MX2013007365A - Péptidos de enlace her2 etiquetados con fluoruro de aluminio- [18] combinados mediante nota. - Google Patents

Abstract

Se describen agentes formadores de imagen que comprenden un polipéptido aislado conjugado con un radionúclido y un quelante; en donde el polipéptido aislado se une específicamente a HER2, o variante del mismo; y métodos para preparar y utilizar estos agentes formadores de imagen.

Description

PÉPTIDOS DE ENLACE HER2 ETIQUETADOS CON FLUORURO DE ALUMINIO-M81 COMBINADOS MEDIANTE NOTA Campo de la Invención La presente invención se refiere de manera general a agentes formadores de imagen que enlazan al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo 2 (HER2), y a métodos para elaborar y utilizar dichos agentes.

Antecedentes de la Invención El receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo 2 (HER2) es una proteína de transmembrana y un miembro de la familia erbB de cinasa de tirosina receptora. HER2 es un biomarcador de tumor bien establecido que se sobreexpresa en una amplia variedad de cánceres, incluyendo de seno, ovario, pulmón, gástrico y oral. Por consiguiente HER2 tiene gran valor como un objetivo molecular, y como un indicador de diagnóstico o pronóstico de supervivencia de un paciente, o como un marcador predictivo de la respuesta a la cirugía antineoplásica.

En la última década, la generación de imágenes moleculares no invasivas de la expresión de HER2 utilizando diversas modalidades de generación de imágenes, ha sido estudiada extensamente. Estas modalidades incluyen generación de imágenes de radionúclido con Tomografía de Emisión de Positrones (PET) y Tomografía de Emisión de Fotón Simple (SPECT). La generación de imágenes con PET y SPECT de HER2 (HER2-PET y HER2-SPECT, respectivamente) proporciona una resolución espacial de alto nivel y alta sensibilidad. La generación de imágenes PET de HER2 también proporciona una fuerte capacidad de cuantificación. HER2-PET y HER2-SPECT son particularmente útiles en ensayos de tiempo real en la expresión general del tumor HER2 en pacientes, la identificación de la expresión de HER2 en tumores con el tiempo, la selección de pacientes para tratamiento dirigido a HER (por ejemplo, terapia basada en trastuzumab), predicción de la respuesta a la terapia, evaluación de la eficacia del fármaco y muchas otras aplicaciones. Sin embargo, no se han desarrollado ligandos HER2 etiquetados con PET o SPECT, que tengan química y presenten comportamientos in vivo que podrían ser adecuados para aplicaciones clínicas.

La proteína A estafilococal de origen natural comprende dominios que forman una estructura de tres hélices (un andamio) que enlaza al fragmento, la región cristalizable (Fe) del isotipo de inmunoglobulina G (IgG). Ciertos polipéptidos, derivados del dominio-Z de la proteína A, contienen un andamio compuesto de tres a-hélices conectadas mediante lazos. Ciertos residuos de aminoácidos situados en dos de estas hélices, constituyen el sitio de enlace para la región Fe de IgG. Las moléculas de enlace alternativas se han preparado sustituyendo residuos de aminoácido expuestos en la superficie (13 residuos) situados en las hélices 1 y 2, para alterar la capacidad de enlace de estas moléculas. Uno de dichos ejemplos son las moléculas de enlace HER2 o los enlazadores HER2. Estos enlazadores HER2 han sido etiquetados con radionúclidos activos con PET o SPECT. Dichos enlazadores etiquetados con PET y SPECT proporcionan la capacidad de medir in vivo los patrones de expresión de HER2 en pacientes, y por consiguiente puede ayudar a los médicos e investigadores en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de condiciones de enfermedad asociada con HER2.

Las moléculas de enlace HER2 Affibody®, radioetiquetadas con el radionúclido activo con PET, 18F, han sido evaluadas como agentes formadores de imagen de tumores malignos que sobreexpresan HER2. Las moléculas de enlace HER2 Affibody®, conjugadas con 99mTc mediante los quelantees tales como maGGG (mercaptoacetiltriglicilo), CGG (cisteína-diglicilo), CGGG (SEQ ID NO: 6) (cisteína-triglicilo) o AA3, también han sido utilizadas para generación de imágenes de diagnóstico. El enlace de estas moléculas a los tumores que expresan HER2 objetivo, se ha demostrado en ratones.

En la mayoría de los casos, se introdujo el grupo 18F de generación de señal al Affibody® a través de un grupo de maleimida reactivo con tiol. El grupo de maleimida reactivo con tiol se prepara utilizando una síntesis de múltiples pasos después de la incorporación de 18F. Sin embargo, esta química únicamente proporciona un bajo rendimiento radioqu ímico.

Similarmente, la conjugación de 99mTc con el Affibody® es un proceso de pasos múltiples. Además, la reducción de Te y la formación del complejo con quelatos, requiere condiciones de pH alto (por ejemplo, pH = 11) y tiempos de reacción largos.

Aunque el desempeño in vivo de las moléculas etiquetadas 18F Affibody® fue moderadamente bueno, existe un espacio significativo para mejorías. Por ejemplo, en algunos estudios, se descubrió la captación de tumor únicamente del 6.36 ± 1.26 %ID/g 2 horas después de la inyección del agente formador de imagen.

Por consiguiente, existe la necesidad de químicas y métodos para sinterizar polipéptidos radioetiquetados en donde la porción radioactiva, tal como por ejemplo, 18F, pueda ser introducida en la etapa final, lo cual a su vez proporcionará altos rendimientos radioqu ímicos. Además, existe la necesidad de un nuevo agente formador de imagen de dirección HER2 para generación de imágenes PET o SPECT con propiedades mejoradas, relacionadas particularmente con el despeje renal y efectos de toxicidad.

Breve Descripción de la Invención Las composiciones de la presente invención son una nueva clase de agentes formadores de imagen que tienen la capacidad de enlazar específicamente a HER2 o variantes del mismo.

En una o más modalidades, la composición del agente formador de imagen comprende un polipéptido aislado que comprende SEQ. ID No. 1, SEQ. ID. No 2 o una variante conservadora de las mismas, conjugada con un 99mTc a través de un quelante de diaminadioxima. El quelante de diaminadioxima puede comprender Pn216, cPn216, Pn44, o derivados del mismo. El polipéptido aislado enlaza específicamente a HER2 o variantes del mismo.

En una o más modalidades, la composición del agente formador de imagen comprende un polipéptido aislado que comprende SEQ. ID No. 1, SEQ. ID. No 2 o una variante conservadora de las mismas, conjugada con 67Ga o 68Ga mediante un quelante NOTA. El polipéptido aislado enlaza específicamente a HER2 o variantes del mismo.

En una o más modalidades, la composición del agente formador de imagen comprende un polipéptido aislado que comprende SEQ. ID No. 1, SEQ. ID. No 2 o una variante conservadora de las mismas, conjugado con un quelato Al 1SF-NOTA. El polipéptido aislado enlaza específicamente a HER2 o variantes del mismo.

En una o más modalidades, la composición del agente formador de imagen comprende un polipéptido aislado que comprende SEQ. ID No. 1, SEQ. ID. No 2 o una variante conservadora de las mismas, conjugado con 18F mediante un enlazador. El enlazador comprende un grupo derivado de un grupo de aminoxi, un grupo azido, o un grupo alquina. El polipéptido aislado enlaza específicamente a HER2 o variantes del mismo.

En una o más modalidades, la composición del agente formador de imagen comprende un polipéptido aislado que comprende SEQ. ID No. 1, SEQ. ID. No 2 o una variante conservadora de las mismas, conjugado con 18F a través de una química de intercambio de fluoro isotópico. El polipéptido aislado enlaza específicamente a HER2 o variantes del mismo.

En una o más modalidades, se proporcionan métodos para elaborar una composición de agente formador de imagen tal como aquí se describe. Un ejemplo de un método de la presente invención, para preparar una composición de agente formador de imagen, comprende (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas; y (ii) hacer reaccionar el quelante de diaminadioxima con el polipéptido para formar un polipéptido conjugado por quelante. En otro ejemplo, el método comprende (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas; (ii) hacer reaccionar el polipéptido con un enlazador; y (iii) hacer reaccionar el enlazador con una porción 18F para formar un polipéptido conjugado con 18F. El enlazador puede comprender un grupo aminoxi, un grupo azido, o un grupo alquino.

En otro ejemplo, el método comprende (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende las SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas; (ii) hacer reaccionar el polipéptido con un quelante NOTA para formar, respectivamente, un polipéptido conjugado por quelante NOTA y (iii) hacer reaccionar el polipéptido conjugado con quelante NOTA con una porción A118F, para formar un polipéptido conjugado con quelante A1 18F-NOTA.

En otro ejemplo, el método comprende (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende las SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas; (ii) hacer reaccionar el polipéptido con un fluoruro de silicón (por ejemplo una porción que contiene fluoruro de silicón [19F]) para formar un polipéptido conjugado con fluoruro de silicón; y (iii) hacer reaccionar el polipéptido conjugado con fluoruro de silicón con una porción 18F para formar un polipéptido conjugado con fluoruro de silicón 18F.

Breve Descripción de las Figuras Se podrán comprender mejor éstas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención, cuando se lea la descripción detallada que se encuentra más adelante, con referencia a las figuras adjuntas, en donde: Las figuras 1A y 1B, son gráficas de la resonancia de plasmón de superficie (SPR) de la afinidad de enlace de dos polipéptidos anti-HER2, Z477 (SEQ. ID No. 3) y (Z477)2 (SEQ. ID No. 5), respectivamente, en ocho diferentes concentraciones, al HER2 humano.

Las figuras 2A y 2B, son gráficas de la citometría de flujo cualitativa de C6 (glioma de rata, control) y anticuerpo anti-HER2 humano para SKOV3 (carcinoma de ovario humano) respectivamente. La figura 2C, muestra una gráfica de barras de los receptores Her2 por célula para las líneas de célula SKOV3 y C6.

La figura 3, es una gráfica de barras de ensayos ELISA para Her2 con respecto a un panel de tipos de tumor SKOV3 2-1, SKOV3 3-1, SKOV3 3-4, con respecto a células SKOV3, y en blanco.

La figura 4, es un cromatograma de HPLC gamma de fase inversa de Z00477 (SEQ. ID No. 3) etiquetado con 99mTc.

La figura 5A, es un cromatograma HPLC gamma de exclusión por tamaño de 99mTc(CO)3 (His6) Z00477 agregado (SEQ. ID. No. 4) ('His6' descrito como SEQ ID NO: 7) en un pH de 9. La figura 5B, es un cromatograma HPLC gamma de exclusión por tamaño de 9mTc(CO)3(His6)Z00477 no agregado ('His6' descrito como SEQ ID NO: 7), estándar Affibody® etiquetado.

La figura 6, es una gráfica de perfil de biodistribución de Z00477 (SEQ. ID No. 3) en muestras de sangre, tumor, hígado, riñón y bazo de ratones que contienen tumor SKOV3, que incluyen la proporción tumor:sangre con el tiempo.

La figura 7, es un diagrama de la estructura química de un enlazador Mal-cPN216.

La figura 8A, es una gráfica del espectro de masa del tiempo de vuelo de ionización de electrorocío (ESl-TOF-MS), y la figura 8B es una gráfica del resultado de la desconvolución de masa para Z00477 purificado (SEQ. ID No. 3)-cPN216.

La figura 9, es un cromatograma de trazo HPLC gamma de fase inversa para Z02891 -cPN216 (SEQ. ID No. 2) etiquetado con 99mTc.

La figura 10, es una gráfica del perfil de biodistribución de Z02891 (SEQ. ID No. 2) etiquetado con 99mTc mediante cPN216 (%ID, % dosis inyectada)) en muestras de sangre, hígado, ríñones, bazo, y la cola de ratones que contienen el tumor SKOV3.

La figura 11, es una gráfica del perfil de biodistribución de Z02891 (SEQ. ID No. 2) etiquetado con 99mTc mediante CPN216 (%ID, % dosis inyectada) en muestras de tumor, sangre, hígado, ríñones, vejiga/orina, cola, intestino y bazo de ratones que contienen el tumor SKOV3.

La figura 12, es una gráfica del perfil de biodistribución de Z02891 (SEQ. ID No. 2) en ratones que contienen el tumor SKOV3 que muestran la proporción de tumor:sangre.

La figura 13A y la 13B son diagramas de las estructuras químicas de los enlazadores de maleimída-aminoxi (Mal-AO-Boc) y maleimida-aminoxi (Mal-AO) protegidos con Boc. La figura 13A es la estructura química del 2-(2-(2,5-dioxo-2,5- dihidro-1 H-pirrol-1 -M)etilamino)-2-oxoetoxicarbamato de ter-butilo (Mal-AO-Boc) y la figura 13B es la estructura química del clorhidrato de 2-(aminooxi)-N-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 - il)etil)acetamida (Mal-AO.HCI).

La figura 14A, es un cromatograma HPLC de fase inversa del material de partida de Z00342 (SEQ. ID No. 1), y la figura 14B, es el cromatograma HPLC de fase inversa del Z00342 (SEQ. ID No. 1) purificado-composición de agente formador de imagen AO, ambos analizados en 280 nm.

La figura 15, es el cromatograma de HPLC de fase inversa de las mezclas de reacción crudas y los productos finales purificados de 18F-fluorobencil-Z00342 (SEQ. ID No. 1) y 8F-fluorobencil-Z02891' (SEQ. ID No. 2).

La figura 16, es una gráfica del perfil de biodistribución (%ID, % dosis inyectada) del polipéptido Z02891 (SEQ. ID No. 2) etiquetado con 18F de animales con tumor SKOV3.

La figura 17, es una gráfica del perfil de biodistribución del polipéptido Z02891 (SEQ. ID No. 2) etiquetado con 18F (%ID, % dosis inyectada) y la proporción de tumor: sangre de los animales con tumor SKOV3.

La figura 18, es una gráfica de barras del perfil de biodistribución (%ID, % dosis inyectada) del etiquetado Z00342 8F (SEQ. ID No. 1) y etiquetado Z02891 18F (SEQ. ID No. 2) en muestras de sangre, tumor, hígado, ríñones, bazo y huesos.

La figura 19, es un diagrama de la estructura química del enlazador Mal-NOTA.

La figura 20A, es una gráfica del espectro de masa del tiempo de vuelo de ionización de electrorocío (ESl-TOF-MS), y la figura 20B es una gráfica del resultado de desconvolución de masa ESl-TOF-MS de Z00477 (SEQ. ID No. 3)-NOTA.

La figura 21, es una gráfica del trazo HPLC gamma de fase inversa de la mezcla de reacción cruda de Z00477 etiquetado-67Ga (SEQ. ID No. 3)-NOTA después de 1 hora de reacción .

La figura 22, es una gráfica del trazo HPLC gamma de fase inversa del NOTA Z00477- 67Ga-polipéptido (SEQ . ID No. 3)-NOTA.

La figura 23, es una HPLC analítica de 2 formulado [parte superior: canal UV en 280 nm que muestra ascorbato, 0.5 minutos y precursor de péptido 3, 4.5 minutos; parte inferior: canal de radioactividad que muestra 2, 5.1 minutos (RCP 95%) y un producto de descomposición en 4.6 minutos.

La figura 24 es una distribución de cartucho FASTIab1M para la preparación de 2 utilizando purificación de tC2 SepPak.

La figura 25, es una HPLC analítica de 2 formulado preparando utilizando FASTIab™ [parte superior: canal de reactividad, que muestra 2 (7.7 min), 18F-FBA (10.4 min) y una impureza desconocida (12.2 min); parte media: canal UV en 280 nm que muestra el aditivo de la formulación de ácido p-aminobenzoico (3 min); parte inferior: canal UV en 350 nm que muestra el sub-producto dimetilaminobenzaldehído (10.2 min) y una impureza desconocida (3.8 min)].

La figura 26, es una distribución de cartucho FASTIab™ para la preparación de 2 utilizando purificación Sephadex.

La figura 27, es una HPLC analítica de 2 formulada preparada utilizando FASTIab con purificación Sephadex [parte superior: canal de radioactividad, que muestra 2 (7.1 minutos), 18F-FBA (8.8 min) y una impureza desconocida (10.2 min); parte media: canal UV en 280 nm; parte inferior: canal UV en 350 nm que muestra el subproducto dimetilaminobenzaldehído (10.0 min)].

La figura 28, es una HPLC analítica de 5 formulado [parte superior: canal de reactividad, que muestra el producto (4.7 min, 92%) y un subproducto (3.9 min, 8); parte inferior: canal UV en 280 nm].

La figura 29, ilustra un estudio de curso de tiempo de 5, que muestra eficiencias de etiquetado tal como se mide mediante HPLC radioanalítica.

La figura 30, es un RCY analítico de 5, después de incrementar la concentración de péptido/AICI3 (P: producto, BP: subproducto, ver figura 28).

La figura 31, es un perfil HPLC analítico de una mezcla etiquetada de 5. (Trazo superior: canal de reactividad, trazo inferior: canal UV en 280 nm).

La figura 32, es una HPLC de canal de reactividad analítico de 7 aislado (Rojo: canal de reactividad, azul: canal UV en 280 nm).

La figura 33, ilustra la expresión de la proteína HER2 en secciones de tumor de modelos de xenoinjerto NCI-N87 y A431 mediante inmunohistoqu ímica de HERCEPTEST mediante DAKO. Las imágenes del lado izquierdo están en una magnificación de x2, las imágenes en el lado derecho están en una magnificación de x10 del cuadro señalado.

La figura 34, muestra biodistribuciones de ratones de 9, 2, 5, y 7.

La figura 35, muestra biodistribuciones de 9, 2, 5, y 7 en los ratones que contienen tumor NC87/A431.

La figura 36, muestra el perfil de biodistribución de 2 en el modelo de xenoijerto del tumor dual.

La figura 37, muestra el perfil de biodistribución del xenoinjerto NCI-N87 de 2 utilizando concentraciones en incremento del precursor frío.

La figura 38, muestra generación de imágenes preliminares con 2 en el modelo de xenoinjerto de tumor dual (A) y la comparación con el estudio de generación de imágenes Affibody® 9 (B).

Descripción Detallada de la Invención Las composiciones del agente formador de imagen de la presente invención, comprenden generalmente un polipéptido aislado de las SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas, conjugada con un radioisótopo tal co„mo„, po rr ej ·e mm ^p ilo ^, 18c r, 67/ G-a_ o . 68 Goa -, m i l _n, 123? l, 124 i l, 89 Z-7-r, o„ 64Cu; y métodos para elaborar y utilizar las composiciones. El polipéptido aislado enlaza específicamente a HER2 o una variante del mismo. En una o más modalidades, la secuencia del polipéptido aislado tiene al menos el 90% de similitud de secuencia con cualquiera de las SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas.

El polipéptido aislado puede comprender aminoácidos naturales, aminoácidos sintéticos o miméticos de aminoácido que funcionan en una forma similar a los aminoácidos que ocurren naturalmente. Los aminoácidos que ocurren naturalmente son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que son modificados posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, O-fosfoserina, fosfotreonina , y fosfotirosina .

Los polípéptidos aislados pueden ser preparados utilizando técnicas de síntesis de fase sólida estándar. Alternativamente, los polípéptidos pueden ser preparados utilizando técnicas recombinantes. Cuando los polípéptidos se preparan utilizando técnicas recombinantes, el ADN que codifica los polípéptidos o las variantes conservadoras de los mismos pueden ser aislados. El ADN que codifica los polípéptidos o las variantes conservadoras de los mismos, se puede insertar en un vector de clonación, introducirse en una célula huésped, (por ejemplo, célula eucariótica, célula de planta o célula procariótica), y ser expresado utilizando cualquier sistema de expresión reconocido en la técnica.

El polipéptido puede estar comprendido sustancialmente de una forma quirálica simple de residuos de aminoácido. Por lo tanto, los polipéptidos de la presente invención pueden estar comprendidos sustancialmente ya sea de L-aminoácidos o D-aminoácidos; aunque también se puede emplear una combinación de L-aminoácidos y D-aminoácidos.

Ya que los polipéptidos aquí proporcionados se derivan del dominio-Z de la proteína, los residuos en la ¡nterfaz de enlace pueden ser sustituidos en forma no conservadora o sustituidos en forma conservadora, mientras al mismo tiempo conservan la actividad de enlace. En algunas modalidades, los residuos sustituidos pueden ser derivados de cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural o cualquier análogo de los mismos.

Los polipéptidos pueden tener de aproximadamente 49 residuos hasta aproximadamente 130 de longitud. Las secuencias de polipéptido específicas se describen en la Tabla 1.

Tabla 1 Se pueden agregar secuencias adicionales a los términos para impartir funcionalidad seleccionada. Por lo tanto, las secuencias adicionales pueden adjuntarse a uno o ambos términos para facilitar la purificación o aislamiento de polipéptido, solo o acoplado a un objetivo de enlace (por ejemplo, adjuntando una etiqueta His al polipéptido).

Los polipéptidos descritos en la tabla 1, se pueden conjugar con 18F a través de un enlazador; 99mTc a través de un quelante de diaminadioxima, con 57 Ga o 68Ga mediante un quelante NOTA, con 18F mediante un quelante A1 18F-NOTA, con 18F mediante SiFA (por ejemplo, un aceptor de fluoruro de silicón) o química de intercambio de fluoruro de silicón, con 111ln mediante química de quelante DOTA, con 123 o 124 mediante química tipo fluorobenzaldehído utilizando yodobenzaldehído, o con "Cu mediante química de quelante NOTA. La tabla 2 proporciona el punto isoeléctrico (pi), de estos polipéptidos.

Tabla 2 En una o más modalidades, el polipéptido aislado, que comprende las SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas, puede conjugarse con 18F. 18F se puede incorporar en un término C, en un N-término o en una posición interna del polipéptido aislado.

En una o más modalidades, el 8F puede conjugarse para el polipéptido aislado mediante un enlazador. El enlazador puede comprender, un grupo aminoxi, un grupo azido, o un grupo alquina. El grupo aminoxi del enlazador puede adherirse con un aldehido, tal como un aldehido sustituido con fluoruro. Un grupo azida del enlazador puede adherirse con una alquina sustituida con fluoro. En forma similar, un grupo alquina del enlazador puede adherirse con una azida sustituido con fluoro.

El enlazador también puede comprender un grupo reactivo tiol. El enlazador puede comprender un grupo maleimido-aminoxi, maleimido-alquina o maleimido-azida . El polipéptido conjugado con 18F puede prepararse mediante: (i) proporcionar el polipéptido aislado que comprende las SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, o una variante conservadora de las mismas; (ii) hacer reaccionar el polipéptido con un. enlazador, en donde el enlazador comprende un grupo aminoxi, un grupo azido, o un grupo alquina, para formar un polipéptido conjugado con el enlazador; y hacer reaccionar el enlazador con una porción 8F para formar el 18F conjugado con polipéptido.

El polipéptido conjugado con 3F puede ser preparado mediante: (i) proporcionar el polipéptido aislado que comprende las SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, o una variante conservadora de las mismas; (ii) hacer reaccionar el polipéptido con un enlazador, en donde el enlazador comprende un grupo maleimido-aminoxi, un grupo maleimido-alquina o un grupo maleimido-azida, para formar un polipéptido conjugado con el enlazador; y hacer reaccionar el enlazador con una porción 8F para formar el polipéptido conjugado con 18F.

En otra modalidad, el método puede comprender: (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende las SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, o una variante conservadora de las mismas; (ii) proporcionar un enlazador; (iii) hacer reaccionar el enlazador con la porción 18F para formar un enlazador etiquetado con 18F; y (¡v) hacer reaccionar el enlazador etiquetado con 18F con el polipéptido aislado de las SEQ. ID No 1, SEQ ID No 2, o una variante conservadora de las mismas, para formar el polipéptido conjugado con 18F.

Utilizando los ejemplos descritos anteriormente, se puede introducir en los péptidos un átomo(s) de fluoro o radiofluoro, tal como 18F. Se obtiene como resultado un polipéptido sustituido con fluoro cuando se hace reaccionar un aldehido sustituido con fluoro con un grupo aminoxi del polipéptido conjugado con enlazador. En forma similar, se obtiene como resultado un polipéptido sustituido con fluoro, cuando se hace reaccionar un grupo alquina o azida sustituido con fluoro, con el grupo alquina o azida respectivo del polipéptido conjugado con enlazador. Se obtiene como resultado una composición de agente formador de imagen o de polipéptido etiquetado con radiofluoro, cuando se hace reaccionar un aldehido, azida o alquina sustituido con radiofluoro con un grupo aminoxi, alquina o azida respectivo del polipéptido conjugado con enlazador. Además, el enlazador puede tener un sustituyente de radiofluoro (18F), para preparar composiciones de agente formador de imagen etiquetadas con radiofluoro. Los métodos para introducir fluoro en el polipéptido también se pueden utilizar para preparar una composición del agente formador de imagen fluorinado de cualquier longitud. Por lo tanto, en algunas modalidades, el polipéptido de la composición del agente formador de imagen puede comprender, por ejemplo, 40 a 130 residuos de aminoácidos.

Se puede preparar un polipéptido conjugado con enlazador o el enlazador conjugado con 18F para utilizarse en la preparación de un agente formador de imagen o una composición del agente formador de imagen de la presente invención, a través de un método de la presente invención, que es más eficiente que los métodos previamente conocidos, y que da como resultado mayores rendimientos. Los métodos son más fáciles de llevar a cabo, más rápidos y se llevan a cabo bajo condiciones más leves, más amigables para el usuario. Por ejemplo, el método para etiquetar un polipéptido con un enlazador conjugado con 18F (por ejemplo, 18F-fluorobenzaldehído)("18F-FBA"), es más simple que los procedimientos conocidos en la técnica. El enlazador conjugado con 18F se prepara en un paso mediante incorporación nucleofílica directa de 8F en el precursor de trimetilanilinio. Posteriormente el enlazador 8F (por ejemplo, F-FBA) es conjugado para el polipéptido, tal como, por ejemplo, un Affibody® y los aquí descritos. La preparación del enlazador también es más fácil que los métodos previamente conocidos en la técnica. Además, los polipéptidos conjugados con el enlazador basados en aminoxi radioetiquetado, y la familia cPn de los polipéptidos conjugados con quelante (por ejemplo, Affibody®), muestran una biodistribución significativamente mejor y una mejor captación del tumor, así como un mejor despeje con menos captación en el hígado.

Las composiciones del agente formador de imagen etiquetadas con fluoro son materiales altamente deseados en aplicaciones de diagnóstico. Las composiciones del agente formador de imagen etiquetadas con 18F pueden ser visualizadas utilizando técnicas de generación de imágenes establecidas, tales como PET.

En otra modalidad, el polipéptido puede ser conjugado con Te a través de un quelante de diaminadioxima de la fórmula CO¬ en donde R' , R", R'", R; es independientemente H o d. 10 alquilo, C3.10 alquilarilo, C2.10 alcoxialquilo, C-,.-,? hidroxialquilo, Ci.10 alquilamina, C1-10 fluoroalquilo, o 2 o más grupos R, junto con los átomos a los cuales se adhieren forman un anillo carbocíclico, heterocíclico saturado o insaturado, en donde R puede ser H, C1.10 alquilo, C3.10 alquilarilo, C2-io alcoxialquilo, Ci. 0 hidroxialquilo, d.10 alquilamina, o Ci. 0 fluoroalquilo. En una modalidad, n puede variar de 0 a 5. Los ejemplos de métodos para preparar quelantees de diaminadioxima se describen en la Solicitud PCT, Publicación Internacional No. WO2004080492 (A1) titulada "Métodos de radio fluorinado de vector biológicamente activo (Methods of radio fluorination of biologically active vector", y la Solicitud PCT, Publicación Internacional No. WO2006067376(A2) titulada "Radioetiquetados de péptidos que contienen RGD y métodos para su preparación mediante química de click" (Radio labelled conjugates of RGD-containing peptides and methods for their preparation via click-chemistry), las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia.

El 99mTc puede conjugarse para el polipéptido aislado a través de la diamindioxima en el N-término del polipéptido aislado. El quelante puede ser un compuesto bifuncional. En una modalidad, el compuesto bifuncional puede ser Mal-cPN216. Mal-cPN216 comprende un grupo maleimida reactivo con tiol para la conjugación con una cisteína terminal del polipéptido de la SEQ ID No. 1 o SEQ ID No 2 y un grupo bis-aminooxima (quelante de diamindioxima) para quelación con 99mTc. El Mal-cPN216 puede tener una fórmula (II). péptido conjugado con quelante de diamindioxima puede prepararse mediante (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende las SEQ.ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas, (ii) hacer reaccionar un quelante de diamindioxima con el polipéptido para formar el polipéptido conjugado con diamindioxima. El quelante de diamindioxima puede ser conjugado en forma adicional con 99m Te.

En una o más modalidades, el polipéptido puede ser conjugado con 67Ga o 68Ga mediante quelante NOTA (ácido 1 ,4,7-triazaciclononano-N,N',N"-triacético). El polipéptido conjugado conjugado con quelante NOTA puede ser preparado mediante (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende las SEQ.ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas, (ii) hacer reaccionar un quelante NOTA con el polipéptido para formar el polipéptido conjugado con quelante NOTA. El quelante NOTA puede ser conjugado en forma adicional con 67Ga o 68Ga.

En una modalidad, el Ga, específicamente 67Ga, puede ser conjugado con el polipéptido aislado mediante el quelante NOTA. El quelante NOTA puede ser funcionalizado con un grupo maleimido, tal como se describe en la fórmula (III).

En una o más modalidades, el polipéptido puede ser conjugado con AI18F mediante el quelante NOTA (ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N"-triacético). El polipéptido conjugado con quelante NOTA puede prepararse mediante (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende las SEQ.ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas, (ii) hacer reaccionar un quelante NOTA con el polipéptido para formar el polipéptido conjugado con quelante NOTA. El polipéptido conjugado con quelante NOTA posteriormente puede ser conjugado en forma adicional con AI 8F para formar el polipéptido conjugado con quelante AI18F-NOTA.

En una o más modalidades, el polipéptido puede ser conjugado con 18F mediante el quelante NOTA. El polipéptido conjugado con quelante NOTA puede prepararse mediante (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende las SEQ.ID No. 1, SEQ. ID No. 2 o una variante conservadora de las mismas, (ii) hacer reaccionar un quelante NOTA con una fuente de 8F (por ejemplo, A118F) para formar un quelante 18F-NOTA; y (iii) hacer reaccionar el quelante 18F-NOTA con el polipéptido aislado para formar polipéptido conjugado con quelante 18F-NOTA.

En una o más modalidades, un quelante puede comprender una porción de quelato (por ejemplo NOTA, DOTA) sola o una porción de quelato y un enlazador, cada una, tal como aquí se describen. A manera de ejemplo, un quelante NOTA puede representar una porción de quelato NOTA sola o una porción de quelato NOTA adherida a un enlazador, tal como aquí se describe.

En una o más modalidades, el polipéptido puede ser conjugado con 18F mediante química SiFA. El polipéptido conjugado con 18F-SiFA puede prepararse mediante: (i) proporcionar el polipéptido aislado que comprende las SEQ.ID No. 1, SEQ.ID No. 2, o una variante conservadora de las mismas; (ii) hacer reaccionar el polipéptido con un enlazador, en donde el enlazador comprende un grupo aceptor de fluoruro de silicón (SiFA), para formar un polipéptido conjugado con SiFA; y (iii) hacer reaccionar el polipéptido conjugado SiFA con una porción 8F o una fuente de 18F. La porción 18F o una fuente de 18F puede ser cualquier porción o fuente con la capacidad de reaccionar con un grupo SiFA, y pasar por química de intercambio de fluoro isotópica. El esquema I que se encuentra a continuación ilustra el radioetiquetado de Z02891 (SEQ. ID No. 2) utilizando acoplamiento [18F]SiF: X» ,9F,-OEt Esquema I En una o más modalidades, el método para elaborar un agente formador de imagen radioetiquetado o composición del agente formador de imagen de la presente invención tal como aquí se describe, son automáticos. Por ejemplo, el agente formador de imagen radioetiquetado o la composición del agente formador de imagen de la presente invención se pueden preparar convenientemente en una forma automática por medio de un aparato de radiosíntesis automático. Existen varios ejemplos comercia Imente disponibles de dicho aparato de plataforma, incluyendo TRACERlab™ (por ejemplo, TRACERlab™ MX) y FASTIab™ (ambos de GE Healthcare Ltd.). Dicho aparato comúnmente comprende un "cartucho" con frecuencia desechable, en el cual se lleva a cabo la radioquímica, la cual se adapta al aparato con el objeto de llevar a cabo una radiosíntesis. El cartucho normalmente incluyen trayectorias de fluido, un envase de reacción y puertas para recibir frascos del reactivo, así como cualquiera cartuchos de extracción de fase sólida utilizados en pasos de limpieza post-radiosintéticos. Opcionalmente, en una modalidad adicional de la presente invención, el aparato de radiosíntesis automático puede enlazarse a una cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC).

La presente invención proporciona por lo tanto un cartucho para la síntesis automática de un agente formador de imagen radioetiquetado o composición del agente formador de imagen de la presente invención, cada uno tal como aquí se definen.

La presente invención también comprende métodos para generar imágenes de al menos una parte de un sujeto. En una modalidad, el método comprende administrar un agente formador de imagen radioetiquetado o una composición del agente formador de imagen de la presente invención a un sujeto, y generar imágenes del sujeto. Se pueden generar imágenes del sujeto, por ejemplo, con un dispositivo de diagnóstico.

En una o más modalidades, un método para generación de imágenes comprende además los pasos de monitorear el suministro del agente o composición al sujeto, y diagnosticar al sujeto con una condición de enfermedad asociada con HER2 (por ejemplo, cáncer de seno). En una modalidad, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un humano. En otra modalidad, el sujeto puede comprender células o tejidos. Los tejidos se pueden utilizar en biopsia. El dispositivo de diagnóstico puede emplear un método de generación de imágenes elegido de generación de imágenes de resonancia magnética, generación de imágenes ópticas, tomografía de coherencia óptica, rayos X, tomografía computarizada de emisión de fotones simples (SPECT), tomografía de emisión de positrones (PET), o combinaciones de los mismos.

Un agente formador de imagen radioetiquetado o una composición del agente formador de imagen de la presente invención, se puede administrar a humanos y a otros animales en forma parenteral, en la forma de una composición farmacéutica. En la composición farmacéutica de la presente invención, comprende un agente formador de imagen radioetiquetado o una composición de agente formador de imagen, tal como aquí se describe, y un transportador, excipiente, solvente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente invención para inyección parenteral comprende soluciones, dispersiones, emulsiones acuosas o no acuosas estériles farmacéuticamente aceptables, así como polvos estériles para reconstitución en soluciones inyectables estériles o dispersiones justo antes de su uso. Los ejemplos de transportadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos o no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de olivo), y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, utilizando materiales de recubrimiento tal como lecitina, ajusfando el tamaño de partículas en dispersiones o mediante el uso de tensoactivos.

Una composición farmacéutica de la presente invención también puede contener un adyuvante, tal como conservadores, agentes de humectación, agentes de emulsificación, y agentes de dispersión. La prevención de la acción de microorganismos, se puede asegurar mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, paraben, clorobutanol , ácido sórbico de fenol, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares, la absorción prolongada de la forma farmacéutica puede obtenerse mediante la inclusión de agentes, que retrasan la absorción, tal como monoestearato de aluminio y gelatina.

Se puede dispersar un agente formador de imagen radioetiquetado o una composición del agente formador de imagen de la presente invención, en un transportador fisiológicamente aceptable para minimizar la toxicidad potencial. Por lo tanto, los agentes formadores de imagen pueden dispersarse en una solución biocompatible con un pH de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8. En algunas modalidades, el agente se dispersa en una solución biocompatible con un pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 7.4. En otras modalidades, el agente de dispersa en una solución biocompatible con un pH de aproximadamente 7.4.

Se pueden combinar una composición de agente formador de imagen o una composición farmacéutica de la presente invención con otros aditivos, que son comúnmente utilizados en la industria farmacéutica para suspender o disolver los compuestos en un medio acuoso, y posteriormente la suspensión o solución puede ser esterilizada en técnicas conocidas en el arte. La composición de agente formador de imagen puede administrarse en una variedad de formas y adaptarse a la ruta de administración elegida. Por ejemplo, los agentes se pueden administrar en forma tópica (por ejemplo, mediante membranas de tejido o de moco), intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea. Las formas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, dispersiones, formulaciones liposomales o de emulsión. Las formas adecuadas para uso mediante inhalación incluyen agentes tales como los que se dispersan en un aerosol. Las formas adecuadas para administración tópica incluyen cremas, lociones, ungüentos, y similares.

Una composición del agente formador de imagen o una composición farmacéutica de la presente invención, se puede concentrar para suministrar de manera conveniente a un sujeto, una cantidad preferida de los agentes y empacarse en un contenedor en la forma deseada. El agente puede suministrarse en un contenedor, en el cual se dispersa en una solución fisiológicamente aceptable que facilita de manera conveniente la administración del agente en concentraciones entre el 0.1 mg y 50 mg del agente por kg del peso corporal del sujeto.

En una o más modalidades, se pueden generar imágenes del tejido objetivo aproximadamente cuatro horas después de administrar los agentes. En modalidades alternativas, se pueden generar imágenes del tejido objetivo aproximadamente veinte cuatro horas después de la administración de los agentes al sujeto.

Ejemplos Se proporcionan los siguientes ejemplos únicamente para ilustración, y no deberán construirse como limitantes de la presente invención.

MATERIALES Se selecciona un panel de líneas de células tumorigénicas con una probabilidad razonable de expresión de HER2, con base en la literatura disponible (Bruskin, et. al. Nucí. Med. Biol. 2004: 31: 205; Tran, et. al. Imaging agent composition Chem. 2007: 18: 1956), tal como se describe en la tabla 3.

Tabla 3 Se obtuvieron todas las líneas celulares del American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron según lo recomendado. Las células se cultivaron hasta una confluencia del > 90% antes de utilizarse. Se llevó a cabo citometría de flujo (Beckman Coulter Cytomics FC500 MPL) en las líneas celulares descritas en la tabla 4 utilizando anticuerpos primarios anti-Her2 (R&D Systems, PN MAB 1129) y Dako QIFIKIT (PN K0078) para análisis cuantitativo manchado de inmunofluoresencia indirecto. Se utilizaron cuentas de calibración con 5 diferentes poblaciones que contienen diferentes números de moléculas Mab, junto con las líneas celulares para determinar el número de receptores de superficie por célula. En todos los casos, se obtuvieron controles de isotipo adecuados de los vendedores correspondientes.

Se liberaron células adherentes de sus frascos utilizando un amortiguador de corte celular (PBS + 10 mM EDTA) en lugar de tripsina para evitar la proteólisis de los receptores de superficie celular. Las células se lavaron dos veces en PBS y se volvieron a suspender en amortiguador FC enfriado con hielo (PBS + 0.5 % BSA p/v) hasta una concentración de 5-10 x 106 células/mL. Se mezclaron alícuotas de 100 µ?_ de las células con 5 g de anticuerpo primario y se incubaron, sobre hielo, durante 45 minutos. Posteriormente las células se lavaron con 1 mi de amortiguador de citometría de flujo (enfriado con hielo) (FC) (PBS con albúmina de suero de bovino al 2%), se centrifugaron en 300 x g durante 5 minutos, y se volvieron a suspender en 0.5 pL-de amortiguador FC. Se agregaron 100 µ?_ de la dilución 1:50 con PBS del fragmento de anticuerpo secundario (F(ab)2 inmunoglobulinas antiratón de cabra conjugadas con FITC) y se incubaron, sobre hielo y en la oscuridad durante 45 minutos. Posteriormente las células se lavaron dos veces con 1 ml_ de amortiguador FC enfriado con hielo, se centrifugaron en 300 x g durante 5 minutos, y se volvieron a suspender en 500 µ?_ de amortiguador FC. Todas las células manchadas se pasaron a través de un filtro de 100 mieras antes de la citometría de flujo para evitar bloqueos de la célula de flujo.

Se llevó a cabo la citometría de flujo en un Beckman Coulter Cytomics FC500 MPL. Se recolectaron para cada tubo un mínimo de 5 x 104 eventos. Todos los análisis tuvieron un solo color, con la detección de FITC en FL1. Los datos de la dispersión directa (FS) y dispersión lateral (SS) demostraron que todas las poblaciones celulares estuvieron agrupadas estrechamente.

Se utilizó citometría de flujo para evaluar las células para su expresión HER2 in vitro (figuras 2A, 2B y 2C), con células SKOV3 que muestran el más alto nivel de expresión HER2 (figura 3). Los resultados en la figura 3 fueron reproducibles (n = 3).

La línea celular con expresión de más alto nivel fue SKOV3. Estas células se inyectaron en ratones inmunocomprometidos de 6 a 12 semanas de edad y se dejaron crecer los tumores. Los rangos de éxito y las curvas de crecimiento de tumor dependieron del número de células inoculadas. Se obtuvo un crecimiento de tumor óptimo con tres a cuatro millones de células/ratón.

Se llevaron a caso estudios in vivo con ratones desprotegidos CD-1 hembra (Charles River Labs, Hopkinton, MA) con un rango de edad entre 6 y 15 semanas. Los ratones se alojaron en una rejilla ventilada con alimento y agua ad libitum y un ciclo de iluminación estándar de 12 horas de día-noche. Para los xenoinjertos, los animales se inyectaron con 100 µ? de células en PBS. Las células fueron implantadas en forma subcutánea en el cuarto trasero derecho. Se llevó a cabo el implante bajo anestesia con isoflurano. Para SKOV3, se implantaron en cada ratón entre 3 x 1 O6 y 4 x 106 células. Bajo estas condiciones, se obtuvieron tumores utilizables (100 a 300 \sg) en de 3 a 4 semanas en más del 80% de los animales inyectados .

Se recolectaron los tumores de ratones mediante disecado, y los tumores completos se almacenaron a una temperatura de -20°C hasta el procesamiento. Los tumores se molieron sobre hielo en 1 mi de amortiguador RIPA suplementado con cóctel inhibidor de proteasa (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA #24948) en un homogen izador Dounce. Posteriormente los homogenados se incubaron sobre hielo durante 30 minutos, posteriormente se centrifugaron en 10,000 x G durante 10 minutos en una centrifugadora refrigerada. Los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron sobre hielo o a una temperatura de 4°C hasta el procesamiento adicional. Las concentraciones de proteína en los Usados se determinaron utilizando un equipo de ensayo de proteína BCA (Pierce Biotechnology 23225). Los Usados se diluyeron en una concentración estándar para producir 20 pg de la proteína/depósito en la placa de microtitulación. Se corrieron ELISA con un equipo HER2 humano comercialmente disponible (R&D Systems, DYC1129) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada muestra se corrió por triplicado, y los datos se reportaron como pg HER2/pg de proteína total, los errores se reportaron como desviaciones estándar.

Se midió la expresión objetivo in vivo mediante ELISA. Los tumores cortados se homogenizaron y analizaron para HER2 utilizando un equipo de par acoplado comercialmente disponible (R&D systems, DYC1129, Minneapolis, MN). Los resultados en la figura 3, muestran que la línea celular SKOV3 hace que crezca un tumor con alto nivel de expresión. Los controles ELISA fueron Usados de cultivo celular de las líneas de control negativas utilizadas para citometría de flujo. Estos resultados indican que los xenoinjertos de tumor SKOV3 son adecuados para el estudio in vivo de moléculas que se dirigen a HER2 humano.

Todos los polipéptidos fueron recibidos de Affibody® AB en Suecia. Los polipéptidos son referidos por sus códigos numéricos de desarrollo interno, los cuales tienen prefijo "Z". La tabla 1 describe los polipéptidos aquí descritos. Los polipéptidos incluyen el polipéptido Z00342 (SEQ. ID No. 1); polipéptido Z02891 (SEQ. ID No. 2); polipéptido Z00477 (SEQ. ID No. 3 y 4); y dímero de Z00477, por ejemplo, (Z00477)2 (SEQ. ID No. 5).

Las interacciones de enlace entre los polipéptidos y el antígeno HER2/neu se midieron in vitro utilizando detección de resonancia de plasmón de superficie (SPR) en un instrumento Biacore™ 3000 ¡nstrument (GE Healthcare, Piscataway, NJ). El dominio extracelular del antígeno Her2/neu se obtuvo como un conjugado con la región Fe de IgG humano (Fc-Her2) de R&D Systems (Minneapolis, MN), y se adhirió covalentemente a un chip de sensor funcionalizado con dextrano CM-5 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) equilibrado previamente con amortiguador HBS-EP (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCI, 3mM EDTA, 0.005% v/v tensoactivo P20) en 10 pL/min, y activado subsecuentemente con EDC y NHS. El Fc-HER2 (5 pg/ml) en acetato de sodio 10 mM (pH 5.5), se inyectó en el chip de sensor activado hasta que se logró (2 minutos) el nivel de inmovilización deseado (~3000 Resonance Units). Los grupos activados residuales en el chip de sensor, se bloquearon mediante inyección de etanolamina (1 M, pH 8.5). Cualquier conjugado enlazado en forma no covalente fue eliminado mediante lavado repetido (5x) con 2.5 M NaCI, 50 mM NaOH. Se trató en forma idéntica una segunda célula de flujo en el mismo chip de sensor, excepto sin inmovilización Fc-HER2, con el objeto de servir como una superficie de control para los cambios de índice refractario e interacciones de enlace no específicas con el chip de sensor. Antes del estudio cinético, se probó el enlace del material para análisis objetivo en ambas superficies, y se llevó a cabo un experimento de estabilidad en la superficie para asegurar la eliminación adecuada del material para análisis enlazado y la regeneración del chip de sensor después del tratamiento con 2.5 M de NaCI, 50 m de NaOH. Se analizaron los sensogramas SPR utilizando el software BIAevaluation (GE Healthcare, Piscataway, NJ). La robustez del modelo cinético fue determinada mediante evaluación de los residuos y el error estándar de cada uno de los parámetros cinéticos calculados, "lo conveniente del ajuste" (?2 < 10) y una comparación directa de los sensogramas modelados de los datos experimentales. Se recolectaron del material para análisis (0 a 100 nM de proteína), medidas SPR en ocho concentraciones y los sensogramas resultantes se ajustaron a un modelo de enlace Langmuir de 1:1.

La figura 1 muestra los datos de la resonancia de plasmón de superficie de ejemplo (SPR) obtenidos para Z00477 (SEQ. ID No. 3) y (Z00477)2 (SEQ. ID No. 5) cuando se corre en superficies funcionalizadas con HER2 humano. Esta relación se mantiene cierta para todos los polipéptidos para los cuales son conocidas las afinidades (cuadro 2), en donde los valores para el dímero Z(477)2 (SEQ. ID No. 5), son estimados basados en el efecto de avidez.

El etiquetado de los polipéptidos etiquetados con His6 (SEQ ID NO: 7) con el centro fac-[99mTc(CO)3]+ se logró utilizando modificaciones a un procedimiento publicado previamente (Waibel, R.; et al., A. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 897.). En síntesis, se agregó Na[99mTc04] en solución salina (4 mCi, 2 ml_) a un equipo de boranocarbonato Isolink® (Alberto, R. et al, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 3135.). La solución resultante se calentó a una temperatura de 95°C durante 15 a 20 minutos para proporcionar fac-[S9mTc(CO)3(H20)3] + . Una parte (2 mCi, 1 mL) de la solución se eliminó y neutralizó hasta un pH ~7 con 1 N HCI. Se eliminó una alícuota de 325 pL y se agregó a una solución de His6-Polipéptido (SEQ ID NO: 7) (40 pg). La solución resultante se calentó en un baño de agua a una temperatura de 35 a 37°C durante 40 minutos. Las producciones radioquímicas típicas fluctuaron de 80 a 95% (determinadas mediante ITLC-SG, Biodex, 0.9% NaCI). Los productos de reacción crudos fueron cromatografiados en una columna NAP-5 (GE Healthcare, 10 mM PBS) para proporcionar productos con >99% de pureza radioquímica. Las actividades específicas típicas obtenidas fueron 3 a 4 pCi/ g. La solución resultante se diluyó posteriormente con 10 mM PBS para proporcionar la concentración adecuada para estudios de biodistribución subsecuentes.

Se llevó a cabo HPLC en una HPLC serie Agilent 1100 equipada con una columna de Péptido/Proteína C4 Grace-Vydac (4.6 x 250 mm) y un detector de radioactividad Raytest GABI. El solvente A fue 95:5 agua: MeCN con 0.1% de TFA, y el solvente fue 5:95 agua: MeCN con 0.1% TFA. El gradiente fue tal como se indica a continuación (todos los cambios lineales; tiempo/%B): 0/0, 4/20, 16/60, 20/100, 25/100, 26/0, 31/0.

Cada polipéptido fue etiquetado con el centro de tricarboniltecnetio con un alto rendimiento (>90%) antes de la purificación. La purificación mediante cromatografía NAP-5 proporcionó muestras de polipéptidos etiquetados con 99mTc con una pureza radioquímica del >99% (tabla 4) Tabla 4 En la figura 4 se muestran cromatogramas HPLC representativos de polipéptidos radioetiquetados purificados con NAP-5. El tiempo de retención de las especies radioetiquetadas estuvo virtualmente sin cambio del tiempo de retención del polipéptido no etiquetado correspondiente en un cromatograma V 220 nm (excepto para la diferencia de tiempo debido a la separación física de los detectores UV y gamma; datos no mostrados).

Modelos animales utilizados para el estudio de 99mTc(CO)3(His6)-Polipéptidos CH¡s6' descrito como SEO. ID NO: 7).

Se llevaron a cabo estudios in vivo con ratones desnudos CD-1 hembra (Charles River Labs, Hopkinton, MA) con un rango de edad entre 6 y 15 semanas. Los ratones se alojaron en una rejilla ventilada con alimento y agua ad libitum y un ciclo de iluminación estándar de 12 horas de día-noche. Para los xenoinjertos, los animales se inyectaron con 100 µ? de células en PBS. Las células se implantaron en forma subcutánea en el cuarto trasero derecho. El implante se llevó a cabo bajo anestesia con isoflurano. Para SKOV3, se implantaron en cada ratón entre 3 x 106 a 4 x 1 O6 células. Bajo estas condiciones, se obtuvieron tumores utilizables (100 a 300 pg) en 3 a 4 semanas en más del 80% de los animales inyectados.

Biodistribución A los ratones se les proporcionaron inyecciones en la vena de la cola de ~1 g de polipéptidos etiquetados con 99mTc (~3 µ C i/ 1 pg). Los ratones se colocaron en jaulas revestidas con papel de filtro hasta que se realizó la eutanasia. Se eutanizaron tres ratones en cada punto de tiempo y los tejidos de interés se disecaron y contaron en un contador Gamma Perkin Elmer Wallac Wizard 1480. Se recolectaron los datos de la sangre, riñon, hígado, bazo y el sitio de inyección (cola). Se recolectó la orina de la vejiga en las jaulas y también se contó. Se contaron los tejidos restantes y la suma de todos los tejidos más la orina de cada animal, se sumó para proporcionar la dosis inyectada total. Se determinó el porcentaje de dosis inyectada de cada órgano con base en este total, y los órganos se pesaron para determinación del porcentaje de dosis inyectada por gramo, (%ID/g). Los datos se reportan como un valor promedio para los tres ratones en el punto de tiempo con las barras de error representando la desviación estándar del grupo.

El polipéptido Z00477 etiquetado con 99mTc (SEQ. ID No. 4) se inyectó en ratones SKOV3. La figura 6 muestra las curvas de tumor y sangre de estos experimentos. El polipéptido Z00477 (SEQ. ID No. 4) mostró buena captación de tumor en tumores SKOV3 de expresión objetivo con un valor máximo de aproximadamente el 3% de la dosis inyectada por gramo de tejido a los 30 minutos posteriores a la inyección (Pl), y una proporción de tumor pico: sangre mayor al 8 en 240 minutos Pl.

Los polipéptidos presentan un despeje monoexponencial de la sangre con vidas medias menores a dos minutos. Este despeje es transmitido principalmente por el hígado y los ríñones. La captación de polipéptido en el bazo fue moderada, y se observó una captación de moderada a alta en el hígado, tal como se describe en la tabla 5.

Tabla 5. Captación etiquetada Z00477 (SEQ. ID No. 3) His6 (SEQ ID NO: 7) (%ID/g) en ratones que contienen el tumor SKOV3.

Los polipéptidos divalentes exhiben mayor afinidad que los monómeros correspondientes, presuntamente debido al efecto de avidez. Sin embargo, su tamaño más grande puede obstaculizar la penetración al tumor. Para los polipéptidos HER2, estuvieron disponibles formas bivalentes de cada uno de los cuatro polipéptidos de alta afinidad. El dímero Z00477 (SEQ. ID No. 3), (Z00477)2 (SEQ. ID No. 5), fue radioetiquetado y utilizado para el experimento de biodistribución de cuatro horas en ratones con tumor SKOV3.

Los polipéptidos monovalentes y bivalentes exhiben características de biodistribución similares, y se observan vidas medias en la sangre para ambos, dentro del rango de uno a dos minutos. Los resultados indican claramente que los polipéptidos tanto monoméricos, como divalentes pueden ser dirigidos a HER2 in vivo.

Para introducir el quelante 99mTc cPN216 (figura 7), se sintetizó un compuesto bifuncional al-cPN216 que comprende un grupo maleimida que reacciona al tiol para la conjugación a una cisteína terminal de un polipéptido y un grupo de oxima de amina para quelar 99mTc.

Se obtuvo cPN216-amina en GE Healthcare. Se compró el ácido ?-ß-maleimidopropiónico en Pierce Technologies (Rockford, IL). Se compraron N-metilmorfolina, hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBoP), ditiotreitol (DTT), bicarbonato de amonio y DMF anhidro en Aldrich (Milwaukee, Wl). Se obtuvo el amortiguador PBS (1x, pH 7.4) en Invitrogen (Carlsbad, CA). Se utilizaron acetonitrilo grado HPLC (CH3CN), ácido trifluoroacético grado HPLC (TFA) y agua Millipore 18 mO para las purificaciones de HPLC.

Ejemplo 1.

A una solución de ácido ?-ß-maleimidopropiónico (108 mg, 0.64 mmoles) enfriada con hielo, cPN216-amina (200 mg, 0.58 mmoles) y PyBoP (333 mg, 0.64 mmoles) en DMF anhidro a una temperatura de 0°C, se le agregó 0.4 M de N-metilmorfolina en DMF (128 pL, 1.16 mmoles). Se eliminó el baño de hielo después de 2 horas, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche antes de someterse a purificación HPLC. Se obtuvo el producto Mal-cPN216 en la forma de un polvo color blanco (230 mg, 80% rendimiento). 1H-RMN (400MHz, DMSO-d6): d 1.35 (m, 2 H), 1.43 (s, 12 H), 1.56 (m, 5 H), 1.85 (s, 6 H), 2.33 (dd, J1 = 8 Hz, J2 = 4 Hz, 2 H ) , 2.78 (m, 4 H), 3.04 (m, 2 H), 3.61 (dd, J1 = 8 Hz, J2 = 4 Hz, 2 H) , 7.02 (s, 2 H), 8.02 (s, 1 H), 8.68 (s, 4 H), 11.26 (s, 2 H); m/z = 495.2 para [M + H]+ (C24H43N605, MW Calculado = 495.3).

Se disolvió el polipéptido Z00477 (SEQ ID No. 3) con amortiguador PBS con gases extraídos recientemente (1x, pH 7.4) en una concentración de aproximadamente 1 mg/mL. Se redujo la ligadura de disulfuro en el polipéptido mediante la adición de la solución DTT en el amortiguador PBS con gases extraídos recientemente (1x, pH 7.4). La concentración final de DTT fue de 20 mM. La mezcla de reacción se vortizó durante 2 horas y se pasó a través de una columna giratoria de extracción de sal Zeba (Pierce Technologies) equilibrada previamente con amortiguador PBS con gases extraídos (1x, pH 7.4) para eliminar el exceso de reactivo DTT. Se recolectó la molécula de polipéptido reducida, eluida, y se agregó el compuesto bifuncional Mal-cPN216 (20 equivalentes por equivalente del polipéptido) en la forma de una solución en DMSO, y la mezcla se vortizó a temperatura ambiente durante 3 horas y se congeló con nitrógeno líquido. La mezcla de reacción se almacenó durante la noche antes de someterse a purificación HPLC de fase inversa (figuras 8A y 8B).

La purificación HPLC se llevó a cabo en una columna MiCHROM Magic C18AQ 5 µ 200A (MiChrom Bioresources, Auburn, CA). Solvente A: H20 (con 0.1% de ácido fórmico), solvente B: CH3CN (con 0.1% de ácido fórmico). Gradiente: 5 a 100% B en 30 minutos.

Las fracciones que contienen el producto deseado se combinaron y neutralizaron con una solución de bicarbonato de amonio 100 mM, y los solventes se eliminaron mediante liofilización para proporcionar la composición del agente formador de imagen deseada en la forma de un sólido color blanco (producción 41%).

El análisis LC-MS del producto purificado confirmó la presencia del producto deseado, y el MW sugirió que se agregó únicamente una etiqueta cPN216 a las construcciones de polipéptido (Z00477 (SEQ. ID No. 3)-cPN216: MW calculado: 7429 Da, encontrado: 7429 Da; Z02891 (SEQ. ID No. 2) -CPN216 MW calculado: 7524 Da, encontrado: 7524 Da).

Ejemplo 2.

A un frasco de 20 ml_ se le agregaron 10.00 ml_ de agua desionizada, destilada. Se sometió a burbujeo el nitrógeno a través de esta solución durante aproximadamente 30 minutos antes de la adición del NaHC03 (450 mg, 5.36x10'3 mol), Na2C03 (60 mg, 5.66x10"4 mol), y para-aminobenzoato de sodio (20 mg, 1.26x10"4 mol). Todos los reactivos se pesaron independientemente, y se agregaron al frasco que contiene agua. Se pesaron juntos cloruro de estaño (1.6 mg, 7.09x10'6 mol) y MDP (2.5 mg, 1.42x10"5 mol) en un frasco de 1 dram y se transfirieron subsecuentemente (con un lavado subsecuente) mediante suspensión rápida en aproximadamente 1 ml_ de la mezcla de amortiguador de carbonato. Se eliminaron alícuotas de 10 pL y se transfirieron bajo una corriente de nitrógeno a frascos silanizados, se congelaron inmediatamente y se mantuvieron en un baño de nitrógeno líquido hasta la Mofilización. Cada frasco se tapó parcialmente con sello con un septo de hule y se colocó en un liofilizador de charola durante la noche. Los frascos se sellaron bajo vacío, se eliminaron del liofilizador, se sellaron a presión con tapas de aluminio, se volvieron a presurizar con nitrógeno anhidro y se almacenaron en un congelador hasta uso futuro.

Ejemplo 3.

Se llevó a cabo la síntesis del polipéptido radioetiquetado utilizando una formulación con equipo de un paso producida localmente (Chelakit A + ) que contiene una mezcla liofilizada de fluoruro estañoso como un agente de reducción para tecnetio, ácido difosfónico de metileno, p-aminobenzoato en la forma de un depurador de radical libre y bicarbonato de sodio/carbonato de sodio (pH 9.2) como un amortiguador. En una sucesión rápida, se agregaron 20 de una solución 2 pg/pL de polipéptido en solución salina al Chelakit, seguido inmediatamente de NaS9mTc04 (0.8 mCi, 29.6 MBq) en 0.080 mL de solución salina (0.15M NaCI) obtenida en Cardinal Health (Albany, NY). La mezcla se agitó una vez y se dejó asentar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Al término, el rendimiento radioquímico crudo se determinó mediante ITLC (tabla 6 que se encuentra a continuación de acuerdo con ITLC-SG, Biodex, 0.9% NaCI).

Tabla 6 El volumen de reacción se incrementó a 0.45 mL con 0.35 mL de NaCI estéril 150 mM, y el producto final se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (NAP5, GE Healthcare, cargado con 10 mM PBS). La mezcla de reacción cruda se cargó en la columna NAP5, se dejó ingresar al lecho de gel, y el producto purificado final se aisló después de la elución con 0.8 mL de 10 mL PBS. Se ensayó la actividad final en un calibrador de dosis estándar (CRC-15R, Capintec, Ramsey, NJ). Se determinó el rendimiento radioquímico (tabla 6) y la pureza mediante ITLC (>98.5%), C4 RP-HPLC (figura 9) y análisis SEC-HPLC. El producto final (10 a 15 pCi/ g, 0.2 a 0.5 pCi/pL, (0.37MBq/pg, 7.4MBq/mL)) utilizó inmediatamente para estudios de biodistribución.

Las condiciones HPLC utilizadas para este experimento fueron como se indica: método 1 C4 RP-HPLC: Solvente A: 95/5 H20/CH3CN (con 0.05% TFA), Solvente B: 95/5 CH3CN/ddH20 (agua desionizada, destilada) con 0.05% de TFA. Elución de gradiente: O minutos. 0%B, 4 minutos. 20%B, 16 minutos. 60%B, 20 minutos. 100%B, 25 minutos. 100%B, 26 minutos. 0%B, 31 minutos. 0%B.

Método 2 C4 RP-HPLC: Solvente A: 0.06% NH3 en agua, Solvente B: CH3CN. Elución de gradiente: 0 minutos. 0%B, 4 minutos. 20%B, 16minutos. 60%B, 20 minutos. 100%B, 25 minutos. 100%B, 26 minutos. 0%B, 31 minutos. 0%B.

El análisis RP-HPLC se llevó a cabo en HP Agilent 1100 con un autoinyector G1311A QuatPump, G1313A con una jeringa de 100µ?_ y una capilaridad de asiento de 2.0 mL, Grace Vydac - columna de proteína C4 (S/N E050929-2-1, 4.6 mmxl50 mm), calentador de columna G1316A, G1315A DAD y Ramón Star -detector gamma GABI.

HPLC SEC: Solvente: 1x (10 mM) PBS (Gibco, Invitrogen, pH 7.4 que contiene CaCI2 y MgCI2). Elución ¡socrática durante 30 minutos. El análisis se llevó a cabo en: una bomba Series 410 LC de control ambiental de solvente Perkin Elmer SEC-4, procesador de muestras ISS 200 Advanced LC y Detector de Formación de Diodo Series 200. Se sometió a interfaz un Raytest GABI con un detector gamma de célula de flujo con poros Socket 8103 0111 (diámetro interno de 0.7 mm con volumen de 250 pL) a través de una interfaz de Cromatografía de Red Perkin Elmer NCI 900. La columna utilizada fue una columna Superdex 75 10/300 GL High Performance SEC (GE Healthcare, código: 17-5174-01, ID no. 0639059).

El pH de operación de Chelakits utilizado para incorporar 9 mTc en el quelato cPN216 (pH = 9.2), casi coincidió con el pH calculado del polipéptido Z00477 (SEQ. ID No. 3). Se determinó el etiquetado bajo estas condiciones, para originar la agregación en el producto final (figuras 5A y 5B). La agregación se confirmó mediante HPLC de exclusión por tamaño y a través del tiempo de residencia en sangre incrementado y la captación de hígado observada en los estudios de biodistribución. Al alterar el punto isoeléctrico del polipéptido, la 99mTc se incorporó con éxito en la construcción Z02891 (SEQ. ID No. 2). La HPLC de exclusión por tamaño confirmó la presencia de una especie con un peso molecular adecuado, y los estudios de biodistribución mostraron la captación del seguidor en los xenoinjertos de tumor.

Se llevaron a cabo estudios in vivo con ratones desnudos CD-1 hembra (Charles River Labs, Hopkinton, MA) con un rango de edad entre 6 y 15 semanas. Los ratones se alojaron en una rejilla ventilada con alimento y agua ad libitum y un ciclo de iluminación estándar de 12 horas día-noche. Para los xenoinjertos, los animales se inyectaron con 100 µ? de células en PBS. Las células se implantaron en forma subcutánea en el cuarto trasero derecho. La implantación se llevó a cabo bajo anestesia con isoflurano. Para SKOV3, se implantaron en cada ratón entre 3 x 106 a 4 x 106 células. Bajo estas condiciones, se obtuvieron tumores utilizables (100 a 300 pg) en 3 a 4 semanas con más del 80% de los animales inyectados.

A los ratones se les administraron inyecciones en la vena de la cola de ~1 ug de polipéptidos etiquetados con 99mTc (-10 pCi/1 pg). Los ratones se colocaron en jaulas revestidas con papel de filtro hasta que se realizó la eutanasia. Se eutanizaron tres ratones en cada punto de tiempo, y los tejidos de interés se disecaron y se contaron en un Contador Gamma Perkin Elmer Wallac Wizard 1480 Gamma. Los datos se recolectaron para sangre, riñón, hígado, bazo y el sitio de inyección (cola). Se recolectó la orina de las jaulas con una vejiga y también se contó. Se contaron los tejidos restantes y la suma de todos los tejidos más la orina de cada animal se sumó para proporcionar la dosis inyectada total. El porcentaje de la dosis inyectada de cada órgano se determinó con base en este total, y los órganos se pesaron para determinación del porcentaje de dosis inyectada por gramo, (% I D/g) . Los datos se reportaron como el valor promedio de los cuatro a cinco ratones en el punto de tiempo con barras de error que representan la desviación estándar del grupo. Se tomaron cuatro puntos de tiempo en cuatro horas (5, 30,120 y 240 minutos postinyección).

El polipéptido Z02891 (SEQ. ID No. 2) -cPN216-99mTc mostró fuerte captación de tumor en los tumores SKOV3 que expresan el objetivo, con un valor de 7.11 ± 1.69% (n = 5) de la dosis inyectada por gramo de tejido a los 30 minutos posteriores a la inyección (Pl), lo cual permaneció muy constante durante el curso de tiempo del estudio de hasta un Pl de 240 minutos. Tumor: las proporciones de sangre fueron 2, 5 y 5 en 30, 120 y 240 minutos posteriores a la inyección, respectivamente. Las figuras 10, 11 y 12 muestran las curvas de tumor, sangre y tumor: sangre de estos experimentos.

Los polipéptidos presentan un despeje monoexponencial de la sangre con vidas medias menores a dos minutos. Este despeje es transmitido principalmente por los ríñones, con 10.58 ± 2.96 (n = 5) ID/órgano en 240 minutos Pl posteriores a la inyección. La actividad es secretada principalmente en la orina. La captación de polipéptido en el bazo fue de moderada a alta debido a la posible agregación, y se observó una captación moderada en el hígado, por ejemplo, 12% ID/órgano (equivalente en valor en ratones para %ID/g) durante el curso del estudio.

Resultados de biodistribución para Z02891 ÍSEQ. ID No. 2>-cPN216-99mTc Tabla 7. Captación de Z02891 (SEQ. ID No. 2) cPN216 (% I D/g) en ratones que contienen tumor SKOV3.

Ejemplo 4.

Se funcionalizaron polipéptidos de cisteína Z00477 (SEQ. ID. NO. 4), Z00342 (SEQ. ID No. 1) y Z02891 (SEQ. ID No. 2) con un grupo aminoxi a través de cisteína C-terminal diseñada. Se determinó la pureza de las moléculas de polipéptido proporcionadas como de >95% mediante Cromatografía Líquida de Alto Desempeño (HPLC).

Ejemplo 5.

Para incorporar 18F en las moléculas de Polipéptido, se sintetizó un enlazador bifuncional Mal-aminooxi que comprende dos grupos ortogonales: un grupo maleimida que reacciona a tiol para conjugación a la cisteína diseñada y un grupo aminoxi que reacciona con aldehido (figuras 13A y 13B). Este enlazador se preparó haciendo reaccionar maleimida N-(2-aminoetilo) con ácido 2-(ter-butoxicarbonilaminooxi) utilizando condiciones de acoplamiento transmitidas por carbodiimida de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] (EDC) - que producen la forma protegida -del enlazador. Posteriormente se desprotegió el grupo de protección Boc mediante corte de ácido para proporcionar el producto Mal-AO final con un rendimiento cuantitativo. El producto final se utilizó directamente sin purificación adicional.

General Se compraron diclorometano, ácido 2-(ter-butoxicarbonilaminooxi), trietilamina, sal de ácido trifluoracético de N-(2-aminoetil)maleim¡da (TFA), hidrato de N- hidroxibenzotriazol (HOBT), 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC), ditiotriotol (DTT), y todos los otros reactivos de síntesis estándar en Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). Todos los químicos se utilizaron sin purificación adicional. Se obtuvo amortiguador PBS (1x, pH 7.4) en Invitrogen (Carlsbad, CA). Se utilizaron para las purificaciones acetato de etilo grado HPLC, hexanos, acetonitrilo (CH3CN), ácido trifluoroacético (TFA) y agua Millipore 18 mO.

Ejemplo 6.

A una solución de ácido acético 2-(ter-butoxicarbonilaminooxi) (382 mg, 2 mmoles) en diclorometano anhidro (20 ml_), se le agregó en secuencias trietilamina (307 µ?_, 2.2 mmoles), sal TFA-N-(2-aminoetil)maleimida-TFA (508 mg, 2 mmoles), HOBT(306 mg, 2 mmoles) y EDC (420 mg, 2.2 mmoles). Después de agitarse durante 24 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (50 ml_), y se lavó con una solución de bicarbonato de sodio saturado (3 x 30 ml_), agua (30 ml_) y salmuera (30 ml_). La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se filtró. El filtrado se concentró hasta obtener un sólido amarillo pálido el cual se purificó mediante cromatografía de columna (70% de acetato de etilo en hexanos) para proporcionar el producto en la forma de un polvo color blanco (500 mg, rendimiento 80%). 1 H-RMN (400MHZ, CDCI3): d 1.50 (s, 9 H), 3.55 (tt, J1= 6.0 Hz, J2= 6.5 Hz, 2 H), 3.77 (dd, J= 7.6 Hz, 2 H), 4.30 (s, 2 H), 6.3 (s, 2 H).

Ejemplo 7.

Se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas una solución de 9.3 mg de Mal-AO-Boc en 1 mL de 3M HCI. Los solventes se eliminaron bajo vacío para producir Mal-AO en la forma de un sólido color amarillo claro. (80% rendimiento). 1H-RMN (400MHZ, DMSO-d6): d 3.27 CH2 (t, J= 4.0 Hz, 2H), 3.49 CH2 (t, J= 4.0 Hz, 2H), 4.39 CH20 (s, 2H), 7.00 CH = CH (s, 2H); m/z = 214.07 para [M + H] + (C8H12N304, MW Calculado = 214.11)).

Ejemplo 8.

Se disolvió el polipéptido (Z00477(SEQ ID No. 4), Z00342 (SEQ ID No. 1) o Z02891 (SEQ ID. No. 2)) en amortiguador PBS con gases extraídos recientemente (1x, pH 7.4) en una concentración de aproximadamente 1 mg/mL. La ligadura de disulfuro en el polipéptido se redujo mediante la adición de una solución de ditiotreitol (DTT) en amortiguador PBS con gases extraídos recientemente (1x, pH 7.4). La concentración final de DTT es de 20 mM. La mezcla de reacción se vortizó durante 2 horas y se eluyó a través de una columna giratoria de extracción de sal Zeba (Pierce Technologies) equilibrada previamente con amortiguador PBS con gases extraídos para eliminar el exceso de reactivo DTT. Se recolectó el polipéptido reducido, y se agregó el compuesto Mal-AO bifuncional (15 equivalentes por equivalente del polipéptido) en la forma de una solución en DMSO. Después de vortizarse a temperatura ambiente durante la noche, la mezcla de reacción se purificó con Cromatografía Líquida de Alto Desempeño (HPLC) (figuras 14A y 14B).

Se llevó a cabo la purificación HPLC en una columna MiCHROM Magic C18AQ 5µ 200A (MiChrom Bioresources, Auburn, CA). Solvente A: H20 (con 0.1% de ácido fórmico), Solvente B: CH3CN (con 0.1% de ácido fórmico). Gradiente: 5 a 100% B durante 30 minutos. Las fracciones que contienen el producto deseado se combinaron y neutralizaron con 100 mM de una solución de bicarbonato de amonio, y los solventes se eliminaron mediante liofilización para proporcionar el polipéptido modificado con aminoxi en la forma de un sólido color blanco.

El análisis ESI-TOF-MS confirmó la presencia del producto objetivo con pesos moleculares esperados (MW calculado: 6964 Da, 8531 Da y 7243 Da, encontrado: 6963 Da, 8532 Da y 7244 Da para Z00477 (SEQ. ID No. 4)-ONH2, Z00342 (SEQ. ID No. 1)-ONH2 y Z02891 (SEQ. ID No. 2) -ONH2, respectivamente.

Ejemplo 9. Preparación de 18FBA.

Métodos: Todas las reacciones se llevaron a cabo ya sea bajo una atmósfera de nitrógeno o en un frasco sellado en la parte superior a presión, purgado con nitrógeno antes de utilizarse. Se compraron Kryptofix 222 (Aldrich) y K2C03 (EMD Science) y se utilizaron tal como se recibieron. Se utilizó acetonitrilo de grado Optima™ - como solvente tanto para la reacción como para HPLC.

Se obtuvo K18F (40mCi mL 1 (1480 MBq mL 1) en agua purificada) en IBA Molecular (Albany, NY) y PETNET Solutions (Albany, NY) y se utilizaron tal como se recibieron. Se inmovilizó primero el fluoruro [18F ] en un cartucho de intercambio de anión Chromafix 30-PS-HCO3 (ABX, Radeberg, Alemania), posteriormente se eluyó en un envase de secado con 1 mi de una mezcla 4:1 de acetonitrilo: desionizada, destilada H20 (ddH20) que contiene Kryptofix K222 (376 g.mol"1, 8 mg, 2.13x10 s mol) y carbonato de potasio (138.2 g.mol"1, 2.1 mg, 1.52x10"5 mol). El solvente se eliminó bajo vacío parcial y un flujo de nitrógeno con calentamiento suave (~ 45°C) (-15 minutos). Posteriormente se lavó el frasco de la fuente y el cartucho de intercambio de aniones con 0.5mL de acetonitrilo que contiene K222 (8 mg) y la mezcla de reacción nuevamente se secó bajo vacío parcial y calentamiento suave (~ 10 minutos). El envase de reacción se volvió a presurizar con nitrógeno, y se repitió una vez el secado azeotrópico con 0.5 mL adicionales de acetonitrilo. Se disolvió triflato de 4-formil-?,?,?-trimetilanilinio (313.30 gmol"1, 3.1 mg, 9.89X10"6 mol) en 0.35 mL de DMSO anhidro (Acros) y se agregó directamente al envase de reacción que contiene K18F K222, K2C03. La mezcla de reacción se calentó a una temperatura de 90°C durante 15 minutos y se enfrió y se extinguió inmediatamente con 3 mL de ddH20. Esta mezcla se pasó en forma subsecuente a través de un cartucho de intercambio de catión (Waters SepPak Light Accell Plus CM), se diluyó a 10 mL con ddH20, y se cargó en una C18 SepPak de fase inversa (Waters SepPak Plus C18). La SepPak se enjuagó con 10 mL de ddH20, posteriormente se purgó con 30 mL de aire. Se eluyó [18F]4-fluorobenzaldehído (18FBA) en 1.0 mL de metanol.

Ejemplo 10.

Por separado, se cargó un frasco de recuperación de alto nivel (2mL, National Scientific) ya sea con Z00477-(SEQ. ID No. 3)-ONH2 (0.35 a 0.5mg), Z00342-(SEQ. ID No.1)-ONH2 (0.35 a 0.5mg) o Z02891-(SEQ. ID No. 2)-ONH2 (0.35 a 0.5mg). El sólido se suspendió en 25 pL de ddH20 y 8 pL de ácido trifluoroacético. Se transfirieron al frasco de reacción 25 pL de 8FBA en metanol (ver Ejemplo 9). El envase se tapó, se engarzó, se colocó en un bloque de calentamiento y se mantuvo a una temperatura de 60°C durante 15 minutos; en ese punto se eliminó una pequeña alícuota (<5 pL) para análisis HPLC analítico. Se utilizó 450 pL de ddH20 con 0.1% TFA para diluir la solución aproximadamente a 500 pL-en preparación para la purificación HPLC semipreparativa. Se aisló 18FB-Polipéptido y se purificó mediante HPLC de semipreparación . La fracción HPLC que contiene el producto (0.113 mCi/4.18MBq) se diluyó 5:1 con ddH20 y se inmovilizó subsecuentemente en una tC18 Plus Sep Pak (Waters). El SepPak se enjuagó primero con 5 mide ddH20, posteriormente 30 ml_ de aire. Se aisló el 8FB-Polipéptido en una cantidad mínima de etanol, eluyendo primero el volumen nulo (aprox. 0.5 mL), seguido de recolección de 250 a 300 µ? del eluente en un frasco de separación. Se llevó a cabo el análisis RP-HPLC en el producto aislado con el objeto de establecer la pureza radioquímica y química. Normalmente se inyectaron 10 µ?_ de una solución 0.1 Ci/pL-para un análisis de la formulación posterior. Los rendimientos radioquímicos aislados se indican en la tabla 9, y la deterioro corregida de la adición del polipéptido para 18FBA y la pureza radioquímica del >99%. Como alternativa, se aislaron los polipéptidos etiquetados con 18F mediante cromatografía de exclusión por tamaño NAP5, diluyendo la mezcla de reacción aproximadamente a 0.5mL con 10mM PBS y cargando en el gel. Se aislaron los polipéptidos etiquetados con 18F, eluyendo al columna con 0.8 mL de 10mM PBS y se utilizaron sin modificación adicional. Estos resultados se ilustran en la tabla 8 y la figura 5.

Tabla 8 Las condiciones HPLC analíticas utilizadas son como se indica: El análisis se llevó a cabo en una HP Agilent 1100 con G1311A QuatPump, autoinyector G1313A con una jeringa de 100 L y una capilaridad de asiento de 2.0mL, columna Phenomenex Gemini C18 (4.6mmx150mm), 5µ, 100A (S/N 420477-10), calentador de columna G1316A, G1315A DAD and Ramón Star - detector gamma GABI. 95:5 ddH20:CH3CN con 0.05% TFA, Solvente B: CH3CN con 0.05% TFA. Elución de gradiente (1.0 mL min1): 0 minutos. 0%B, 1 minuto. 15%B, 21 minutos. 50%B, 22 minutos. 100%B, 26 minutos. 100%B, 27 minutos. 0%B, 32 minutos. 0%B. o elución de gradiente (1.2 mL min"1): 0 minutos. 0%B, 1 minuto. 15%B, 10 minutos. 31%B, 10.5 minutos. 100%B, 13.5 minutos. 100%B, 14 minutos. 0%B, 17 minutos. 0%B.

Se utilizaron las condiciones HPLC de semipreparación tal como se indican a continuación: La purificación se llevó a cabo en LC con un extractor de gases de linea 4 DG-2080-54, un Mezclador MX-2080-32 y dos bombas PU-2086 Plus Prep, un autoinyector AS-2055 Plus Intelligent con un equipo de inyección de volumen grande instalado, una columna de 5 µ, 250 x 10 mm, Phenomenex 5µ Luna C18(2) 100Á, con protección (S/N 295860-1, P/N 00G-4252-N0), un MD-2055 PDA y un Carroll & Ramsey Associates Modelo 105S Analogue Ratemeter adherido a un detector gamma de fotodiodo SiPIN de estado sólido. Elución de gradiente: 0 minutos. 5%B, 32 minutos. 20%B, 43 minutos. 95%B, 46 minutos. 95%B, 49 minutos. 5%B, Solvente A: ddH20:CH3CN con 0.05% TFA, Solvente B: CH3CN con 0.05% TFA.

Ejemplo 11.

Se llevaron a cabo estudios in vivo con ratones desnudos CD-1 hembra (Charles River Labs, Hopkinton, MA) con un rango de edad entre 6 y 15 semanas. Los ratones se alojaron en una rejilla ventilada con alimento y agua ad libitum y un ciclo de eliminación estándar de 12 horas día-noche. Para los xenoinjertos, los animales se inyectaron con 100 µ? de células en PBS. Las células se implantaron en forma subcutánea en el cuarto trasero derecho. Se llevó a cabo la implantación bajo anestesia de isoflurano. Para SKOV3, se implantaron en cada ratón entre 3 x 106 a 4 x 10e células. Bajo estas condiciones, se obtuvieron tumores utilizables (100 a 300 pg) de 3 a 4 semanas con más del 80% de los animales inyectados.

A los ratones se les proporcionaron inyecciones en la vena de la cola de ~1 ug de polipéptido etiquetado-18F (~4 uCi/1 pg). Los ratones se colocaron en jaulas revestidas con papel de filtro hasta la eutanasia. Se eutanizaron tres ratones en cada punto de tiempo, y los tejidos de interés se disecaron y se contaron en un contador Gamma Perkin Elmer Wallac Wizard 1480. Los datos se recolectaron para sangre, riñón, hígado, bazo, huesos y sitio de inyección (cola). La orina de las jaulas se recolectó con la vejiga y también se contó. Se contaron los tejidos restantes y la suma de todos los tejidos más la orina de cada animal se sumó para proporcionar la dosis inyectada total. El porcentaje de dosis inyectado de cada órgano se determinó con base en este total, y los órganos se pesaron para determinación del porcentaje de dosis inyectada por gramo, (%ID/g). Los datos se reportan como un valor promedio para los tres ratones en el punto de tiempo con barras de error que representan la desviación estándar del grupo.

Los polipéptidos pasaron por estudios de biodistribución en modelos de xenoinjerto de célula SKOV3. Se tomaron cuatro puntos de tiempo en cuatro horas (5, 30, 120 y 240 minutos posteriores a la inyección). Los datos de biodistribución completos están incluidos en la tabla 12 (%ID/g Z02891 (SEQ. ID No. 2) -oxima de fluorobencilo- 8F en Ratones que Contienen el Tumor SKOV3) y la tabla 13 (%ID/g Z00342 (SEQ. ID No. 1), oxima de fluorobencilo- 8F en Ratones que Contienen el Tumor SKOV3). Las figuras 16, 17 y 18 muestran las curvas de tumor, sangre, tumor: sangre y de despeje de estas pruebas.

El polipéptido de oxima fluorobencilo-18F Z02891 (SEQ. ID No. 2) muestra una fuerte captación de tumor en tumores SKOV3 que expresan el objetivo con un valor de 17.47 ± 2.89 (n = 3) de la dosis inyectada por gramo de tejido a los 240 minutos posteriores a la inyección (Pl). Las proporciones de tumor: sangre fueron de aproximadamente 3, 34 y 128 en 30, 120 y 240 minutos posteriores a la inyección, respectivamente.

El polipéptido de oxima de fluorobencilo-18F Z00342 (SEQ. ID. No. 1) muestra fuerte captación en tumores SKOV3 que expresan el objetivo, con un valor de 12.45 ± 2.52 (n = 3) de la dosis inyectada por gramo de tejido a los 240 minutos Pl. Las proporciones de tumor:sangre fueron de aproximadamente 3, 32 y 53 en 30, 120 y 240 minutos después de la inyección, respectivamente.

Los polipéptidos exhiben un despeje monoexponencial de la sangre con vidas medias menores a dos minutos. Este despeje de Z02891 (SEQ. ID. No. 2) es transmitido principalmente por los ríñones, con 0.95 ± 0.07 (n = 3) ID/órgano en 240 minutos Pl. La actividad es segregada principalmente en la orina. La captación de polipéptido en el bazo fue mínima, y se observó una baja captación en el hígado, aproximadamente 1.8% ID/órgano (equivalente en valor en ratones a %ID/g) durante el curso del estudio (cuatro horas después de la inyección) .

Tabla 9. Captación de oxima de fluorobencilo-18F Z02891 (SEQ.

ID. No. 2) (%ID/g) en ratones que contienen tumor SKOV- 3 Tabla 10. Captación de oxima de fluorobencilo-18F Z00342 (SEQ. ID. No. 1) (%ID/g) en ratones que contienen el tumor SKOV-3 General Todas las reacciones se llevaron a cabo ya sea bajo una atmósfera de nitrógeno o en un frasco sellado con presión en la parte superior purgado con nitrógeno. Se utilizó acetonitrilo grado Optima™ como solventes tanto para HPLC como para la reacción .

Ejemplo 12 Se agregó [123l]4-yodobenzaldehído (123l BA) a un frasco de recuperación de alto nivel (2 ml_, National Scientific) que contiene el polipéptido-ON H2 (Z02891 , SEQ. ID. No. 2), (0.35 mg a 0.5 mg). La reacción comienza disolviendo el polipéptido en 25 µ?_ de ddH20, y agregando 8 µ?_ de ácido trifluoroacético seguido de la adición de 123IIBA en metanol. El envase se tapó, se presionó, se colocó en un bloque de calentamiento y se mantuvo a una temperatura 60°C durante 15 minutos; se llevó a cabo la eliminación de una pequeña alícuota (<5 µ?_) para análisis HPLC analítico, para evaluar el estado de la reacción. La mezcla de reacción se diluyó en una mezcla mínima de 1:1 de ddH20:Acetonitrílo que contiene 0.1% de TFA en preparación a la purificación HPLC de semipreparación. Se aisló el 123IB-Polipéptido y se purificó mediante HPLC de semipreparación o cromatografía de exclusión por tamaño NAP5. La fracción HPLC que contiene el producto, se diluyó en forma adicional (5:1) con ddH20 y se inmovilizó en forma subsecuente en un tC18 Plus Sep Pak (Waters). Se enjuagó primero la SepPak con 5 mL de ddH20, posteriormente 30 mL de aire que proporciona el 1 3IB-Polipéptido en una cantidad mínima de etanol, eluyendo primero el volumen nulo (aproximadamente 0.5 ml_) seguido de la recolección de 250 a 300 µ?_ del eluente en un frasco por separado. Se llevó a cabo el análisis RP-HPLC en el producto aislado, para establecer la pureza radioquímica y química.

Ejemplo 13. Preparación de 67Ga-NOTA-Z00477 (SEQ.

ID. No. 3) Se etiquetó el polipéptido Z00477 (SEQ. ID. No. 3) con Ga, específicamente 67Ga, posteriormente se conjugó un quelante NOTA (ácido 1 ,4,7-triazacíclononano-N,N',N"-triacético) para el polipéptido. (figura 19).

La bioconjugación de Mal-NOTA para las moléculas de polipéptido, se logró como se indica a continuación. Se disolvió el polipéptido con amortiguador PBS con gases extraídos recientemente (1x, pH 7.4) en una concentración de aproximadamente 1 mg/mL. La ligadura de disulfuro en el polipéptido se redujo mediante la adición de una solución de DTT en amortiguador PBS con gases extraídos recientemente (1x, pH 7.4). La concentración final de DTT fue de 20 mM. La mezcla de reacción se vortízó durante 2 horas y se pasó a través de una columna giratoria de extracción de sal Zeba (Pierce Technologies) con amortiguador PBS equilibrado previamente con gases extraídos (1x, pH 7.4) para eliminar el exceso del reactivo DTT. La molécula de polipéptido reducida eluida, fue recolectada, y se agregó el compuesto bifuncional mal-NOTA (15 equivalentes por equivalente del polipéptido) como una solución en D SO, y la mezcla se vortizó a temperatura ambiente. La reacción se dejó proceder durante la noche para asegurar la conversión total de las moléculas de polipéptido.

La purificación HPLC se llevó a cabo en una columna MiCHROM Magic C18AQ 5µ 200A (MiChrom Bioresources, Auburn, CA). Solvente A: H20 (con 0.1% de ácido fórmico), Solvente B: CH3CN (con 0.1% de ácido fórmico). Gradiente: 5% a 100% B en 30 minutos, (figura 20A).

Las fracciones que contienen el producto deseado se combinaron y neutralizaron con 100 mM de solución de bicarbonato de amonio, y los solventes se eliminaron mediante liofilización para proporcionar el polipéptido conjugado en la forma de un sólido color blanco.

El análisis LC-MS del producto purificado, confirmó la presencia del producto deseado, y el MW sugirió que se agregó únicamente un quelante NOTA a la construcción de polipéptido (MW calculado: 7504 Da, encontrado: 7506 Da para Z00477 (SEQ. ID. No. 3)-NOTA). (figura 20B).

El radioetiquetado se logró en forma subsecuente como se indica a continuación: 25 µ? de solución HEPES (63 mM) que se agregó inicialmente a un frasco con la parte superior en forma de rosca seguido de 10 µ? de 67GaCI3 (GE Healthcare) en 40.5 MBq de HCI 0.04M. 30 pg (MW = 7506, 4.0 x 109 mol) del NOTA Z00477 (SEQ. ID. No. 3) en 30 µ? de H20 que posteriormente se agregó a la mezcla de reacción para proporcionar una concentración NOTA Z00477 final (SEQ. ID. No. 3) de 61 µ? con un pH de 3.5 a 4.0. El frasco de reacción se selló y la reacción se mantuvo a temperatura ambiente. El análisis HPLC de fase inversa de la mezcla de reacción crudo determinó la pureza radioquímica de 67Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID. No. 3) del 95% mediante HPLC después de 2 horas a temperatura ambiente, (figura 21). Se purificó 67Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID. No. 3) mediante HPLC después de un tiempo de reacción de 1 día. Se inyectó 22 Bq de 67Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID. No. 3) en la HPLC para la purificación. Se obtuvieron 15 MBq del producto etiquetado con 67Ga de la purificación (producción radioquímica = 68%). Los solventes HPLC se eliminaron bajo vacío para proporcionar una solución con un volumen aproximado de 0.5 mL. Posteriormente, se agregaron aproximadamente 1.45 mL de la solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco para obtener una solución final en un pH de 6 a 6.5 con una concentración de radioactividad de 7.7 Bq/mL. Se encontró el 67Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID. No. 3) formulado, purificado como estable durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. (RCP = 96% mediante HPLC) (figura 22).

Las condiciones HPLC analíticas utilizadas son como se indica a continuación: 5 mieras de proteína C4 Grace Vydac, 300Á, columna HPLC 4.6 x 250 mm. Solvente A = 95/5 H20/MeCN en ácido trifluoroacético (TFA) al 0.05%, Solvente B = 95/5 CH3CN/H20 en TFA al 0.05%. Gradiente HPLC (Min/%B): 0/0, 4/20, 16/60, 20/100, 25/100, 26/0.

Las condiciones HPLC de semi-preparación utilizadas son como se indica a continuación: Columna: 5 mieras de proteína C4 Grace Vydac, 300A 4.6 x 250 mm. Solvente A = 95/5 H20/MeCN en ácido trifluoroacético (TFA) al 0.05%, Solvente B = 95/5 CH3CN/H20 en TFA al 0.05%. Gradiente HPLC (Min/%B): 0/0, 4/20, 16/60, 20/100, 25/100, 26/0.

General Se compró HER2 Z28921-Cys recombinante en Affibody AB, Suecia. Se compró el éster succínico de ácido Eei-amino-oxiacético en IRIS Bíotec , y di-ter-butildifluorosilano en Fluorochem. Los reactivos y solventes se compraron en IRIS Biotech, Merck, Romil y Fluka.

Se registraron los espectros LC-MS analíticos en un instrumento Thermo Finnigan MSQ mediante ionización de electro-rocío (ESI) operada en un modo positivo acoplado a un sistema de cromatografía Thermo Finnigan Surveyor PDA utilizando las siguientes condiciones: Solvente A = H2O/0.1% TFA y solvente B = ACN/0.1% TFA, si no se indica de otra manera, rango de flujo: 0.6 mL/min, columna: Phenomenex Luna 3 pm C18 (2) 20 x 2 mm, detección: UV 214/254 nm.

Se llevaron corridas HPLC de fase inversa de semipreparación en un sistema de cromatografía Beckman System Gold utilizando las siguientes condiciones: Solvente A = H2O/0.1% TFA y solvente B = ACN/0.1% TFA, si no se indica de otra manera, rango de flujo: 10 mL/min, columna: Phenomenex Luna 5 pm C18 (2) 250 x 21.2 mm, detección: UV 214 nm.

Se llevaron corridas HPLC de fase inversa de preparación en un sistema Waters Prep 4000 utilizando las siguientes condiciones: Solvente A = H2O/0.1% TFA y solvente B = ACN/0.1% TFA, si no se indica de otra manera, rango de flujo: 50 mL/min, columna: Phenomenex Luna 10 µ C18 (2) 250 x 50 mm, detección: UV 214/254 nm.

Abreviaturas: Ala (A): Alanina Arg (R): Arginina Asn (N): Asparagina Asp (D): Ácido aspártico ACN: Acetonitrilo Boc: ter-Butiloxicarbonilo Cys (C): Cisteína DIPEA: Di-isopropiletilamina DMF: N,N-Dimetilformamida DMAB: 4-dimetilamino-benzaldehído DOTA: Ácido 1 ,4,7,10-tetra-azaciclododecano- 1,4,7,10-tetra-acético EDT: 1 ,2-Etanoditiol EMS: Sulfuro de etil metilo ESI: Ionización de electro-rocío eq: Equivalente FBA: 4-Fluorobenzaldehído Gln (Q): Glutamina Glu (E): Ácido glutámico hr(s): Hora(s) HER2: Receptor de factor de crecimiento Epidérmico Humano HOAt: 1-Hidroxi-7-azabenzotriazol HPLC: Cromatografía líquida de alto desempeño Me (I): Isoleucina LC-MS: Cromatografía líquida - espectroscopia de masa Leu (L): Leucina Lys (K): Lisina Met (M) Metionina min: Minutos µ??: M icrómetro nm: Nanómetro NMP: 1-Metil-2-pirrolidinona NOTA: Ácido 1,4,7-Triazaciclononano-1,4,7- triacético PDA: Formación de fotodiodo PET: Tomografía de emisión de positrones Phe (F) Fenilalanina Pro (P): Prolina PyAOP: Hexafluorofosfato de (7-Azabenzotriazol-1- ilox¡)tr¡pirrol¡d¡nofosfon¡o Ser (S): Serina SiFA: 4-(D¡-ter-butilfluorosilil)benzaldehído TFA: Ácido trifluoroacético Thr (T): Treonina TIS: Tri-isopropilsilano Trp (W): Triptofan Tyr (Y) : Tirosina Val (V): Valina Ejemplo 14. Radiosíntesis semi-automática del Compuesto 2 f°F]-FBA Se utilizó una plataforma FASTIabTM (GE Healthcare) para preparar [18F]Fluorobenzaldehído ( " [ 18 F ] F B A " ) que normalmente produce 7 GBq de [18F]FBA en etanol (1.5 mL, rendimientos corregidos sin deterioro 12% a 54%). Posteriormente, se conjugó en forma manual una pequeña fracción (92 µ?_) de esta solución [18F]FBA, conjugada para el precursor de aminoxi 3 (0.4 mg, 55 nmol) en la presencia de clorhidrato de anilina (3.2 mg, 25 pmol) en agua (138 µ?_) en un frasco P6 silanizado. La mezcla se calentó a una temperatura de 70°C durante 20 minutos utilizando un calentador Peltier. Se aisló 2 con cromatografía de exclusión por tamaño (cartucho NAP5, GE Healthcare). Se desechó una elución inicial con 0.25 mL de solución salina/0.1% de ascorbato de sodio. Se recolectó una elución subsecuente de 0.75 mL de solución salina/0.1% de ascorbato de sodio que contiene 2, y se formuló con la misma mezcla de elución en un pH de 5 a 5.5 para proporcionar la concentración radioactiva deseada. Los rendimientos corregidos sin deterioro del 2 aislado del paso de conjugación fueron del 17% al 38%, y los valores de pureza radioquímica (RCP) para el 2 preparado manualmente fueron de = 95%. (Sistema TLC: Perkin Elmer Instant Imager utilizando laminas de fase inversa C18 con agua/30% de acetonitrilo (v/v) como la fase móvil. El péptido etiquetado permaneció en el origen). El producto se analizó en forma adicional mediante HPLC utilizando una bomba Gilson 322 con un detector Gilson UV/ViS 156, un detector de radioactividad Bioscan Flow-Count, y una columna Luna C18 Phenomenex (50 x 4.6 mm, 3 pm) o una columna Luna C18 Phenomenex (150 x 4.6 mm, 5 µ?t?). La fase móvil comprendió los solventes A (0.1 M de acetato de amonio) y B (acetonitrilo) que corren en 1 mL/min con un gradiente lineal (5% a 95% B en 15 mín). Se midió la absorbancia UV en 280 nm y 350 nm. La figura 23 muestra un ejemplo representativo de un trazo HPLC analítico de la formulación de 2.

Ejemplo 14a. Preparación del Compuesto 3 (i) Preparación de Eei-amino-oxiacetil-maleimida Se disolvieron sal TFA de N-(2-Aminoetil)maleimida (51 mg, 0.20 mmol) y Eei-AOAc-OSu (77 mg, 0.30 mmol) en NMP (2 ml_). Se agregó Sym.-colidina (80 µ?_, 0.6 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 70 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con agua (7 ml_) y el producto, eei-amino-oxiacetil-maleimida, se purificó mediante HPLC de semipreparación. La purificación utilizando HPLC de semipreparación (gradiente: 15% a 30% B en 40 minutos, en donde A = agua/0.1% de ácido acético y B = ACN) produjo 43 mg (75%) de Eei-amino-oxiacetil-maleimida puro. El material purificado, eei-amino-oxiacetil-maleimida, se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 10% a 40% B en 5): rR: 1.93 min, encontrado m/z: 284.1, esperado MH + : 284.1 (ii) Preparación del Compuesto 3 Se disolvieron Z02891-Cys recombinante (144 mg, 0.205 mmol) (comprado en Affibody AB, Suecia) y eei-amino-oxiacetil-maleimida (17 mg, 0.60 mmol) en agua (3 mL). La solución se ajustó a un pH 6 mediante la adición de acetato de amonio, y la mezcla de reacción se agitó durante 90 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con agua (7 mL) y el producto se purificó mediante HPLC de semipreparación para producir 126 mg del producto protegido-Eei liofilizado. El producto protegido con eei se trató con 2.5% de TFA/agua (16 mL) bajo un manto de argón durante 20 minutos. La solución se diluyó con agua (144 mL), se congeló utilizando un baño de isopropanol/hielo seco bajo un manto de argón y se liofilizó para producir 149 mg (100%) de Z02891 -Cys-maleimida-amino-oxiacetilo (3). Se analizó Z02891-Cys-maleimida-amino-oxiacetilo liofilizado (3) mediante LC-MS analítico (gradiente: 10% a 40% B durante 5 min, íR: 3.28 min, encontrado m/z: 1811.8, esperado MH4 + : 1811.4.

Ejemplo 15. Radiosíntesis automática del Compuesto 2 utilizando purificación tC2 SepPak Se ensambló un cartucho FASTIabTM que contiene un primer frasco (8.25 mg/21.9 pmol de Kryptofix, 1.16 mg/8.4 µ?t??? de K2C03, 165 pL de agua, 660 pL de acetonitrilo), un segundo frasco (1.5 mg/4.8 pmol de triflato 1, 1.5 mL de DMSO anhidro), un tercer frasco (5.5 mg/0.76 pmol de 3, 8.2 mg/63 pmol de clorhidrato de anilina, 0.7 mL de amortiguador de acetato de amonio, pH 4.5/0.25 M), un cuarto frasco (4 mL, de amonia acuosa al 4% p/v), frascos externos de etanol (25 mL) y ácido fosfórico (1% p/p, 25 mL), un cartucho SepPak QMA ligero acondicionado ligeramente, un cartucho OASIS MCX SepPak, y dos cartuchos lC2 SepPak. El frasco del producto contenía una solución acuosa de ácido p-aminobenzo¡co (0.08% p/p, 19 mL). La distribución del cartucho se muestra en la figura 24.

Se cargó la secuencia del programa requerida del control PC en el módulo de sintetización, y el cartucho ensamblado se montó en la máquina. Se adhirió una bolsa de agua y un frasco de producto. Se adhirió un frasco que contiene [18F]agua (300 MBq, 1 mL) al módulo FASTIab™, y comenzó la radiosíntesis. El proceso incluyó un paso de secado azeotrópico del complejo de [18F]-Kryptofix/carbonato de potasio tal como se eluyó a partir del cartucho QMA, la radiosíntesis de [18F]FBA, la purificación de [ 8F]FBA utilizando el cartucho MCX, la solución de amonia y la elución con etanol, el paso de conjugación para producir 2, y la purificación y el paso de formulación utilizando ácido fosfórico/etanol en los cartuchos lC2. El proceso total tomó una hora y generó 2 en un rendimiento radioquímico corregido sin reducción del 33% con 94% de pureza radioquímica.

Ejemplo 16. Radiosíntesis automática del Compuesto 2 utilizando purificación Sephadex Se ensambló un cartucho FASTIab™ que contiene un primer frasco (8.25 mg/21.9 prnol de Kryptofix, 1.16 mg/8.4 µ?t??? de K2C03, 165 µ?_ de agua, 660 µ?_ de acetonitrilo), un segundo frasco (1.5 mg/4.8 pmol de triflato 1, 1.5 mL de DMSO anhidro), un tercer frasco (5.0 mg/0.69 µ???? de 3, 8.2 mg/63 µ???? de clorhidrato de anilina, 0.7 mL amortiguador de acetato de amonio pH 4.5/0.25 M), un cuarto frasco (4 mL de amonia acuosa al 4% p/v), frascos externos de etanol (25 mL) y solución salina (Polyfusor, 0.9% p/v, 25 mL), un cartucho SepPak ligero QMA acondicionado previamente, un cartucho OASIS MCX SepPak, y un cartucho de exclusión por tamaño empacado en forma acostumbrada (2 ml_, Supelco, Catálogo #57608-U) que contiene Sephadex G10 seco (500 mg, Sigma-Aldrich, Catálogo #G10120). La distribución del cartucho se muestra en la figura 26. Se llevó a cabo la radiosíntesis de 2 tal como se describe en el Ejemplo 15. Después de imprimar el cartucho Sephadex con solución salina (5 ml_), la mezcla de reacción cruda se bombeó a través de un cartucho Sephadex y 2 puro se recolectó en el frasco del producto. El tiempo de síntesis fue de 40 minutos y el rendimiento radioquímico corregido sin reducción fue del 10%. La pureza radioquímica del producto fue del 95% y el nivel de DMAB fue de 0.8 pg/mL. La figura 27 muestra el análisis HPLC del producto final.

Ejemplo 17. Radiosíntesis de G18F1 AIF-NOTA(COOH)2-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (5) 5 Una solución de NOTA(COOH)2-Z02891 (4) (746 pg, 100 nmol) en amortiguador de acetato de sodio (50 pL, pH 4.0, 0.5 M), se mezcló con una solución de AICI3 (3 pL, 3.33 pg, 25 nmol en amortiguador de acetato de sodio, pH 4.0, 0.5 M) en un frasco de centrifugación de polipropileno cónico (1.5 mL). Esta mezcla se agregó a un pequeño volumen de [18F]fluoruro (50 µ?_) en un frasco P6 tapado con sello. Este frasco se calentó durante 15 minutos a una temperatura de 100°C. Después de la dilución con solución salina (100 µ?_), la solución de reacción se transfirió a un cartucho de exclusión por tamaño NAP5 (GE Healthcare). El producto final se eluyó en un frasco P6 utilizando solución salina (750 µ?_). Se obtuvo el péptido etiquetado 5 con 11% de rendimiento radioquímico corregido sin reducción. La figura 28 muestra la HPLC analítica del producto formulado. La Tabla 11 resume los datos de las corridas individuales.

Tabla 11. Síntesis de preparaciones [18F]AIF-NOTA(COOH)2-Z02891(SEQ. ID. No. 2) (5) utilizando purificación NAP5.

Final de la Síntesis del rendimiento radioquímico, corregido sin deterioro Ejemplo 17a. Preparación del Compuesto 4 (i) Preparación de NOTA(bis-tBu) (a) Síntesis de diamina de Tetratosil-N,N'-bis(2- Se agitó a una temperatura de 0°C, N,N'-bis(2-hidroxietil)-etilenodiamina (Aldrich, 14.8 g, 100 mmol) y piridina (Fluka, 200 mL) bajo nitrógeno, mientras que se goteó en la solución durante un período de 75 minutos, una solución de cloruro de tolueno-4-sulfonilo (Fluka, 77 g, 400 mmol) disuelta en piridina (Fluka, 100 mL). La temperatura se elevó lentamente a temperatura ambiente y continuó en agitación durante 4 horas. La solución se vertió en una mezcla de hielo (250 mL) y ácido hidroclórico (concentrado, 250 mL) mientras se agitó para producir un aceite pegajoso oscuro. Los solventes se eliminaron mediante decantado, el producto crudo se lavó con agua, se decantó y se volvió a disolver en metanol (250 mL). La pasta resultante se aisló mediante filtración y el producto crudo se volvió a disolver en metanol caliente (60°C, 600 mL) y se enfrió. El producto sólido se filtró y se secó in vacuo. Rendimiento 36.36 g (47.5%). El producto fue purificado mediante RMN. (b) Síntesis de 1 -Bencil-4-7-ditosil-1 ,4.7-triazonano calentó a una temperatura de 100°C, diamina tetratosil-N,N'-bis(2-hidroxietil)et¡leno (Ver Ejemplo I7a(i)(a); 2.0 g, 2.6 mmol), bencilamina (500 µ?, 4.6 mmol), carbonato de potasio (Fluka, 792 mg, 5.7 mmol) y acetonitrilo (Merck, 25 mL) y se agitó durante la noche. Los solventes se eliminaron del producto sólido mediante filtración. El sólido se lavó con acetonitrilo (2 x 10 mL) y los solventes se evaporaron. Los sólidos se disolvieron en etanol caliente (15 mL) y se dejaron durante tres días a temperatura ambiente. Se recolectaron los cristales mediante filtración y se secaron durante la noche in vacuo. El producto se confirmó mediante LC-MS (Phenomenex Luna C18(2) 2.0 x 50 mm, 3 µ??, solventes: A = agua/0.1% de ácido trifluoroacético y B = acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10% a 80% B durante 5 min; rango de flujo: 0.6 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm, ESI- MS) íR = 3.66 min. Rendimiento: 1 g (72%). (c) Síntesis de éster terbutílico de ácido (4-Bencil-7-ter-butoxicarbonilmetil-H .4.71triazonan-1-il)acético Se agregó ácido sulfúrico (Sigma, concentrado, 25 ml_) a 1 -Bencil-4-7-ditosil-1 ,4,7-triazonano (Ver Ejemplo 17a(i)(b); 2.5 g, 4.7 mmol) mientras se agitó y calentó a una temperatura de 100°C y se dejó durante 20 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se agregó en forma de gotas en éter dietílico (VWR, 500 ml_). El producto (precipitado color blanco) se filtró y se lavó con acetonitrilo, cloroformo y diclorometano. Los solventes se eliminaron in vacuo. El producto crudo (986.3 mg, 4.5 mmol) se mezcló con trietilamina (Fluka, 1.4 mL, 10 mmol) en acetonitrilo (50 mL). Se disolvió bromoacetato de terbutilo (Fluka, 1.47 mL, 10 mmol) en acetonitrilo (25 mL) y se agregó en forma de gotas. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El pH se controló y se agregó si era necesario, trietilamina . Los solventes se eliminaron in vacuo y el material crudo se disolvió en diclorometano (150 ml_) y se lavó con agua (2 x 25 ml_), ácido idroclórico 0.1 M (1 x 25 mL) y agua (1 x 25 ml_). La fase orgánica se filtró y el solvente se evaporó. El material crudo se disolvió en acetonitrilo/agua (1:1) y purificó mediante HPLC de preparación (Phenomenex Luna C18 (2) 5 pm 250 x 21.2 mm, solventes: A = agua/0.1% de ácido trifluoroacético y B = acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10% a 80% B durante 60 min) y se liofilizó. LC- S (Phenomenex Luna C18(2) 2.0 x 50 mm, 3 pm, solventes: A = agua/0.1% de ácido trifluoroacético y B = acetonitrilo/0. % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10% a 80% B durante 5 min; rango de flujo: 0.6 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm, ESI-MS) fR = 3.99 min, (MI) 447.4. El producto se verificó mediante RMN.

El producto se mezcló con Pd/C (10%, 235 mg) y metanol (25 mL) y se agitó bajo argón. Posteriormente se eliminó el argón in vacuo y se inició el suministro de gas de hidrógeno. La mezcla de reacción se dejó durante tres horas con agitación y con suministro continuo de gas de hidrógeno. El catalizador se eliminó mediante centrifugación y los solventes se evaporaron. El producto crudo se purificó con HPLC de preparación (Phenomenex Luna C18 (2) 5 pm 250 x 21.2 mm, solventes: A = agua/0.1% de ácido trifluoroacético y B = acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 2% a 80% B durante 60 min). LC-MS (Phenomenex Luna C18(2) 2.0 x 50 mm, 3 µ??, solventes: A = agua/0.1% de ácido trifluoroacético y B = acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10% a 80% B durante 5 min; rango de flujo: 0.6 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm, ESI-MS) íR = 2.55 min, (MI) 357.9. Rendimiento: 150 mg. El producto se confirmó mediante RMN. (d) Síntesis de Ácido (4.7-Bis-ter-butoxicarbonilmetil-G1.4.7Ur¡azonan-1-¡n-acético rNOTAfbis-tBuH Se disolvieron éster terbutílico de ácido (4-ter-Butoxicarbonilmetil-[1,4,7]triazonano-1-il)-acético (Ver Ejemplo 17a(i)(d); 280 pmol, 100 mg) y ácido bromoacético (Fluka, 1 mmol, 138.21 mg) en metanol (1 mL). Se disolvió carbonato de potasio en agua (1 mL) y se agregó con agitación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en agua (2.5 mL), y se ajustó el pH a 4 con ácido clorhídrico (1 M). El producto crudo se purificó mediante HPLC de preparación (Phenomenex Luna C18 (2) 5 µ?? 250 x 21.2 mm, solventes: A = agua/0.1% de ácido trifluoroacético y B = acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10% a 80% B durante 60 min). LC-MS (Phenomenex Luna C18(2) 2.0 x 50 mm, 3 µ??, solventes: A = agua/0.1% de ácido trifluoroacético y B = acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10% a 80% B durante 5 min; rango de flujo: 0.6 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm, ESI-MS) tR = 2.40 min. Rendimiento 117.7 mg. El producto se confirmó mediante RMN.

Se purificó NOTA(bis-tBu) mediante HPLC de preparación (gradiente: 20% a 40% B durante 40 min) para producir 72 mg de NOTA(bis-tBu) puro. El material purificado se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 10% a 40% B durante 5): fR: 3.75 min, encontrado m/z: 416.2, esperado MH + : 416.3. (ii) Preparación de NOTA(bis-tBu)-maleimida Se disolvieron sal de ácido trifluoroacético de N-(2-Aminoetil)maleimida (23 mg, 0.090 mmol), NOTA(bis-tBu) (30 mg, 0.072 mmol) y PyAOP (51 mg, 0.10 mmol) en N,N-dimetilformamida (DMF) (2 mL). Se agregó Sym.-colidina (29 µ?, 0.40 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora.

La mezcla se diluyó con agua/0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) (6 mL) y el producto se purificó mediante HPLC de semi-preparación. La purificación utilizando HPLC de semi-preparación (gradiente: 20% a 50% B durante 60 min) produjo 33 mg (87%) de NOTA(bis-tBu)-maleimida puro. El material purificado se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 10% a 40% B durante 5, fR: 4.09 min, encontrado m/z: 538.2, esperado MH + : 538.3. (iii) Preparación de NOTA(bis-ácido)-maleimida Se trató NOTA(bis-tBu)-maleimida (33 mg, 61 pmol) con una solución de 2.5% de tri-isopropilsilano (TIS) y 2.5% de agua en TFA (10 mL) durante 4 horas 30 minutos. Se evaporó TFA in vacuo, el residuo se disolvió en agua/0.1% de TFA (8 mL) y el producto se purificó mediante HPLC de semi-preparación. La purificación utilizando HPLC de semi-preparación (gradiente: 0% a 20% B durante 40 min) produjo 15 mg (58%) de NOTA(bis-ácido)-maleimida puro. El material purificado se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 0% a 30% B durante 5): fR: 1.34 min, encontrado m/z 426.0, esperado MH + : 426.2. (iv) Preparación de 4 Se disolvieron en agua (1.5 ml_), Z02891-Cys recombinante (40 mg, 5.7 pmol) (comprado en Affibody AB, Suecia) y NOTA(bis-ácido)-maleimida (6.1 mg, 14 pmol). La solución se ajustó a un pH de 6 agregando acetato de amonio, y la mezcla se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó con agua/0.1% de TFA (6 mL) y el producto se purificó mediante HPLC de semi-preparación . La purificación utilizando HPLC de semi-preparación (gradiente: 20% a 30% B durante 40 min) produjo 38 mg (90%) del compuesto 4 puro. El 4 purificado, se analizó mediante LC-MS analítico (gradiente: 10% a 40% B durante 5 min): fR: 3.31 min, encontrado m/z: 1864.5, esperado MH44 + : 1864.5.

Ejemplo 18 Estudio de curso de tiempo para la radiosíntesis de r18F1AIF-NOTA(COOH>,- Z0289K (SEQ. ID. No. 2) (5a) Se purificó Fluoro-18 utilizando un cartucho QMA y se eluyó con solución salina tal como lo describe W. J. McBride y asociados. (Bioconj. Chem. 2010, 21, 1331). Se mezcló una solución de 18F-agua (25 µ?, 12 MBq) con AICI3 (1.667 pg, 12.5 nmol) en amortiguador de acetato de sodio (1.5 pL, pH 4.0, 0.5 M) y el compuesto 6 (380 pg, 50 nmol): se disolvió en amortiguador de acetato de sodio (25 µ?_, pH 4.0, 0.5 M). La mezcla se calentó a una temperatura de 100°C y las alícuotas se analizaron mediante HPLC. Los datos analíticos se proporcionan en la figura 29.

Ejemplo 18a. Preparación del Compuesto 6 (i) Preparación de NOTA(tris-tBu) (a) Síntesis de éster 5-bencílico de ácido a- bromoglutárico A una solución de éster 5-bencílico de ácido L-glutámico (Fluka, 3.0 g, 0.013 mol) y bromuro de sodio (Fisher, 4.6 g, 0.044 mol) en ácido bromhídrico acuoso (Fluka, 1 M, 22.5 ml_), enfriada a una temperatura de 0°C, se le agregó nitrito de sodio en porciones (Fluka, 1.6 g, 0.023 mol). Después de la agitación durante 2 horas a una temperatura de 0°C, se agregó ácido sulfúrico concentrado (Merck, 1.2 ml_) seguido de éter dietílico (Eternell). La fase de agua se extractó tres veces con éter dietílico. Las fases orgánicas combinadas se lavaron cuatro veces con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron bajo presión reducida. El producto crudo se purificó utilizando cromatografía de fase normal (Columna de sílice (40 g), solventes: A = hexano, B = acetato de etilo, gradiente: 10% a 35% B durante 20 min, rango de flujo: 40 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm) para producir 1.81 g del producto puro. Rendimiento 46%. La estructura se verificó mediante RMN. (b) Síntesis de éster 1 -ter-butílico de éster 5-bencílico de ácido a-bromoglutárico (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000 10, páginas 2133 a 2135) A una solución de éster 5-bencílico de ácido a- bromoglutárico (Ver Ejemplo 18a(i)(a); 1.2 g, 4.0 mmol) en cloroformo (Merck, 5 ml_), se le agregó en forma de gotas durante 5 minutos una solución de 2,2,2-tricloroacetimidato de terbutilo (Fluka, 1.57 ml_, 8.52 mmol) en ciclohexano (Merck, 5 ml_). Se agregó ?,?-Dimetilacetamida (Fluka, 0.88 ml_) seguido de eterato de etilo de trifluoruro de boro (Aldrich, 80 µ?) en la forma de catalizador. La mezcla de reacción se agitó durante 5 días a temperatura ambiente. Se agregó hexano y la fase orgánica se lavó con salmuera tres veces, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó bajo presión reducida. El producto crudo se purificó utilizando cromatografía de fase normal (Columna de sílice (40 g), solventes: A = hexano, B = acetato de etilo: gradiente: 10% a 35% B durante 15 min, rango de flujo: 40 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm) para producir 1.13 g (79%) del producto puro. La estructura se verificó mediante RMN (c) Síntesis de éster 1 -ter-butílico de éster 5-bencílico de ácido 2-? ,4,7ltriazonan-1 -il-pentanodioico Se agregó una solución de éster 1 -ter-butílico de éster 5-bencílico de ácido a-bromoglutárico (Ver Ejemplo 18a(i)(a); 513 mg, 1.44 mmol) en cloroformo (Merck, 20 mL) durante un período de 3 horas a una solución de 1,4,7 triazaciclononano (Fluka, 557 mg, 4.31 mmol) en cloroformo (Merck, 20 ml_). La mezcla se agitó durante 3 días a temperatura ambiente y se concentró in vacuo hasta obtener un aceite color amarillo claro. El producto crudo se purificó utilizando cromatografía de fase normal (Columna de sílice (40 g), solventes: A = etanol:amonia (ac) 95:5, B = cloroformo:etanol:amonia (ac) 385:175:20, gradiente: 0% B durante 6 min, 100% B durante 12 min, rango de flujo: 40 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm) para producir un producto semi-puro (289 mg). Rendimiento 49%. Producto confirmado mediante LC-MS (columna Phenomenex Luna C18(2) 2.0 x 50 mm, 3 pm, solventes: A = agua/0.1% de ácido trifluoroacético y B = acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10% a 50% B durante 5 min; rango de flujo: 0.6 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm, ESI-MS) tR = 2.5 min, m/z (MH + ), 406.3. (d) Síntesis de éster 1 -ter-butí lico de éster 5-bencílico de ácido 2-(4.7-bis-ter-butoxicarbonilmetil-ri .4,71triazonan-1-il-pentanodioico Se enfrió a cero grados éster 1 -ter-butílico de éster 5-bencílico de ácido 2-[1 ,4,7]Triazonan-1 -il-pentanodioico (Ver Ejemplo 18a(i)(b); 600 mg, 1.48 mmol) en acetonitrilo seco (40 ml_) antes de que se agregara en forma de gotas durante un período de 15 minutos bromoacetato de terbutilo (Fluka, 548 mg, 414 µ?_, 2.81 mmol) en acetonitrilo seco (10 ml_). La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos adicionales antes de que se agregara carbonato de potasio seco (Fluka, 1.13 g, 814 mmol) y la mezcla de reacción se templó lentamente a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla se filtró sobre Celita y se evaporó hasta secarse para producir el producto crudo. El producto se confirmó mediante LC-MS (columna Phenomenex Luna C18(2) 2.0 x 50 mm, 3 µ?t?, solventes: A = agua/0.1% de ácido trif luoroacético y B = acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético; gradiente: 10% a 80% B durante 5 min; rango de flujo: 0.6 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm, ESI-MS) íR = 3.9 min, m/z (MhT), 634.4. (e) Síntesis de éster 1 -ter-butílico de ácido 2-(4.7-bis-te r-butoxicarbonilmetil-M, 4, 71 triazonan-1 - il-pentanodioico rNOTA(tris-tBun Se disolvió éster 1 -ter-butílico de éster 5-bencílico de ácido 2-(4,7-Bis-ter-butoxicarbonilmetil-[1,4,7]triazonan-1-il-pentanodioico (Ver Ejemplo 18a(i)(c); 938 mg, 1.48 mmol) en 2-propanol (Arcus, 115 mL) y se agregó 10% de Pd/C (Koch-Light, 315 mg) suspendido en agua (3 mL). La mezcla se trató con hidrógeno (4 atm) durante 3 horas, se filtró sobre Celita y se evaporó hasta secarse. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice (Columna de sílice (4 g), solventes: 2-propanol:amonia 95:5, rango de flujo: 40 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm) para producir un producto semipuro (225 mg). El producto se confirmó mediante LCMS (Phenomenex Luna C18 (2), 2.0 x 50 mm, 3 pm; solventes: A = agua/0.1% de ácido trifluoroacético y B = acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético, gradiente: 10% a 80% B durante 5 min, rango de flujo: 0.6 mL/min, detección UV en 214 nm y 254 nm, ESI-MS) tR: 2.4 min, MH+ 544.5.

Se caracterizó NOTA(tris-tBu) purificado mediante LC-MS (gradiente: 10% a 80% B durante 5): tR: 2.4 min, encontrado m/z: 544.5, esperado MH + : 544.4. (ii) Preparación de NOTA(tris-tBu)-NH-CH2CH2-NH2 Se agregó PyAOP (96 mg, 0.18 mmol) disuelto en NMP (1 mL) a una solución de NOTA(tris-tBu) (100 mg, 0.18 mmol) y etilenodiamina (1.2 mL, 18 mmol) en NMP (1 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora y posteriormente se agregó una segunda alícuota de PyAOP (38 mg, 0.073 mmol). Se continuó con la agitación durante 30 minutos. Se agregó 20% de ACN/agua (5 mL) y el producto se purificó mediante HPLC de semi-preparación. La purificación utilizando HPLC de semi-preparación (gradiente: 20% a 50% B durante 40 min) produjo 123 mg (98%) de NOTA(tris-tBu)-NH-CH2CH2-NH2 puro. El material purificado se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 20% a 50% B durante 5): fR: 1.95 min, encontrado m/z: 586.4, esperado MH + : 586.4. (iii) NOTA(tris-tBu)-NH-CH2CH2-NH-maleimida Se disolvieron NOTA(tris-tBu)-NH-CH2CH2-NH2 (123 mg, 0.176 mmol), éster NHS de ácido 3-maleimido-propiónico (70 mg, 0.26 mmol) y sym.-colidina (346 µ?, 2.60 mmol) en NMP (2 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 6 horas. Se agregó agua (6 mL) y el producto se purificó mediante HPLC de semi- preparación. La purificación utilizando HPLC de semi-preparación (gradiente: 20% a 50% B durante 40 min) produjo 115 mg (87%) de NOTA(tris-tBu)-NH-CH2CH2-NH-maleimida pura. El material purificado se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 10% a 60% B durante 5): íR: 3.36 min, encontrado m/z: 737.4, esperado MH + : 737.4. (iv) Preparación de NOTA(tr¡s-ácido)-NH-CH?CH?-NH-ma le i mida Se trató NOTA(tris-tBu)-NH-CH2CH2-NH-maleimida (115 mg, 0.150 mmol) con una solución de 2.5% de TIS y 2.5% de agua en TFA (10 ml_) durante 4 horas. Los solventes se evaporaron in vacuo, el residuo se volvió a disolver en agua (8 mL) y el producto se purificó mediante HPLC de semi-preparación. La purificación utilizando HPLC de semi-preparación (gradiente: 0% a 20% B durante 40 min) produjo 80 mg (90%) de NOTA(tris-ácido)-NH-CH2CH2-NH-maleimida pura. El material purificado se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 0% a 30% B durante 5): tR: 2.1 min, encontrado m/z: 569.5, esperado MH + : 569.2. (v) Preparación del Compuesto 6 (a) Preparación del Z02891-Cys sintético Secuencia: Se ensambló EAKYAKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSE AKKLNDSQAPKVDC en un sintetizador de péptido de microondas CEM Liberty utilizando química Fmoc comenzando con 0.05 mmol de resina de Amida NovaPEG Rink. Se aplicaron 0.5 mmol de aminoácido en cada paso de acoplamiento (5 minutos a una temperatura de 75°C) utilizando 0.45 mmol de HBTU/0.45 mmol de HOAt/1.0 mmol de DIPEA para activación in situ. Se eliminó Fmoc mediante 5% de piperazina en DMF. Se aplicó acoplamiento doble de ambos Arg. Se incorporaron en la secuencia dipéptidos de pseudoprolina de Asp-Ser y Leu-Ser (0.5 mmol).

La eliminación simultánea de los grupos de protección de cadena lateral y la corte del péptido de la resina se llevó a cabo en TFA (40 mL) que contiene 2.5% de TIS, 2.5% de EDT, 2.5% de EMS y 2.5% de agua durante 1 hora. La resina se eliminó mediante filtración, se lavó con TFA y los filtrados combinados fueron evaporados ¡n vacuo. Se agregó al residuo éter dietílico, el precipitado formado se lavó con éter dietílico y se secó. Se repitió una vez más el procedimiento de corte. Los precipitados secos se disolvieron en 20% de ACN/agua y se dejaron durante la noche con el objeto de eliminar los grupos de protección Trp restantes. La solución se liofilizó para producir 148 mg (42%) de Z02891-Cys crudo. Se purificaron 148 mg de Z02891-Cys crudo mediante HPLC de semi-preparación (4 corridas, gradiente: 25% a 30% B durante 40 min) para producir 33 mg (9%) de Z02891-Cys puro. El material purificado se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 10% a 40% B durante 5): fR: 3.40 min, encontrado m/z: 1758.3, esperado MH4 +: 1758.4.

Se disolvieron en agua (1 mL) Z02891-Cys sintético (13.7 mg, 1.95 pmol) y NOTA(tris-ácido)-N H-C H2C H2-NH-maleimida (11 mg, 19.3 µ????). La solución se ajustó a un pH de 6, agregando acetato de amonio y la mezcla se agitó durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua/0.1% de TFA (6.5 mL) y el producto se purificó utilizando HPLC de semi-preparación. La purificación se llevó a cabo utilizando HPLC de semi-preparación (gradiente: 15% a 35% B durante 40 min) para producir 8.4 mg (57%) de 6 puro. El compuesto 6 se analizó mediante LC-MS analítico (gradiente: 10% a 40% B durante 5 min): rR: 3.31 min, encontrado m/z: 1900.7, esperado MH44 + : 1900.2.

Ejemplo 19. Impacto de los rendimientos radioquímicos de la proporción AIC 13/péptido de G18F1AIF-NOTA(COOH)?-Z02891 SEQ. ID. No. 2) (5) Se mezclaron tres soluciones de 4 (149 pg, 20 nmol) en amortiguador de acetato de sodio (10 pL, pH 4.0, 0.5 M) con soluciones de AIC l3 (0.33 pg, 2.49 nmol; 0.66 pg, 4.98 nmol; y 1.33 pg, 9.96 nmol, respectivamente) en amortiguador de acetato de sodio (1 pL, pH 4.0, 0.5 M) en frascos de centrifugación de polipropileno cónico (1.5 ml_). A estos frascos se les agregó un pequeño volumen de [18F]fluoruro (10 µ?_). Los frascos se calentaron durante 15 minutos a una temperatura de 100°C y posteriormente se analizaron mediante HPLC. Los rendimientos de la incorporación se proporcionan en la Tabla 12.

Tabla 12. Impacto de la proporción AIC l3/péptido en RCY analítico de [18F]AIF-NOTA(COOH)2-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (5).

Ejemplo 20. Impacto de la dilución del reactivo en los rendimientos radioquímicos de G 8F1 AIF-NOT A(COOH)2-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (5) Se mezcló una solución de 4 (373 pg, 50 nmol) en amortiguador de acetato de sodio (25 pL, pH 4.0, 0.5 ) con una solución de A I C 13 (1.66 µg, 12.5 nmol) en amortiguador de acetato de sodio (1.5 pL, pH 4.0, 0.5 M) en un frasco de centrifugación de polipropileno cónico (1.5 mL). Se agregó un pequeño volumen de [18F]fluoruro (10 pL, 80 MBq). Se prepararon dos diluciones en serie de esta mezcla (50% y 25% v/v) con amortiguador de acetato de sodio (1.5 pL, pH 4.0, 0.5 M). Posteriormente, se calentaron los tres frascos a una temperatura de 100°C durante 15 minutos y subsecuentemente se analizaron mediante HPLC. Los datos se mostraron en la Tabla 13.

Tabla 13. Impacto de la concentración del reactivo en RCY analítico de [18F]AIF-NOTA(COOH)2-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (5). La proporción de reactivos se mantuvo constante.

Ejemplo 21. Impacto de la concentración de péptido/AICh en rendimientos radioauímicos de f18F1 AIF-NOTAf COOH),-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (5) Se calentaron tres frascos que contienen [ 8F]fluoruro (25 pL, 23 a 25 MBq), AICI3 (¼ eq. de péptido 4 en 1.5 pL de amortiguador de acetato de sodio, pH 4.0, 0.5 M), y 4 (50, 100, 150 nmol) en amortiguador de acetato de sodio (25 pL, pH 4.0, 0.5 M) a una temperatura de 100°C durante 30 minutos. La figura 30 muestra los datos de incorporación después de 15 y 30 minutos.

Ejemplo 22. Impacto de calentamiento con microondas en los rendimientos radioauímicos de r18F1AIF-NOTA(COOH)?-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (5) Se calentó un frasco Wheaton (3 mL) que contiene [18F]fluoruro (25 pL, 29 MBq), AICI3 (1.66 pg, 12.5 nmol) en 1.5 pL de amortiguador de acetato de sodio, pH 4.0, 0.5 M), y 4 (373 pg, 50 nmol) en amortiguador de acetato de sodio (25 µ?_, pH 4.0, 0.5 M) utilizando un dispositivo de microondas (Resonance Instruments Modelo 521, temperatura de ajuste 80°C, 50 W) durante 5, 10, y 15 segundos. La Tabla 14 proporciona un resumen de los análisis HPLC después de estos puntos de tiempo.

Tabla 14. RCY analítico de la preparación de [18F]AIF-NOTA(COOH)2-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (5) utilizando calentamiento con microondas.

Ejemplo 23. Preparación de f18F1 AIF-NOTA(COOHh-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (5a) Se calentó un frasco de centrifugación PP (1.5 mL) que contiene [18F]fluoruro (25 pL, 29 MBq), AICI3 (1.66 pg, 12.5 nmol) en 1.5 pL de amortiguador de acetato de sodio, pH 4.0, 0.5 M), y 6 (380 pg, 50 nmol) en amortiguador de acetato de sodio (25 pL, pH 4.0, 0.5 M) a una temperatura de 100°C durante 15 minutos. El RCY analítico de 5a fue del 15% al 20%.

La figura 31 muestra el perfil de HPLC de la mezcla de reacción.

Ejemplo 24. Preparación de [18F]S¡FA-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) Una solución del precursor del péptido 8 (750 pg, 100 nmol) en amortiguador de acetato de sodio (50 µ?, pH 4.0, 0.5 ) se agregó a una solución de [18F]fluoruro en agua (50 pL) en un frasco de centrifugación de polipropileno (1.5 mL) y se calentó durante 15 minutos a una temperatura de 95°C. Después de agregar solución salina (100 \JL, 0.9% p/v), la mezcla se purificó utilizando una columna NAP5 acondicionada con solución salina (GE Healthcare). El producto 7 se obtuvo con el 18% de rendimiento radioquímico corregido sin deterioro y el 87% de pureza radioquímica después de 26 minutos. La figura 32 muestra el análisis HPLC del producto final.

Ejemplo 24a. Preparación del Compuesto 8 (i) Síntesis de SiFa Se agregó en forma de gotas n-Butil-litio en hexano (2.5 M, 3.2 ml_, 7.9 mmol) bajo argón a una solución enfriada (-78°C) de 2-(4-bromofenil)-1 ,3-dioxolano (1.8 g, 7.9 mmol) en tetrahídrofurano seco (THF) (6 ml_). Después de agitar durante 2 horas a una temperatura de -78°C, la suspensión color amarillo resultante se tomó en una jeringa y se agregó en forma de gotas durante un período de 20 minutos a una solución enfriada (-70°C) de di-fer-butildifluorosilano (1.5 ml_, 8.33 mmol) en THF (15 ml_). La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a una temperatura de -70°C y posteriormente se dejó templar a temperatura ambiente. Se extrajo una muestra (3 ml_) de la mezcla de reacción después de 2 horas 30 minutos y se extinguió con agua/0.1% de TFA, para obtener como resultado la eliminación del grupo de protección dioxolano. El producto desprotegido se purificó mediante HPLC de preparación. La purificación utilizando HPLC de preparación (gradiente: 40% a 95% B durante 60 min) produjo SiFA puro. El material purificado se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 50% a 95% B durante 5): fR: 2.05 min, encontrado m/z: no detectado, esperado MH + : 267.2. (ii) Preparación de SiFA-amino-oxiacetil-maleimida Se agregó Eei-amino-oxiacetil-maleimida (20 mg, 71 pmol) a SiFA en agua/ACN/0.1 % de TFA (de las fracciones de preparación HPLC). Se agregó HCI 1 M (1 ml_) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. El producto se purificó mediante HPLC de semi-preparación . La purificación utilizando HPLC de semipreparación (gradiente: 40% a 80% B durante 40 min) produjo 15 mg (45%) de SiFA-amino-oxiacetil-maleimida pura. El material purificado se caracterizó mediante LC-MS (gradiente: 40% a 70% B durante 5): tR: 3.00 min, encontrado m/z: 462.1, esperado MH + : 462.2.

(Mi) Preparación del Compuesto 8 Se disolvieron el Aficuerpo Z02891-Cys recombinante (24 mg, 3.4 pmol) y SiFA-amino-oxiacetil-maleimida (4.7 mg, 10 pmol) en 50% de ACN/agua (1 mL). La solución se ajustó a un pH de 6 agregando acetato de amonio, y la mezcla se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó con 10% de ACN/agua/0.1 % de TFA (8 mL) y el producto se purificó utilizando HPLC de semipreparación. La purificación utilizando HPLC de semipreparación (gradiente: 20% a 40% B durante 40 min) produjo 26 mg (100%) de Z02891 -Cys-maleimida-amino-oxiacetil-SiFA puro (8). Se analizó Z02891 -Cys-maleimida-amino-oxiacetil-SiFA (8) purificado mediante LC-MS analítico (gradiente: 10% a 40% B durante 5 min): fR: 3.87 min, encontrado m/z: 1873.6, esperado MH44 + : 1873.5.

Ejemplo 25. Validación de modelo de tumor Se validaron los modelos de xenoinjerto A431 y NCI-N87 para crecimiento de tumor y expresión de HER2. La preparación del modelo animal implicó la inoculación de células 2 x 106 NCI-N87 o 107 A431 por animal (en 100 µ? de 50%PBS/50%Matrigel) en forma subcutánea en el franco derecho, seguido de un período de inoculación de 30 días. La expresión de HER2 en estos valores se evaluó mediante inmunohistoquímica, utilizando HercepTest (Dako, K5204) validado por FDA.

La figura 33 muestra que con la escala de intensidad recomendada (0 ? +3), los tumores NCI-N87 manchan fuertemente ( + 3), mientras que las células A431 muestran una intensidad de manchado considerablemente más débil ( + 1). Estos datos sugieren que los modelos de tumor tienen una expresión HER2 significativamente diferente, y por consiguiente son adecuadas para comparar la captación de las moléculas de Aficuerpo etiquetadas con HER2. Con base en la separación adecuada de calificaciones IHC, no se consideró necesaria una evaluación cuantitativa adicional.

Ejemplo 26. Biodistribución de los Compuestos 2. 5. v 7 en ratones normales Los compuestos seguidores formulados con solución salina 2, 5, y 7, han sido evaluados utilizando ratones CD1 na'íve. Después de la inyección intravenosa de 3 MBq de actividad (2.5 MBq para el punto de tiempo de 2 minutos), los animales fueron sacrificados en 2, 90, 120 y 180 minutos después de la inyección, y se evaluó en órganos clave la retención de radioactividad. En las medidas de biodistribución , 5 mostró una retención de riñon significativa (70.3% ID en 90 minutos p.i.) la cual no se observó para 2 o 7 (4.8% ID y 10% ID, respectivamente en 90 minutos p.i.). Se observó el desfluorinado de 7 (captación de huesos 5.3% ID/g en 90 minutos p.i.). La figura 34 compara los datos de biodistribución con el compuesto [ 11 ln]DOTA-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (9): Ejemplo 27. Captación de Tumor de los Compuestos 2, 5, y 7 En un modelo de ratón de tumor con células de tumor (NC87 y A431, respectivamente) que expresan un alto y bajo nivel de HER2 se observó tal como se esperó una captación diferencial de los compuestos 2, 5, y 7. La figura 35, Tablas 15 y 16 comparan los datos de biodistribución con el compuesto [111ln]DOTA-Z02891 (SEQ. ID. No. 2) (9) correspondiente.

Tabla 15. Proporciones clave de la biodistribución del xenoinjerto NCI-N87 de los Compuestos 9, 2, 5 y 7.

Tabla 16. Proporciones clave de biodistribución del xenoinjerto A431 de los Compuestos 9, 2, 5 y 7.

Ejemplo 28. Generación de 2 en modelo de xenoinjerto de tumor dual Se generaron ratones de xenoinjerto de tumor dual mediante implante de A431 y NCI-N87 en cada uno de los dos flancos. Estos ratones se utilizaron para evaluar la biodistribución de 2, permitiendo una evaluación de captación del mismo animal en tumores de expresión HER2 tanto de bajo como de alto nivel. Los puntos de tiempo incluyeron 30 y 60 p.i.

La figura 36 muestra que el desempeño de 2 fue comparable con el observado en los estudios con animales de tumor simple, con una buena separación en la captación de enlazador entre los tumores A431 y NCI-N87, comenzando en forma tan temprana como 30 min p.i. En lo que respecta al despeje en tejido de fondo (ver Tabla 7 para proporciones de tejido clave), los niveles en sangre a los 60 min p.i. habían reducido significativamente, proporcionando una proporción de tumor NC l-N87:sangre de 4.52, mientras que en 30 min, el despeje en sangre parcial proporcionó una proporción de 2.39, acompañada de una proporción de tumor:hígado positiva de 1.39. Estas propiedades sugieren que las farmacocinéticas de 2 son suficientes para generar imágenes de sujetos humanos dentro de una ventana de generación de imágenes adecuada.

Tabla 17. Proporciones clave de la biodistribución en injerto de tumor dual de 2.

Ejemplo 29. Compuesto 2 agrega estudios de soporte en ratones con tumor NCI-N87 Para los estudios de adición de soporte llevados a cabo en el modelo de tumor NCI-N87 para evaluar el efecto del ligando frío en exceso en la eficacia de enlazador, se evaluaron las siguientes cuatro preparaciones diferentes en 90 min p.i.: 1. Preparación de compuesto 2 estándar 2. Preparación estándar más 100 pg/kg de precursor frío por ratón 3. Preparación estándar más 500 pg/kg de precursor frío por ratón 4. Preparación estándar más 1000 pg/kg de precursor frío por ratón La concentración del precursor frío en la preparación estándar fue de 120 pg/kg por ratón, por consiguiente este estudio revisó los efectos del precursor frío en 10 x, la concentración original utilizada (en el ratón). La figura 37 muestra que el efecto en la captación de tumor no fue significativo, y que el despeje de otros tejidos tampoco se vio afectado significativamente.

Ejemplo 30. Estudios de generación de imágenes in vivo de Compuesto 2 en ratones de tumor A431/NCI-N87 de flanco doble Se utilizó el modelo de ratón de tumor doble descrito en el Ejemplo 28, para llevar a cabo un estudio preliminar de generación de imágenes. Se inyectaron i.v. 10 MBq de 2 por animal y se generaron imágenes de los ratones durante 30 minutos comenzando en 120 min p.i. La imagen en la figura 38 muestra que el despeje fue a través de los ríñones y la vejiga, tal como se demostró previamente a través de los estudios de biodistribución. La generación de imágenes transversal muestra la captación en los 2 tumores, con el tumor NCI-N87 mostrando una intensidad de señal considerablemente mayor que el tumor A431, de acuerdo con los estudios de biodistribución de tumor doble del Ejemplo 28.

La comparación del estudio de generación de imágenes de 2 en curso, con el estudio de la generación de imágenes de 9 de Affibody® (figura 38) muestra una diferencia similar en la captación entre los tumores que expresan HER2 en alto y bajo nivel. Sin embargo, 2 tiene un trasfondo de los ríñones mejorado en forma considerable, debido a la retención mínima del riñón, también observada en las biodistribuciones.

Todas las patentes, artículos de revistas, publicaciones y otros documentos descritos y/o mencionados anteriormente, están incorporados a la presente invención como referencia.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de agente formador de imagen que comprende un polipéptido aislado que comprende las SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2 o una variante conservadora de las mismas, conjugada con un AI18F-NOTA-quelante para formar un polipéptido conjugado con quelante AI18F-NOTA, en donde el polipéptido conjugado con quelante AI18F-NOTA aislado enlaza específicamente a HER2 o variantes del mismo.

2. Un método para elaborar una composición de agente formador de imagen tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende (i) proporcionar un polipéptido aislado que comprende las SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2 o una variante conservadora de las mismas; (ii) hacer reaccionar el polipéptido con un quelante-NOTA para formar un polipéptido conjugado con quelante-NOTA; y (iii) hacer reaccionar el polipéptido conjugado con quelante-NOTA con una porción AI18F para formar un polipéptido conjugado con quelante-AI 18F-NOTA.

3. Un método para preparar un quelante-18F-NOTA, que comprende hacer reaccionar un quelante-NOTA con una fuente de AI18F.

4. Un método tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque el quelante-NOTA comprende una porción de quelato NOTA y un enlazador.

5. Un método para elaborar una composición de agente formador de imagen tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende (i) proporcionar el polipéptido aislado que comprende las SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, o una variante conservadora de las mismas; (ii) hacer reaccionar el polipéptido con un quelante-NOTA, en donde el quelante-NOTA comprende una porción de quelato NOTA y un enlazador, para formar un polipéptido conjugado con quelante-NOTA; y (iii) hacer reaccionar el polipéptido conjugado con quelante-NOTA con una porción 18F o una fuente de 18F.

6. Una composición farmacéutica que comprende una composición de agente formador de imagen tal como se describe en la reivindicación 1, y un trasportador farmacéuticamente aceptable.