Se agrega un volumen de 50 µ? de alginato de calcio al 3%. La mezcla se revuelve durante 30 segundo y se mezcla a 4°C durante una hora adicional con agitación suave. Finalmente, se agregan 50 µ? de una solución de gelatina al 50% a la mezcla para obtener una mezcla homogénea que puede administrarse.
Partículas de ADN-ornitina-alqinato: Se mezcla un volumen de 100 µ? de plásmido de ADN a una concentración de 1pg/ml con 50 µ? de poli-L-Ornitina. La mezcla se revuelve durante 30 segundos y se mezcla a 4°C durante 3 horas con agitación suave. Se agrega un volumen de 50 µ? de alginato de calcio al 3% y se mezcla a 4°C durante una hora adicional con agitación suave. Finalmente, se agregan 50 µ? de una solución de gelatina al 50% a la mezcla para obtener una mezcla homogénea que puede administrarse.
Partículas de ADN-arginina-alginato: Se mezcla un volumen de 100 µ? de plásmido de ADN a una concentración de 1 g/ml con 50 µ? de poli-L-Arginina. La mezcla se revuelve durante 30 segundos y se mezcla a 4°C durante 3 horas con agitación suave. Se agrega un volumen de 50 mi de alginato de calcio al 3% y se mezcla a 4°C durante una hora adicional con agitación suave. Finalmente, se agregan 50 µ? de solución de gelatina al 50% a la mezcla para obtener una mezcla homogénea que puede administrarse.
ADN puro en colágeno: Se mezcla un volumen de 100 µ? de plásmido de ADN a una concentración de 1 g/ml con 50 µ? de una solución de gelatina al 50%, y se mezcla a conciencia para obtener una mezcla homogénea que puede administrarse. Las formulaciones de la presente invención pueden elaborarse también como nanopartículas o macropartículas de una variedad de tamaños, en combinación con compuestos anfifílicos, o lo similar, a fin de suministrar un compuesto tal como el ADN acoplado a un aminoácido. Aunque la lisina, la arginina y la ornitina se ilustran en la presente como agentes de transporte a manera de ejemplo, otros compuestos y/o composiciones que tienen al menos los grupos funcionales requeridos y si se requiere, una carga apropiada, pueden funcionar también como agentes de transporte de manera similar.
La inclusión de elementos reguladores genéticos particulares (mejoradores), le entregan a las composiciones de la presente invención la utilidad agregada de expresión controlable in vivo. La expresión de tejido específico de ios genes terapéuticos puede lograrse utilizando elementos reguladores genéticos de tejido específico que restringen la expresión genética a tejidos específicos. Mediante el uso juicioso de tales promotores, el grado de expresión puede personalizarse para cumplir necesidades específicas. Por ejemplo, mediante el uso de ß-Actina, se logra un mejorado ubicuo, de expresión amplia. Alternativamente, el uso de elementos reguladores genéticos de tejido específico, se ilustra, pero no se limita a un mejorador de albúmina (expresión de hígado), quinasa de creatina muscular (MCK) para la expresión muscular, y queratinocita (expresión cutánea) proporcionan la capacidad de expresar la proteína en una ubicación particularmente deseada, por ejemplo, una porción específica del cuerpo, órgano específico, o tipo de célula o tejido específico. De acuerdo con la presente invención un agente terapéutico incluye cualquier material genético que se introduce en un huésped con objeto de instigar un efecto biológico deseable. Tales materiales genéticos pueden incluir, pero no se limitan a ADN, ARN, Ribozima, Antidetección, Híbridos, sea de cepa individual o doble, o combinaciones de los mismos. De acuerdo con la presente invención un efecto biológico puede incluir, pero no se limita a, expresión genética, inhibición genética, y corrección genética. Dicho efecto biológico puede incluir, pero no se limita a, aquellos efectos los cuales se refieren directamente a ia captación celular de un agente terapéutico después del suministro oral, por ejemplo, ADN FIX el cual conduce a una producción de FIX. Dicho efecto biológico puede ocurrir directamente como resultado de dicha captación celular, como resultado de ia expresión sistémica, o alternativamente de expresión seleccionada como objetivo, lo cual se comprende por incluir la expresión dirigida específicamente a un órgano particular, sistema o una célula o grupo de células seleccionados como objetivo. Dicho efecto biológico se ejemplifica por, pero no se limita a, la modulación de un estado de enfermedad, donde la expresión de un agente terapéutico modifica el inicio, transcurso, manifestación o severidad del estado de enfermedad. De acuerdo con la presente invención, la expresión sistémica se comprende por referirse a la captación celular mensurable de un agente terapéutico en células, inclusive de, pero que no se limita a, las células de los tejidos epiteliales, conectores, nerviosos y músculo-esqueléticos, encontrados en diversos órganos por todo el cuerpo. De acuerdo con la presente invención, la expresión sostenida o el suministro sostenido se comprende por referirse a una expresión mensurable de un agente terapéutico suficiente para instigar un efecto biológico deseable, como resultado de una sola administración, cuyo efecto es detectable par aun mínimo de 40 días.
La proteína codificada por el agente terapéutico puede ser intracelular o extracelular. De acuerdo con la presente invención, la distribución amplia se comprende por referirse a la distribución de un agente terapéutico a esencialmente todos los órganos (como se evidencia y ejemplifica en las Tablas 1 y 2 y las figuras acompañantes), incluyendo pero sin limitarse al sistema nervioso central, en particular al cerebro, corazón y médula ósea; tal distribución efectuada, por ejemplo, mediante la membrana basal del epitelio intestinal y más allá de múltiples sitios de órgano. En sus modalidades preferidas, la presente invención se refiere a la formación de un residuo distribuible, cuyo residuo se forma por el acoplamiento de un agente de transporte y al menos un material genético de manera eficaz para proporcionar, mediante una trayectoria gastrointestinal (por ejemplo, oralmente o rectalmente), para una distribución amplia, la expresión sistémica y el suministro sostenido de dicho material. Dicho material genético puede ser, por ejemplo, una unidad de transcripción completa, la cual se define ampliamente como la combinación de al menos una porción particular de codificación de ADN para un agente terapéutico para el cual se desea la expresión, en combinación con un mejoradory otros elementos reguladores genéticos suficientes para proporcionar expresión, subsecuente a la absorción intracelular, del agente terapéutico deseado. Dicho agente puede comprender cualquier entidad expresada la cual exhibe valor terapéutico, y puede incluir, pero no se limita a, proteínas, anticuerpos, ADN, ARN, o porciones o fragmentos particulares de los mismos. Aunque se considera obligatorio el uso de un mejorador para la expresión del transgen con objeto de realizar exitosamente la expresión sistémica que es sello de la presente invención, un mejorador no es obligatorio cuando la meta es la inhibición de la producción de un producto terapéutico existente (es decir, virus de la hepatitis o genes de VIH en seres humanos). Adicionalmente, el uso de un tejido específico, contrariamente a un mejorador ubicuo proporciona un grado de libertad para personalizar el grado de expresión sistémica alcanzado. Además, el suministro de ácidos nucléicos de antidetección (ARN y/o ADN) o ribozimas puede realizarse sin incluir un mejorador. Otra aplicación contemplada por la presente tecnología, en la cual no se requiere una unidad de transcripción completa, tiene que ver con la utilización juiciosa de inteínas y exteínas con objeto de lograr un tipo de terapia genética. Las inteínas son secuencias de inserción incorporadas en una proteína precursora, y son capaces de lograr una segmentación de proteína que elimina la secuencia de inteína y al mismo tiempo liga los polipéptidos distintivos (definidos exteínas). El gen terapéutico puede dividirse en 2 entidades distintas que se administran separadamente mediante la técnica descrita en la presente. Las inteínas se han utilizado para producir una proteína funcional, después de la división del gen en 2 partes, que se expresaron separadamente. Después de que se elaboran las dos proteínas (traducción), las porciones de inteína se eliminan (por si mismas), y las porciones de exteína adyacentes (una en el extremo de una primera parte del gen y la segunda al inicio de la segunda parte de la parte genética) se unen conjuntamente para formar una proteína funcional completa. Sin embargo, la incorporación de un mejorador en una porción estará en orden para que se expresen ambas partes de la proteína. Adicionalmente, algunos vectores, tales como el virus Adenoasociados (AAV) forman concatámeros al interior de las células infectadas. En el proceso, el vector se multiplica a si mismo para crear una serie de copias del vector que se colocan una después de la otra. Uno puede explotar este hecho, utilizando la tecnología de agente de transporte descrita en la presente, para dividir un gen a la mitad, y expresar ambas porciones separadamente en dos vectores. Si una transporta después e introduce ambos vectores al interior de la misma célula, ambos vectores pueden colocarse físicamente juntos, y el contexto genético de mejorador completo puede reestablecerse al Interior de la célula. Alternativamente, como se muestra por Zhou et al., "Concatamerization of Adeno-Associated Virus Circular Genomes Occurs Through Intermolecular Recombination" ("La concatamerización de genomas circulares de virus-adenoasociado ocurre mediante recombinación intermolecular ") (J Virology 1999 Nov 73 (11): 9468-77), uno podría colocar el mejorador en un vector, y el transgen en un segundo vector, que se administran separadamente.
El listado siguiente de aminoácidos, sus derivados, y compuestos relacionados, son ejemplos ilustrativos no limitativos de compuestos que contienen la estructura requerida considerada necesaria para la distribución amplia del ADN in vivo.
Aminoácidos y derivados: Alifático - alanina, glicina, isoleucina, leucina, prolina, valina Aromático - fenilalanina, triptofan, tirosina Acídico - ácido aspártico, ácido glutámico Básico - arginina, histidina, lisina Hidroxílico - serina, treonina Con contenido de azufre - cisteína, metionina Amídica (con contenido de grupo amida) - asparagina, glutamina Péptidos: Pueden enlazarse dos aminoácidos individuales para formar una molécula más grande, con la pérdida de una molécula de agua como un derivado de la reacción. El enlace de C-N recién creado entre los dos aminoácidos separados es llamado un enlace de péptidos. El término "enlace de péptidos" implica la existencia del grupo de péptidos que se escribe comúnmente en texto como -CONH-; Dipéptido: dos moléculas enlazadas por un enlace de péptido se vuelven lo que se llama dipéptido; Polidipéptido: una cadena de moléculas enlazadas por enlaces de péptido; Proteínas: conformadas de una o más cadenas de polipéptidos, cada una de las cuales consiste en aminoácidos los cuales se han mencionado con anterioridad. Se sabe que cuando una célula viva hace una proteína, el grupo carboxilo de un aminoácido se enlaza al grupo amino de otro para formar un enlace de péptido. El grupo carboxilo del segundo aminoácido se enlaza de manera similar al grupo amino de un tercero, y así sucesivamente, hasta que se produce una cadena larga, llamada polipéptido. Puede formarse una proteína de una sola cadena de polipéptido, o puede consistir de varias de tales cadenas sujetadas conjuntamente por débiles enlaces moleculares. Los grupos R de las subunidadés de aminoácido determinan la forma final de la proteína y sus propiedades químicas; por lo que se produce una variedad extraordinaria de proteínas. Además de los aminoácidos que forman las proteínas, se han encontrado más de otros 150 aminoácidos en la naturaleza, incluyendo algunos que tienen los grupos carboxilo y amino unidos para separar átomos de carbono. Estos aminoácidos estructurados inusualmente frecuentemente se encuentran en hongos y plantas más grandes. Cualquiera que tenga los agrupamientos funcionales requeridos, y que sean capaces de acoplarse al agente terapéutico de elección se contemplan para su uso en la presente invención. Como se utiliza en la presente, el término ácido desoxirribonucléico (ADN) se comprende por referirse a un polímero largo de nucleótidos articulados por grupos fosfato , el ADN es el material genético que proporciona el diseño para las prote ínas que cada célula diferente producirá en su vida útil. Consiste de una hélice de cepa doble consistente en un azúcar de cinco partes (desoxiribosa) sin un grupo hidróxilo libre, un grupo fosfato que enlaza los dos nucleótidos , y una base de nitrógeno. Como se utiliza en la presente, el término ácido ribonucleico (ARN) se com prende por referirse a un polímero largo de ribosa (un azúcar de cinco partes con un grupo hidróxilo libre) y bases de nitrógeno enlazadas mediante grupos fosfato. Es complementario a una de las cepas de ADN y forma las proteínas que se especifican por la célula. Como se utiliza en la presente, el término "formas de ion anfotérico" se comprende por referirse a aminoácidos en forma de neutralidad donde el grupo carbóxilo y el grupo amino se encuentran listos para donar y aceptar protones , respectivamente. La evolución y mutación de las proteínas puede realizarse mediante cambios en el ácido desoxirribonucléico (ADN) . El ADN se traduce en proteínas mediante ácido ribonucléico (ARN) . Aunque cada célula contiene una copia idéntica de ADN con instrucciones completas para todos los tipos de tejidos corporales , solamente algunas proteínas son producidas por cada tipo celular. De esta manera, las células de diferentes tejidos pueden realizar diversas tareas mediante la producción de proteínas únicas. De acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, un agente terapéutico, por ejemplo, ADN o ARN puede distribuirse generalmente por un organismo mediante la administración oral, produciendo consecuentemente una alteración detectable. Esta alteración detectable puede referirse ampliamente hacia todas las células del organismo, efectuando consecuentemente una cura para una enfermedad, o mejora de una característica particular. Alternativamente, por el uso juicioso de mejoradores de órgano o tejido específico, las alteraciones detectables pueden limitarse a la expresión en ubicaciones determinadas particularmente, proporcionando consecuentemente un medio seguro y eficaz para la administración oral de modificadores químicos o genéticos, cuyo lugar de actividad es particularmente controlado. Los aminoácidos que forman cadenas laterales cargadas en solución son la lisina, arginina, histidina, ácido aspártico, y ácido glutámico. Aunque el ácido aspártico y el ácido glutámico liberan sus protones para volverse cargados negativamente en condiciones fisiológicas de un ser humano normal, la lisina y la arginina ganan protones en solución para volverse cargados positivamente. La histidina es única porque puede formar sea cadenas laterales básicas o acídicas dado que el pKa del compuesto está próximo al pH del cuerpo. Dado que el pH comienza a exceder el pKa de la molécula, el equilibrio entre sus formas neutral y acídica comienza a favorecer la forma acídica (forma desprotonada) de la cadena lateral de aminoácidos. En otras palabras, es más probable que un protón se libere en solución.
En el caso de la histidina, puede liberarse un protón para exponer un grupo NH2 básico cuando el pH aumenta su pKa (6). Sin embargo, la histidina puede volverse cargada positivamente bajo condiciones donde el pH cae debajo de 6. Debido a que la histidina es capaz de actuar como un ácido o una base en condiciones relativamente neutrales, se encuentra en los sitios activos de muchas enzimas que requieren un cierto pH para catalizar reacciones, y se contempla como útil en la presente invención. Los aminoácidos pueden ser polares o no polares. Los aminoácidos polares tienen grupos R que no se ionizan en solución pero son bastante solubles en agua debido a su carácter polar. También son conocidos como aminoácidos hidrofílicos, o "amantes del agua". Estos incluyen serina, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, y cisteína. Los aminoácidos no polares incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina y triptofan. Los aminoácidos no polares son solubles en ambientes no polares tales como membranas celulares y son llamados moléculas hidrofóbicas debido a sus propiedades de "miedo al agua". Estos compuestos se contemplan para su uso donde puede inducirse una carga o donde se ocasiona que se cargue el agente terapéutico a fin de iniciar un efecto de acoplamiento.
Ejemplos Biodistribución de ADN oral el cual expresa la Proteína Fluorescente Verde (GFP) Se llevó a cabo la administración individual de nanopartículas de ADN de GFP de alginato/PLL en ratones (n = 3). Se probaron tres formulaciones: 1) icrocápsulas de alginato de ADN/PLL (Cápsulas); 2) Nanopartículas de alginato/DNA/PLL (Alginato); y 3) Nanopartículas de PLL/ADN/alginato (PLL). Se trataron 9 ratones, y se sacrificaron el día 42. Las muestras de tejido de todos se ilustran en micrográficas fluorescentes designadas como las Figuras 1-7. La Figura 1 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión en el hígado; la Figura 2 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en el riñon; la Figura 3 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en el pulmón; la Figura 4 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en el corazón; la Figura 5 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en el músculo; la Figura 6 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión en la piel; y la Figura 7 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión en los vasos. La GFP (proteína fluorescente verde) es intracelular y permanece en la célula donde se produce. Como es fácilmente aparente al revisar las figuras acompañantes y como se resume en la Tabla 1, la microscopía fluorescente detecta virtualmente todas las células en todos los órganos principales examinados por ser verdes (donde "verde" se representa en las Figuras 1 a 7, 10 a 25, y 28 por el contraste blanco contra el fondo negro).
Tejido Hígado Riñón Pulmón Corazón Músculo Cerebro Piel Vaso (aorta) Cápsulas +++ ++ ++ +++ +++ ++ +++ +++ Alginato +++ ++ ++ +++ +++ ++ +++ ++ PLL +++ ++ ++ +++ +++ ++ +++ + Tejido Médula Bazo Páncreas Duodeno Yeyuno Ileo Colon Gónadas ósea Cápsulas ++ ++ ++ ++ +++ +++ + + Alginato ++ +++ +++ ++ +++ +++ + + PLL ++ + ++ ++ +++ +++ + + Esto indica que el ADN, en forma de microcápsulas conjugadas con el agente de transporte (PLL) e internalizado en una cápsula que comprende alginato/agente de transporte degradado pasa por el intestino y se transporta a todos los órganos principales donde ingresa a las células y se expresa eficazmente. Esto se encuentra en contraste con el ADN encapsulado de la técnica anterior, donde el PLL actuó como un elemento estructural el cual evitó/redujo la difusión del ADN. Como validación de la técnica, el análisis de muestras de tejido se realizó utilizando reacción de cadena de polimerasa (PCR) como una amplificación técnica. El día post-42 del tratamiento, se sacrificaron los ratones. El ADN derivado de diversos tejidos se amplificó por PCR, y mostró que el ADN administrado oralmente se encuentra en cada órgano principal examinado (Tabla 2). Este descubrimiento confirma también que el ADN administrado oralmente se lleva a todos los órganos, donde ingresa a las células. Tabla 2 PCR de ADN de GFP en tejidos (día 42) Nota: no se realizó la PCR en médula ósea y gónadas Ejemplo: Para determinar la importancia del alginato y la PLL para la expresión eficiente del ADN oral se llevó a cabo el siguiente experimento. Se determinó una sola administración de nanopartículas de ADN hFIX de alginato/PLL a ratones (n=3). Se probaron tres formulaciones: nanopartículas de alginato de ADN/PLL (control regular), nanopartículas de alginato /ADN (sin PLL), y nanopartículas de PLL/ADN (sin alginato). El día 3, 7 y 14 post-tratamiento, se combinaron los ratones. Los ratones de control tuvieron hFIX en sangre (aproximadamente 70 ng/ml). Ninguno de los ratones sin alginato o sin PLL tuvieron hFIX detectable (sensibilidad 3 ng/ml). Consecuentemente, se concluyó que tanto el alginato como la PLL son necesarias para asegurar la distribución de ADN amplia y la expresión de proteína subsecuente. Aunque no se desea limitarse a una teoría de operación particular, parece que el alginato protege el ADN en el tracto Gl, y la PLL ayuda a distribuir el ADN en todos los órganos.
Ejemplo utilizando HFIX: Para determinar el grado de expresión obtenible, se realizó una experimentación adicional para demostrar el suministro de factor IX Humano (FIX). Se llevó a cabo una sola administración de nanopartículas de ADN FIX alginato/PLL en ratones hemofílicos. Se realizó la APTT (prueba de tiempo de coagulación de sangre) para determinar la corrección de la enfermedad en los ratones hemofílicos tratados. Como se ilustra adicionalmente en la Figura 8, los ratones hemofílicos tratados demostraron un patrón de sangrado normalizado durante al menos 180 días (experimento aún en curso). Refiriéndose ahora a la Figura 9, la amplificación de datos mediante PCR se realizó en muestras de tejido cosechadas a partir de una pluralidad de órganos el día 42 después de la ingestión de nanopartículas de ADN de alginato/PLL. Todas las muestras de órganos demostraron una presencia positiva de GFP mediante análisis de PCR. Estos datos se exponen adicionalmente en la Tabla 2 expuesta con anterioridad.
Se realizó experimentación adicional para validar la eficacia de la distribución y expresión utilizando agentes de transporte alternativos. Se conjugaron la poli-ornitina y la poli-arginina con codificación de ADN para GFP y alginato y se formularon en nanopartículas. Las nanopartículas se administraron a los ratones (n=3) de la manera descrita con anterioridad. El día 10, los ratones se sacrificaron y se tomaron micrográficas fluorescentes (Figuras 10-25). La Figura 10 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el duodeno; la Figura 11 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Yeyuno; la Figura 12 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el íleo; la Figura 13 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Colon; la Figura 14 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Hígado; la Figura 15 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Bazo; La Figura 16 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Riñon; La Figura 17 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Pulmón; la Figura 18 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Corazón; la Figura 19 es una micrográf ica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Músculo; La Figura 20 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Páncreas; la Figura 21 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en el Cerebro; la Figura 22 es una micrográfica fluorescente que ¡lustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en las Gónadas; la Figura 23 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en la Piel; la Figura 24 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en los vasos; y la Figura 25 es una micrográfica fluorescente que ilustra la expresión utilizando agentes de transporte de Arginina/Ornitina en la Médula Ósea. Las Figuras ilustran que el ADN que se codifica para la producción de proteína fluorescente verde se distribuyó por todos los órganos y tejidos, y ha ocurrido la expresión de proteína exitosa.
Ejemplo - Suministro de hormona del crecimiento humano en ratones El suministro sostenido de hormona del crecimiento humano (hGH) por terapia genética es muy desafiante. La razón principal es que la naturaleza antigénica de la hGH produce una fuerte respuesta de anticuerpos en los ratones inmunocompetentes. Como resultado, el suministro de hGH reportado en la literatura es consistentemente modesto (1-3 ng/ml) y de naturaleza transitoria (dura días). Se prepararon nanopartículas de alginato - PLL - hGH ADN como se describe en los protocolos y se mezcla con Jell-O. Los ratones inmunocompetentes adultos C57BL/6 (20 semanas de edad) fueron alimentados con 100 pg de nanopartículas de ADN oralmente (n=3). Los ratones sangraron regularmente. La concentración de hGH se determinó por ELISA (UBI Inc). La presencia de anticuerpos contra la hGH se determinó por ELISA. Los ratones tratados tuvieron niveles altos de hGH (pico de -50 ng/ml). Más importantemente, el suministro de hGH persistió durante al menos 120 días (Figura 26). Además, no se detectaron los anticuerpos de anti-hGH (Figura 27). Estos datos indican que esta tecnología puede suministrar niveles sostenidos de productos terapéuticos tales como hGH, sin producir una respuesta de anticuerpos.
Ejemplo - Suministro de un producto terapéutico a manera de tejido específico en ratones Suministro de tejido especifico de hFIX Día 85 post-tratamiento • Se administró un plásmido con contenido del cADN factor IX humano bajo control del mejorador de albúmina a ratones hemofílicos, alimentando cada ratón con 100 microgramos de ADN en una formulación de nanopartículas de alginato-PLL • El mejorador de albúmina es específico para el hígado. • hFIX se detectó en la sangre de ratones de tratados. • Inmunohistoquímica (se detectó hFIX presente en los diversos tejidos utilizando anticuerpos específicos a hFIX) mostró que la expresión de hFIX en ratones tratados se restringió al hígado, y no se expresó en otros tejidos como se ¡lustra en la Figura 28. • Esto valida el logro de la expresión de tejido específico de un transgen después de la administración oral del ADN.
Protocolo Experimental: Las nanopartículas de ADN de alginato-PLL-hFIX se prepararon como se describe en protocolos y se mezcló con Jell-O. El factor humano IX (hFIX) de ADN se clonó en un plásmido de manera tal que la expresión de hFIX se colocó bajo el control del mejorador de albúmina. El mejorador de albúmina es de hígado específico. Por lo tanto, la expresión de hFIX solamente se desea en células de hígado, mientras que las células derivadas de otros órganos que cosechan este plásmido no sería capaz de segregar hFIX. Cada uno de los ratones C57BL/6 inmunocompetentes adultos (20 semanas de edad) se alimentaron 100 ng de nanopartículas de ADN oralmente (n=3). Los ratones se mezclaron regularmente, y la concentración de hFIX en plasma determinada por ELISA (Affinity Biologicals). Todos los ratones tratados tuvieron niveles terapéuticos de hFIX en sangre, aunque no se detectaron anticuerpos.
En resumen, los presentes inventores han confirmado que el ADN administrado oralmente se capta eficazmente mediante el intestino y se distribuye por el cuerpo, cuando se protege a medida que recorre el tracto Gl por alginato (o cualquier agente similar), y si el ADN se conjuga a un polipéptido (tal como PLL). Las formulaciones sin recubrimiento protector o sin polipéptido evidenciaron una distribución mínima, y una expresión de proteína/y una eficacia muy baja. Aunque no se desea limitarse a cualquier teoría de operación en particular, se teoriza que el ADN se transporta a todos los órganos mediante un mecanismo de distribución de aminoácido natural con alta eficacia. El ADN ingresa virtualmente todas las células en todos los órganos principales examinados y el producto terapéutico codificado se produce en los diversos tejidos. La inclusión de mejoradores, sean ubicuos o de tejido específico, permiten el control preciso de expresión proteína. El suministro es de largo plazo sostenido (durante al menos 180 días). El producto terapéutico puede segregarse por las células en la circulación (en el caso de productos segregables). Alternativamente, las proteínas no segregables permanecerán en las células donde se producen. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en esta especificación son indicativas de los niveles de aquellos expertos en la materia a la cual pertenece la invención. Todas las patentes y publicaciones se incorporan en la presente para referencia al mismo grado como si cada publicación individual se indicase específicamente e individualmente para incorporarse para referencia.
Debe comprenderse que aunque se ilustra una cierta forma de la invención, no debe limitarse a la forma o configuración específica de las partes descritas y mostradas en la presente. Será aparente para aquellos expertos en la materia que pueden realizarse diversos cambios sin aislarse del alcance de la invención y la invención no pretende considerarse limitada a lo que se muestra y describe en la especificación. Un experto en la materia apreciará fácilmente que ia presente invención se encuentra bien adaptada para realizar los objetos y obtener los extremos y ventajas mencionados, así como también aquellos inherentes a la presente. Los oligonucleótidos, péptidos, polipéptidos, compuestos relacionados biológicamente, métodos, procedimientos y técnicas descritas en la presente son actualmente representativos de las modalidades preferidas, pretenden ser ejemplares y no pretenden ser limitaciones al alcance. Los cambios en la presente y otros usos ocurrirán a aquellos expertos en la materia los cuales se encuentran contemplados dentro del espíritu de la invención y se definen por el alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque la invención se ha descrito en conexión con las modalidades preferidas específicas, debe comprenderse que la invención según se reivindica no debe limitarse excesivamente a tales modalidades específicas. De hecho, diversas modificaciones de los modos descritos para realizar la invención los cuales son obvios para aquellos expertos en la materia se encuentran destinados a ser el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (16)

REIVINDICACIOIMES
1. Una composición para la administración de un agente terapéutico a un huésped mediante una trayectoria gastrointestinal natural que comprende: al menos un compuesto que incluye un grupo amina; y al menos un material genético; al menos dicho compuesto y al menos un material genético acoplado de manera eficaz para habilitar la distribución amplia, la expresión sistémica y el suministro sostenido mediante dicha trayectoria gastrointestinal; por lo que se obtiene un efecto biológico deseado.
2. Una composición para la administración de un agente terapéutico a una célula seleccionada como objetivo mediante una trayectoria gastrointestinal natural que comprende: al menos un agente de transporte eficaz para transportar un material genético mediante dicha trayectoria gastrointestinal natural; al menos un material genético eficaz para instigar un efecto biológico deseable; dicho agente de transporte y al menos dicho material genético acoplado de manera eficaz para permitir una distribución amplia, la expresión sistémica y el suministro sostenido como resultado de la captación celular subsecuente al paso mediante dicha trayectoria gastrointestinal natural.
3. Una composición para la administración de un material genético a un huésped mediante una trayectoria gastrointestinal natural permitiendo así la expresión intracelular de un agente terapéutico, que comprende en combinación: al menos un compuesto eficaz para proteger dicho material genético en dicha trayectoria gastrointestinal natural; al menos un agente de transporte eficaz para transportar un material genético mediante dicha trayectoria gastrointestinal natural; y al menos un material genético eficaz para la expresión intracelular de un agente terapéutico; dicho agente de transporte y al menos dicho material genético acoplado de manera eficaz para permitir una distribución amplia, suministro sistémico y expresión sostenida como resultado de la captación celular subsecuente al paso mediante dicha trayectoria gastrointestinal natural; por lo que la expresión intracelular de dicho agente terapéutico ocurre subsecuente a dicha captación celular.
4. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o 3 donde dicho agente de transporte es un compuesto que contiene un grupo amina el cual facilita la distribución in vivo amplia de dicho material genético después del acoplamiento con el mismo.
5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o 3 donde dicho agente de transporte es un polipéptido.
6. La composición según la reivindicación 1 o 2 o 3 donde dicho material genético comprende una unidad de transcripción completa.
7. La composición según la reivindicación 6, donde dicha unidad de transcripción completa es eficaz para la expresión ubicua de dicho agente terapéutico.
8. La composición según la reivindicación 6, donde dicha unidad de transcripción completa es eficaz para la expresión de tejido específico.
9. Un proceso para expresar un agente terapéutico en un huésped a manera de una trayectoria gastrointestinal natural que comprende: proporcionar al menos un agente de transporte eficaz para habilitar la distribución amplia, la expresión sistémica y el suministro sostenido de un material genético acoplado al mismo mediante dicha trayectoria gastrointestinal natural; proporcionar al menos un material genético construido y configurado para proporcionar la expresión intracelular de dicho agente terapéutico después de la captación celular del mismo; formar un residuo distrlbuible al acoplar dicho agente de transporte y al menos dicho material genético de manera eficaz para producir la distribución amplia, el suministro sistémico y la expresión sostenida después de la absorción intracelular mediante dicha trayectoria gastrointestinal natural; administrar dicho residuo distribuible; transportar dicho residuo distribuible in vivo mediante dicha trayectoria gastrointestinal natural, por lo que dicho residuo se incluye esencialmente en todas las células de dicho sujeto; y expresar dicho agente terapéutico subsecuente a la absorción intracelular, donde se instiga un efecto biológico deseable.
10. El proceso según la reivindicación 91, donde dicho paso de expresión es ubicuo.
11. El proceso según la reivindicación 9, donde dicho paso de expresión es de tejido específico.
12. El proceso según la reivindicación 9, que incluye además proporcionar al menos un compuesto eficaz para proteger dicho material genético en dicha trayectoria gastrointestinal natural.
13. El proceso según la reivindicación 9, donde dicho material genético comprende al menos una unidad de transcripción completa.
14. El proceso según la reivindicación 9, donde dicho agente terapéutico es un polipéptido.
15. El proceso según la reivindicación 9, donde dicho agente de transporte es un compuesto que contiene un grupo amina y se construye y configura para acoplarse con dicho material genético para permitir la distribución amplia, la expresión sistémica y el suministro sostenido de dicho terapéutico.
16. El proceso según la reivindicación 9, donde dicho acoplamiento es mediante unión electrostática.
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