CN100591361C

CN100591361C - 包含载体、靶向部分和造影剂的医学成像用缀合物

Info

Publication number: CN100591361C
Application number: CN200480006063A
Authority: CN
Inventors: 约翰·罗德尼·伍德罗
Original assignee: Upperton Ltd; Novozymes Biopharma UK Ltd
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS; Upperton Ltd
Priority date: 2003-02-17
Filing date: 2004-02-17
Publication date: 2010-02-24
Anticipated expiration: 2024-02-17
Also published as: CN1761489A; GB0303532D0

Abstract

本发明涉及给身体递送试剂。一种特定类型的这类试剂为用于医学成像技术的造影剂。所述的试剂可以为用作磁共振成像(MRI)或核成像，包括正电子发射体层摄影术(PET)的造影剂的金属；或用作放射治疗的治疗剂的金属。所述的试剂可选地为用于X线显像的造影剂。本发明还涉及可以使递送给身体的试剂与载体以及与有效使该试剂定向于体内特定部位的靶向部分偶联的方法。

Description

包含载体、靶向部分和造影剂的医学成像用缀合物

发明领域

发明背景

已知通过预先给予合适的造影剂来增强通过诸如MRI或X线显像这类技术获得的影像的对比度。就X线显像而言，这类试剂一般为高度不透射线的物质，而对MRI而言，它们一般为影响它们所导入的介质的弛豫时间的顺磁物质。在核成像中，使用放射性核素生成用于使该放射性核素所定位的体内部位显影的信号。

已经进行了许多尝试来研发含有表现出改善性能的造影剂的新制剂。这类改善可以包括造影剂在体内停留时间的延长和递送试剂所具有的特异性的改善，即该试剂在体内特定部位浓度的改善。

在核成像中，使用诸如二亚乙三胺五乙酸(DTPA)这类螯合部分使放射性金属离子直接与单克隆抗体(Mab)结合。然而，已经发现这种化学手段为非特异性的且一般导致抗体结合活性降低，随着与Mab偶联的试剂的量增加，其活性降低加大。

例如，使用DTPA酸酐(DTPAa)标记单克隆抗体，并用该复合物螯合[¹⁵³Sm]氯化物(Boniface等1989.J Nucl Med 30：683-691)。当负荷20个金属离子时，该复合物保持抗体结合活性大于90％。然而，当金属离子数量增加至50时，免疫反应性降至50％以下。显然在抗体结合活性受到不良影响前可以结合的摩尔比方面，使用金属标记抗体受到限制。

其它工作人员已经证实DTPA：Mab比低至2∶1时导致抗体结合活性显著降低(Paik等1987，J Nucl Med 24：1158-1163)。

已经将抗体的直接标记用于生产大量基于抗体的商品。例如，CEA-scan^TM和Onco-scint^TM为可以用于使癌症显像的商购试剂。这些试剂由用^99mTc直接标记的抗体组成，且它们在静脉内给药后与癌细胞结合。

在MRI领域中已经采取了类似的方法，其中早期研究关注于使用DTPAa用DTPA-Gd标记单克隆抗体(Unger等1985.Investigative Radiol 20(7)：693-700)。然而，Gd负荷水平极低(每个抗体分子1.5个Gd³⁺离子)且在体内模型中没有观察到影像的抗体-DTPA-Gd增强。据推断每个抗体分子至少需要结合100个Gd原子才能产生高至足以通过MRI检测的信号。

文献中报导了按照类似路线的其它方法(例如：Shahbazi-Gahrouei等2002，Aust Phys and Eng Sci in Med 25(1)：31-38，Matsumura等(1994)，Acta neurochirurgica 60：356-358，Curtet等(1988)，Intl J Cancer2：126-132)。

涉及使造影剂与诸如抗体的靶向部分直接缀合的所有方法遇到的一个常见问题是必须将造影剂负荷维持在低水平，否则，抗体的免疫反应性就会受到不良影响。造影剂的负荷由此可能低于所需要的，从而低于所需的对比效果。类似地，如果使治疗剂与靶向部分缀合，那么可能因为需要维持相对低的试剂负荷而损害该试剂的功效。

为了延长造影剂在血液中的停留时间，已经将聚合分子用作造影剂的载体。在早期实验中，用DTPA标记诸如人白蛋白和聚赖氨酸这类载体并用于携带MRI造影金属(例如与聚赖氨酸结合的DTPA-Gd，参见Gerhard等(1994)，MRM 32：622-628)。在其它研究中，用DTPA和Gd标记牛血清白蛋白和牛免疫球蛋白(Lauffer等(1985)Magnetic Resonance Imaging 3(1)：11-16)，并使基于聚-L-赖氨酸骨架的多肽与DTPAa反应，并用于螯合¹¹¹In以达到成像目的(Pimm等(1992)，Eur JNucl Med 19：449-452)。在这些研究中，发现载体结合的造影剂在血液中具有延长的停留时间。

已经进行了结合上述概括的两种普通方法的尝试，即利用载体分子增加造影剂负荷并使用靶向部分改善特异性。

在一项研究(Gohr-Rosenthal等(1993)Invest Radiol 28：789-795)中，用DTPA-Gd标记的聚赖氨酸用作MRI造影剂。平均获得每个聚合物65个Gd离子的负荷。使其与单克隆抗体偶联并用于评价裸鼠上的人肿瘤。在用高碘酸盐活化抗体后，通过还原酰胺化并使用200倍摩尔过量的聚合物使Mab与聚赖氨酸-DTPA连接。然后加入10倍摩尔过量的Gd³⁺。抗体结合研究表明抗体结合活性比游离抗体降低了60-70％。还注意到聚赖氨酸-抗体缀合物为免疫原性的且被诸如肝和肾这类重要器官吸收。

负荷DTPA-Gd的聚(L-赖氨酸)链与Mab缀合的另一个实例由Manabe等(1986)Biochemica at Biophysica Acta 883(3)：460-467描述。

已经采取了与将药物递送给身体相关的类似方法。例如，将抗癌药氨甲蝶呤(MTX)与人血清白蛋白连接(Pimm等1988：″Human tumour xenografts in anticancer drug development″pp95-98，publ Springer Verlag)。至多可以使30个MTX分子通过化学手段与白蛋白连接，并将获得的缀合物通过化学手段与抗体连接。然而，这种抗体-白蛋白-MTX缀合物与游离抗体相比具有非常明显缩短的血液半衰期。

Hartung等(1999)Clin Cancer Res 5(4)：753-759中使用MTX进行了类似的工作，其中HAS分子上负荷了极低水平的MTX。由于药物负荷降低，所以估计药物的半衰期至多达3周。

WO 94/12218和US4794170中描述了使抗病毒核苷缀合物靶向至肝的乳糖胺化人白蛋白在治疗慢性乙型肝炎中的应用。WO90/01900中描述了将MRI造影剂靶向递送至特定细胞型的载体系统。它包括用于该细胞型的与顺磁性材料的络合剂化学键合的受体特异性配体。聚(L-赖氨酸)与无唾液酸糖蛋白靶向剂偶联以增加每个靶向基团中螯合基团的数量。然而，在结合螯合基团前进行聚(L-赖氨酸)偶联，由此聚(L-赖氨酸)载体和无唾液酸糖蛋白靶向剂的修饰必然会发生，可能对复合物的结合活性产生有害作用。

将试剂靶向递送给身体的其它方法涉及使用分子聚集物(例如脂质体)和颗粒，它们一般具有低于10μm的尺寸。

使用脂质体进行工作的实例包括：

US 5929044中描述了使用靶向剂将生物活性化合物递送至细胞。所述的生物活性剂在脂质体或病毒中携带。

大量有关将脂质体用作显像剂的载体/靶向载体的公开文献由Garide(1985)Critical reviews in therapeutic drug carrier systems 1(2) 121-153和Tilcock(1999)Adv Drug Deliv Reviews 37：33-51描述。

已经通过化学方式使DTPA-Gd与硬脂酰胺连接并引入脂质体膜表面。这些颗粒比单独的DTPA-Gd具有增加的松弛性(Kunimasa等 (1992)Chem and Pharm Bulletin(Japan)40(9)：2565-2567)。

进行了大量工作的另一个领域为纳米颗粒递送造影剂的应用和这些纳米颗粒将试剂向疾病部位的靶向递送。

使用纳米颗粒进行工作的实例包括：

Winter等(2003)Magnetic Resonance in Medicine 50(2)：411-416中描述了使用血纤蛋白靶向的Gd-DTPA-双-油酸纳米颗粒使血栓成像和使用血纤蛋白用Gd-DTPA-磷脂酰乙醇胺(PE)纳米颗粒进行的类似靶向。

几个小组已经描述了靶向的氧化铁纳米颗粒的应用。例如，Suwa 等(1998)Intl J Cancer 75(4)：626-634中描述了包被了抗表皮生长因子Mab的超顺磁体纳米颗粒(T2造影剂)。Suzuki等(1996)Brain Tumour Pathology 1(2)：127-132中使用Mab-标记的聚乙二醇包被的铁纳米颗粒进行了类似的工作。

在另一种方法中，Artemov等(2003)Magnetic Resonance in Medicine 49(3)：403-408中描述了首先使用已经生物素化的Mab靶向酪氨酸激酶Her-2/neu受体。然后将链霉抗生物素标记的超顺磁体纳米颗粒用于靶向生物素化的癌细胞。所述的纳米颗粒产生强T2 MRI对比。

Yu等(2000)Magnetic Resonance in Medicine 44(6)：867-872描述了一种T1造影剂，它由血纤蛋白靶向的在外表面上引入大量Gd-DTPA复合物的脂质包囊的全氟化碳纳米颗粒组成。经证实它可以牢固结合凝块。

Anderson等(2000)Magnetic Resonance in Medicine 44(3)：433-439中描述了另一种基于全氟化碳的纳米颗粒，其中使Gd-全氟化碳纳米颗粒靶向至存在于生血管内皮上的α(v)β(3)整联蛋白(使用特异性Mab)。

Samten(1996)Chinese J Microbiol and Immunol 16：54-57中已经将针对人膀胱癌的Mab与负荷阿霉素的人血清白蛋白纳米球连接。

在许多论文中已经描述了微球作为载体/靶向载体的应用。例如，Klibanov(1999)Adv Drug Deliv Reviews 37：139-157中描述了可以标记并用作靶向造影剂的充满气体的微气泡。WO 03/015756中描述了制备蛋白质物质微球并将治疗剂和造影剂引入这些微球的方法。

已经有许多公开文献描述了与白蛋白微粒连接的药物的递送。例如，细胞毒性药物(多柔比星和丝裂霉素c)被加载在40um的人血清微球上并对结肠直肠癌肝转移患者的肝脏给药(Kerr等(1992) EXS(Switzerland)61 339-345)。

尽管已经进行了大量工作，但是仍然需要用于递送给身体的试剂的靶向缀合物，它们满足该缀合物充分负荷所涉及的试剂和保持靶向部分结合活性之间的相矛盾的要求，以便进行有效靶向。

因此本发明的一个目的在于提供将试剂，特别是造影剂靶向递送给身体的方式，这通过使载体与所述试剂和靶向部分缀合来进行，所述的靶向部分使所述缀合物定向于目标作用部位，该缀合物能够容纳高负荷的试剂，同时维持所述靶向部分足够高的结合活性。

本发明的另一个目的在于能够使大量造影剂与一个或多个靶向部分结合而不会破坏靶向部分的结合活性，这可能是因与所述靶向部分形成大量共价键所致。

本发明的另一个目的在于提供给身体靶向递送大量金属离子，而同时维持这些金属离子在体内定位上的高度特异性的方式。

本发明的另一个目的在于提供装配将试剂递送给身体的靶向缀合物的方法，该方法能够使所述缀合物携带高负荷量的所涉及的试剂，同时维持缀合物靶向的高度特异性。

发明概述

本发明在第一个方面中提供了用于医学成像的缀合物，该缀合物包含蛋白质分子形式或由蛋白质分子形成的颗粒形式的载体，该载体与造影剂或其前体和对体内特定部位具有亲和力的靶向部分结合。

所谓造影剂的″前体″指的是自身不能有效作为造影剂、但可以通过在使用前与某些其它物质反应或混合而表现出有效的部分。这类前体的一个实例为能够与金属离子形成键而形成起造影剂作用的金属螯合物的金属螯合部分。

所谓″医学成像″指的是为诊断、研究或治疗目的而使人或动物体内区域显影的任何技术。这类技术主要包括X线显像、MRI和核成像，包括PET。用于增强这类技术的试剂为那些能够使体内特定部位、气管或疾病位置显影，和/或使通过成像技术产生的影像质量有一定程度改善，从而改善或更易于解释那些影像的物质。这类试剂在本文中称作造影剂，其应用有利于通过增加影像不同区域之间的″对比度″来区分影像的不同部分。术语″造影剂″由此包括用于增强在没有这类试剂情况下仍然可以产生的影像(例如在MRI中)质量的试剂，以及作为产生影像的先决条件(例如在核成像中)的试剂。

可以理解尽管缀合物包含″造影剂″和″靶向部分″，但实际上每一载体将结合大量造影剂(或其前体)且一个以上靶向部分可以与载体结合。一般来说，如果载体具有蛋白质分子形式，那么与每一载体结合的造影剂数量可以为几十，例如10-100，更优选20-60，例如20-50。构成颗粒形式载体的每个蛋白质分子可以结合相似数量的造影剂。然而，由于颗粒一般由大量各个蛋白质分子形成(可能为10³-10¹¹个分子)，所以与每一颗粒结合的造影剂总数相当大。如果载体具有蛋白质分子形式，那么每一载体上的靶向部分数量一般低于5且可以仅为1。对于颗粒载体，靶向部分的数量可以且一般相当大。如果载体为蛋白质分子形式，那么一个以上载体与一个靶向部分偶联也是可能的，不过每个靶向部分上的载体数量一般低于10且通常为1、2或3。一般来说，仅优选少量载体与靶向部分结合，因为在靶向部分与载体之间形成过量键可能对靶向部分的结合活性产生不良影响。

一般将本发明的缀合物作为包含药学上可接受的液体介质的制剂形式对身体施用。该介质一般为含水介质，最常用的为含有合适的赋形剂的水溶液。这类赋形剂可以包括一种或多种张力调节剂、防腐剂、表面活性剂和其它常用药物赋形剂。

本发明的缀合物可以溶于液体介质，在这种情况中，制剂一般为缀合物的溶液。另一方面，如果载体为颗粒，那么颗粒和由此的缀合物一般为不溶性的且制剂为缀合物在液体介质中的混悬液或分散体。

因此，本发明的第二个方面提供了包含与药学上可接受的液体介质混合的本发明第一个方面的缀合物的制剂。

本发明的缀合物和制剂在许多方面是有利的。首先，它们可以延长造影剂在血流中的停留时间。此外，存在对特定器官或疾病位置具有亲和力的靶向部分强化了造影剂对该部位的递送，并且例如可以通过使造影剂累积在特定器官或疾病位置，例如肝或肿瘤，而改变那些试剂的生物分布，由此靶向至该器官或疾病位置并使其显影。造影剂的″载体″的应用可以增加递送至体内所需部位的造影剂的量。这可以因对背景(未患病)组织的信/噪比增加而强化检测。靶向部分的应用避免了将试剂递送至正常/健康组织。此外，如下所述，可以在不破坏靶向部分的结合能力的情况下使大量造影剂与载体缀合。

可以用于本发明的MRI造影剂包括金属离子，特别是钆。这类离子可以通过与载体物质共价结合的螯合部分与载体物质偶联。

类似地，用于核成像的金属，例如^99mTc、²⁰¹Tl和¹¹¹In也可以例如通过螯合部分与载体物质直接或间接偶联。

在将有效作为造影剂的金属以本发明第一个方面的缀合物形式递送给身体类似的方式中，也可以为其它目的将其它金属递送给身体。例如，某些金属可能具有直接治疗作用，例如用于放射治疗的放射性金属。一种这样的放射性金属为⁶⁷Cu，它可以按照与用于成像金属的金属类似的方式与载体结合。得到的缀合物可以用于靶向放射治疗。

因此，本发明在另一个方面中提供了用于将金属递送给身体的缀合物，该缀合物包含蛋白质分子或由蛋白质分子形成的颗粒形式的载体，该载体通过螯合剂与所述的金属偶联并与对体内特定部位具有亲和力的靶向部分缀合。

如上所述，所述的金属可以为例如在MRI或核成像中用作造影剂的金属，或可以为用于疗法的金属，例如用于放射治疗的放射性金属。还能够制备含有一种以上类型金属，例如造影剂(例如钆)和放射治疗剂(例如⁶⁷Cu)的混合物的缀合物。也能够制备包含一种以上缀合物的制剂，例如第一种缀合物包含造影剂且第二种缀合物包含放射治疗剂。通过这类方式能够使用常规成像技术测定试剂在体内的精确递送和定位，且照此可以证实放射性同位素的成功递送。

还能够制备可以携带放射性同位素和/或显像剂的较大尺寸(例如超过10μm)的颗粒。可以将这些颗粒递送(例如通过导管)入肿瘤的微循环且由此通过毛细管阻塞减少血液供应。此外，如果放射性同位素存在于颗粒上，那么可以将其递送入肿瘤(导致细胞死亡)，在有造影剂例如钆的存在下，能够使用常规成像技术(例如MRI)在一定时间内使肿瘤成像。

本发明第一个方面的缀合物可以如下制备：使载体与造影剂或与其前体在没有靶向部分情况下反应，随后使用异双功能交联剂使载体与靶向部分偶联。这种方法一般更为适用于制备多种载体与递送给身体的试剂的靶向缀合物。因此，本发明的另一个方面提供了制备递送给身体的试剂与载体的靶向缀合物的方法，该方法包括：

(a)使递送给身体的试剂或其前体与载体反应而形成中间体缀合物，且此后

(b)(i)使所述的中间体缀合物与异双功能交联剂反应以活化该中间体缀合物，然后使活化的中间体缀合物与靶向部分反应；或(ii)使所述的中间体缀合物与靶向部分反应，而所述靶向部分通过与异双功能交联剂反应而已经被活化；或(iii)使所述的中间体缀合物、异双功能交联剂和靶向部分一起同时反应。

特别优选的是，载体与递送给身体的试剂(或其前体)的反应，以及与异双功能交联剂的反应，应通过存在于载体上的两种不同类型的官能团进行，且异双功能交联剂与靶向部分的反应应通过存在于靶向部分上的第三种类型的官能团进行，这三种类型的官能团彼此不同。

本发明该方面的方法的优点在于，载体与递送给身体的试剂(或其前体)的反应和载体与靶向部分的反应在公开的步骤中进行。载体由此与递送给身体的试剂反应，此后与靶向部分缀合，递送给身体的试剂与靶向部分的反应得到避免。由此可以达到试剂在载体上且由此在最终缀合物上的高负荷，而对靶向部分的结合活性的不利影响最小或者没有。因此，按照本发明方法制备的缀合物的特征在于靶向部分中不存在递送给身体的试剂(或其前体)。为了实施另一种方式：缀合物优选使得至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的递送给身体的试剂(或其前体)与载体而非与靶向部分共价结合。这使得结合活性的损失最低，因此按照本发明制备的缀合物的特征在于：正如在竞争性结合试验中测定的，缀合物中靶向部分的结合活性至少为游离靶向部分的结合活性的50％，更优选60％，70％，80％或至少90％。

如果载体具有颗粒形式，本发明的方法可以包括由颗粒形成物质形成颗粒的预先步骤，所述的颗粒构成载体，然后载体与递送给身体的试剂(或其前体)反应，随后与靶向部分反应。

在这种方法的变化形式中，形成颗粒的步骤可以在递送给身体的试剂或其前体与颗粒形成物质反应后进行。

如果载体与递送给身体的试剂的前体反应，那么该前体随后被转化成所述试剂。这样的转化可以在所述方法的步骤(b)之前、之后或同时进行。如果所述前体为螯合剂且转化包括在螯合剂与金属离子之间形成螯合物，那么在添加金属离子的过程中将反应混合物的pH维持在5.0-6.5是优选的。

该方法特别适合于制备载体蛋白质性质的缀合物。

极为优选的是，交联剂带有对与存在于所述载体上而在所述靶向部分上不存在的基团例如巯基的反应具有特异性的一种官能性和对与存在于所述靶向部分上而在所述载体上不存在的基团例如醛基的反应具有特异性的第二种官能性。这减少或消除了可以使载体和/或靶向部分彼此偶联的不需要的副反应的发生。该方法还特别适合于制备如下缀合物：其中递送给身体的试剂含有羧基或其衍生物，或通过含有羧基或其衍生物的中间体化合物或部分与载体偶联，在这种情况中，与载体偶联可以通过这些羧基与存在于载体上的氨基之间形成酰胺键进行。

如果异双功能交联剂与存在于载体上的巯基反应，那么发现中间体缀合物上的游离巯基在该方法的步骤(a)中以可逆方式被封闭。在这类情况中，该方法优选包括对游离巯基解除封闭的中间步骤(步骤(a)与(b)之间)。这类解除封闭优选通过在例如20-50℃温度下将中间体缀合物温育1-24小时来进行。

本发明在另一个方面中提供了增强通过医学成像技术获得的影像的对比度的方法，该方法包括在获得影像之前对该影像所获自的人或动物受试者给予本发明第一个方面的缀合物或本发明第二个方面的制剂。进一步提供了本发明第一个方面的缀合物在制备用于增强通过医学成像技术获得影像的对比度的制剂中的应用。

发明详述

载体物质的性质

本发明第一个方面的缀合物包含作为用于造影剂和靶向部分的载体物质的蛋白质。

可以用作载体物质的蛋白质包括球状蛋白和纤维状蛋白或结构蛋白及其混合物。

球状蛋白的实例包括：合成或天然血清蛋白；其天然或合成衍生物；其盐；以酶方式、化学方式、或者以其它方式修饰、裂解、缩短或交联的、氧化或水解的其衍生物或亚单位。纤维状蛋白或结构蛋白的实例包括：合成或天然胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝心蛋白、血纤蛋白和纤连蛋白；其天然或合成衍生物；及其混合物。血清蛋白的实例有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、运甲状腺素蛋白、血纤蛋白原、凝血酶和运铁蛋白。

最优选地，蛋白质为单一、完整或基本上完整的蛋白质分子。然而，蛋白质分子可以为缀合的完整或基本上完整的蛋白质分子的寡聚体。这种寡聚体可以为蛋白质二聚体或三聚体或含有至多，即20个不连续蛋白质分子，更优选至多10个或至多5个不连续蛋白质分子的高级寡聚体。

所述的蛋白质分子可选地为完整蛋白质分子的片段，其含义是含有相当于在天然存在的蛋白质分子中发现的氨基酸序列、但在长度上较短的氨基酸序列的分子。不过优选地，这类片段含有的氨基酸序列的长度为天然存在蛋白质分子的氨基酸序列的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上且最优选95％以上，并且与天然存在的蛋白质分子的相应部分具有80％以上、90％以上或最优选95％以上的同源性程度。

运铁蛋白作为载体物质可能具有特别的优点，因为它含有大量潜在的偶联位点，这种蛋白可以有利于将本发明的缀合物通过血脑屏障转运，并且可以将其制成重组产物(例如，参见MacGillivray等2002： in Molecular and Cellular Iron Transport，Temoleton(Ed).Marcel Dekker. Inc.p41和Mason等1993.Biochemistry 32：5472)。

特别优选的载体物质为白蛋白，原因在下文中详述。

如果所述缀合物用于对人体施用，那么载体物质优选来源于人，即实际上来源于人或与来源于人的蛋白质在结构上相同(或基本上相同)。一种特别优选的载体物质由此为人血清白蛋白。

人血清白蛋白可以是血清来源的，例如获自捐献的血液，然而，为了消除或减少可能存在于血液衍生制品中的潜在污染物例如病毒或其它有害病原体传播的危害，也为了消除或减少对分离自捐献血液的物质相关的供应的可能限制，载体物质，例如人血清白蛋白，优选地应为来源于已经转化或转染以表达所述载体物质的微生物(包括细胞系)、转基因植物或动物的重组产品。

目前最优选的用于本发明的载体物质由此为重组人血清白蛋白(rHA)。rHA的合适形式可以商购自Delta Biotechnology Ltd，Nottingham，United Kingdom。

制备rHA的方法一般为本领域技术人员所熟知，例如描述在WO96/37515和WO 00/44772中。

在制备rHA的优选方法中，起始的rHA溶液来源于通过在发酵培养基中培养用编码rHA的核苷酸序列转化的真菌获得的真菌培养基，由此所述的真菌表达rHA并将其分泌入该培养基。所述的真菌可以为丝状真菌，诸如曲霉属的种。优选地，所述的真菌为酵母。更优选地，所述的真菌为酵母属(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))、克鲁维酵母属(例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis))或毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))。

rHA优选含有大比例带有游离-SH(硫氢基或巯基)的分子。这提供了使rHA分子与靶向部分缀合的特别有用的方式，如下所述。

如果将本发明的缀合化学方法应用于非蛋白质载体，那么可以使用多种载体物质中的任意一种。载体物质应为生物相容性的，且应使得载体物质与靶向部分的缀合物在使用前维持其完整性，并在体内保持有用的时间。极为优选地，载体物质应带有两种不同类型的官能团，从而能够将不同的化学方法用于使载体物质与递送给身体的试剂(或其前体)和靶向部分偶联。

可以用作载体物质的其它非蛋白质物质包括多糖类以及合适的合成聚合物。

然而，最优选载体物质是蛋白质性质的。如果载体为颗粒形式，那么载体物质(或颗粒形成物质)可以为不溶性的，或者颗粒可以由可溶性物质形成，然后通过随后的处理，例如热诱导的交联，被赋予不溶性。例如，载体物质可以为胶原蛋白或明胶。

如果载体不为颗粒形式，那么优选载体物质为可溶性的。白蛋白为目前最优选的用于可溶性和颗粒缀合物的载体物质，原因如下：

a)白蛋白可溶于含水介质；

b)白蛋白颗粒易于被赋予不溶性；

c)存在于白蛋白分子上的游离巯基提供了与靶向部分选择性偶联的方式；和

d)白蛋白含有带有氨基侧基的大量氨基酸残基(特别是赖氨酸残基)，所述的氨基侧基为递送给身体的试剂提供了偶联位点。

颗粒的形成

可以通过任意合适的技术生产颗粒形成物质的颗粒，大量这类技术为本领域技术人员所熟知。

一种用于制备本发明颗粒的特别优选的方法包括下列步骤：

i)形成颗粒形成物质的混悬液；和

ii)喷雾干燥所述混悬液。

步骤i)，即形成颗粒形成物质的混悬液优选通过下列步骤进行：实现将颗粒形成物质溶于溶剂，然后向由此形成的溶液中加入对颗粒形成物质而言的非溶剂，以便使颗粒形成物质沉淀。所谓″非溶剂″指这样一种液体，颗粒形成物质在该液体中的溶解度基本上低于颗粒形成物质在溶剂中的溶解度，但是该液体与溶剂可混溶。

优选加入过量的非溶剂，即加入到溶剂中的非溶剂的体积优选大于颗粒形成物质在溶剂中的溶液的体积。换句话说，在步骤ii)中喷雾干燥的溶剂/非溶剂混合物含有50％v/v以上的非溶剂，更优选60％v/v以上且可能为70％v/v以上。

最常用的溶剂为水。优选的非溶剂为乙醇。然而，一般来说，可以使用溶剂与非溶剂的任意合适的组合，条件是非溶剂的添加具有使颗粒形成物质沉淀的希望的作用，且非溶剂以所用比例可混溶。

尽管最常用的溶剂为水，但是例如可以使用有机溶剂。在这类情况中，非溶剂可以为水，且非溶剂的应用有益于减少与随后喷雾干燥含有可能易燃有机溶剂的混悬液相关的危险。

作为最常用的情况，如果颗粒形成物质为蛋白质物质，那么优选在除等电点之外的pH下添加非溶剂进行沉淀，从而防止了悬浮颗粒的聚集或将其减少到最低限度，并产生在喷雾干燥后易于分散的亲水性颗粒。在这种方式中，可以避免为实现相同目的而另外使用表面活性剂。

步骤ii)，即喷雾干燥步骤i)中形成的混悬液可以按照一般方式使用一般常用性能的设备进行。概括的说，喷雾干燥法包括将混悬液喷入含有加热气体，最常用的是空气的室。这一过程使溶剂/非溶剂混合物蒸发并产生固体颗粒。从室内抽出气体，例如通过气旋分离器或一定形式的过滤装置从气体中分离气体中夹带的颗粒。然后将颗粒收集在合适的容器中。

通过喷雾干燥法获得的颗粒的性质依赖于许多因素。它们包括气体通过喷雾干燥设备的流速、颗粒形成物质在混悬液中的浓度、溶剂和非溶剂的性质、混悬液进料入喷雾干燥设备的速率和室内气体温度。通常可以通过将低混悬液进料速率、合适的喷嘴设计、高度雾化和高气体流速相组合实现小尺寸分布。

特别优选在步骤i)与步骤ii)之间，即在混悬液形成后而喷雾干燥前，例如通过机械搅拌使混悬液进行匀化。这一步骤使得颗粒在混悬液中具有更为均匀的大小分布，且在步骤ii)中形成的颗粒具有相应更小和更为均匀的大小分布。

混悬液优选含有0.1-50％w/v的颗粒形成物质，更优选1-20％w/v且最优选2-10％w/v，特别是当颗粒形成物质为白蛋白时更是如此。可以使用颗粒形成物质的混合物，其中上述数值代表了颗粒形成物质的总含量。

在将颗粒喷雾干燥后，必须或需要使颗粒不溶。可以通过使颗粒形成物质交联实现该目的，其中可以通过本领域中本身公知的多种技术实现颗粒形成物质的交联。在一种优选的方法中，通过加热处理，例如在超过150℃的温度下加热处理30分钟以上，例如1小时或几小时，使颗粒产生不溶性。

如上所述制备颗粒的优选方法的优点在于，可以分别使该方法的两个阶段(形成混悬液和喷雾干燥)最优化，以获得所需形式和大小分布的颗粒。由此获得了对颗粒性质的高度控制。特别是该方法能够产生具有特别小尺寸和特别窄范围的大小分布的颗粒。例如，通过该方法生产的颗粒具有基本上低于4μm的颗粒大小和具有低于1μm的模态峰值和低于2μm的平均大小(如使用Coulter计数器测定的)的数值大小。具有这类小尺寸的颗粒优点面在于它们可以将进入极小的血管(毛细血管)和/或可以深透入肺。还能够产生较大尺寸的颗粒，例如用于鼻部给药。

可以理解，涉及的颗粒的″大小″一般指的是颗粒的″直径″，因为颗粒最常见的基本上为球形。然而，还可以理解，颗粒可以不为球形，在这种情况中，可以将大小解释为与非球形颗粒具有相等质量的抽象球形颗粒的直径。

试剂与载体物质的偶联

可以通过任意许多方式使递送给身体的试剂与载体物质进行偶联，这特别取决于试剂和载体物质的性质。不过，一般来说，偶联包括在载体物质与试剂之间或在载体物质与能够和试剂本身形成化学或物理键的偶联部分之间形成共价键。

一种优选的偶联方法，特别适合于偶联金属，例如用于MRI或核成像的金属，或偶联用于放射治疗的放射性金属，该方法包括使载体物质与能够结合金属的螯合剂缀合。

在一个特别优选的实施方案中，螯合剂含有羧基或其衍生物，该羧基或其衍生物与存在于载体物质(例如蛋白质载体物质，诸如白蛋白)上的胺基反应而形成连接螯合剂与载体物质的酰胺键。然后加入金属的合适的盐溶液，使得金属被缀合的螯合剂螯合。

可以使用的螯合剂包括含有多个胺基的化合物的乙酸衍生物。实例包括乙二胺四乙酸、二亚乙三胺五乙酸及其衍生物，例如二亚乙三胺五乙酸酐。可以使用的其它类型的螯合剂包括大环螯合剂。大环螯合剂的实例有：

1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)

1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸(DOTA)

1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸(TETA)

用于使螯合剂与载体物质偶联的其它方法对本领域技术人员而言显而易见。合适的化学方法最常见的包括通过存在于载体物质和/或螯合剂上的胺、巯基、羰基、羧基或羟基形成键。

如果试剂与金属螯合物形式的载体偶联，那么螯合物可以作为制备方法的组成部分形成，或另一方面，可以稍后加入金属，例如恰在使用前加入金属。特别地，如果金属为放射性金属，那么需要在使用前立即将金属离子加入到制剂中。

同样，可以通过在有机试剂与载体物质之间形成共价键使有机试剂，诸如下文涉及的用作X射线造影剂的含碘化合物，直接与载体物质偶联。用于使有机试剂与载体物质偶联的方法对本领域技术人员而言也是显而易见的，且可以包括通过存在于载体物质和/或有机试剂上的胺、巯基、羰基、羧基或羟基形成键。

一般来说，一个以上有机试剂或螯合剂分子与载体偶联，更优选10个以上这类分子或20个以上这类分子与载体偶联。在蛋白质载体物质的优选情况中，例如白蛋白，能够使10-100个，更优选20-60个有机试剂或螯合剂的分子与每一蛋白质分子偶联，例如每个蛋白质分子中有20-50个这类试剂的分子。这导致这类试剂的密度比用于MRI造影剂或用于放射治疗的放射性金属的常用递送系统显著增加。在许多实例中，需要在载体上负荷尽可能高的有机试剂或螯合剂。在其它情况中，将负荷限制到较低水平可能是有利的。

靶向部分的性质

使载体物质与对体内特定器官或疾病部位具有亲和力的靶向部分缀合。这类靶向部分包括抗体、其它蛋白质和肽类。优选的靶向部分为抗体，特别是单克隆抗体。许多合适的靶向部分(例如抗体)为商购的。

可以在本发明中用作靶向部分的抗体实例包括：

肿瘤类型靶抗原抗体

结肠直肠癌 CEA hMN-14

乳腺癌 MUC1 HuBrE3

膀胱癌 MUC1 C595

前列腺癌 PSMA J591

肾细胞癌糖蛋白 chG250

可以与载体物质缀合的抗体的其它实例包括如下：

a)Vitaxin^TM-结合肿瘤内新形成血管上表达的α-v β-3的人源化抗体；

b)人源化CD22抗体(一般用钇-90标记，用于治疗非何杰金氏淋巴瘤)；和

c)对在所有造血细胞且特别是在淋巴细胞上表达的酪氨酸磷酸酶CD45的αCD45抗体。

其它形式的靶向部分的实例包括：

a)用于使凝块成像的血纤蛋白；

b)能与血纤蛋白结合的结合部分；

c)亲脂性和两亲性有机分子；

d)受体配体；

e)类固醇；

f)脂质；

g)激素；

h)能结合肺癌上促生长素抑制素受体的合成肽(商购自Diatide)；

i)针对白细胞抗原的抗体片段-用于检测传染病；和

j)膜联蛋白V，它能结合在细胞死亡时释放的磷脂酰丝氨酸-使心脏病成像并评价对化学治疗反应的一种标记。

靶向部分的作用在于使负荷了造影剂或治疗剂的缀合物集中在体内所需部位，例如特定器官或疾病部位，诸如肿瘤。

载体与靶向部分的偶联

靶向部分与载体物质偶联的方法本身是公知的且为本领域技术人员所熟知。合适的化学方法最常见的包括通过存在于载体物质和/或靶向部分上的胺、巯基、羰基、羧基或羟基形成键。

使用异双功能交联剂使载体与靶向部分偶联。优选地，所述的交联剂具有对存在于所述载体上而在所述靶向部分上不存在的官能团具有特异性的一种反应性和对存在于所述靶向部分上而在所述载体上不存在的官能团具有特异性的另一种反应性。如上所述，这消除了诸如载体分子或颗粒彼此偶联、交联剂的两种官能团都与载体或靶向部分官能团反应等不需要的副反应的发生。

可以首先使交联剂与中间体缀合物(即在与递送给身体的试剂或其前体反应后的载体)反应，由此活化中间体缀合物，然后加入将与异双功能交联剂另一端反应的靶向部分(例如抗体)。另一方面，可以首先使交联剂与靶向部分反应，然后使活化的靶向部分与中间体缀合物反应。还能够使中间体缀合物、靶向部分和交联剂在单一步骤中彼此反应。合适的异双功能交联剂可以商购。

用于通过载体上的-SH(硫氢基或巯基)反应的优选交联剂带有与巯基特异性反应的基团。这类基团的一个优选实例为马来酰亚胺基。其它实例有2-吡啶基二硫基、卤代乙酸或卤代乙酰胺，特别是碘衍生物、氮丙啶、丙烯酰基/乙烯基、4-吡啶基二硫基和2-硝基苯甲酸-5-二硫基。

在载体物质不含游离巯基的情况中，例如，可以通过使用二硫苏糖醇还原在载体上产生这类基团，或使用硫醇化试剂，诸如亚氨基硫茂烷(iminothiolane)或N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)，引入这类基团。

使交联剂与靶向部分反应的一种优选方法通过靶向部分上的碳水化合物部分进行，尤其是在靶向部分为抗体或其它蛋白质时。在适度氧化条件下，可以将碳水化合物中发现的顺式-二醇转化成醛基，酰肼基可以与之发生特异性反应。

用于本发明的特别优选的异双功能交联剂由此包含：SH-反应性官能团，例如马来酰亚胺或2-吡啶基二硫基；和醛基-反应性官能团，例如酰肼。

用于本发明的优选的异双功能交联剂由此包括：

马来酰亚氨基己酸酰肼(通常称作EMCH)

3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰基酰肼(PDPH)

马来酰亚氨基丙酸酰肼(MPH)

N-(κ-马来酰亚氨基十一酸)酰肼(KMUH)

4-(4-N-马来酰亚氨基苯基)丁酸酰肼(MPBH)

包括酰肼基在内的交联剂可以以其酸加成的盐形式使用，尤其是盐酸盐。

如上所述，在载体物质为rHA的优选情况中，使靶向部分与rHA分子偶联的一种特别有用的方法通过经过存在于rHA上的游离硫氢基(巯基)的键来进行。当每个rHA分子上存在不超过一个这类游离巯基时，一个rHA分子仅偶联一个靶向部分。

当使用Ellman试剂5，5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸盐)(DTNB)测定时，rHA优选具有的游离巯基含量至少为0.85、0.8、0.75、0.7、0.65或0.60摩尔SH/摩尔蛋白质，这是检测游离巯基如cys-SH(就rHA而言为34位上的Cys-残基)的特异性方式。该反应释放在412nm处具有最大光吸收的5-硫代-2-硝基苯甲酸盐离子TNB^2-。可以通过测定412nm处的吸光度增加并除以412nm处的TNB^2-离子的摩尔消光系数计算rHA的游离巯基含量。

优选地，抗体靶向部分通过抗体恒定区内的偶联位点与载体物质偶联，由此保护了抗体可变区的特异性结合活性。

造影剂的性质

本发明的缀合物和制剂可用于递送造影剂。使用造影剂的成像技术包括MRI、X线显像和核成像，包括PET。

可以用于本发明的X射线造影剂包括多种具有用于这类应用的合适特性的含碘化合物。这类化合物一般是可溶性的且可以为离子或非离子型。这类的一个具体实例称作碘帕醇。其它公知的X射线造影剂包括碘美普尔、碘普罗胺、碘佛醇、碘克沙醇和碘海醇。

可以使用的MRI造影剂包括多种含有顺磁金属离子的化合物。合适的这类离子包括锰，特别是钆。

金属也用于核成像。适合于这种应用的金属一般为放射性γ发射体。实例包括^99mTc、²⁰¹Tl和¹¹¹In。

除金属外，还能够使载体物质与用于成像的非金属原子偶联(或偶联含有这类原子或可以引入这类原子的化合物)。这类原子的实例包括¹²³I和¹²¹I。

用于放射治疗的金属

本发明的缀合物和制剂还可以用于递送用于放射治疗的放射性金属。这类金属一般为β-粒子的发射体，其实例包括⁶⁷Cu、¹⁵³Sm、⁹⁰Y、¹⁹¹Pt、¹⁹³Pt和¹⁹⁵Pt。

制剂的施用

可以通过多种途经给予本发明的缀合物和制剂。例如，可以通过静脉内给予制剂。还可以通过口服或鼻吸入，例如作为雾化溶液给予制剂。如果合适，可以通过导管将制剂直接递送至疾病部位。

本发明的典型实施方案

现在参照下列实施例和附图来更具体地描述本发明，这仅是为了说明的目的。实施例1-10涉及基于可溶性rHA的缀合物，实施例11-19涉及基于不溶性rHA颗粒的缀合物。

附图简述

图1表示用二乙烯三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)标记的rHA的体外MRI特性；

图2表示铜离子与DTPA-标记的白蛋白的结合；

图3表示作为反应中所用DTPAa量的函数的rHA-DTPA缀合物的Gd³⁺-结合容量；

图4解释了通过不同色谱方法从过量DTPA中分离rHA-DTPA的可行性；

图5解释了rHA-DTPA和rHA-DTPA-Gd样品中游离巯基的回收率；

图6表示抗体与PDPH反应的程度，正如通过测定释放的2-硫代吡啶所证实的；

图7是对于不同抗体的与图6相似的曲线图；

图8表示本发明缀合物的结合活性的保留程度；

图9表示用Gd-DTPA标记的rHA颗粒的体外MRI特性；

图10表示用Gd-DTPA标记之前(图10a)和之后(图10b)的颗粒大小分布；和

图11是在水中重新悬浮后用Gd-DTPA标记的rHA颗粒的显微照片。

缩写

αCD45 小鼠抗-大鼠CD45

C595 对MUC1抗原具有特异性的单克隆抗体

DTNB Ellman试剂(5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸))

DTPA 二亚乙基三胺五乙酸盐

DTPAa 二亚乙基三胺五乙酸酐

DTT 二硫苏糖醇

EMCH N-(ε-马来酰亚氨基己酸)酰肼

GPHPLC 凝胶渗透高效液相色谱法

IgG 免疫球蛋白G

Mab 单克隆抗体

MRI 磁共振成像

磷酸缓冲盐水(0.9％(w/v)NaCl，15mM Na₂HPO₄，

PBS

5mM NaH₂PO₄)

PDPH 3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰基酰肼

rHA 重组人白蛋白

XO 二甲酚橙

实施例1-10的一般方法

通过在pH 8下与DTNB反应并在412nm下测定吸光度、使用对释放的5-硫代-2-硝基苯甲酸盐为13600M^-1.cm^-1的消光系数，测定游离巯基的浓度。

蛋白质测定

在接近280nm的峰处测定吸光度、使用0.53的1g.L^-1消光系数确定rHA浓度。类似地使用1.43的1g.L^-1消光系数测定IgG浓度。

GPHPLC

使用TSKgel G3000SWXL 0.78X30cm柱和保护柱(Tosoh Biosep)进行GPHPLC，用PBS以1mL.分钟^-1洗脱。

材料

DTPAa和氯化钆获自Sigma。Recombumin

-25(25％(w/v)rHA)获自Delta Biotechnology Ltd，Nottingham，UK。Magnevist^TM(一种0.5MGd-DTPA螯合物)购自商品来源且用作对照。

实施例1

用MRI造影剂标记的可溶性rHA(钆螯合物)的制备

本方法描述基于用DTPA、随后用钆(Gd)标记的可溶性rHA进行的MRI造影剂的研发。

1.1 用MRI造影剂标记的rHA(rHA-DTPA-Gd)的制备

在水中将rHA稀释至20g.L^-1rHA并在恒定搅拌的同时和约30分钟期限内缓慢加入DTPAa(1g/0.3g rHA)。在此期间，加入5M NaOH以便将pH尽可能维持在接近8.0。在最终添加DTPAa后继续搅拌30分钟，然后用5M HCl将pH调节至7.0。将可溶性rHA-DTPA对约120倍体积的水透析过夜以除去过量的游离DTPA。

通过用0.1M GdCl₃滴定进行Gd标记。谨慎操作以避免加入过量GdCl₃，否则会导致复合物形成和白蛋白沉淀。沉淀点被认为是可利用的DTPA的标准。根据Gd-诱导的沉淀点测定的结合DTAP水平为46mol.mol^-1rHA。

1.2 用MRI造影剂标记的rHA(Gd-DTPA)的成像特性

基本上如上所述制备可溶性rHA-DTPA-Gd，但做下列修改：

a)用于DTPA标记的rHA浓度为25g.L^-1；

b)DTPAa添加时间≈25分钟；

c)对约350倍体积的水进行透析18小时，随后对约100倍体积的水透析2小时；

d)根据Gd-诱导的沉淀点测定的结合DTAP水平为45mol.mol^-1rHA。

将所得物质经0.2μm滤器过滤、通过超滤(在Sorvall RT6000B离心机中以3300rpm使用Vivaspin20 10000MWCO离心浓缩器)浓缩至约90g.L^-1rHA(基于起始rHA)，并配成在5％(w/v)甘露糖醇中的50g.L^-1rHA。假定在超滤过程中没有损失来计算所得Gd的浓度。通过在-30℃浴中缓慢搅拌将配成的物质以2mL等份冷冻，并冷冻储存(约-20℃)至需要时为止。

可溶性rHA-DTPA-Gd和Magnevist^TM对照用水适当稀释至约2mL，然后与8mL 0.5％琼脂糖混合，达到指定的Gd浓度，用它们进行磁共振成像。使用一定范围的重复时间(TR)和回波时间(TE)，通过使数据与以下公式拟合，来对每种样品测定弛豫率(R1和R2)：

M＝M_∞(1-e^-R1.TR)或M＝M₀(e^-R2.TE)

其中：

M为在时间T时的测定信号；

M₀为T＝0时的信号

且

M_∞为T＝∞时的信号。

将这种可溶性rHA-DTPA-Gd的体外MRI特性与一种基于Gd-DTPA的商品MRI造影剂Magnevist^TM的体外MRI特性进行比较(图1)。R1和R2弛豫率均显著大于Magnevist^TM的R1和R2弛豫率。这表明在相同Gd浓度下，特别是由于对基于rHA的物质预计的清除率明显下降，可溶性rHA-DTPA-Gd应产生等同于或优于使用Magnevist^TM观察到的体内影像。另一方面，也提示可以以低于Magnevist^TM的Gd剂量使用可溶性rHA-DTPA-Gd。

实施例2

铜离子与用DTPA标记的可溶性rHA的结合

使用DTPA标记的重组人白蛋白(如实施例1制备)可以用作放射性金属如铜、铟、锝等的载体。

为了证实这一点，可以证实DTPA-标记的白蛋白(如上述实施例1中制备)结合铜离子(就该实例而言，使用非放射性铜)。

2.1rHA-DTPA的制备

如上文实施例1.3中所述制备rHA-DTPA样品，但做如下修改：

a)DTPAa添加时间≈20分钟；

b)添加DTPAa后的搅拌时间≈20分钟；

c)对约350倍体积的水进行透析4小时，随后对约350倍体积的水透析16小时并对约100倍体积的水透析3小时；

d)在进行GdCl₃滴定前停止制备；

e)使用rHA-DTPA小样本根据Gd-诱导的沉淀点测定的结合DTAP水平为46mol.mol^-1rHA。

2.2 Cu ²⁺ 分光光度滴定

用0.5M NaOH将5mL等份的rHA-DTPA调节至pH 6并记录总体积。取样品进行A₇₀₀测定，然后倒回。加入20份50μL的0.1M CuSO₄等份，在每次添加后如上所述进行pH调节和A₇₀₀测定。将测定的吸光度值折算回5mL体积并对加入的Cu量绘图。使回归线与滴定的两相相拟合并将其交叉点取为终点。

正如可以在附图2中观察到的，铜结合量(取为交叉点)与钆结合(如上述实施例1中所述根据沉淀终点测定)获得的图紧密地匹配。

实施例3

载体负荷的最优化

为了达到最大作用，在许多情况中重要的是载体携带最大负荷的试剂，例如用于MRI的Gd³⁺或用于核成像或治疗的放射性金属。该方法描述了对rHA的Gd³⁺结合容量的最优化。

3.1 rHA-DTPA的合成

将4份0.6g rHA等份各自在水中稀释至24mL。分别在25、20、12和9分钟内向它们各自中加入2、1、0.5或0.2g DTPAa，同时恒定搅拌，通过添加5M NaOH尽可能将pH维持在pH 8。在最终添加后将溶液搅拌约30分钟并用3M HCl调节至pH7。将全部样品一起对11L的水透析，其中换水4次，总计透析44小时。

3.2 Gd ³⁺ 结合容量的测定

通过使用XO指示剂进行配位滴定测定Gd³⁺结合容量，在pH6左右时，该指示剂在有游离Gd³⁺存在下从黄色变成紫色。因为XO颜色还取决于pH，并且发现在rHA-DTPA在未缓冲的溶液中进行GdCl₃滴定过程中发生较大的pH改变，所以在滴定过程中需要进行良好的pH控制以便获得可靠的结果。

将1mL各rHA-DTPA样品与0.2mL 0.2M六胺和5μL 0.1％(w/v)XO混合(起始pH5.9-6.1)，并用0.1M GdCl₃滴定至第一次出现持久的颜色改变(终点pH5.4-5.6)。为了证实结果的可靠性，还如实施例2中所述用CuSO₄将各份样品进行分光光度滴定。将两种滴定剂对10mMEDTA二钠盐(Fisher)标准滴定溶液进行标准化。

结果(表1和图3)表明在两种方法之间显示出了极佳的一致性，证实了两者均为可利用的DTPA基团的可靠测定方法。它们还证实需要添加最高水平的DTPAa(3.33g DTPAa.g^-1rHA；与10mol DTPAa.mol^-1rHA-NH₂等效)以达到基本上最大的Gd³⁺结合容量。

表1

实施例4

除去过量反应剂的最优化

在标记载体分子后，需要除去过量反应剂。发现为了该目的使用透析需要极长的时间和极大的体积才能获得有效除去(例如，参见实施例3.1)。应用凝胶过滤显著节约了时间和体积。该方法描述了用于从rHA-DTPA中除去过量DTPA的凝胶过滤的研发。

4.1 rHA-DTPA的合成

将0.3g rHA在水中稀释至12mL并在恒定搅拌的同时在约30分钟内加入1g DTPAa，通过添加5M NaOH尽可能将pH维持在pH 8。在最终添加后将溶液搅拌约60分钟并用3M HCl调节至pH7。与起始rHA的0.68mol.mol^-1 rHA值相比，对该物质进行游离巯基测定得到0.10mol.mol^-1rHA的值。

4.2 Sephadex G25色谱

使0.5mL rHA-DTPA上PD10柱(预装8.3mL来自AmershamBiosciences的Sephadex G25介质的柱)，用0.9％(w/v)NaCl平衡该柱。用0.5mL等份0.9％(w/v)NaCl洗脱该柱，弃去前4份洗脱液并收集剩余部分用于测定。为了测定rHA-DTPA的洗脱分布，用1mL水稀释0.1mL合适的级分并在280nm处测定吸光度。为了测定过量游离DTPA的洗脱分布，用在pH5的20mM六胺中的1mL 4mM CuSO₄洗脱20μL合适的级分并在700nm处测定吸光度。结果(图4a)表明尽管上柱量相对较低(6％柱体积)，但是没有实现从过量游离DTPA中对rHA-DTPA的基线分离。

4.3 Sephadex G25色谱(小规模)

排空PD10柱并重新填充相同柱床体积的Sephadex G50介质(Amersham Biosciences)。用0.9％(w/v)NaCl平衡该柱并上0.5mLrHA-DTPA。如上所述洗脱该柱并检测级分。结果(图4b)显示，尽管自己填充的柱的效力低于商购填充柱，产生明显较大的峰宽，但是在使用具有较高孔隙率的基质分离两个峰方面明显改善。

4.4 检测波长

0.18M DTPA pH7(在rHA/DTPAa反应结束时的近似浓度和pH)的吸收光谱表明在高于270nm处的光吸收可以忽略不计，而在低于260nm处显示出显著的光吸收。由此选择254nm的检测波长用于监测柱流出液，以便能够检测rHA-DTPA和游离DTPA。

4.5 Sephadex G50色谱(大规模)

给XK16/40柱(Amersham Biosciences)填充在0.9％(w/v)NaCl中的Sephadex G50介质至37cm床高，并连接带有2mm流动池的设定在254nm和2AU满刻度的UV-1监控器(Amersham Biosciences)。如上所述制备rHA-DTPA新鲜样品，但在最终添加与调节至pH7之间的搅拌时间减至约30分钟。使该物质上柱并用0.9％(w/v)NaCl以2.85mL.min^-1洗脱。结果(图4c)表明，甚至在高柱负荷(20％柱体积)情况下，也易于从过量游离DTPA中对rHA-DTPA进行基线分离，其中从柱洗脱开始的10分钟内产生纯化的rHA-DTPA。

实施例5

可溶性rHA衍生物中游离巯基恢复条件的研究

上述结果(参见实施例4)表明，与DTPAa反应明显封闭了rHA游离巯基。如果将该巯基用作交联剂的连接点，那么需要恢复rHA游离巯基以便有效与交联剂反应。该方法描述了在rHA与DTPAa反应(rHA-DTPA)或Gd³⁺与rHA-DTPA结合(rHA-DTPA-Gd)后实现这一目的的条件的研究。

5.1 储存对rHA-DTPA游离巯基的影响

在冷冻储存6周后重新检测来自实施例4的rHA-DTPA中游离巯基的含量，发现已经从0.10增加至0.29mol.mol^-1rHA。这一结果提示在合适的条件下能够恢复游离巯基。

5.2 rHA-DTPA的合成

如实施例4Sephadex G50色谱(大规模)中所述进行rHA-DTPA的合成，从洗脱开始后的2-9分钟收集rHA-DTPA峰。在起始rHA中游离巯基的水平为0.70mol.mol^-1rHA。

5.3 rHA-DTPA-Gd的合成

将9.8mL rHA-DTPA与30μL 0.1％(w/v)XO混合，并用0.1MGdCl₃滴定至通过第一次从黄色变成紫色所指示的终点(≡48mol Gd³⁺.Mol^-1rHA)，其中用1M NaOH将pH维持在pH5.5-pH6.0。

再加入0.1mL rHA-DTPA以结合过量的Gd³⁺，颜色恢复至黄色，并用1M NaOH将该溶液调节至pH7。

5.4 游离巯基的恢复

各取6份1mL等份的rHA-DTPA和rHA-DTPA-Gd。如果合适，用HCl或NaOH将每类中的3份样品调节至pH5、pH6或pH8并将剩余的3份样品保持在pH7下。用水将全部样品均制成1.1mL。在35℃或45℃下温育每类中的2份pH7样品并在25℃下温育剩余的所有样品。对起始rHA-DTPA和rHA-DTPA-Gd，然后在指定时间时对温育的每份样品进行游离巯基检测。结果(图5)显示，简单温育可以在两种样品中恢复游离巯基，不过使用rHA-DTPA-Gd的恢复率远高于使用rHA-DTPA的恢复率。这两种反应都显示出了一定的pH依赖性，不过在提高反应速率方面增加温度更为有效。在45℃下获得最大恢复率(约等于起始游离巯基的80％)，对rHA-DTPA-Gd而言需要约2小时，而对rHA-DTPA而言，需要约20小时。

实施例6

交联剂与可溶性rHA衍生物的反应

在本发明的方法中，为了产生定义明确的产物，靶向部分和载体分子各自含有用于选择性交联剂反应的不同化学基团。就抗体靶向部分和rHA载体分子的特定情况而言，这些基团优选分别为碳水化合物和游离巯基。该方法描述了rHA-DTPA和rHA-DTPA-Gd与适用于这些基团的两种交联剂PDPH和EMCH的反应。

6.1 rHA-DTPA的合成

在水中将0.3g rHA(游离巯基水平为0.67mol.mol^-1rHA)稀释至12mL并在恒定搅拌的同时在约30分钟内加入1g DTPAa，通过添加5M NaOH以便将pH尽可能维持在接近pH8。在最终添加后将该溶液搅拌约30分钟，并用3M HCl调节至pH 7，上用0.9％(w/v)NaCl平衡的Sephadex G50介质柱(1.6x37cm)。以2.84mL.min^-1进行洗脱，在254nm处检测。在洗脱开始后2-9分钟收集rHA-DTPA峰，显示游离巯基水平为0.07mol.mol^-1rHA。在45℃下将rHA-DTPA温育20小时以解除对巯基的封闭，得到的游离巯基水平为0.57mol.mol^-1rHA。

6.2 rHA-DTPA-Gd的合成

如上所述将0.3g rHA(游离巯基水平为0.70mol.mol^-1rHA)转化成rHA-DTPA，但不同之处在于：a)在约35分钟内加入DTPAa；b)以2.7mL.min^-1洗脱Sephadex G50柱；c)在洗脱开始后2-10分钟收集rHA-DTPA峰，显示游离巯基水平为0.14mol.mol^-1rHA。取出1mLrHA-DTPA并向剩余部分中加入60μL 0.1％(w/v)XO。用0.1M GdCl₃滴定DTPA基团至终点(≡48mol Gd³⁺.Mol^-1rHA)，其中用1M NaOH将pH维持在pH5.5-pH6.0。加入0.3mL保留的rHA-DTPA与过量的Gd³⁺结合，用1M NaOH将该溶液调节至pH7，然后在45℃下温育2小时以解除对巯基的封闭，得到的游离巯基水平为0.51mol.mol^-1rHA。

6.3 与PDPH反应

将2mL rHA-DTPA与0.15mL 0.2M Na₂HPO₄和0.05mL 0.2MNaH₂PO₄混合。取1mL样品并在343nm处测定其吸光度，此后立即添加0.1mL 10mM PDPH(Pierce)，并在此后的20分钟内每隔2分钟测定一次。将测定值对PDPH自身的吸光度校准，并使用8080M^-1.cm^-1的消光系数对释放的2-硫代吡啶计算反应程度。使用rHA-DTPA-Gd重复进行该实验。结果表明在两种情况中与PDPH的反应均快捷且有效，在前2分钟时间点时反应完成96-98％，最终反应程度约为通过游离巯基检测所测定值的90％。

6.4 与EMCH的反应

将4mL rHA-DTPA-Gd与0.3mL 0.2M Na₂HPO₄和0.1mL 0.2MNaH₂PO₄混合并加入0.44mL 10mM EMCH(Pierce)。在添加后15、30、60及120分钟时取1mL样品，立即上用50mM pH7磷酸钠平衡的PD10柱以除去过量的EMCH。从洗脱开始后收集1.5-3.5mL的高分子量级分。对洗脱液直接进行游离巯基检测，并掺加恒定量的DTT进行检测(以评价EMCH的去除)，并进行蛋白质检测(以评价rHA的回收)。对DTT测定的回收率为98-104％，而对rHA测定的回收率为102-104％，证实完全消除了EMCH并回收了rHA。直接游离巯基检测结果表明与EMCH的反应快捷而有效，其中在前15分钟时间点时游离巯基水平降至0.02mol.mol^-1rHA。

实施例7

交联剂与抗体的反应

本实施例描述了两种抗体αCD45和C595与交联剂PDPH的反应。

7.1 αCD45与PDPH的反应

将1mL αCD45(Serotec MCA43G；IgG浓度1.0mg.mol^-1)加入2.3mg KIO₄，并在室温下和黑暗中混合30分钟。使该溶液上用PBS平衡的PD10柱并在洗脱开始后收集1.5-3.5mL的高分子量级分。使用用PBS预洗涤的Nanosep 10Kω离心浓缩器(Pall)将洗脱液浓缩至最终体积为1mL，加入1.0mg PDPH，并在室温下混合21小时。使用PD10柱纯化αCD45-PDPH并如上所述将洗脱液再浓缩至1mL，得到总计90％的IgG收率。通过在343nm处进行吸光度测定，此后立即添加10μL 10mM DTT，并在此后15分钟内每隔1分钟测定一次，使用8080M^-1.cm^-1的消光系数，根据在结合PDPH减少后释放的2-硫代吡啶确定反应程度。结果(图6)表明PDPH与αCD45成功反应，得到的化学计量值为2.3mol PDPH.mol^-1 IgG。分析型GPHPLC(注射50μL，检测波长为280nm)显示所得αCD45-PDPH保持了高单体纯度，峰洗脱时间约为8.4分钟。

7.2 C595与PDPH反应

用0.65mL PBS稀释0.35mL C595(获自The University ofNottingham；IgG浓度3.2mg.mL^-1)，加入2.4mg KIO₄，并在室温下和黑暗中混合30分钟。使该溶液上用PBS平衡的PD10柱，并在洗脱开始后收集1.5-3.5mL的高分子量级分。使用用PBS预洗涤的Nanosep 10K ω离心浓缩器将洗脱液浓缩至最终体积为1mL，加入1.0mg PDPH，并在室温下混合19小时。使用PD10柱纯化C595-PDPH，并如上所述将洗脱液再浓缩至1mL，得到总计85％的IgG收率。通过在343nm处进行吸光度测定，此后立即添加10μL 10mM DTT，并在此后15分钟内每隔1分钟测定一次，使用8080M^-1.cm^-1的消光系数，根据在结合PDPH减少后释放的2-硫代吡啶确定反应程度。结果(图7)表明PDPH与C595成功反应，得到的化学计量值为2.5mol PDPH.mol^-1 IgG。分析型GPHPLC(注射50μL，检测波长为280nm)显示所得C595-PDPH保持了高单体纯度，峰洗脱时间约为8.5分钟。

实施例8

rHA-DTPA/rHA-DTPA-Gd的纯化

靶向部分和载体分子的缀合物显然大于任一单个成分，因此应通过凝胶渗透色谱法从未反应的各成分中纯化该缀合物。就rHA载体分子的特定情况而言，人白蛋白形成二聚体和高级寡聚体的趋向可能阻碍从非靶向载体分子中成功纯化靶向缀合物。该方法描述了在与靶向部分反应前纯化单体rHA-DTPA和rHA-DTPA-Gd，以简化随后的缀合物纯化。

8.1 制备型GPHPLC

纯化rHA衍生物使用大注射体积(200μL)以获得高产量，而使用次优的检测波长(254nm)是为了降低在高rHA浓度下的峰吸光度。

8.2 rHA-DTPA的纯化

rHA-DTPA的制备型GPHPLC的特征在于：二聚体峰在约6.6分钟处，而单体峰在约7.6分钟处。为了纯化单体rHA-DTPA，收集7.2-9.0分钟之间洗脱的物质。对收集的物质进行分析型GPHPLC(注射50μL，检测波长为280nm)证实通过该方法获得了高度的单体纯度。

8.3 rHA-DTPA-Gd的纯化

rHA-DTPA-Gd的制备型GPHPLC的特征在于：二聚体峰在约6.9分钟处，而单体峰在约8.1分钟处。为了纯化单体rHA-DTPA，收集7.7-9.0分钟之间洗脱的物质。对收集的物质进行分析型GPHPLC(注射100μL，检测波长为254nm)证实通过该方法获得了高度的单体纯度。

实施例9

αCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd的制备

基于上述对合成中的各步骤的研究(实施例1-8)，该方法描述了靶向试剂的完整制备，其中用DTPA，随后用Gd以高水平标记载体分子(rHA)，使得它适合于用作靶向MRI造影剂。

9.1 rHA-DTPA的合成

在水中将0.3g rHA(游离巯基水平为0.70mol.mol^-1 rHA)稀释至12mL，并在恒定搅拌的同时在约35分钟内加入DTPAa，通过添加5M NaOH以便将pH尽可能维持在接近pH8。在最终添加后将该溶液搅拌约30分钟，用3M HCl调节至pH 7，并上用0.9％(w/v)NaCl平衡的Sephadex G50介质柱(1.6x37cm)。以2.7mL.min-1进行洗脱，在254nm处检测。在洗脱开始后2-10分钟收集rHA-DTPA峰，显示游离巯基水平为0.14mol.mol^-1rHA。

9.2 rHA-DTPA-Gd的合成

取出1mL rHA-DTPA并向剩余部分中加入60μL 0.1％(w/v)XO。用0.1M GdCl₃滴定DTPA基团至通过第一次从黄色变成紫色所指示的终点(≡48mol Gd³⁺.Mol^-1 rHA)，其中用1M NaOH将pH维持在pH5.5-pH6.0。加入0.3mL保留的rHA-DTPA以与过量的Gd³⁺结合，颜色恢复至黄色，用1M NaOH将该溶液调节至pH7，然后在45℃下温育2小时，以解除对巯基的封闭，得到的游离巯基水平为0.51mol.Mol^-1rHA。

9.3 αCD45-PDPH的合成

将1mLαCD45加入2.3mg KIO₄，并在室温下和黑暗中混合30分钟。使该溶液上用PBS平衡的PD10柱，并在洗脱开始后收集1.5-3.5mL的高分子量级分。使用用PBS预洗涤的Nanosep 10Kω离心浓缩器将洗脱液浓缩至最终体积为1mL，加入1.1mg PDPH，并在室温下混合5小时。使用PD10柱纯化αCD45-PDPH，如上所述进行。

9.4 rHA-DTPA-Gd的纯化

通过制备型GPHPLC，使用200μL注射体积和在254nm处检测，纯化单体rHA-DTPA-Gd。进行8个循环的色谱，注射后7.7-9.0分钟收集产物。产物的rHA浓度为1.1g.L^-1。通过分析型GPHPLC，使用50μK注射体积和在280nm处检测，证实产物的高单体纯度。

9.5 αCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd的合成

以约10mol rHA.mol^-1 IgG的浓度将纯化的rHA-DTPA-Gd加入到αCD45-PDPH中，使用用PBS预洗涤的Vivaspin2010K离心浓缩器(Sartorius)将该溶液浓缩至1mL并在室温下混合24小时。在分析型GPHPLC上出现新的分子量峰证实形成了αCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd，其中使用20μL注射体积，并在280nm处检测。根据推定的rHA:αCD45化学计量值为2.3(如实施例7中对PDPH:αCD45所测定的)且测定的Gd³⁺:rHA化学计量值为48而得出了对该复合物预测的Gd水平约为110mol Gd³⁺.Mol^-1IgG。

9.6 αCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd的纯化

如上所述通过制备型GPHPLC 纯化αCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd，但使用10次注射约95μL，在280nm处检测，在6.0-7.2分钟收集产物。使用两个Nanosep 10Kω离心浓缩器将产物浓缩至1mL，并通过分析型GPHPLC，使用50μL注射体积和在280nm处检测证实纯度。最终将产物以约150μL的等份在-30℃浴中冷冻，并储存在-20℃下。

9.7 抗体结合活性

在对荧光团标记的αCD45的竞争性结合试验中使用表达白细胞共同抗原CD45的大鼠脾细胞测定αCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd的抗体活性。通过流式细胞术，使用恒定的0.2μg荧光抗体和增加量的αCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd测定细胞的荧光强度。类似地检测未标记的αCD45作为阳性对照。结果(图8)表明αCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd能够按照与未标记的αCD45相同的方式取代荧光抗体，证明该缀合物保持了抗体结合活性。

9.8 磁共振特性

αCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd在2特斯拉下产生的T1和T2弛豫时间分别为92和95ms。这比同时测定的0.5mM Omniscan^TM(来自Amersham的非靶向的基于钆的MRI造影剂)的结果大约好两倍，后一测定得到分别为193和177ms的值，这表明该缀合物具有极佳的弛豫增强。

实施例10

C595-PDPH-rHA-DTPA的制备

该方法描述了靶向试剂的制备，其中用DTPA而非金属离子以高水平标记载体分子(rHA)，使得它适合于负荷用作靶向核成像剂或治疗剂的适宜放射性金属。

10.1 rHA-DTPA的合成

在水中将0.3g rHA(游离巯基水平为0.67mol.mol^-1 rHA)稀释至12mL并在恒定搅拌的同时在约30分钟内加入1g DTPAa，通过添加5M NaOH以便将pH尽可能维持在接近pH8。在最终添加后将该溶液搅拌约30分钟，用3M HCl调节至pH 7，并上用0.9％(w/v)NaCl平衡的Sephadex G50介质柱(1.6x37cm)。以2.84mL.min^-1进行洗脱，在254nm下检测。在洗脱开始后2-9分钟收集rHA-DTPA峰，显示游离巯基水平为0.07mol.mol^-1rHA。在45℃下将rHA-DTPA温育20小时，以解除对巯基的封闭，得到的游离巯基水平为0.57mol.mol^-1rHA。通过如上所述使用GdCl₃的配位滴定对该物质的4mL等份进行测定，DTPA水平为44mol.mol^-1 rHA。

10.2 C595-PDPH的合成

用PBS将C595(获自The University of Nottingham；IgG浓度3.2mg.mL^-1)稀释至1.0mg.mol^-1IgG，1ml该溶液加入2.3mg KIO₄，并在室温下和黑暗中混合30分钟。使该溶液上用PBS平衡的PD10柱，并在洗脱开始后收集1.5-3.5mL的高分子量级分。使用用PBS预洗涤的Nanosep 10Kω离心浓缩器将洗脱液浓缩至最终体积为1mL，加入1.1mg PDPH，并在室温下混合5小时。使用PD10柱纯化C595-PDPH，如上所述进行。

10.3 rHA-DTPA的纯化

通过制备型GPHPLC，在TSKgel G3000SWXL 0.78X30cm柱和保护柱上使用200μL注射体积，纯化单体rHA-DTPA，用PBS以1mL.min^-1的流速洗脱，在254nm处检测。进行6个循环的色谱，在注射后7.2-9.0分钟收集产物。产物的rHA浓度为1.0g.L^-1。通过分析型GPHPLC证实产物的高单体纯度，该分析型GPHPLC如以上制备型GPHPLC所述进行，但使用50μL注射体积，在280nm处检测。

10.4 C595-PDPH-rHA-DTPA的合成

以约10mol rHA.mol^-1IgG的浓度将纯化的rHA-DTPA加入到C595-PDPH中，使用用PBS预洗涤的Vivaspin20 10K离心浓缩器将该溶液浓缩至1mL并在室温下混合18小时。在分析型GPHPLC上出现新的分子量峰证实形成了C595-PDPH-rHA-DTPA，其中使用20μL注射体积，并在280nm处检测。根据推定的rHA:C595化学计量值为2.5(如实施例7中对PDPH:C595所测定的)且测定的Gd³⁺:rHA化学计量值为44而得出了对该复合物预测的Gd水平约为110mol Gd³⁺.Mol^-1 IgG。

10.5 C595-PDPH-rHA-DTPA的纯化

如上所述通过制备型GPHPLC纯化C595-PDPH-rHA-DTPA，但使用10次注射约95μL，在280nm处检测，且在5.7-6.6分钟收集产物。使用两个Nanosep 10Kω离心浓缩器将产物浓缩至1mL并通过分析型GPHPLC，使用50μL注射体积和在280nm处检测证实纯度。最终将产物以约115μL的等份在-30℃浴中冷冻，并储存在-20℃下。

实施例11

用MRI造影剂标记的rHA颗粒(钆螯合物)的制备

11.1 方法

11.1.1 rHA颗粒的制备

如下通过喷雾干燥rHA混悬液生产一批rHA颗粒：

将200mL 25％(w/v)rHA对5L不含致热原的纯水在室温下透析过夜以除去过量氯化钠，得到最终体积为320mL。用1M NaOH将52mL透析的蛋白质调节至pH8.0，并缓慢加入乙醇，同时在磁力搅拌器上恒速混合至形成乳状混悬液(80mL乙醇)。使用安装了Schlick2-流体雾化喷嘴(970/0型)的Buchi小型喷雾干燥器(B-191型)在下列条件下喷雾干燥连续搅拌的混悬液：

入口温度100℃；

出口温度67℃；

进料速率3mL.min^-1；

雾化压力6巴。

从旋流收集瓶中回收所得的微粒(4.0g)，在176℃下加热固定55分钟以使其成为不溶性的(得到3.5g)，与7.0g甘露糖醇混合，并使用入口压力为5巴和研磨压力为3巴的Attritor 6in流体能量磨解聚。

11.1.2 与DTPAa缀合

用乙醇湿润制成的颗粒，并通过离心(Sorvall RT6000)用水充分洗涤以除去赋形剂甘露糖醇。洗涤后，取一等份用于干重测定，并用水将rHA颗粒稀释至20g.L^-1(基于该测定值)。在恒定搅拌和约25分钟期限内缓慢加入DTPAa(1g/0.3g颗粒)。在此过程中，加入5M NaOH以便将pH尽可能维持到接近8.0。在最后添加DTPAa后持续搅拌30分钟，然后用5M HCl将pH调节至7.0。通过离心，用0.9％(w/v)NaCl将rHA-DTPA颗粒洗涤两次，并用水洗涤两次，且重新悬浮至8g.L-¹(基于起始干重)，最终重新悬浮至60g.L^-1。

11.1.3 用Gd标记

为了测定因DTPA标记导致的质量增加，测定rHA-DTPA颗粒混悬液的干重，得到32.4mol.mol^-1rHA的值。对于Gd标记，用水稀释另一等份的混悬液，并在恒定混合的同时加入0.1M GdCl₃，得到2.5倍的总稀释度，且最终Gd浓度等于通过干重测定测得的DTPA水平。继续混合10分钟，用水将混悬液进一步稀释1.5倍，通过离心使rHA-Gd颗粒沉降，并将沉淀重新悬浮于水中达60g.L^-1(基于起始干重)。将所得混悬液配成50g.L-15％(w/v)甘露糖醇并冻干。

11.2 颗粒的表征

11.2.1 颗粒的磁共振特性

对Gd-DTPA标记的颗粒进行磁共振成像。用水将颗粒和Magnevist^TM对照品适当稀释至2mL，然后与8mL 0.5％琼脂糖混合而得到指定的Gd浓度。如实施例1中所述对每份样品测定弛豫率(R1和R2)。

将rHA-Gd颗粒的体外MRI特性与一种基于Gd-DTPA的商品MRI造影剂Magnevist^TM进行比较。使用颗粒rHA-Gd获得的弛豫率(图9)等于(对R1而言)或显著大于(对R2而言)使用Magnevist^TM获得的弛豫率。这一结果表明在相同Gd浓度下，特别是由于对颗粒物质预计的清除率显著下降，rHA-Gd颗粒应产生等同于或优于使用Magnevist^TM观察到的体内影像。另一方面，也提示可以以低于Magnevist^TM的Gd剂量使用颗粒。

11.2.2 大小分布分析

进行Coulter大小分析以测定该标记方法是否可以产生显著水平的聚集。图10中显示的结果证实大小分布(Gd-DTPA标记后)没有显著改变。

11.2.3 重悬浮特性

光学显微镜检查(图11)证实Gd-DTPA标记的颗粒没有聚集，且可以重悬浮而得到合适的混悬液。

实施例12

用MRI造影剂标记可溶性rHA，然后制成颗粒

本实施例解释了有关本发明方法的一种变化形式，其中由预先已经用Gd-螯合物标记的可溶性rHA分子形成颗粒。

12.1 方法

用水将1.5g rHA的等份稀释至20g.L^-1，并用在恒定搅拌下和约40分钟期限内缓慢添加的5g DTPAa处理。在此期间，加入5M NaOH以便将pH尽可能维持在接近8.0。在最后添加DTPAa后继续搅拌30分钟，然后用5M HCl将pH调节至7.0。

将标记的(+DTPA)样品对10.5L水透析，5小时后换水，总计进行21小时。为了估计所需的Gd添加量，用1M GdCl₃滴定5mL+DTPA样品的等份至首次出现持久浑浊。基于此，使用可溶性rHA获得的DTPA水平为47mol.mol^-1。再取出5mL+DTPA样品的等份，并用1MGdCl₃滴定剩余的样品至首次出现持久浑浊，并加回未滴定的等份以结合任何过量的Gd。

然后将Gd-标记的样品通过0.2μm滤器过滤以除去任何残余的不溶性物质。使用带有Schlick 2流体喷嘴的Buchi喷雾干燥器喷雾干燥样品，其中入口温度为110℃，雾化压力为0.5巴，进料速率为3.5mL.min^-1，得到出口温度约为79℃。对收集的样品称重以计算收率，然后在175℃下加热固定总计5.5小时。

在没有DTPA标记的情况下，在175℃下55分钟后rHA颗粒为不溶性的。然而，Gd-标记的样品却不是这样，它需要额外的固定才能使物质获得不溶性。

实施例13

颗粒rHA的游离巯基含量

为了用作靶向试剂，重要的是颗粒含有合适的用于化学偶联靶向部分的反应基。就rHA作为颗粒形成物质的情况而言，在cys34处的游离巯基为用于该目的的非常合适的基团。该方法描述了rHA颗粒中游离巯基含量的测定，以证实它仍然可应用于反应，尽管利用高温加热固定使颗粒成为不溶性的。

13.1 rHA颗粒的制备

在室温下将100mL 25％(w/v)rHA对20L水透析过夜，并通过在280nm处进行吸光度测定，使用0.53的1g.L^-1消光系数，来测定所得蛋白质的浓度。用水将透析的蛋白质(24.4g)稀释至12.5％(w/v)，并用NaOH调节至pH8.0。加入275mL乙醇，并使用入口温度100℃、出口温度72℃、流速3mL.min^-1和雾化压力6巴的条件喷雾干燥所得混悬液。将所得微粒(13.4g)在175℃下加热固定1小时(得到11.1g)，与22.2g甘露糖醇混合，并使其通过入口压力为5巴、研磨压力为3巴的流体能量磨两次。

13.2 游离巯基测定

通过在pH7下与DTNB反应和在412nm下测定吸光度，使用13600M^-1.cm^-1的对释放的5-硫代-2-硝基苯甲酸盐的消光系数，测定游离巯基的浓度。在室温下使反应进行1小时，并在对上清液进行吸光度测定前通过离心使颗粒沉降。对DTNB的吸光度和来自未沉降的颗粒的残留浊度进行校准。测定的游离巯基水平为0.36mol.mol^-1rHA，证实加热固定步骤没有完全破坏游离巯基，且它以适用于偶联靶向部分的水平存在。

实施例14

颗粒负荷的最优化

为了达到最大作用，在许多情况中重要的是颗粒携带最大负荷的试剂，例如用于MRI的Gd³⁺或用于核成像或放射治疗的放射性金属。该方法描述了对rHA颗粒的Gd³⁺结合容量的最优化。

14.1 DTPA-1标记的rHA颗粒的合成

将rHA颗粒的等份悬浮于水中，并在恒定搅拌下和约10-40分钟内向每份中加入不同量的DTPAa(覆盖约0.5-5g.g^-1rHA的范围)，通过添加5M NaOH以便将pH尽可能维持在接近pH8。在最后添加后将该混悬液搅拌约30分钟，并用3M HCl调节至pH 7。通过离心充分洗涤全部样品，并重悬浮以除去未结合的DTPA。

14.2 Gd ³⁺ 结合容量的测定

通过用XO指示剂进行配位滴定测定Gd³⁺结合容量。在滴定过程中通过使用合适的缓冲剂(例如六胺)或通过用合适的碱(例如NaOH)调节将pH控制在pH5.0-6.5的范围。向含有已知量DTPA-标记的rHA颗粒的混悬液中加入XO，并使用标准化GdCl₃溶液进行滴定至首次出现持久颜色改变。

实施例15

用于颗粒rHA衍生物中游离巯基恢复的条件的研究

使用可溶性rHA的结果(参见实施例4)表明，与DTPAa反应明显封闭了rHA的游离巯基。如果将该巯基用作交联剂的连接点，那么需要恢复rHA的游离巯基以便有效与交联剂反应。该方法描述了在rHA颗粒与DTPAa反应(DTPA-标记的rHA颗粒)后或在Gd³⁺结合(Gd-标记的rHA颗粒)后实现这一目的的条件的研究。

15.1 标记的rHA颗粒的合成

基本上如实施例11中所述生产DTPA-标记的rHA颗粒。基本上如实施例11中所述由DTPA-标记的rHA颗粒生产Gd-标记的rHA颗粒。另一方面，也可以如实施例14中所述，在XO的存在下使用GdCl₃进行配位滴定来生产它们，其中在滴定结束时进一步添加少量DTPA-标记的rHA颗粒以结合过量的Gd³⁺。

15.2 游离巯基的恢复

在一定范围pH值和/或一定范围温度下温育DTPA-标记的和Gd-标记的rHA颗粒的等份，并在温育开始时取样且此后定时取样。对它们进行游离巯基测定，以确定每种颗粒类型的游离巯基恢复的最佳条件。

实施例16

交联剂与颗粒rHA衍生物的反应

在本发明的方法中，为了产生定义明确的产物，靶向部分和载体分子各自含有用于交联剂反应的独特化学基团。就抗体靶向部分和rHA颗粒的特定情况而言，这些基团分别为碳水化合物和游离巯基。该方法描述了DTPA-标记的rHA颗粒和Gd-标记的rHA颗粒与适用于这些基团的两种交联剂PDPH和EMCH的反应。

16.1 标记的rHA颗粒的合成

基本上如实施例15中所述合成DTPA-标记的和Gd-标记的rHA颗粒，并使用该实施例中确定的最佳条件解除对游离巯基的封闭。

16.2 与PDPH的反应

通过添加磷酸盐缓冲液将两种类型的标记的rHA颗粒的等份缓冲至pH7左右。取样后立即加入明显比可利用游离巯基摩尔过量的PDPH，并在此后定期取样。立即离心样品并在343nm处测定上清液吸光度。对PDPH自身吸光度和来自未沉降颗粒的残留浊度进行测定值校准，并使用对释放的2-硫代吡啶的8080M^-1.cm^-1的消光系数计算反应程度。将这些数据用于确定使PDPH与每种颗粒类型偶联的最佳反应条件。

16.3 与EMCH反应

通过添加磷酸盐缓冲液将两种类型的标记的rHA颗粒的等份缓冲至pH7左右。取样后立即加入明显比可利用游离巯基摩尔过量的PDPH，并在此后定期取样。立即离心样品，并在进行游离巯基测定前充分洗涤沉淀以除去过量的EMCH。将这些数据用于确定使EMCH与每种颗粒类型偶联的最佳反应条件。

实施例17

抗体/Gd-标记的rHA颗粒的制备

基于上述对合成中的各步骤的研究(实施例11-16)，该方法描述了靶向试剂的制备，其中用DTPA，随后用Gd以高水平标记颗粒(rHA)，然后与抗体偶联，使得它适合于用作靶向MRI造影剂。

17.1 使用和不使用交联剂合成Gd-标记的rHA颗粒

基本上如实施例16中所述合成Gd-标记的rHA颗粒和Gd-标记的rHA颗粒+交联剂(PDPH或EMCH)。然后通过离心充分洗涤颗粒并重悬浮以除去过量的反应剂。

17.2 使用和不使用交联剂合成高碘酸盐氧化的抗体

基本上如实施例7中所述，通过将抗体与KIO₄一起温育、进行PD10色谱并离心浓缩，合成高碘酸盐氧化的抗体。也基本上如实施例7中所述进行PDPH交联剂与高碘酸盐氧化的抗体偶联和随后的PD 10色谱以及离心浓缩。可以类似地进行EMCH交联剂的偶联。

17.3 抗体/Gd-标记的rHA颗粒的合成

可以通过温育如下三组反应剂组合中的任意一组产生抗体/Gd-标记的rHA颗粒。

1.(Gd-标记的rHA颗粒+交联剂)+(高碘酸盐氧化的抗体)

2.(Gd-标记的rHA颗粒)+(高碘酸盐氧化的抗体+交联剂)

3.(Gd-标记的rHA颗粒)+(高碘酸盐氧化的抗体)+(交联剂)

无论使用哪种合成途经，均通过离心充分洗涤所得颗粒，并重悬浮以除去过量反应剂。

实施例18 抗体/DTPA-标记的rHA颗粒的制备

该方法描述了靶向试剂的制备，其中用DTPA而非金属离子以高水平标记颗粒(rHA)，然后与抗体偶联，使得它适合于负荷用作靶向核成像剂或治疗剂的适宜放射性金属。

18.1 使用和不使用交联剂合成DTPA-标记的rHA颗粒

基本上如实施例16中所述合成DTPA-标记的rHA颗粒和DTPA-标记的rHA颗粒+交联剂(PDPH或EMCH)。然后通过离心充分洗涤颗粒并重悬浮以除去过量的反应剂。

18.2 使用和不使用交联剂合成高碘酸盐氧化的抗体

基本上如实施例7中所述，通过将抗体与KIO₄一起温育、进行PD10色谱并离心浓缩，合成高碘酸盐氧化的抗体。也基本上如实施例7中所述进行PDPH交联剂与高碘酸盐氧化的抗体偶联和随后的PD10色谱以及离心浓缩。可以类似地进行EMCH交联剂的偶联。

18.3 抗体/Gd-标记的rHA颗粒的合成

可以通过温育如下三组反应剂组合中的任意一组产生抗体/DTPA-标记的rHA颗粒。

1.(DTPA-标记的rHA颗粒+交联剂)+(高碘酸盐氧化的抗体)

2.(DTPA-标记的rHA颗粒)+(高碘酸盐氧化的抗体+交联剂)

3.(DTPA-标记的rHA颗粒)+(高碘酸盐氧化的抗体)+(交联剂)

Claims

1.-种制备递送给身体的试剂与蛋白质分子或由蛋白质分子形成的颗粒形式的载体的靶向缀合物的方法，该方法包括：

(b)(i)使所述的中间体缀合物与异双功能交联剂反应以活化该中间体缀合物，然后使活化的中间体缀合物与靶向部分反应；或(ii)使所述的中间体缀合物与靶向部分反应，而所述靶向部分通过与异双功能交联剂反应而已经被活化；或(iii)使所述的中间体缀合物、异双功能交联剂和靶向部分一起同时反应，

其中所述的交联剂带有对与存在于所述载体上而在所述靶向部分上不存在的巯基反应具有特异性的一种官能性和对与存在于所述靶向部分上而在所述载体上不存在的碳水化合物部分反应具有特异性的第二种官能性。

2.如权利要求1中所述的方法，其中所述的载体物质为白蛋白。

3.如权利要求2中所述的方法，其中所述的白蛋白为人血清白蛋白。

4.如权利要求3中所述的方法，其中所述的白蛋白为重组人血清白蛋白。

5.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的靶向部分为抗体。

6.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的交联剂含有选自马来酰亚胺、2-吡啶基二硫基、卤代乙酸酯、卤代乙酰胺、氮丙啶、丙烯酰基/乙烯基、4-吡啶基二硫基和2-硝基苯甲酸-5-二硫基的基团。

7.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的交联剂含有酰肼基。

8.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中用于递送给身体的试剂含有羧基或通过含有羧基的偶联部分与所述载体偶联。

9.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中中间体缀合物上的游离巯基在步骤(a)中以可逆方式封闭，且在步骤(b)之前解除对存在于所述载体上的巯基的封闭。

10.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中步骤(a)包括使所述载体与螯合剂反应，且该方法进一步包括在和载体物质结合的螯合剂与加入到反应混合物中的金属离子之间形成螯合物，其中在添加所述金属离子的过程中将反应混合物的pH维持在5.0-6.5。

11.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的载体包括可溶性蛋白质分子。

12.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的载体为由蛋白质分子形成的颗粒，且该方法包括由蛋白质分子形成所述颗粒的预先步骤。

13.如权利要求12中所述的方法，其中通过包括下列步骤的方法形成所述的颗粒：

i)形成蛋白质分子的混悬液；和

ii)喷雾干燥所述混悬液。

14.如权利要求13中所述的方法，其中通过下列步骤形成蛋白质分子的混悬液：将蛋白质分子溶于溶剂中，然后加入对蛋白质分子而言的非溶剂，以便使蛋白质分子沉淀。

15.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中递送给身体的试剂是造影剂或其前体。

16.如权利要求15中所述的方法，其中所述造影剂用于磁共振成像。

17.如权利要求16中所述的方法，其中所述造影剂包含顺磁金属离子。

18.如权利要求17中所述的方法，其中所述金属离子包括Gd³⁺离子。

19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述的金属离子通过与所述载体共价结合的螯合部分与所述载体偶联。

20.如权利要求19中所述的方法，其中所述的螯合部分含有与载体上胺基反应而形成酰胺键的羧基。

21.通过权利要求1-20中任意一项所述方法制备的缀合物。

22.权利要求21的缀合物在制备用于增强通过医学成像技术获得的影像对比度的制剂中的应用。