JP2014503546A - 放射性標識ｈｅｒ２結合ペプチド - Google Patents

Abstract

放射性核種及びキレーターと結合した単離ポリペプチドを含むイメージング剤であって、該単離ポリペプチドがＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する、イメージング剤。これらイメージング剤を調製及び使用する方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は一般に、ヒト上皮成長因子受容体タイプ２（ＨＥＲ２）に結合するイメージング剤並びにかかる剤を作成及び使用する方法に関する。

ヒト上皮成長因子受容体タイプ２（ＨＥＲ２）は膜貫通型タンパク質で、受容体型チロシンキナーゼタンパク質であるｅｒｂＢファミリーのメンバーである。ＨＥＲ２は、乳がん、卵巣がん、肺がん、胃がん及び口腔がんを包含する幅広い種類のがんにおいて過剰発現している、十分に確立した腫瘍バイオマーカーである。それ故にＨＥＲ２は、分子標的として、及び患者生存の診断若しくは予後の指標として、又は抗悪性腫瘍外科手術への応答の予測マーカーとして、大きな価値がある。

この１０年間にわたって、様々なイメージングモダリティを用いた非侵襲性のＨＥＲ２発現分子イメージングが広範に研究されてきた。これらのモダリティとしては、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）及び単光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を使用した放射性核種イメージングが挙げられる。ＨＥＲ２のＰＥＴ及びＳＰＥＣＴイメージング（それぞれＨＥＲ２−ＰＥＴ及びＨＥＲ２−ＳＰＥＣＴ）は、高感度、高空間分解能をもたらす。ＨＥＲ２のＰＥＴイメージングはまた、強力な定量化能力をもたらす。ＨＥＲ２−ＰＥＴ及びＨＥＲ２−ＳＰＥＣＴは、患者における全身的な腫瘍ＨＥＲ２発現のリアルタイムアッセイ、腫瘍におけるＨＥＲ２発現の経時的な同定、ＨＥＲを標的とした治療（例として、トラスツズマブをベースにした療法）のための患者の選択、療法に対する応答の予測、薬効の評価及び多くの他の用途で特に有用である。しかしながら、化学作用を有し、臨床応用に適しているであろうインビボでの挙動を呈するＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ標識のＨＥＲ２リガンドは開発されていない。

自然に存在するブドウ球菌タンパク質Ａは、免疫グロブリンアイソタイプＧ（ＩｇＧ）の結晶化可能領域（Ｆｃ）断片に結合する３ヘリックス構造（足場）を形成するドメインを含む。タンパク質ＡのＺ−ドメイン由来のあるポリペプチドは、ループにより接続された３つのα−ヘリックスから構成される足場を含有する。２つのこれらヘリックス上に位置する、あるアミノ酸残基は、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合部位を構成する。別のバインダー分子は、これらの分子の結合能力を変えるために、ヘリックス１及び２上に位置する表面に露出したアミノ酸残基（１３残基）を置き換えることにより調製されている。その一例はＨＥＲ２結合分子又はＨＥＲ２バインダーである。これらのＨＥＲ２バインダーは、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ活性放射性核種で標識されている。かかるＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ標識のバインダーはインビボのＨＥＲ２発現パターンを患者の中で測定する能力を与え、それ故にＨＥＲ２に関連した病態の診断、予後判定及び治療において臨床医及び研究者を補助する。

ＰＥＴ活性放射性核種の¹⁸Ｆで放射性標識されたＨＥＲ２結合アフィボディ分子は、ＨＥＲ２を過剰発現する悪性腫瘍用のイメージング剤として評価されている。キレーター、例えばｍａＧＧＧ（メルカプトアセチルトリグリシル）、ＣＧＧ（システイン−ジグリシル）、ＣＧＧＧ（配列番号６）（システイン−トリグリシル）又はＡＡ３などによって^99mＴｃと結合したＨＥＲ２結合Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子もまた、診断イメージングに用いられている。これら分子の標的ＨＥＲ２発現腫瘍への結合は、マウスにおいて実証されている。

多くの場合、シグナルを生成する¹⁸Ｆ基は、チオール反応性のマレイミド基を通じてＡｆｆｉｂｏｄｙに導入される。チオール反応性のマレイミド基は、¹⁸Ｆ導入後、多段階合成を用いて調製される。しかしながら、この化学作用は低い放射化学的収率をもたらすのみである。同様に、^99mＴｃのＡｆｆｉｂｏｄｙとのコンジュゲーションは多段階低収率プロセスである。加えて、Ｔｃの還元及びキレートとの錯体形成には、高いｐＨ（例として、ｐＨ＝１１）条件及び長い反応時間が必要である。

¹⁸Ｆ標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子のインビボでの性能は中程度に良好であるが、顕著な改良の余地がある。例えば、いくつかの研究において、腫瘍への取り込みはイメージング剤注入後２時間でたったの６．３６±１．２６％ＩＤ／ｇであったことが見出された。他方、^99mＴｃ標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ分子は肝胆道クリアランスが優勢であって、このことは腸内への高い放射活性蓄積を引き起こし、腹部においてＨＥＲ２腫瘍及び転移を検出するための使用を制限する。

それ故に、放射性部分、例えば¹⁸Ｆを最終ステージで導入することが可能で、結果として高い放射化学的収率をもたらす放射性標識ポリペプチドを合成する化学作用及び方法へのニーズがある。加えて、改良された性質、特に腎クリアランス及び毒性作用に関連した性質を有する、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴイメージングのための新たなＨＥＲ２系イメージング剤へのニーズがある。

国際公開第２００８／１１８６０１号

本発明の組成物は、ＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する能力がある新たな種類のイメージング剤である。

１以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、ジアミンジオキシムキレーターを介して^99mＴｃと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。ジアミンジオキシムキレーターは、Ｐｎ２１６、ｃＰｎ２１６、Ｐｎ４４又はそれらの誘導体を含むことができる。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。

１以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、ＮＯＴＡキレーターを介して⁶⁷Ｇａ又は⁶⁸Ｇａと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。

１以上の実施形態では、イメージング剤組成物は、リンカーを介して¹⁸Ｆと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含む。リンカーは、アミノキシ基、アジド基又はアルキン基から得られる基を含む。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。

本発明のイメージング剤組成物を調製する方法の例は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、及び（ｉｉ）ジアミンジオキシムキレーターをポリペプチドと反応させて、キレーター結合ポリペプチドを形成させることを含む。別の例において、方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをリンカーと反応させること、及び（ｉｉｉ）リンカーを¹⁸Ｆ部分と反応させて、¹⁸Ｆ結合ポリペプチドを形成させることを含む。リンカーはアミノキシ基、アジド基又はアルキン基を含むことができる。

本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点は、以下の詳細な説明を添付の図を参照しながら読むと、より良く理解されるようになろう。

それぞれ８つの異なる濃度での２つの抗ＨＥＲ２ポリペプチド、Ｚ４７７（配列番号３）及び（Ｚ４７７）₂（配列番号５）の、ヒトＨＥＲ２に対する結合アフィニティーの表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）のグラフである。 図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれＣ６（ラットグリオーマ、対照）及びＳＫＯＶ３（ヒト卵巣がん）に対するヒト抗ＨＥＲ２抗体の定性的フローサイトメトリーのグラフである。図２Ｃは、ＳＫＯＶ３及びＣ６細胞株についての細胞当たりのＨｅｒ２受容体の棒グラフである。 ＳＫＯＶ３細胞に関する腫瘍タイプＳＫＯＶ３ ２−１、ＳＫＯＶ３ ３−１、ＳＫＯＶ３ ３−４のパネル及びブランクに関する、Ｈｅｒ２についてのＥＬＩＳＡアッセイの棒グラフである。 ^99mＴｃ標識Ｚ００４７７（配列番号３）の逆相ＨＰＬＣγクロマトグラムである。 図５Ａは、凝集^99mＴｃ（ＣＯ）₃（Ｈｉｓ６）Ｚ００４７７（配列番号４）（「Ｈｉｓ６」は配列番号７として開示）のｐＨ９でのサイズ排除ＨＰＬＣγクロマトグラムである。図５Ｂは、非凝集^99mＴｃ（ＣＯ）₃（Ｈｉｓ６）Ｚ００４７７（「Ｈｉｓ６」は配列番号７として開示）標識アフィボディ標品のサイズ排除ＨＰＬＣγクロマトグラムである。 ＳＫＯＶ３担がんマウスからの血液、腫瘍、肝臓、腎臓及び脾臓試料におけるＺ００４７７（配列番号３）の生体分布プロファイルを、経時的な腫瘍：血液比を包含して表したグラフである。 Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６リンカーの化学構造の図である。 図８Ａはエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）のグラフであり、図８Ｂは精製されたＺ００４７７（配列番号３）−ｃＰＮ２１６についての質量デコンボリューション結果のグラフである。 ^99mＴｃ標識Ｚ０２８９１−ｃＰＮ２１６（配列番号２）についての逆相ＨＰＬＣγトレースクロマトグラムである。 ＳＫＯＶ３担がんマウスからの血液、肝臓、腎臓、脾臓及び尾部試料における、ｃＰＮ２１６によって^99mＴｃ標識Ｚ０２８９１（配列番号２）の生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）のグラフである。 ＳＫＯＶ３担がんマウスからの腫瘍、血液、肝臓、腎臓、膀胱／尿、尾部、腸及び脾臓試料における、ｃＰＮ２１６によって^99mＴｃ標識Ｚ０２８９１（配列番号２）の生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）のグラフである。 ＳＫＯＶ３担がんマウスにおけるＺ０２８９１（配列番号２）についての生体分布プロファイルのグラフであり、腫瘍：血液比を示す。 Ｂｏｃ保護されたマレイミド−アミノキシ（Ｍａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃ）及びマレイミド−アミノキシ（Ｍａｌ−ＡＯ）リンカーの化学構造の図である。図１３Ａはｔｅｒｔ−ブチル ２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチルアミノ）−２−オキソエトキシカルバメート（Ｍａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃ）の化学構造であり、図１３Ｂは２−（アミノオキシ）−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アセトアミド塩酸塩（Ｍａｌ−ＡＯ．ＨＣｌ）の化学構造である。 図１４ＡはＺ００３４２（配列番号１）出発物質の逆相ＨＰＬＣクロマトグラム、図１４Ｂは精製されたＺ００３４２（配列番号１）−ＡＯイメージング剤組成物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムであり、いずれも２８０ｎｍで分析されたものである。 ¹⁸Ｆ−フルオロベンジル−Ｚ００３４２（配列番号１）及び¹⁸Ｆ−フルオロベンジル−Ｚ０２８９１'（配列番号２）の粗反応混合物及び精製された最終生成物についての逆相ＨＰＬＣγクロマトグラムである。 ＳＫＯＶ３腫瘍動物からの¹⁸Ｆ標識Ｚ０２８９１（配列番号２）ポリペプチドの生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）のグラフである。 ＳＫＯＶ３腫瘍動物からの¹⁸Ｆ標識Ｚ０２８９１（配列番号２）ポリペプチドの生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）及び腫瘍：血液比のグラフである。 血液、腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓及び骨試料における¹⁸Ｆ標識Ｚ００３４２（配列番号１）及び¹⁸Ｆ標識Ｚ０２８９１（配列番号２）の生体分布プロファイル（％ＩＤ、％注入用量）の棒グラフである。 Ｍａｌ−ＮＯＴＡリンカーの化学構造の図である。 図２０ＡはＺ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡについてのエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量スペクトル（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）のグラフであり、図２０ＢはＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量デコンボリューション結果のグラフである。 ⁶⁷Ｇａ標識Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡの反応１時間後の粗反応混合物についての逆相ＨＰＬＣγトレースのグラフである。 精製された⁶⁷Ｇａ標識ＮＯＴＡ Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡポリペプチドについての逆相ＨＰＬＣγトレースのグラフである。

本発明のイメージング剤は、一般に、¹⁸Ｆ、^99mＴｃ、⁶⁷Ｇａ又は⁶⁸Ｇａと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体の単離ポリペプチド及び該組成物を作成及び使用する方法を含む。単離ポリペプチドはＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する。１以上の実施形態では、単離ポリペプチドの配列は、配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体のいずれかに対して９０％以上の配列類似性を有する。

単離ポリペプチドは、天然アミノ酸、合成アミノ酸又は自然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸模倣物を含むことができる。自然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたものや、同様に後から修飾されたアミノ酸であり、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、ホスホスレオニン及びホスホチロシンである。

単離ポリペプチドは標準的な固相合成技術を用いて調製することができる。あるいは、ポリペプチドは組換え技術を用いて調製してもよい。ポリペプチドが組換え技術を用いて調製される場合、ポリペプチド又はその保存的変異体をコードするＤＮＡを単離することができる。ポリペプチド又はその保存的変異体をコードするＤＮＡは、クローニングベクター内に挿入し、宿主細胞（例として、真核生物細胞、植物細胞又は原核生物細胞）中に導入して、当該技術分野で認められている任意の発現系を用いて発現させることができる。

ポリペプチドは、単一のキラル型のアミノ酸残基から実質的に構成することができる。従って、本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸のいずれかから実質的に構成することができる。しかし、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との組合せもまた利用することができる。

本明細書で提供されるポリペプチドはタンパク質ＡのＺ−ドメインに由来することから、結合面上の残基は、結合活性を保つ限り、非保存的に置換されてもよく、保存的に置換されてもよい。いくつかの実施形態では、置換される残基は２０個の自然に存在するアミノ酸又はそれらの任意のアナログのいずれかに由来し得る。

ポリペプチドは約４９残基から約１３０残基の長さであることができる。具体的なポリペプチド配列は表１に記載される。

選択的機能性を付与するため、付加配列を末端に加えることができる。従って、付加配列は、ポリペプチドの精製又は単離を促進するため、片方又は両方の末端に、単独又は結合標的と連結して付け加えることができる（例として、Ｈｉｓタグをポリペプチドに付け加えることによって）。

表１に記載されたポリペプチドは、リンカーを介して¹⁸Ｆと、ジアミンジオキシムキレーターを介して^99mＴｃと、又はＮＯＴＡキレーターを介して⁶⁷Ｇａ若しくは⁶⁸Ｇａと、結合させることができる。表２はこれらポリペプチドの等電点（ｐＩ）を提供する。

１以上の実施形態では、配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドは、¹⁸Ｆと結合させることができる。¹⁸Ｆは、単離ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端又は内部位置に組み込むことができる。

１以上の実施形態では、¹⁸Ｆはリンカーを介して単離ポリペプチドに結合させることができる。リンカーはアミノキシ基、アジド基又はアルキン基を含むことができる。リンカーのアミノキシ基はアルデヒド、例えばフッ素置換アルデヒドなどと結合することができる。リンカーのアジド基はフッ素置換アルキンと結合することができる。同様に、リンカーのアルキン基はフッ素置換アジドと結合することができる。リンカーはまた、チオール反応性基を含んでもよい。リンカーはマレイミド−アミノキシ、マレイミド−アルキン又はマレイミド−アジド基から構成されてもよい。¹⁸Ｆ結合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ポリペプチドをアミノキシ基、アジド基又はアルキン基を含むリンカーと反応させて、リンカー結合ポリペプチドを形成させること、及びリンカーを¹⁸Ｆ部分と反応させることにより、調製することができる。

別の実施形態では、方法は、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）リンカーを用意すること、（ｉｉｉ）リンカーを¹⁸Ｆ部分と反応させて、¹⁸Ｆ標識リンカーを形成させること、及び（ｉｖ）¹⁸Ｆ標識リンカーを配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体の単離ポリペプチドと反応させて、リンカー結合ポリペプチドを形成させることを含むことができる。

上記の例を用いて、フッ素又は放射性フッ素原子（例えば¹⁸Ｆなど）を、ポリペプチド上に導入することができる。フッ素置換アルデヒドをリンカー結合ポリペプチドのアミノキシ基と反応させる場合、フッ素置換ポリペプチドが結果として得られる。同様に、フッ素置換アジド又はアルキン基をリンカー結合ポリペプチドの各アルキン又はアジド基と反応させる場合、フッ素置換ポリペプチドが結果として得られる。放射性フッ素置換アルデヒド、アジド又はアルキンをリンカー結合ポリペプチドの各アミノキシ、アルキン又はアジド基と反応させる場合、放射性フッ素標識ポリペプチド又はイメージング剤組成物が結果として得られる。さらに、アルデヒド、アジド又はアルキンの各々は、放射性フッ素（¹⁸Ｆ）標識のイメージング剤組成物を調製するため、放射性フッ素置換基を有してもよい。ポリペプチド上にフッ素を導入する方法はまた、任意の長さのフッ化イメージング剤組成物を調製するのに用いてもよい。従って、いくつかの実施形態では、イメージング剤組成物のポリペプチドは、例えば、４０から１３０個のアミノ酸残基を含むことができる。

イメージング剤のリンカー結合ポリペプチドを合成するための化学作用は手軽であり、この方法の１段階反応は今まで知られていた方法より効率的で高い収率につながるものである。この方法はより容易に行うことができ、より早く、及びより緩やかでよりユーザーフレンドリーな条件下で実施される。例えば、ポリペプチドを、リンカーと結合した¹⁸Ｆ（例として、¹⁸Ｆ−フルオロベンズアルデヒド）で標識する方法は、当技術分野で公知の手順より簡単である。¹⁸Ｆ結合リンカーは、トリメチルアニリニウム前駆体上に¹⁸Ｆを直接求核導入することにより１段階で調製される。¹⁸Ｆ−リンカー（すなわち¹⁸Ｆ−ＦＢＡ）は次いでポリペプチド、例えばアフィボディに結合させる。リンカーの調製もまた、当技術分野で公知の方法より容易である。その上、放射性標識アミノキシ系リンカーと結合したポリペプチド及びｃＰｎファミリーのキレーターと結合したポリペプチド（例として、アフィボディ）は、顕著により良好な生体分布及びより良好な腫瘍取り込み、同様により少ない肝臓取り込みを伴うより良好なクリアランスを示す。

フッ素標識組成物は、診断用途で大変望ましい物質である。¹⁸Ｆ標識イメージング剤組成物は、確立したイメージング技術、例えばＰＥＴを用いて可視化することができる。

別の実施形態では、ポリペプチドは式（１）のジアミンジオキシムキレーターを介して^99mＴｃと結合することができる。

式中、Ｒ'、Ｒ''、Ｒ'''、Ｒ''''は独立してＨ若しくはＣ_1-10アルキル、Ｃ_3-10アルキルアリール、Ｃ_2-10アルコキシアルキル、Ｃ_1-10ヒドロキシアルキル、Ｃ_1-10アルキルアミン、Ｃ_1-10フルオロアルキルであり、又は２以上のＲ基は、それらが結合している原子と共に炭素環、複素環、飽和若しくは不飽和環を形成し、ここでＲはＨ、Ｃ_1-10アルキル、Ｃ_3-10アルキルアリール、Ｃ_2-10アルコキシアルキル、Ｃ_1-10ヒドロキシアルキル、Ｃ_1-10アルキルアミン若しくはＣ_1-10フルオロアルキルであることができる。１つの実施形態では、ｎは０〜５まで変わり得る。ジアミンジオキシムキレーターを調製する方法の例は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｒａｄｉｏ ｆｌｕｏｒｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｖｅｃｔｏｒ」と題するＰＣＴ出願の国際公開第２００４／０８０４９２号及び「Ｒａｄｉｏ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ ＲＧＤ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｖｉａ ｃｌｉｃｋ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」と題するＰＣＴ出願の国際公開第２００６／０６７３７６号に記載されており、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。

^99mＴｃは、ジアミンジオキシムによって単離ポリペプチドのＮ末端で、単離ポリペプチドに結合させることができる。キレーターは二官能性化合物であることができる。１つの実施形態では、二官能性化合物はＭａｌ−ｃＰＮ２１６であることができる。Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６は、配列番号１又は配列番号２のポリペプチドの末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基、及び^99mＴｃをキレートするためのビス−アミノオキシム基（ジアミンジオキシムキレーター）を含む。Ｍａｌ−ｃＰＮ２１６は式（２）を有することができる。

ジアミンジオキシムキレーター結合ペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ジアミンジオキシムキレーターをポリペプチドと反応させて、ジアミンジオキシム結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。ジアミンジオキシムキレーターはさらに^99mＴｃと結合させてもよい。

１以上の実施形態では、ポリペプチドはＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリ酢酸）キレーターを介して⁶⁷Ｇａ又は⁶⁸Ｇａと結合することができる。ＮＯＴＡ結合ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、（ｉｉ）ＮＯＴＡキレーターをポリペプチドと反応させて、ＮＯＴＡ結合ポリペプチドを形成させることにより、調製することができる。ＮＯＴＡキレーターはさらに⁶⁷Ｇａ又は⁶⁸Ｇａと結合させてもよい。

１つの実施形態では、Ｇａ、特に⁶⁷Ｇａは、ＮＯＴＡキレーターを介して単離ポリペプチドに結合させることができる。ＮＯＴＡキレーターは、式（３）に記載の通り、マレイミド基で官能化することができる。

本発明はまた、対象の少なくとも一部をイメージングする方法を含む。１つの実施形態では、方法は、イメージング剤組成物を対象に投与すること及び対象をイメージングすることを含む。対象は、例えば、診断デバイスを使用してイメージングすることができる。

方法は、組成物が対象に送達されるのをモニターする段階、及び対象をＨＥＲ２関連の病態（例として、乳がん）と診断する段階をさらに含んでもよい。１つの実施形態では、対象は哺乳類、例えばヒトであることができる。別の実施形態では、対象は細胞又は組織を含むことができる。組織は生検において用いることができる。診断デバイスは、磁気共鳴イメージング、光学イメージング、光干渉断層撮影、Ｘ線、コンピュータ断層撮影法、陽電子放射断層撮影又はそれらの組合せから選ばれるイメージング方法を利用することができる。

イメージング剤組成物は、ヒト及び他の動物に非経口で投与することができる。非経口注入のための本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される滅菌された水性若しくは非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、同様に使用直前に滅菌された注入可能な溶液若しくは分散液へと再構成するための滅菌粉末を含む。適した水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒又は媒体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適した混合物、植物油（例えばオリーブ油など）、並びに注入可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどが挙げられる。例えばコーティング材料、例えばレシチンなどを用いることにより、分散液中の粒子サイズを調整することにより、及び界面活性剤を用いることにより、適切な流動性を維持可能である。

これらのイメージング剤組成物はまた、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などを含有してもよい。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを包含させることにより、確実にできる。等張性の剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを包含させることもまた望ましい。注入可能な医薬形態の持続性吸収は、吸収を遅らせる剤、例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンなどを包含させることにより、もたらされ得る。

イメージング剤組成物は、潜在的な毒性を最小化するため、生理的に許容される担体中に分散することができる。従って、イメージング剤はｐＨが約６から約８の生体適合性溶液中に分散することができる。いくつかの実施形態では、該剤はｐＨが約７から約７．４の生体適合性溶液中に分散することができる。他の実施形態では、該剤はｐＨが約７．４の生体適合性溶液中に分散される。

イメージング剤組成物は、医薬産業において化合物を水性媒体中に懸濁又は溶解するのに一般に用いられる他の添加物と組合せ、次いで懸濁液又は溶液は当技術分野で公知の技術で滅菌することができる。イメージング剤組成物は、種々の形態で投与し、選ばれた投与経路に適合させることができる。例えば、該剤は、局所的に（すなわち組織又は粘膜経由で）、静脈内に、筋肉内に、皮内に又は皮下に投与することができる。注入に適した形態としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌された注入可能な溶液、分散液、リポソーム製剤若しくはエマルジョン製剤を調製するための滅菌粉末が挙げられる。吸入使用に適した形態としては、エアロゾル中に分散されたような剤が挙げられる。局所投与に適した形態としては、クリーム、ローション、軟膏などが挙げられる。

イメージング剤組成物は、好ましい量の剤を対象へと好都合に送達するように濃縮し、所望の形態で容器中に包装することができる。剤は容器中に分注することができ、この中で剤は、対象のｋｇ体重当たり０．１ｍｇから５０ｍｇの間の剤濃度での剤の投与を好都合に促進する、生理的に許容される溶液中に分散される。

１以上の実施形態では、標的組織は、該剤の投与後約４時間でイメージングすることができる。代替的実施形態では、標的組織は、対象への該剤の投与後約２４時間でイメージングすることができる。

以下の例は説明の目的のみのために提供されるものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。

合理的なＨＥＲ２発現の可能性を有する腫瘍原性細胞株のパネルを、利用可能な文献（Ｂｒｕｓｋｉｎ， ｅｔ． ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２００４： ３１： ２０５； Ｔｒａｎ， ｅｔ． ａｌ． Ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍ． ２００７： １８： １９５６）に基づいて、表３に記載の通り選択した。

全ての細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、推奨されるように培養した。細胞は、使用前に＞９０％コンフルエンスまで培養した。フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００ ＭＰＬ）は、間接的な免疫蛍光染色の定量分析のため、表４に記載された細胞株に対して、抗Ｈｅｒ２一次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ ＭＡＢ１１２９）及びＤａｋｏ ＱＩＦＩＫＩＴ（ＰＮ Ｋ００７８）を用いて行った。異なる数のＭａｂ分子を有する５つの異なる集団を持つ較正ビーズを、細胞株と一緒に、細胞当たりの表面受容体数を決定するのに用いた。全ての場合、適切なアイソタイプの対照を該当する販売業者から入手した。

付着細胞は、細胞表面受容体のタンパク質分解を避けるため、トリプシンよりむしろ細胞分離緩衝液（ＰＢＳ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いてフラスコから遊離させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷冷ＦＣ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡｗ／ｖ）中に濃度５〜１０×１０⁶細胞／ｍｌになるように再懸濁した。１００μＬの一定分量の細胞を５μｇの一次抗体と混合し、氷上で４５分間インキュベートした。細胞を次いで１ｍｌの氷冷フローサイトメトリー（ＦＣ）緩衝液（２％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳ）で洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離して、０．５μＬのＦＣ緩衝液中に再懸濁した。ＰＢＳで１：５０に希釈した二次抗体断片（Ｆ（ａｂ）₂ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン）を１００μＬ加え、氷上、暗所で４５分間インキュベートした。細胞を次いで１ｍＬの氷冷ＦＣ緩衝液で２回洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離して、５００μＬのＦＣ緩衝液中に再懸濁した。全ての染色細胞は、フローセルが詰まるのを防ぐため、フローサイトメトリーの前に１００ミクロンのフィルターを通過させた。

フローサイトメトリーはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００ ＭＰＬ上で行った。各チューブについて最少で５×１０⁴のイベントを収集した。全ての分析は単一色で、ＦＬ１におけるＦＩＴＣの検出を使用したものであった。前方散乱（ＦＳ）及び側方散乱（ＳＳ）のデータは、全ての細胞集団がしっかりグループ分けされることを実証した。

フローサイトメトリーはインビトロでのＨＥＲ２発現について細胞を評価するのに用いられ（図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）、ＳＫＯＶ３細胞は最も高いＨＥＲ２発現レベルを示した（図３）。図３の結果は再現性があった（ｎ＝３）。

最も高発現の細胞株はＳＫＯＶ３であった。これらの細胞を６〜１２週齢の免疫不全マウスに注射し、腫瘍を増殖させた。腫瘍増殖曲線及び成功率は、接種した細胞数に依存した。最適な腫瘍増殖は３００万から４００万個の細胞／マウスを使用して得られた。

インビボ研究は、週齢が６週から１５週の間の範囲である雌性ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に１００μｌのＰＢＳ中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＳＫＯＶ３の場合、３×１０⁶〜４×１０⁶の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が注入された動物の８０％超で３から４週の間に得られた。

剥離によりマウスから腫瘍を回収し、全腫瘍を処理まで−２０℃で保存した。腫瘍はプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ＃２４９４８）添加ＲＩＰＡ緩衝液１ｍｌの中で、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー中で氷上で粉砕した。ホモジネートは次いで氷上で３０分間インキュベートし、次いで冷却遠心分離機中で１０，０００×Ｇで１０分間、遠心分離した。上清を回収して、さらなる処理まで氷上又は４℃で保存した。溶解液中のタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３２２５）を用いて決定した。溶解液は、マイクロタイタープレート中で２０μｇのタンパク質／ウェルが得られるよう、標準的な濃度に希釈した。ＥＬＩＳＡは市販のヒトＨＥＲ２キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ１１２９）を使用して、製造業者の説明書に従って行った。各試料について３回測定を行い、データをｐｇ ＨＥＲ２／μｇ総タンパク質として報告し、誤差を標準偏差として報告した。

インビボでの標的の発現は、ＥＬＩＳＡにより測定した。切除した腫瘍をホモジナイズし、市販のマッチドペアキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ１１２９、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いてＨＥＲ２について分析した。図３の結果は、ＳＫＯＶ３細胞株が高発現腫瘍を増殖させることを示す。ＥＬＩＳＡの対照は、フローサイトメトリーに用いた陰性対照株の細胞培養物溶解液であった。これらの結果は、ＳＫＯＶ３の腫瘍異種移植片がヒトＨＥＲ２を標的とする分子のインビボ研究に適切であることを指し示す。

全てのポリペプチドは、ＳｗｅｄｅｎにあるＡｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢから受け入れた。ポリペプチドは、「Ｚ」を前に付けた、数字で表される内部開発コードで呼ばれる。表１は本明細書で記載されるポリペプチドを詳述する。ポリペプチドとしては、ポリペプチドＺ００３４２（配列番号１）、ポリペプチドＺ０２８９１（配列番号２）、ポリペプチドＺ００４７７（配列番号３及び４）及びＺ００４７７のダイマー、すなわち（Ｚ００４７７）₂（配列番号５）が挙げられる。

ポリペプチドとＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原との間の結合相互作用は、インビトロで表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の検出を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で測定した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外ドメインは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からヒトＩｇＧのＦｃ領域とのコンジュゲート（Ｆｃ−Ｈｅｒ２）として入手し、ＣＭ−５デキストラン官能化センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に共有結合で結合させたが、このセンサーチップはＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）を１０μＬ／分で使用して予め平衡化し、続いてＥＤＣ及びＮＨＳで活性化したものである。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中のＦｃ−ＨＥＲ２（５μｇ／ｍｌ）は、所望の固定化レベル（約３０００Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）に達するまで（２分）、活性化センサーチップ上に注入した。センサーチップ上の残りの活性化基は、エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を注入してブロックした。非共有結合的に結合したあらゆるコンジュゲートは、２．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＨを使用して繰り返し（５回）洗浄することで除去した。同じセンサーチップ上の２つ目のフローセルは、屈折率変化及びセンサーチップとの非特異的な結合相互作用の対照表面として働かせるため、Ｆｃ−ＨＥＲ２固定化を行わない点を除いて同様に処理した。動態研究の前に標的分析物の結合を両表面上で試験して表面安定性実験を実施し、結合した分析物の十分な除去と、２．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＨでの処理後のセンサーチップ再生とを確実にした。ＳＰＲセンサーグラムはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて分析した。動態学的モデルのロバスト性は、計算された動態学的パラメーターの各々についての残差及び標準誤差、「適合度」（χ²＜１０）を評価することにより、並びにモデル化したセンサーグラムを実験データと直接的に比較することにより決定した。ＳＰＲ測定値を８つの分析物濃度（０〜１００ｎＭタンパク質）で収集し、結果として得られたセンサーグラムを１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。

図１は、ヒトＨＥＲ２官能化表面上で測定したときのＺ００４７７（配列番号３）及び（Ｚ００４７７）₂（配列番号５）について得られた、例の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）データを示す。この関係はアフィニティーが知られている全てのポリペプチド（表２）について当てはまり、この中でダイマーＺ（４７７）₂（配列番号５）の値は親和性の性向に基づく推定である。

Ｈｉｓ６（配列番号７）タグ付加ポリペプチドのｆａｃ−［^99mＴｃ（ＣＯ）₃］⁺コアでの標識は、以前に公表された手順（Ｗａｉｂｅｌ， Ｒ．； ｅｔ ａｌ．， Ａ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９９， １７， ８９７）を改変したものを用いて達成した。簡潔には、生理食塩水中のＮａ［^99mＴｃＯ₄］（４ｍＣｉ、２ｍＬ）をＩｓｏｌｉｎｋ（登録商標）ボラノカーボネートキット（Ａｌｂｅｒｔｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００１， １２３， ３１３５）に加えた。結果として得られた溶液を９５℃まで１５〜２０分間加熱することで、ｆａｃ−［^99mＴｃ（ＣＯ）₃（Ｈ₂Ｏ）₃］⁺が生じた。溶液の一定分量（２ｍＣｉ、１ｍＬ）を取り出し、１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨ約７に中和した。３２５μＬの一定分量を取り出し、Ｈｉｓ６−ポリペプチド（配列番号７）（４０μｇ）の溶液に加えた。結果として得られた溶液を３５〜３７℃の水浴中で４０分間加熱した。典型的な放射化学的収率は８０〜９５％の範囲であった（ＩＴＬＣ−ＳＧ、Ｂｉｏｄｅｘ、０．９％ＮａＣｌにより決定）。粗反応生成物についてＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ ＰＢＳ）上でクロマトグラフィーにかけて、＞９９％放射化学的純度の生成物が生じた。得られた典型的活性は３〜４μＣｉ／μｇであった。結果として得られた溶液を次いで１０ｍＭ ＰＢＳで希釈することで、その後の生体分布研究に適当な濃度を与えた。

ＨＰＬＣは、Ｇｒａｃｅ−Ｖｙｄａｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４（４．６×２５０ｍｍ）カラム及びＲａｙｔｅｓｔ ＧＡＢＩ放射能検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ上で行った。溶媒Ａは０．１％ＴＦＡを添加した９５：５ 水：ＭｅＣＮで、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡを添加した５：９５ 水：ＭｅＣＮであった。グラジエントは以下であった（全ては直線的に変化する。時間／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０、３１／０。

各ポリペプチドは、精製前にトリカルボニルテクネチウムのコアで高収率（＞９０％）に標識した。ＮＡＰ−５クロマトグラフィーによる精製で、^99mＴｃ標識ポリペプチド試料が＞９９％の放射化学的純度で生じた（表４）。

ＮＡＰ−５で精製された放射性標識ポリペプチドの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。放射性標識種の保持時間は、２２０ｎｍのＵＶクロマトグラムにおける対応する非標識ポリペプチドの保持時間と実質的に変わらなかった（ＵＶ検出器及びγ検出器の物理的分離が原因である時間差を除く。データは図示せず）。
^99mＴｃ（ＣＯ）₃（Ｈｉｓ₆）−ポリペプチドの研究に用いた動物モデル（「Ｈｉｓ₆」は配列番号７として開示）
インビボ研究は、週齢が６週から１５週の間の範囲である雌性ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に１００μｌのＰＢＳ中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＳＫＯＶ３の場合、３×１０⁶〜４×１０⁶の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が注入された動物の８０％超で３から４週の間に得られた。

生体分布
マウスに約１μｇの^99mＴｃ標識ポリペプチド（約３μＣｉ／１μｇ）を尾静脈注射した。マウスは安楽死までろ紙を並べたケージの中に置かれた。各時点で３匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を切除してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ｗｉｚａｒｄ １４８０γＣｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注入部位（尾部）についてデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールして、これもまたカウントした。残りの組織をカウントし、各動物について全組織＋尿の和を合計して、全注入用量が与えられた。各器官についての％注入用量はこの全量に基づいて決定し、器官はグラム当たりの％注入用量（％ＩＤ／ｇ）を決定するために秤量した。データは、その時点での全３匹のマウスについての平均値として、群の標準偏差を表すエラーバーと共に報告される。

^99mＴｃ標識Ｚ００４７７（配列番号４）ポリペプチドをＳＫＯＶ３マウスに注入した。図６はこれらの実験についての腫瘍及び血液曲線を示す。Ｚ００４７７（配列番号４）ポリペプチドは標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において良好な腫瘍への取り込みを示し、最大値は注入後（ＰＩ）３０分で組織のグラム当たりの注入用量のおよそ３％であり、ピークの腫瘍：血液比はＰＩ２４０分で８より大きい。

ポリペプチドは単指数関数的な血液からのクリアランスを呈し、半減期は２分未満である。このクリアランスは主として肝臓及び腎臓が媒介する。表５に記載の通り、脾臓におけるポリペプチドの取り込みは中程度で、肝臓において中程度から高度の取り込みが観察されている。

二価のポリペプチドは対応するモノマーより高いアフィニティーを呈するが、これはおそらく親和性効果のためである。それらのより大きなサイズは、しかしながら、腫瘍の浸透を妨げ得る。ＨＥＲ２ポリペプチドの場合、各々４つの高アフィニティーポリペプチドの二価形態が利用可能であった。Ｚ００４７７（配列番号３）のダイマーである（Ｚ００４７７）₂（配列番号５）を放射性標識し、ＳＫＯＶ３腫瘍マウスにおける４時間の生体分布実験に用いた。

一価及び二価のポリペプチドはその他の点では似たような生体分布特性を呈し、血中半減期はいずれについても１から２分の範囲内に観察されている。結果は、モノマー及び二価ポリペプチドのいずれもインビボでＨＥＲ２を標的にすることが可能であることを明確に指し示す。

^99mＴｃキレーターのｃＰＮ２１６（図７）を導入するため、二官能性化合物のＭａｌ−ｃＰＮ２１６を、ポリペプチドの末端システインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基、及び^99mＴｃをキレートするためのアミンオキシム基を含んで合成した。

ｃＰＮ２１６−アミンはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸はＰｉｅｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。Ｎ−メチルモルフォリン、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、炭酸水素アンモニウム及び無水ＤＭＦはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入した。ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ）、ＨＰＬＣグレードのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ １８ｍΩ水をＨＰＬＣ精製に用いた。

Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸（１０８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、ｃＰＮ２１６−アミン（２００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）及びＰｙＢｏＰ（３３３ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を０℃の無水ＤＭＦ中に溶解した氷冷溶液に、０．４ＭのＤＭＦ中Ｎ−メチルモルフォリン（１２８μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を２時間後に除去し、混合物を室温で一晩撹拌し、ＨＰＬＣ精製に供した。生成物は白色粉末として得られた（２３０ｍｇ、８０％収率）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．３５（ｍ、２Ｈ）、１．４３（ｓ、１２Ｈ）、１．５６（ｍ、５Ｈ）、１．８５（ｓ、６Ｈ）、２．３３（ｄｄ、Ｊ１＝８Ｈｚ、Ｊ２＝４Ｈｚ、２Ｈ）、２．７８（ｍ、４Ｈ）、３．０４（ｍ、２Ｈ）、３．６１（ｄｄ、Ｊ１＝８Ｈｚ、Ｊ２＝４Ｈｚ、２Ｈ）、７．０２（ｓ、２Ｈ）、８．０２（ｓ、１Ｈ）、８．６８（ｓ、４Ｈ）、１１．２６（ｓ、２Ｈ）；［Ｍ＋Ｈ］⁺についてのｍ／ｚ＝４９５．２（Ｃ２４Ｈ４３Ｎ６Ｏ５、計算されたＭＷ＝４９５．３）。

ポリペプチドを、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を使用して濃度およそ１ｍｇ／ｍＬで溶解した。ポリペプチド内のジスルフィド結合は、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中にＤＴＴ溶液を加えることにより還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭであった。反応混合物を２時間ボルテックスし、脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）で予め平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通過させて、過剰なＤＴＴ試薬を除去した。溶出した還元ポリペプチド分子を回収し、二官能性化合物のＭａｌ−ｃＰＮ２１６をＤＭＳＯ溶液として加え（等価のポリペプチド当たり２０当量）、混合物を室温で３時間ボルテックスして、液体窒素で凍らせた。反応混合物を一晩保存して、逆相ＨＰＬＣ精製に供した（図８Ａ及び８Ｂ）。

ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ Ｍａｇｉｃ Ｃ１８ＡＱ ５μ ２００Ａカラム（ＭｉＣｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上で実施した。溶媒Ａ：Ｈ₂Ｏ（０．１％ギ酸を添加）、溶媒Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ（０．１％ギ酸を添加）。グラジエント：３０分間かけて５〜１００％のＢ。

所望の生成物を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を使用して中和し、凍結乾燥により溶媒を除去することで、所望のイメージング剤組成物を白色固体として生じた（収率４１％）。

精製生成物のＬＣ−ＭＳ分析により所望の生成物の存在を確認し、ＭＷによりｃＰＮ２１６標識は１つだけがポリペプチドコンストラクトに加えられたことが示唆された（Ｚ００４７７（配列番号３）−ｃＰＮ２１６：計算されたＭＷ：７４２９Ｄａ、見出されたもの：７４２９Ｄａ；Ｚ０２８９１（配列番号２）−ｃＰＮ２１６ 計算されたＭＷ：７５２４Ｄａ、見出されたもの：７５２４Ｄａ）。

２０ｍＬバイアルに１０．００ｍＬの蒸留脱イオン水を加えた。窒素ガスをこの溶液に通しておよそ３０分間バブリングした後、ＮａＨＣＯ₃（４５０ｍｇ、５．３６×１０^-3ｍｏｌ）、Ｎａ₂ＣＯ₃（６０ｍｇ、５．６６×１０^-4ｍｏｌ）及びパラ−アミノ安息香酸ナトリウム（２０ｍｇ、１．２６×１０^-4ｍｏｌ）を加えた。全ての試薬は独立して秤量し、水を含有するバイアルに加えた。塩化スズ（１．６ｍｇ、７．０９×１０^-6ｍｏｌ）及びＭＤＰ（２．５ｍｇ、１．４２×１０^-5ｍｏｌ）を１ドラムバイアル中に合わせて秤量し、その後におよそ１ｍＬの炭酸塩緩衝液混合物中に迅速に懸濁することにより移動させた（その後に１回洗浄した）。１０μＬの一定分量を取り出して、窒素流下でシラン処理されたバイアルに移し、直ちに凍らせて凍結乾燥まで液体窒素浴の中で維持した。各バイアルはゴムのセプタムを使用して部分的に蓋をかぶせ、トレー式凍結乾燥機の中に一晩置いた。バイアルは真空下で密封し、凍結乾燥機から取り出し、アルミニウムキャップでクリンプシールし、無水窒素で再加圧して、将来使用するまで冷凍庫の中で保存した。

放射性標識ポリペプチドの合成は、テクネチウム還元剤としての塩化第一スズ、フリーラジカルスカベンジャーとしてのメチレンジホスホン酸、ｐ−アミノ安息香酸及び緩衝液としての炭酸水素ナトリウム／炭酸ナトリウム（ｐＨ９．２）からなる凍結乾燥混合物を含有する内製の１段階キット処方（Ｃｈｅｌａｋｉｔ Ａ＋）を用いて実施した。間断なく、２０μＬの２μｇ／μＬポリペプチド生理食塩水溶液をＣｈｅｌａｋｉｔに加え、その後直ちにＣａｒｄｉｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）から入手した０．０８０ｍＬの生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中のＮａ^99mＴｃＯ₄（０．８ｍＣｉ、２９．６ＭＢｑ）を加えた。混合物を１回かき混ぜ、周囲温度で２０分間置いた。終了次第、粗放射化学的収率をＩＴＬＣにより決定した（下の表６はＩＴＬＣ−ＳＧ、Ｂｉｏｄｅｘ、０．９％ＮａＣｌによる）。

０．３５ｍＬの１５０ｍＭ滅菌ＮａＣｌを使用して反応容量を０．４５ｍＬに増量し、最終生成物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ ＰＢＳを使用して飽和させたもの）により精製した。粗反応混合物をＮＡＰ５カラム上にロードし、ゲル層に入り込ませ、０．８ｍＬの１０ｍＬ ＰＢＳを使用して溶出した後に最終精製生成物を単離した。最終活性は標準的な用量キャリブレーター（ＣＲＣ−１５Ｒ、Ｃａｐｉｎｔｅｃ、Ｒａｍｓｅｙ、ＮＪ）中でアッセイした。放射化学的収率（表６）及び純度は、ＩＴＬＣ（＞９８．５％）、Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ（図９）及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により決定した。最終生成物（１０〜１５μＣｉ／μｇ、０．２〜０．５μＣｉ／μＬ（０．３７ＭＢｑ／μｇ、７．４ＭＢｑ／ｍＬ））は直ちに生体分布研究に用いた。

この実験に用いたＨＰＬＣ条件は以下であった。Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ方法１：溶媒Ａ：９５／５ Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ＣＮ（０．０５％ＴＦＡを添加）、溶媒Ｂ：０．０５％ＴＦＡを添加した９５／５ ＣＨ₃ＣＮ／ｄｄＨ₂Ｏ（蒸留脱イオン水）。グラジエント溶出：０分 ０％Ｂ、４分 ２０％Ｂ、１６分 ６０％Ｂ、２０分 １００％Ｂ、２５分 １００％Ｂ、２６分 ０％Ｂ、３１分 ０％Ｂ。

Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ方法２：溶媒Ａ：０．０６％ＮＨ₃水、溶媒Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ。グラジエント溶出：０分 ０％Ｂ、４分 ２０％Ｂ、１６分 ６０％Ｂ、２０分 １００％Ｂ、２５分 １００％Ｂ、２６分 ０％Ｂ、３１分 ０％Ｂ。

ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、Ｇ１３１１Ａ ＱｕａｔＰｕｍｐ、１００μＬシリンジ及び２．０ｍＬシートキャピラリーの付いたＧ１３１３Ａオートインジェクター、Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ−タンパク質Ｃ４カラム（Ｓ／Ｎ Ｅ０５０９２９−２−１、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、Ｇ１３１６Ａカラムヒーター、Ｇ１３１５Ａ ＤＡＤ並びにＲａｍｏｎ Ｓｔａｒ−ＧＡＢＩγ検出器を備えたＨＰ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００上で実施した。

ＳＥＣ ＨＰＬＣ：溶媒：１×（１０ｍＭ）ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ₂及びＭｇＣｌ₂を含有する）。３０分間均一濃度で溶出。分析は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＳＥＣ−４ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌコントロール、Ｓｅｒｉｅｓ ４１０ ＬＣポンプ、ＩＳＳ ２００ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＬＣサンプルプロセッサー及びＳｅｒｉｅｓ ２００ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ上で実施した。Ｓｏｃｋｅｔ ８１０３ ０１１１ピンホール（０．７のｍｍ内径、２５０μＬの容量を有する）を備えたＲａｙｔｅｓｔ ＧＡＢＩフローセルγ検出器はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮＣＩ ９００ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅによってインターフェーズ接続した。用いたカラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＳＥＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．コード：１７−５１７４−０１、ＩＤ番号０６３９０５９）であった。

^99mＴｃをｃＰＮ２１６キレートに組み込むのに用いたＣｈｅｌａｋｉｔの動作ｐＨ（ｐＨ＝９．２）は、計算されたＺ００４７７（配列番号３）ポリペプチドのｐＩとほとんど一致した。これらの条件下での標識は、最終生成物中の凝集の原因になると決定された（図５Ａ及び５Ｂ）。凝集は、サイズ排除ＨＰＬＣにより、及び生体分布研究において観察された血液滞留時間及び肝臓取り込みの増加を通じて確認された。ポリペプチドの等電点を変えることにより、^99mＴｃはＺ０２８９１（配列番号２）コンストラクト上に成功裡に組み込まれた。サイズ排除ＨＰＬＣにより適切な分子量を有する種の存在を確認し、生体分布研究により腫瘍異種移植片へのトレーサーの取り込みが示された。

インビボ研究は、週齢が６週から１５週の間の範囲である雌性ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に１００μｌのＰＢＳ中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＳＫＯＶ３の場合、３×１０⁶〜４×１０⁶の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が注入された動物の８０％超で３から４週の間に得られた。

マウスに約１μｇの^99mＴｃ標識ポリペプチド（約１０μＣｉ／１μｇ）を尾静脈注射した。マウスは安楽死までろ紙を並べたケージの中に置かれた。各時点で３匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を切除してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ｗｉｚａｒｄ １４８０γＣｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓及び注入部位（尾部）についてデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールして、これもまたカウントした。残りの組織をカウントし、各動物について全組織＋尿の和を合計して、全注入用量が与えられた。各器官についての％注入用量はこの全量に基づいて決定し、器官はグラム当たりの％注入用量（％ＩＤ／ｇ）を決定するために秤量した。データは、その時点での全４から５匹のマウスについての平均値として、群の標準偏差を表すエラーバーと共に報告される。４時間の間に４つの時点が取られた（注入後５、３０、１２０及び２４０分）。

Ｚ０２８９１（配列番号２）−ｃＰＮ２１６−^99mＴｃポリペプチドは標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において強い腫瘍への取り込みを示し、注入後（ＰＩ）３０分での組織のグラム当たりの注入用量の７．１１±１．６９％（ｎ＝５）という値であって、この値はＰＩ２４０分までの研究のタイムコースにわたってほとんど一定のままである。腫瘍：血液比は注入後３０、１２０及び２４０分でそれぞれ２、５及び５であった。図１０、１１及び１２はこれらの実験についての腫瘍、血液及び腫瘍：血液曲線を示す。

ポリペプチドは単指数関数的な血液からのクリアランスを呈し、半減期は２分未満である。このクリアランスは主として腎臓が媒介し、注入後ＰＩ２４０分で１０．５８±２．９６（ｎ＝５）ＩＤ／器官である。活性は主として尿中に分泌されている。脾臓におけるポリペプチドの取り込みは潜在的な凝集が原因で中程度から高いものであって、肝臓において中程度の、例として、研究経過全体にわたって１２％ＩＤ／器官（マウスにおける値で％ＩＤ／ｇと等価）の取り込みが観察されている。

Ｚ０２８９１（配列番号２）−ｃＰＮ２１６− ^99m Ｔｃの生体分布結果

Ｚ００４７７（配列番号４）、Ｚ００３４２（配列番号１）及びＺ０２８９１（配列番号２）−システインポリペプチドを、人工的に作り出されたＣ末端システインによって、アミノキシ基で官能化した。与えられたポリペプチド分子の純度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により＞９５％と決定した。

¹⁸Ｆをポリペプチド分子に組み込むため、２つの直交性の基：人工的に作り出されたシステインへのコンジュゲーションのためのチオール反応性マレイミド基及びアルデヒド反応性アミノキシ基を含む二官能性リンカーのＭａｌ−ＡＯを合成した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。このリンカーは、Ｂｏｃ保護形態のリンカーを生じる１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を介したカップリング条件を用いて、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドを２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸と反応させることにより調製した。Ｂｏｃ保護基を次いで酸切断により脱保護することで、最終のＭａｌ−ＡＯ生成物が定量的収率で生じた。最終生成物はさらに精製せずに直接的に用いた。

ジクロロメタン、２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸、トリエチルアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び全ての他の標準的合成試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。全ての化学物質はさらに精製せずに用いた。ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。ＨＰＬＣグレードの酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ １８ｍΩ水を精製に用いた。

２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸（３８２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）にトリエチルアミン（３０７μＬ、２．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドＴＦＡ塩（５０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３０６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（４２０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を順次加えた。室温で２４時間撹拌後、反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３×３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過した。ろ液を淡黄色固体へと濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中に７０％の酢酸エチル）で精製することで、生成物が白色粉末として生じた（５００ｍｇ、８０％収率）。¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：δ１．５０（ｓ、９Ｈ）、３．５５（ｔｔ、Ｊ１＝６．０Ｈｚ、Ｊ２＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．７７（ｄｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．３０（ｓ、２Ｈ）、６．３（ｓ、２Ｈ）。

９．３ｍｇのＭａｌ−ＡＯ−Ｂｏｃを１ｍＬのメタノール中３Ｍ ＨＣｌに溶解した溶液を室温で１８時間撹拌した。溶媒を真空下で除去することで、Ｍａｌ−ＡＯが薄黄色の固体として生じた（８０％収率）。¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆）：δ３．２７ ＣＨ₂（ｔ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．４９ ＣＨ₂（ｔ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．３９ ＣＨ₂Ｏ（ｓ、２Ｈ）、７．００ ＣＨ＝ＣＨ（ｓ、２Ｈ）；［Ｍ＋Ｈ］⁺についてのｍ／ｚ＝２１４．０７（Ｃ₈Ｈ₁₂Ｎ₃Ｏ₄、計算されたＭＷ＝２１４．１１））
ポリペプチドを、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を使用して濃度およそ１ｍｇ／ｍＬで溶解した。ポリペプチド内のジスルフィド結合は、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中にジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を加えることにより還元した。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭである。反応混合物を２時間ボルテックスし、脱気ＰＢＳ緩衝液で予め平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通過させて、過剰なＤＴＴ試薬を除去した。還元したポリペプチドを回収し、二官能性Ｍａｌ−ＡＯ化合物をＤＭＳＯ溶液として加えた（ポリペプチド１当量当たり１５当量）。室温で一晩ボルテックスした後、反応混合物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。

ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ Ｍａｇｉｃ Ｃ１８ＡＱ ５μ ２００Ａカラム（ＭｉＣｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上で実施した。溶媒Ａ：Ｈ₂Ｏ（０．１％ギ酸を添加）、溶媒Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ（０．１％ギ酸を添加）。グラジエント：３０分間かけて５〜１００％のＢ。所望の生成物を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を使用して中和し、凍結乾燥により溶媒を除去することで、アミノキシ修飾ポリペプチドが白色固体として生じた。

ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により予想された分子量を有する標的生成物の存在を確認した（Ｚ００４７７（配列番号４）−ＯＮＨ₂、Ｚ００３４２（配列番号１）−ＯＮＨ₂及びＺ０２８９１（配列番号２）−ＯＮＨ₂それぞれについて計算されたＭＷ：６９６４Ｄａ、８５３１Ｄａ及び７２４３Ｄａ、見出されたもの：６９６３Ｄａ、８５３２Ｄａ及び７２４４Ｄａ）。

方法：全ての反応は、窒素雰囲気下又は使用前に窒素パージしたクリンプトップの密封バイアル中のいずれかで実施した。Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ ２２２（Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＫ₂ＣＯ₃（ＥＭＤ Ｓｃｉｅｎｃｅ）は購入して受け取ったらすぐに用いた。Ｏｐｔｉｍａ（商標）グレードのアセトニトリルをＨＰＬＣ及び反応溶媒の両方として用いた。

Ｋ¹⁸Ｆ（精製水中に４０ｍＣｉ・ｍＬ^-1（１４８０ＭＢｑ・ｍＬ^-1））はＩＢＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）及びＰＥＴＮＥＴ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）から入手し、受け取ったらすぐに用いた。［¹⁸Ｆ^-］フッ化物は最初にＣｈｒｏｍａｆｉｘ ３０−ＰＳ−ＨＣＯ３アニオン交換カートリッジ（ＡＢＸ、Ｒａｄｅｂｅｒｇ、ドイツ）上に固定化し、次いで、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ Ｋ２２２（３７６ｇ．ｍｏｌ^-1、８ｍｇ、２．１３×１０^-5ｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１３８．２ｇ．ｍｏｌ^-1、２．１ｍｇ、１．５２×１０^-5ｍｏｌ）を含有するアセトニトリル：蒸留脱イオン化Ｈ₂Ｏ（ｄｄＨ₂Ｏ）の４：１混合物を１ｍＬ使用してドライダウン（ｄｒｙｄｏｗｎ）容器中に溶出した。部分的な真空下、窒素流下で穏やかに加温しながら溶媒を除去した（約４５℃）（約１５分間）。供給源のバイアル及びアニオン交換カートリッジを次いでＫ２２２（８ｍｇ）を含有するアセトニトリル０．５ｍＬで洗浄し、反応混合物を再び部分的な真空下で穏やかに加温しながら乾燥させた（約１０分間）。反応器は窒素を使用して再加圧し、共沸性ドライダウンを０．５ｍＬのアセトニトリルを添加して１回繰り返した。４−ホルミル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウムトリフレート（３１３．３０ｇ・ｍｏｌ^-1、３．１ｍｇ、９．８９×１０^-6ｍｏｌ）を０．３５ｍＬの無水ＤＭＳＯ（Ａｃｒｏｓ）中に溶解し、Ｋ¹⁸Ｆ・Ｋ２２２、Ｋ₂ＣＯ₃を含有する反応器に直接的に加えた。反応混合物を９０℃まで１５分間加温し、直ちに３ｍＬのｄｄＨ₂Ｏを使用してクエンチした。この混合物を続いてカチオン交換カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ ＳｅｐＰａｋ Ｌｉｇｈｔ Ａｃｃｅｌｌ Ｐｌｕｓ ＣＭ）を通過させ、ｄｄＨ₂Ｏで１０ｍＬに希釈し、逆相Ｃ１８ ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ ＳｅｐＰａｋ Ｐｌｕｓ Ｃ１８）上にロードした。ＳｅｐＰａｋは１０ｍＬのｄｄＨ₂Ｏでフラッシュし、次いで３０ｍＬの空気でパージした。［¹⁸Ｆ］４−フルオロベンズアルデヒド（¹⁸ＦＢＡ）を１．０ｍＬのメタノール中に溶出した。

別々に、高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＺ００４７７−（配列番号３）−ＯＮＨ₂（０．３５〜０．５ｍｇ）、Ｚ００３４２−（配列番号１）−ＯＮＨ₂（０．３５〜０．５ｍｇ）又はＺ０２８９１−（配列番号２）−ＯＮＨ₂（０．３５〜０．５ｍｇ）のいずれかを充填した。固体を２５μＬのｄｄＨ₂Ｏ及び８μＬのトリフルオロ酢酸中に懸濁した。２５μＬのメタノール中の¹⁸ＦＢＡ（上記参照）を反応バイアルに移した。容器は蓋をかぶせ、クリンプし、ヒートブロック中に置いて、６０℃で１５分間維持した。この時点で小分量（＜５μＬ）を分析ＨＰＬＣ分析用に取り出した。４５０μＬの０．１％ＴＦＡ添加ｄｄＨ₂Ｏは、セミ分取ＨＰＬＣ精製のための調製において、溶液をおよそ５００μＬに希釈するのに用いた。¹⁸ＦＢ−ポリペプチドはセミ分取ＨＰＬＣにより単離精製された。生成物（０．１１３ｍＣｉ／４．１８ＭＢｑ）を含有するＨＰＬＣ画分をｄｄＨ₂Ｏで５：１希釈し、続いてｔＣ１８ Ｐｌｕｓ Ｓｅｐ Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）上に固定化した。ＳｅｐＰａｋは最初に５ｍＬのｄｄＨ₂Ｏ、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュした。¹⁸ＦＢ−ポリペプチドは、最初に空隙容量（およそ０．５ｍＬ）を溶出し、その後に２５０から３００μＬの溶出液を別々のフラスコ中に回収することにより、最小限の量のエタノール中に単離した。放射化学的及び化学的純度を確立するため、単離生成物に対してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施した。典型的には、処方後分析のため、１０μＬの０．１μＣｉ／μＬ溶液を注入した。単離放射化学的収率は表９中に指し示され、¹⁸ＦＢＡへのポリペプチド添加量及び放射化学的純度＞９９％から崩壊補正されている。あるいは、反応混合物を１０ｍＭ ＰＢＳでおよそ０．５ｍＬに希釈してゲル上にロードすることにより、¹⁸Ｆ標識ポリペプチドをＮＡＰ５サイズ排除クロマトグラフィーにより単離した。¹⁸Ｆ標識ポリペプチドは０．８ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳでカラムを溶出することにより単離し、さらなる修飾はせずに用いた。これらの結果を表８及び図１５中で説明する。

用いた分析ＨＰＬＣ条件は以下である。分析は、Ｇ１３１１Ａ ＱｕａｔＰｕｍｐ、１００μＬシリンジ及び２．０ｍＬシートキャピラリーの付いたＧ１３１３Ａオートインジェクター、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、５μ、１００Å（Ｓ／Ｎ ４２０４７７−１０）、Ｇ１３１６Ａカラムヒーター、Ｇ１３１５Ａ ＤＡＤ並びにＲａｍｏｎ Ｓｔａｒ−ＧＡＢＩγ検出器を備えたＨＰ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００上で実施した。０．０５％ＴＦＡを添加した９５：５ ｄｄＨ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ、溶媒Ｂ：０．０５％ＴＦＡを添加したＣＨ₃ＣＮ。グラジエント溶出（１．０ｍＬ・ｍｉｎ^-1）：０分 ０％Ｂ、１分 １５％Ｂ、２１分 ５０％Ｂ、２２分 １００％Ｂ、２６分 １００％Ｂ、２７分 ０％Ｂ、３２分 ０％Ｂ又はグラジエント溶出（１．２ｍＬ・ｍｉｎ^-1）：０分 ０％Ｂ、１分 １５％Ｂ、１０分 ３１％Ｂ、１０．５分 １００％Ｂ、１３．５分 １００％Ｂ、１４分 ０％Ｂ、１７分 ０％Ｂ。

用いたセミ分取ＨＰＬＣ条件は以下である。精製は、ＤＧ−２０８０−５４ ４ラインＤｅｇａｓｓｅｒ、ＭＸ−２０８０−３２ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｉｘｅｒ及び２個のＰＵ−２０８６ Ｐｌｕｓ Ｐｒｅｐポンプ、大容量注入キットがインストールされたＡＳ−２０５５ Ｐｌｕｓ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔオートインジェクター、ガード付きＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ５μ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）１００Å、２５０×１０ｍｍ、５μカラム（Ｓ／Ｎ２９５８６０−１、Ｐ／Ｎ００Ｇ−４２５２−Ｎ０）、ＭＤ−２０５５ ＰＤＡ及びＣａｒｒｏｌｌ ＆ Ｒａｍｓｅｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｍｏｄｅｌ １０５Ｓ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｒａｔｅｍｅｔｅｒを取り付けた固体ＳｉＰＩＮフォトダイオードγ検出器を備えたＪａｓｃｏ ＬＣ上で実施した。グラジエント溶出：０分 ５％Ｂ、３２分 ２０％Ｂ、４３分 ９５％Ｂ、４６分 ９５％Ｂ、４９分 ５％Ｂ、溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡを添加したｄｄＨ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ、溶媒Ｂ：０．０５％ＴＦＡを添加したＣＨ₃ＣＮ。

インビボ研究は、週齢が６週から１５週の間の範囲である雌性ＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行った。マウスは換気ラック中で、食餌及び水を自由摂取させて、標準的な１２時間の昼夜照明サイクルで飼育した。異種移植のため、動物に１００μｌのＰＢＳ中の細胞を注入した。細胞を右後部に皮下移植した。移植はイソフルラン麻酔下で実施した。ＳＫＯＶ３の場合、３×１０⁶〜４×１０⁶の細胞を各マウスに移植した。これらの条件下で、使用可能な腫瘍（１００〜３００μｇ）が注入された動物の８０％超で３から４週の間に得られた。

マウスに約１μｇの¹⁸Ｆ標識ポリペプチド（約４μＣｉ／１μｇ）を尾静脈注射した。マウスは安楽死までろ紙を並べたケージの中に置かれた。各時点で３匹のマウスを安楽死させ、目的の組織を切除してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ｗｉｚａｒｄ １４８０γＣｏｕｎｔｅｒ上でカウントした。血液、腎臓、肝臓、脾臓、骨及び注入部位（尾部）についてデータを収集した。ケージからの尿を膀胱と共にプールして、これもまたカウントした。残りの組織をカウントし、各動物について全組織＋尿の和を合計して、全注入用量が与えられた。各器官についてのパーセント注入用量はこの全量に基づいて決定し、器官はグラム当たりのパーセント注入用量（％ＩＤ／ｇ）を決定するために秤量した。データは、その時点での全３匹のマウスについての平均値として、群の標準偏差を表すエラーバーと共に報告される。

ポリペプチドに対し、ＳＫＯＶ３細胞異種移植モデルにおける生体分布研究を行った。４時間の間に４つの時点が取られた（注入後５、３０、１２０及び２４０分）。完全な生体分布データを表１２（ＳＫＯＶ３担がんマウスにおける％ＩＤ／ｇ Ｚ０２８９１（配列番号２）−¹⁸Ｆ−フルオロベンジルオキシム）及び表１３（ＳＫＯＶ３担がんマウスにおける％ＩＤ／ｇ Ｚ００３４２（配列番号１）¹⁸Ｆ−フルオロベンジルオキシム）中に記載する。図１６、１７及び１８はこれらの試験についての腫瘍、血液、腫瘍：血液及びクリアランス曲線を示す。

Ｚ０２８９１（配列番号２）¹⁸Ｆ−フルオロベンジルオキシムポリペプチドは標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において強い腫瘍への取り込みを示し、注入後（ＰＩ）２４０分での組織のグラム当たりの注入用量の１７．４７±２．８９（ｎ＝３）という値である。腫瘍：血液比は注入後３０、１２０及び２４０分でそれぞれおよそ３、３４及び１２８であった。Ｚ００３４２（配列番号１）¹⁸Ｆ−フルオロベンジルオキシムポリペプチドは標的発現ＳＫＯＶ３腫瘍において強い腫瘍への取り込みを示し、ＰＩ２４０分での組織のグラム当たりの注入用量の１２．４５±２．５２（ｎ＝３）という値である。腫瘍：血液比は注入後３０、１２０及び２４０分でそれぞれおよそ３、３２及び５３であった。

ポリペプチドは単指数関数的な血液からのクリアランスを呈し、半減期は２分未満である。このＺ０２８９１（配列番号２）のクリアランスは主として腎臓が媒介し、ＰＩ２４０分で０．９５±０．０７（ｎ＝３）ＩＤ／器官である。活性は主として尿中に分泌されている。脾臓におけるポリペプチドの取り込みはごくわずかであって、肝臓において低い取り込み、例として、研究経過全体（注入後４時間）にわたって約１．８％ＩＤ／器官（マウスにおける値で％ＩＤ／ｇと等価）の取り込みが観察されている。

全ての反応は、窒素雰囲気下又は窒素パージしたクリンプトップの密封バイアル中のいずれかで実施する。Ｏｐｔｉｍａ（商標）グレードのアセトニトリルをＨＰＬＣ及び反応溶媒の両方として用いる。

［¹²³Ｉ］４−ヨードベンズアルデヒド（¹²³ＩＢＡ）を、ポリペプチド−ＯＮＨ₂（Ｚ０２８９１、配列番号２）、０．３５〜０．５ｍｇ）を含有する高回収バイアル（２ｍＬ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加える。反応は、ポリペプチドを２５μＬのｄｄＨ₂Ｏ中に溶解し、８μＬのトリフルオロ酢酸、その後にメタノール中の¹²³ＩＩＢＡを添加することにより、始まる。容器は蓋をかぶせ、クリンプし、ヒートブロック中に置いて、６０℃で１５分間維持する。反応状況を査定するため、小分量（＜５μＬ）を分析ＨＰＬＣ分析用に取り出す。反応混合物は、セミ分取ＨＰＬＣ精製のための調製において、０．１％ＴＦＡを含有するｄｄＨ₂Ｏ：アセトニトリル混合物の１：１混合物の最少量に希釈される。¹²³ＩＢ−ポリペプチドはセミ分取ＨＰＬＣ又はＮＡＰ５サイズ排除クロマトグラフィーにより単離精製される。生成物を含有するＨＰＬＣ画分をｄｄＨ₂Ｏでさらに希釈（５：１）し、続いてｔＣ１８ Ｐｌｕｓ Ｓｅｐ Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）上に固定化する。ＳｅｐＰａｋを最初に５ｍＬのｄｄＨ₂Ｏ、次いで３０ｍＬの空気でフラッシュすることで、最小限の量のエタノール中に¹²³ＩＢ−ポリペプチドが生じるが、これは最初に空隙容量（およそ０．５ｍＬ）を溶出し、その後に２５０から３００μＬの溶出液を別々のフラスコ中に回収することにより、得られるものである。放射化学的及び化学的純度を確立するため、単離生成物に対してＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施する。

ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリ酢酸）キレーターをポリペプチドに結合した後、ポリペプチドＺ００４７７（配列番号３）をＧａ、特に⁶⁷Ｇａで標識した（図１９）。

Ｍａｌ−ＮＯＴＡのポリペプチド分子へのバイオコンジュゲーションは、次のように達成した。脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）を使用して濃度およそ１ｍｇ／ｍＬで溶解した。ポリペプチド内のジスルフィド結合は、脱気したばかりのＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）中にＤＴＴ溶液を加えることにより還元させた。ＤＴＴの最終濃度は２０ｍＭであった。反応混合物を２時間ボルテックスし、脱気ＰＢＳ緩衝液（１×、ｐＨ７．４）で予め平衡化したＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通過させて、過剰なＤＴＴ試薬を除去した。溶出した還元ポリペプチドを回収し、二官能性化合物ｍａｌ−ＮＯＴＡをＤＭＳＯ溶液として加え（ポリペプチド１当量当たり１５当量）、混合物を室温でボルテックスした。反応は、ポリペプチド分子の完全な変換を確実にするため、一晩続けられた。

ＨＰＬＣ精製は、ＭｉＣＨＲＯＭ Ｍａｇｉｃ Ｃ１８ＡＱ ５μ ２００Ａカラム（ＭｉＣｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上で実施された。溶媒Ａ：Ｈ₂Ｏ（０．１％ギ酸を添加）、溶媒Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ（０．１％ギ酸を添加）。グラジエント：３０分間かけて５〜１００％のＢ（図２０Ａ）。

所望の生成物を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を使用して中和し、凍結乾燥により溶媒を除去することで、結合ポリペプチドが白色固体として生じた。

精製生成物のＬＣ−ＭＳ分析により所望の生成物の存在を確認し、ＭＷによりＮＯＴＡキレーターは１つだけがポリペプチドコンストラクトに加えられたことが示唆された（Ｚ００４７７（配列番号３）−ＮＯＴＡについて計算されたＭＷ：７５０４Ｄａ、見出されたもの：７５０６Ｄａ）（図２０Ｂ）。

放射性標識は続いて次のように達成した。２５μｌのＨＥＰＥＳ溶液（６３ｍＭ）を始めにスクリュートップバイアルに加え、その後に０．０４Ｍ ＨＣｌ中の４０．５ＭＢｑ ⁶⁷ＧａＣｌ₃（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０μｌ加えた。３０μｌ Ｈ₂Ｏ中の３０μｇ（ＭＷ＝７５０６、４．０×１０^-9ｍｏｌ）のＮＯＴＡ Ｚ００４７７（配列番号３）を次いで反応混合物に加えることで、濃度が６１μＭでｐＨが３．５〜４．０である最終ＮＯＴＡ Ｚ００４７７（配列番号３）が生じた。反応バイアルを密封して、反応を周囲温度で維持した。粗反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析により、⁶⁷Ｇａ−ＮＯＴＡ Ｚ００４７７（配列番号３）の放射化学的純度は、室温で２時間の後にＨＰＬＣによると９５％であると決定された（図２１）。１日の反応時間の後、⁶⁷Ｇａ−ＮＯＴＡ Ｚ００４７７（配列番号３）をＨＰＬＣにより精製した。２２ＭＢｑの⁶⁷Ｇａ−ＮＯＴＡ Ｚ００４７７（配列番号３）を精製のためにＨＰＬＣ上に注入した。１５ＭＢｑの⁶⁷Ｇａ標識生成物が精製から得られた（放射化学的収率＝６８％）。ＨＰＬＣ溶媒を真空下で除去することで、容量がおよそ０．５ｍＬの溶液を生じた。およそ１．４５ｍＬのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水を次いで添加することで、ｐＨ６〜６．５で放射能濃度が７．７ＭＢｑ／ｍＬである最終溶液を生じた。精製された処方物⁶⁷Ｇａ−ＮＯＴＡ Ｚ００４７７（配列番号３）は室温で２時間以上安定であることが見出された（ＲＣＰ＝９６％、ＨＰＬＣによる）（図２２）。

用いた分析ＨＰＬＣ条件は以下である。Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ Ｃ₄タンパク質５ミクロン、３００Å、４．６×２５０ｍｍ ＨＰＬＣカラム。溶媒Ａ＝０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の９５／５ Ｈ₂Ｏ／ＭｅＣＮ、溶媒Ｂ＝０．０５％ＴＦＡ中の９５／５ ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ。ＨＰＬＣグラジエント（分／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０。

用いたセミ分取ＨＰＬＣ条件は以下である。カラム：Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ Ｃ４タンパク質５ミクロン、３００Å、４．６×２５０ｍｍ。溶媒Ａ＝０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の９５／５ Ｈ₂Ｏ／ＭｅＣＮ、溶媒Ｂ＝０．０５％ＴＦＡ中の９５／５ ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ。ＨＰＬＣグラジエント（分／％Ｂ）：０／０、４／２０、１６／６０、２０／１００、２５／１００、２６／０。

本発明のある一定の特徴だけが本明細書に記載及び説明してきたが、当業者は多くの改変及び変更を想到するであろう。それ故に、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨内にある限り、全てのかかる改変及び変更に及ぶことを意図すると理解されるものである。

Claims (17)

1. ジアミンジオキシムキレーターを介して^99mＴｃと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含むイメージング剤組成物であって、単離ポリペプチドがＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する、組成物。
2. ＮＯＴＡキレーターを介して⁶⁷Ｇａ又は⁶⁸Ｇａと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含むイメージング剤組成物であって、単離ポリペプチドがＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する、組成物。
3. リンカーを介して¹⁸Ｆと結合した配列番号１、配列番号２又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを含むイメージング剤組成物であって、リンカーがアミノキシ基、アジド基又はアルキン基から得られる基を含んでおり、、単離ポリペプチドがＨＥＲ２又はその変異体に特異的に結合する、組成物。
4. ジアミンジオキシムキレーターがＰｎ２１６、ｃＰｎ２１６、Ｐｎ４４又はそれらの誘導体を含む、請求項１記載の組成物。
5. ¹⁸Ｆが単離ポリペプチドのＮ末端のアミノキシリンカーを介して単離ポリペプチドに結合している、請求項３記載の組成物。
6. ^99mＴｃが単離ポリペプチドのＮ末端のｃＰｎ２１６キレーターを介して単離ポリペプチドに結合している、請求項４記載の組成物。
7. 請求項１記載の組成物を対象に投与すること、及び
   対象を診断デバイスを使用してイメージングすること
   を含む、対象の少なくとも一部をイメージングする方法。
8. 請求項１記載の組成物が対象に送達されるのをモニターする段階、及び
   対象をＨＥＲ２関連の病態と診断する段階
   をさらに含む、請求項７記載の方法。
9. 請求項２記載の組成物を対象に投与すること、及び
   対象を診断デバイスを使用してイメージングすること
   を含む、対象の少なくとも一部をイメージングする方法。
10. 請求項２記載の組成物が対象に送達されるのをモニターする段階、及び
    対象をＨＥＲ２関連の病態と診断する段階
    をさらに含む、請求項９記載の方法。
11. 請求項３記載の組成物を対象に投与すること、及び
    対象を診断デバイスを使用してイメージングすること
    を含む、対象の少なくとも一部をイメージングする方法。
12. 請求項３記載の組成物が対象に送達されるのをモニターする段階、及び
    対象をＨＥＲ２関連の病態と診断する段階
    をさらに含む、請求項１１記載の方法。
13. ＨＥＲ２関連の病態が乳がんである、請求項１２記載の方法。
14. 診断デバイスがＭＲＩ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、放射性イメージング及びそれらの組合せからなる群から選択されるイメージング方法を利用する、請求項１１記載の方法。
15. （ｉ）配列番号１若しくは配列番号２、又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、
    （ｉｉ）ジアミンジオキシムキレーターをポリペプチドと反応させて、キレーター結合ポリペプチドを形成させること
    を含む、キレーター結合ポリペプチド組成物を調製する方法。
16. ジアミンジオキシムキレーターが^99mＴｃと結合している、請求項１５記載の方法。
17. （ｉ）配列番号１若しくは配列番号２、又はそれらの保存的変異体を含む単離ポリペプチドを用意すること、
    （ｉｉ）ポリペプチドをアミノキシ基、アジド基又はアルキン基から得られる基を含むリンカーと反応させること、及び
    （ｉｉｉ）リンカーを¹⁸Ｆ部分と反応させて、¹⁸Ｆ結合ポリペプチドを形成させること
    を含む、¹⁸Ｆ結合ポリペプチド組成物を調製する方法。