JP2016165289A - アルブミン変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
・変異体:「変異体」(variant)との語は、親アルブミンに対して1又は2以上の改変、即ち置換、挿入、及び/又は欠失を、1又は2以上(数個)の位置に導入して得られたポリペプチドを意味する。置換(substitution)は、ある位置を占めるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、欠失(deletion)とは、ある位置を占めるアミノ酸を除去することを意味し、挿入(insertion)とは、ある位置を占めるアミノ酸の隣に、1又は2以上、好ましくは1〜3のアミノ酸を付加することを意味する。
(同一残基数 × 100)/(アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数)
(同一デオキシリボヌクレオチド数 × 100)/(アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数)
本発明の目的においては、配列番号2に開示の成熟ポリペプチドを用いて、別のアルブミンの対応するアミノ酸残基を決定する。別のアルブミンのアミノ酸配列を、配列番号2に開示の成熟ポリペプチドとアラインし、当該アラインメントに基づき、配列番号2に開示の成熟ポリペプチドの任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を決定する。掛かる作業は、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)を、EMBOSSパッケージ(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)のNeedleプログラム(好ましくはバージョン3.0.0以降)で実行して行う。
アルブミンは、哺乳類血漿の最も豊富な構成要素であるタンパク質の総称である。多数の哺乳類由来のアルブミンが、生化学的手法及び/又は配列情報により特定されている。幾つかのアルブミン(例えばヒト血清アルブミン(human serum albumin:HSA)等)については、結晶学的特性及び構造も決定されている。
更なる観点によれば、本発明は、アルブミン、その断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドを調製する方法であって、
a)アルブミン、その断片、又は、アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドのアルブミン部分の中で、アルブミンのFcRnへの結合にとって重要な1又は2以上のアミノ酸残基位置を特定し、
b)前記アルブミン、その断片、又は、アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドのアルブミン部分をコードする核酸を用意し、
c)b)で用意した核酸について、a)で特定された位置の1又は2以上(数個)のアミノ酸残基が欠失し、又は異なるアミノ酸によって置換され、又は異なるアミノ酸が挿入されるように修飾し、
d)修飾された核酸を適切な宿主細胞内で発現させ、
e)前記の変異アルブミン、その断片、又は、アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドを回収する
工程を含む、方法に関する。
i)FcRnに対して異なる結合特性を有する非ヒトアルブミンを特定し、
ii)FcRnと相互作用するヒト血清アルブミンのアミノ酸残基を特定し、
iii)工程ii)で特定されたアミノ酸残基について、工程i)で特定された非ヒトアルブミンとヒト血清アルブミンとの間で一次及び/又は三次構造を比較し、前記非ヒトアルブミンとヒト血清アルブミンとの間で異なるアミノ酸残基を、観測された結合の相違に関与するものとして特定し、
iv)任意により、工程iii)で特定された位置におけるHSAの変異体を調製し、調製された変異体をHSAと比較して、FcRnに対する結合が改変されたか否か確認する、
工程を含む。
本発明は、親アルブミンの変異アルブミン、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドであって、配列番号2の位置417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574、575、577、578、579、580、581、582及び584に対応する1又は2以上(数個)の位置に改変を含み、各改変は各々独立に、置換、挿入又は欠失であり、但し、当該変異体は、配列番号2において置換D494N、E501K、K541E、D550G,A、K573E又はK574Nを有する変異体ではないものも提供する。
本発明は、本発明の変異体をコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。
本発明は、本発明の変異体をコード化するポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに作動式に連結された1又は2以上(数個)の調節配列とを含み、前記調節配列が、前記調節配列に適合する条件下、適切な宿主細胞において、前記コーディング配列の発現を指示する、核酸コンストラクトにも関する。
本発明の変異体は、当業者に周知の手法を用いて調製することが可能である。便宜な手法としては、親アルブミン、又はその断片、又はアルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドをコードする核酸をクローン化し、配列番号2の位置417、464、490、492、493、494、495、496、499、500、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、550、573、574及び580に対応する1又は2以上(数個)の位置に所望の置換を導入するよう、前記核酸を修飾し(ここで得られる変異体は、配列番号2における置換D494N、E501K、K541E、D550G,A、K573E又はK574Nからなる変異体ではない)、修飾された核酸が適切な調節遺伝要素(例えばプロモーター、ターミネーター、活性化部位、リボゾーム結合部位等)と作動式に連結されるような位置に配置された適切な遺伝子コンストラクトを調製し、前記遺伝子コンストラクトを適切な宿主生物内に導入し、形質転換された宿主生物を変異体の発現を生じる条件下で培養し、得られた変異体を回収する、という手法が挙げられる。これらの手法は何れも当業界で公知であり、平均的な当業者の技量があれば、本発明に係る具体的な変異体を調製するための適切な方法を設計することが可能である。
本発明に係るアルブミンの変異体又はその断片を、非アルブミンポリペプチド融合パートナーと融合させてもよい。斯かる融合パートナーは、原則としてはどのようなポリペプチドでもよいが、通常は治療又は診断特性を有するポリペプチドであることが好ましい。アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドは当業界では公知である。斯かるアルブミン又はその断片と融合パートナーポリペプチドとを含む融合ポリペプチドは、融合されていない融合パートナーポリペプチドと比べて、血漿中半減期が延長されることが判明している。本発明によれば、従来の対応する融合ポリペプチドと比較して、本発明に係る融合ポリペプチドの血漿中半減期を改変することが可能である。
本発明に係るアルブミンの変異体又はその断片は、当業界で公知の手法により、第2の分子にコンジュゲートされてもよい。前記第2の分子は、診断部位を有していてもよく、この態様によれば、得られるコンジュゲートは、例えば診断ツールとして、例えばイメージングに有用である。或いは、第2の分子は、治療用化合物であってもよく、この態様によれば、得られるコンジュゲートは、例えば治療目的に有用である。この場合、コンジュゲートは、治療用化合物の治療特性に加えて、アルブミンの長い血漿中半減期を兼ね備えることになる。アルブミンと治療分子とのコンジュゲートは当業界では公知であり、斯かるコンジュゲートは、コンジュゲートされていない遊離状態の治療分子単独の場合と比べて、長い血漿中半減期を有することが確認されている。斯かるコンジュゲートは、周知の化学法を用いて、HSAの表面に存在する遊離状態のチオ基(成熟HSAのアミノ酸残基34)を介して連結することが可能である。
更に、アルブミンの変異体又はその断片は、「アソシエート」の形態で使用することも可能である。ここで、「アソシエート」(associates)という語は、アルブミンの変異体又はその断片と、非共有結合により当該変異アルブミン又はその断片に結合又は関連付け(associated)された別の化合物とを含む化合物を意味する。斯かるアソシエートの例としては、変異アルブミンと、前記アルブミンに疎水性相互作用によって関連付けされた資質とからなるアソシエートが挙げられる。斯かるアソシエートは当業界で公知であり、周知の手法によって調製可能である。本発明に係る好ましいアソシエートの例としては、変異アルブミンとパクリタキセルとを含むアソシエートが挙げられる。
本発明に係る変異アルブミン、又はその断片、又は変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドは、親アルブミン、又はその断片、又は親アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、血漿中半減期が改変されたという利点を有する。これにより、本発明に係る変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は変異アルブミン若しくはその断片を含むコンジュゲート、又は変異アルブミン若しくはその断片を含むアソシエートの血漿中半減期を、具体的な治療目的に応じて選択し得るという利点がある。
本発明は、本発明に係るアルブミンの変異体若しくはその断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲート、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むアソシエートの、医薬組成物の製造における使用であって、前記のアルブミンの変異体若しくはその断片、又は、変異アルブミン若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むコンジュゲート又は、アルブミン変異体若しくはその断片を含むアソシエートが、HSA若しくは対応するその断片、又は、HSA若しくはその断片を含む融合ポリペプチド、又は、HSAを含むコンジュゲートと比べて、改変された血漿中半減期を有する使用も対象とする。
ELISA:
ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)により別記の濃度に希釈された野生型HSA又は変異体により被覆し、4℃で一晩インキュベートし、次に4%スキムミルク(Acumedia)により室温で1時間ブロックした。次に、ウェルを、FEBS J. 2008 Aug;275(16):4097-110の記載に従って、PBS/0.005% TWEEN(登録商標)20(PBS/T)pH6.0、続いてグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合shFcRn(0.5μg/ml)により4回洗浄し、ヤギ由来のホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートポリクローナル抗GST(1:5000;GE Healthcare)と共に予インキュベートし、4%スキムミルクに希釈し、PBS/0.005% TWEEN(登録商標)20(PBS/T)pH6.0を各ウェルに添加し、室温で1.5時間インキュベートし、続いてPBS/T(pH6.0)により4回洗浄した。100μlの基質テトラメチルベンジジン(TMB)(Calbiochem)を各ウェルに添加し、45分間インキュベートし、続いて100μlの0.25MのHClを添加した。吸光度を、Sunrise TECAN分光光度計(TECAN, Maennedorf、スイス)を用いて450nmで測定した。同じELISAをPBS/T(pH7.4)を用いて反復した。
SPR実験をBiacore 3000 装置(GE Healthcare)を用いて実施した。CM5センサーチップの流動細胞を、shFcRn−GST(〜1400−5000RU)により、メーカー提供のプロトコールに記載のアミンカップリング化学を用いてカップリングした。このカップリングは、10mMの酢酸ナトリウムpH5.0(GE Healthcare)中、10μg/mlのタンパク質の注入により実施した。リン酸緩衝液(67mMのリン酸緩衝液、0.15MのNaCl、0.005% TWEEN(登録商標)20(pH6.0))を、実行緩衝液及び希釈緩衝液として使用した。表面の再生を、pH7.4でのHBS-EP緩衝液(0.01M のHEPES、0.15M のNaCl、3mMのEDTA、0.005%の界面活性剤P20)(Biacore AB)の注入を用いて達成した。固定されたshFcRn-GSTへの結合については、1.0〜0.5μMの各HSA変異体を、25℃で一定の流速(40μl/ml)で前記表面上に注入した。何れの実験でも、データをゼロ点調整し、参照細胞を減算した。データ評価は、BIAevaluation 4.1ソフトウェア(BIAcore AB)を用いて実施した。
同じSPRアッセイを、HBS−EP緩衝液pH7.4を用いて反復した。
特定のHSAムテイン発現プラスミドの調製
HSA変異体及びHSA融合変異体の発現方法としては、数種の手法を用いて製造した。標準的な分子生物学の手法(例えばSambrook, J. and D. W. Russell, 2001. Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに記載の手法等)を、全体を通じて使用した。
翻訳されたタンパク質内に所望のアミノ酸置換を導入するべく、HSAコーディング遺伝子(配列番号1)内に点突然変異を含む合成DNAのNcoI/SacI断片(859bp)を、遺伝子アセンブリー(GeneArt AG, Germany)により生成した。HSAコーディング遺伝子内にアミノ酸置換を導入するべく使用したコドンを表2に詳述する。未変更アミノ酸(即ち野生型)をコードする合成断片のヌクレオチド配列は、pDB2243(国際公開00/44772号に記載)の配列と同一とした。合成ヌクレオチド断片を、NcoI/SacIにより消化したpDB2243に連結し、プラスミドpDB3876-pDB3886(表1)を生成した。発現プラスミドを作製すべく、pDB3876〜pDB3886(表1参照)を各々NotI及びPvuIにより消化し、得られたDNA断片を0.7%(w/v)TAEゲルを通して分離し、2992bpの断片(PRB1プロモーター、融合リーダー(FL)配列をコードするDNA(国際公開第2010/092135号開示)、HSA及びADH1ターミネーターをコードするヌクレオチド配列を含む「NotIカセット」;図1参照)を、Qiagen Gel Extraction Kitを用いて、メーカーの説明書に従って、アガロースゲルから精製した。この「NotIカセット」を、(欧州特許出願第286424号に開示及びSleep, D.,et al. (1991) Bio/Technology 9, 183-187に記載の)NotI/エビアルカリホスファターゼ(Roche)で処理された「分解」(disintegration)プラスミドpSAC35中に連結した。連結混合物を用いて、ケミカルコンピテント大腸菌(E. coli)DH5αを形質転換した。「NotIカセット」を含む発現プラスミドpDB3887〜pDB3897、pSAC35誘導体を、標準法を用いて同定した。分解プラスミドpDB3887〜pDB3897及びpDB2244(野生型HSAの発現については国際公開第00/44772号に記載)(表1)を用いて、(前述の国際公開第2001/0799480号に従い)後述の通りにS.セレビシエ(S. cerevisiae)BXP10cir0を形質転換した。
QuickChange Lightening Kit(Statagene)を用いたPCRに基づく方法を用いて、HSA内に点突然変異を導入した。オリゴヌクレオチド対xAP094(配列番号5)/xAP095(配列番号6)及びxAP096(配列番号7)/xAP097(配列番号8)を用いて、2種のHSA変異体(それぞれ、D494N+E495Q+T496A及びE495Q+T496A)を生成した。プラスミドpDB3927(国際公開第2010/092135号に開示)を鋳型DNAとして使用し、キットのメーカーが推奨する方法に従った。得られたプラスミドをpDB3995及びpDB3996(それぞれHSA D494N+E495Q+T496A 及び E495Q+T496A発現カセットを含む)と命名した。pDB3995及びpDB3996をBstEII/BsrBIで消化し、線状化されたDNA分子を標準法を用いて精製した。QiagenPCR精製キットを用いてメーカーの説明書に従って精製された各100ngのBstEII/BsrBI消化DNAをそれぞれ、100ngのAcc65I/BamHI消化pDB3936(国際公開第2010/092135号に開示)と混合し、後述のSigma Yeast形質転換キットを用いて、後述のS.セレビシエ(S. cerevisiae)BXP10cir0を直接形質転換した。
成熟HSAタンパク質内のアミノ酸置換に応じて、プラスミドpDB3927(国際公開第2010/092135号に開示)(pDB2243と同一のHSAコードヌクレオチド配列を含む)を操作した。翻訳されたタンパク質配列内に所望のアミノ酸置換を導入するための点突然変異をHSAコーディング遺伝子内に含む合成DNA断片を生成した(GeneArt AG(独国)又は DNA2.0 Inc.(米国))(NcoI/Bsu36I、AvrII/SphI又はSacI/SphI断片)。HSAコーディング遺伝子内にアミノ酸置換を導入するべく使用したコドンを表2に詳述する。未変更アミノ酸(即ち野生型)をコードする合成断片のヌクレオチドは、pDB3927における配列と同一とした。合成DNA断片をNcoI/Bsu36I、AvrII/SphI、SacI/Sph消化pDB3927(PCT 11527.204-WOに記載)内にサブクローン化し、pDB4006〜pDB4010、pDB4083〜pDB4101及びpDB4103〜pDB4111、並びにpDB4194、pDB4200、pDB4202(表3参照)を生成した。
PCRを用いて2つの順列ライブラリーを製造した。本ライブラリーでは、成熟HSAのアミノ酸500又は573をコードするコドンを、他の非野生型アミノ酸及び終止コドン(K5XXSTOP)に変更(変異)させた。HSAコーディングDNAが増幅され、所望の変更が導入されるように、変異誘発オリゴヌクレオチド(表4及び5)を設計した。即ち、位置500での変更については、pDB4082(図1)を鋳型DNAとして使用した。pDB4082は、pDB2305(欧州特許出願第1788084号に開示)の誘導体であり、以下のように作製した。pDB2305(図2)をNsiI/SpeIにより消化し、得られる8.779kbのNsiI断片を自己連結し、pDB4005(図3)を作製した。遺伝子アセンブリー(DNA2.0 Inc, USA)により作製された合成DNA断片(BsaI/SphI)(配列番号1)(PRB1プロモーターの3’領域、修飾された融合リーダー配列、HSAをコードするヌクレオチド配列、及び修飾されたADH1ターミネーターの5’領域を含む)を、Hind3/SphI消化pDB4005(図3)内に連結し、pDB4082を作製した。注:PRB1プロモーター部位のHindIII部位は除去され、HSAコーディングヌクレオチド配列内にSacII部位が導入されている。
S.セレビシエ(S. cerevisiae)BXP10 cir0(上述の国際公開第2001/079480号を参照)又は菌株A Ciro(国際公開第2005/061718号に記載)を、YEPDプレート(1%(w/v)酵母抽出物、2%(w/v)バクトペプトン、2%(w/v)グルコース、1.5%寒天)上に画線培養し、30℃で4日間増殖させてから形質転換に供した。1μgの完全プラスミド(即ち環状プラスミド)又は、ギャップ修復用に、100ngのBstEII/BsrBI又はNsiI/PvuI消化HSA変異体又はHSA変異体融合体含有プラスミド、及び100ngのAcc65I/BomHI消化pDB3936を用いて、改良された酢酸リチウム法を用いたSigma Yeast 形質転換キット(Sigma yeast transformation kit YEAST-1, protocol 2; Ito et al. (1983) J. Bacteriol., 153, 16; Elble, (1992) Biotechniques, 13, 18)により、S.セレビシエ(S. cerevisiae)を形質転換した。前記プロトコールを僅かに変更し、ヒートショックの前、室温で4時間、前記形質転換物をインキュベートした。ヒートショックに続いて、細胞を軽く遠心分離してから、200μlの1Mソルビトールに再懸濁し、BMMD寒天プレート上に展開した。BMMDの組成はSleep et al., (2001), Yeast, 18, 403に記載される。プレートを30℃で4日間インキュベートした後、各コロニーを新鮮なBMMDプレート上にパッチした。酵母株番号を表1に詳述する。
BMMD(レシピ、アミノ酸及び硫酸アンモニウムを有さない0.17%(w/v)の酵母窒素基質(Difco)、37.8mMの硫酸アンモニウム、29mMのクエン酸、142mMのオルトリン酸水素ニナトリウム二水和物pH6.5、2%(w/v)グルコース)培地(10cml)に、各酵母株を接種し、200rpmのオービタル振盪下、30℃で12時間増殖させた。各開始培養物のアリコート(4ml)を2×200mlのBMMD培地に接種し、200rpmのオービタル振盪下、30℃で36時間増殖させた。GF-Dプレフィルター(Whatman)を備えた0.2μmの真空フィルター膜(Stericup, Millipore)を用いた濾過により細胞を収穫し、上清液を精製用に取得した。
取得された培養物上清液を、トランスメンブラン圧20psi及び循環速度180ml・分−1で、Omega 10KD(0.093sq.m2)フィルター(LV CentramateTM カセット, Pall Filtron)を備えたPall Filtron LVシステムを用いた接線流濾過(Tangential Flow Filtration)を用いて濃縮した。
10LのSartorius Biostat C発酵器を用い、30℃で流加発酵(fed-batch fermentation)を実施した。pHをモニターし、アンモニア又は硫酸の添加により適宜調節した。アンモニアは培養物の窒素源としても利用した。溶解酸素のレベルをモニターし、撹拌速度に反映させて、20%以上の飽和レベルを維持した。接種物を緩衝化最少培地(レシピ)を含む振盪フラスコ内で増殖させた。バッチ相については、培養物を、2%(w/v)スクロースを含む発酵培地(発酵器体積の約50%)中に接種した。供給段階は、溶解酸素レベルの急激な上昇により自動的に開始した。供給速度を所定の名目増殖速度に調節することにより、スクロースを増殖制限濃度に維持した。供給物の構成は50%(w/v)スクロースを含む発酵培地であった。何れもCollins(Collins, S.H., (1990) Production of secreted proteins in yeast, in: T.J.R. Harris (Ed.) Protein production by biotechnology, Elsevier, London, pp. 61-77)に記載のとおりである。
精製されたアルブミン変異体、融合体及びコンジュゲートを、以下の手順でGP−HPLC及び定量化分析した。長さ7.8mm id × 300mmのTSK G3000SWXLカラム(Tosoh Bioscience)及び長さ6.0mm id × 40mmのTSK SWガードカラム(Tosoh Bioscience)に、それぞれ25μlを注入した。サンプルを、25mMのリン酸ナトリウム、100mMの硫酸ナトリウム、0.05%(w/v)のアジ化ナトリウム、pH7.0、1ml/分でクロマトグラフィー処理した。サンプルを、280nmのUV検出により、ピーク面積に基づき、既知濃度(10mg/ml)の組換ヒトアルブミン標準を基準として定量化し、相対的消衰係数を補正した。
振盪フラスコ(培養物上清液又は濃縮培養物上清液の何れか)から、アルブミン親和性マトリックス(AlbuPure(登録商標)- ProMetic BioSciences, Inc.)を用いた単一クロマトグラフィー工程を用いて、アルブミン変異体を精製した。クロマトグラフィーは常時一定線速度240cm/時で実施した。培養物上清液を、50mMの酢酸ナトリウム(pH5.3)で前平衡化された層高6cm、2.0mlの充填層に負荷した。負荷後、カラムを10カラム体積(CV)の平衡化緩衝液、次に50mMの酢酸アンモニウム(pH8.0)(10CV)で洗浄した。生成物を、50mM 酢酸アンモニウム、10mM オクタノエートpH8.0、50mM 酢酸アンモニウム、30mM オクタン酸ナトリウム、200mM 塩酸ナトリウム(pH7.0)、又は200mM チオシアン酸カリウムの何れかにより溶出した。カラムを、0.5MのNaOH(3cv)及び20mM NaOH(3.5cv)により洗浄した。各アルブミン変異体由来の溶出物画分を濃縮し、10体積部の50mM 塩化ナトリウムに対してダイアフィルトレートした(任意のダイアフィルトレーションカップを備えたVivaspin20 10,000 MWCO PES、Sartorius)。精製されたアルブミン変異体を、上記に従ってGP−HPLCにより定量化した。
振盪フラスコ培養物上清液から、アルブミン親和性マトリックス(AlbuPure(登録商標)- ProMetic BioSciences, Inc.)を用いた単一クロマトグラフィー工程を用いて、アルブミン融合変異体を精製した。クロマトグラフィーは常時一定線速度240cm/時で実施した。培養物上清液又は濃縮された培養物上清液を、50mM 酢酸ナトリウム(pH5.3)で前平衡化された層高6cm、2.0mlの充填層に負荷した。負荷後、カラムを10カラム体積(CV)の平衡化緩衝液、次に50mM 酢酸アンモニウム(pH8.0)(10CV)で洗浄した。生成物を、50mM 酢酸アンモニウム、10mM オクタノエートpH8.0、50mM 酢酸アンモニウム、30mM オクタン酸ナトリウム、200mM 塩酸ナトリウムpH7.0、50mM 酢酸アンモニウム、100mM オクタン酸ナトリウム又は200mM チオシアン酸カリウムの何れかにより溶出した。カラムを、0.5M NaOH(3cv)及び20mM NaOH(3.5cv)により洗浄した。各アルブミン変異体融合物由来の溶出物画分を濃縮し、、10体積部の50mM 塩化ナトリウムに対してダイアフィルトレートした(任意のダイアフィルトレーションカップを備えたVivaspin20 10,000 MWCO PES、Sartorius)。精製されたアルブミン融合変異体を、上記に従ってGP−HPLCにより定量化した。
アルブミン変異体を、Sorvall RC 3C遠心分離機(DuPont)を用いた遠心分離により分離した後、高細胞密度流加発酵上清液から精製した。培養物上清液を、上記に従って、注文合成されたアルブミン親和性マトリックス(AlbuPure(登録商標) - ProMetic BioSciences, Inc.)を充填した層高11cm、充填層8.6mlのカラムを通してクロマトグラフィー処理した。生成物を、流速120cm/時で、上記溶出緩衝液を用いて溶出した。溶出物画分をGP−HPLC(上記)及び純度についての還元性SDS−PAGEにより分析し、必要に応じて濃縮し(Vivaspin20 10,000 MWCO PES)、25mM トリス、150mM NaCl、2mM KCl(pH7.4)中、流速39cm/時で、Supardox75を充填した2.4×96cmカラムに導入した。ピークを分取し、GP−HPLCでアッセイし、所望のモノマータンパク質をプールして取得した。プールされた画分を濃縮した(Vivaspin20 10,000 MWCO PES, Sartorius)。
実質的に脂肪酸を有さないHSA(Sigma-Aldrich)を、Andersen et al. (2010), J. Biol. Chem. 285, (7), 4826-4836の記載に従って、サイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。10μMノモノマーHSA及びrHAを、上記に従ってSPRを用いて分析した。データを図4に示す。
確立された2種のFcRn結合アッセイ、ELISA及びSPRを使用した。これらのアッセイには大きな違いがある。ELISA系では、ウェルをHSAで直接被覆し、shFcRn−GSTを溶液として添加する。一方、FPRアッセイでは、shFcRn−GSTをCM5チップに固定し、HSAを溶液として注入する。何れの系でもpHは可変である。
HSA及びマウス血清アルブミン(MSA)のヒト及びマウスFcRnへの結合について、下記SPR分析法を用いて、会合定数Ka、解離定数Kd及び結合定数KDを計算した(表8)。
市販の動物アルブミン(Sigma-Aldrich又はCalbiochemの何れか)を、Andersen et al., (2010). J.Biol.Chem. 285, (7), 4826-4836の記載に従って更に精製した。ロバ血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、 ウサギ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ハムスター血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、ラット血清アルブミン及びニワトリ血清アルブミンのshFcRnへの結合を、材料及び方法の欄に記載の手法を用いて決定した。ELISAの結果を図9A〜Dに示す。相対的結合を図9Eに要約する。
本発明の変異体の結合定数を、材料及び方法の欄に記載の方法に従って決定した。
実施例1で調製されたHSA変異体及びWT HSAの競合分析を、実施例4に記載の方法を用いて実施した。結果を図15に示す。これらの結果は、変異体E492Gが、E492H E492P及びE492G+V493Pとは異なり、HSAよりもshFcRnに対してより強い結合性を有することを示している。
実施例1の方法を用いて、置換Q417A及びD494E+Q417Hを有するHSAの変異体を構築した。これらの変異体の動態特性(kinetic properties)を、材料及び方法の欄に記載の方法を用いて試験した。結果を表12に示す。
実施例1の方法を用いて、置換P499A、K500A、K536A、P537A、K538A及びK573Aを有するHSAの変異体を構築した。これらの変異体の受容体結合特性を、材料及び方法の欄の記載に従って試験した。結果を図11に示す。
実施例1の方法を用いて、置換E501A及びE501Qを有するHSAの変異体を構成した。それらの変異体の動態特性を、材料及び方法の欄の記載に従って試験した。
実施例1の方法を用いて、位置573に置換を有するHSAの変異体を構成した。位置573における全変異体の生成、及びそれらの変異体の受容体結合特性の試験は、材料及び方法の欄の記載に従って行ったが、pH5.5でのSPR分析を追加した。結果を下記表14並びに図12及び13に示す。
実施例1の方法を用いて、置換E492G、E492G+N503H、N503H、D550E、E492G+N503K、E542P、H440Q、K541G、K541D、D550N、E492G+K538H+K541N+E542D、E492T+N503K+K541A、E492P+N503K+K541G+E542P、E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E、A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D、E492G+V493P+K538H+K541N+E542Dを有するHSAの変異体を構成した。それらの変異体の受容体結合特性を、材料及び方法の欄の記載に従って試験した。結果を表15及び図14に示す。
次の変異体を、実施例1に記載される方法を用いて生成した。H440Q、H464Q、H510Q及びH535Q。材料及び方法の欄の記載に従って得られた、これらの変異体とshFcRnとの相互作用のSPRセンサーグラムを図15に示す。
以下の変異体を、実施例1に記載の方法を用いて生成した。HSAのK574N及びQ580K。これらの変異体のFcRnへの結合を、材料及び方法の欄に記載のSPRアッセイを用いて試験した。結果を表16に示す。これらの結果は、変異体K574N及びQ580Kが、shFcRnに対して強く結合したことを示す。
実施例1の方法を用いて、位置500に置換を有するHSAの変異体を構成した。位置500における全変異体の生成、及びこれらの変異体の受容体結合特性の試験を行った。何れの分析でも、Biacore X、 Biacore X100 及び Sensor Chip CM5を用いた。これらは何れもGE Healthcareにより提供される。GeneArt AG(独国)により生成されるshFcRn(10mM 酢酸ナトリウム(pH5.0)により10μg/mlに希釈(GE Healthcare))を、流動細胞2(FC2)に対して、標準アミンカップリングにより、メーカーの説明書(GE Healthcare)に従って1600〜2200応答単位(RU)のレベルまで固定した。流動細胞1(FC1)にはブランクの固定化を実施し、対照細胞として使用した。アッセイの安定化のため、まずランニングバッファー(67mM リン酸緩衝液、0.15M NaCl、0.005% Tween 20(pH5.75±0.25))のみを用いて3〜5回の始動サイクルを実施し、続いて再生を行った。WT rHA及びK500ライブラリー変異体を、25℃、一定流速(30μl/分)で90秒間、種々の濃度(1μM〜150μM)で注入し、続いて、初期基線RUが概ね回復されるまで(通常は12秒パルスで十分)、HBS−EP緩衝液pH7.4(GE Healthcare)を用いて表面を再生した。
結果を表17及び図16に示す。
アルブミンムテインを含むアルブミン融合体の生成:
scFv(vHvL)生成用の発現カセットを、HSAのN末端又はC末端の一方又は両方に、遺伝子的手法で融合したプラスミド(Evans et al., 2010. Protein Expression and Purification. 73,113-124に記載)を、アルブミン融合体を生成し得るようインビボクローニング(上述)で修飾した。即ち、pDB3017(図17)、pDB3021(図18)、pDB3056(図19)をNsiI/SpeIにより消化し、それぞれ9.511kb、9.569kb及び8.795kbに対応するNsiI断片を、標準法を用いて精製した。精製HsiI断片を自己連結し、それらを用いてケミカルコンピテント大腸菌(E. coli)DHSαを形質転換することにより、それぞれpDB4168、pDB4169及びpDB4170を生成した(表18)。
PCRサイクルを表19に示す。
コンジュゲート分析では、市販の組換アルブミン(Recombumin(登録商標))を対照分子として使用した。この実施例では、流加発酵から、最終量200mg/mlの本発明のアルブミンK573P変異体を、材料及び方法の欄に記載の手段で精製した。
第一段階では、AlbuPure(登録商標)マトリックス(ProMetic)を充填したカラム(層体積約400ml、層高11cm)を使用した。これを50mM 酢酸ナトリウム(pH5.3)で平衡化し、新鮮な培養上清液を、約pH5.5〜6.5で、約20mg/mlマトリックスとなるように充填した。次にカラムを、約5カラム体積の50mM 酢酸ナトリウム(pH5.3)、50mM リン酸ナトリウム(pH6.0)、50mM リン酸ナトリウム(pH7.0)及び50mM 酢酸アンモニウム(pH8.0)によりそれぞれ洗浄した。結合されたタンパク質を、約2カラム体積の50mM 酢酸アンモニウム、10mM オクタノエート(pH7.0)を用いて溶出した。全精製を通じて流速は154ml/分とした。
実施例17で使用した2種のアルブミンサンプル、即ち約200mg/mlのrHA又はK573Pアルブミン変異体を、本実施例でも出発材料として用いた。
実施例1に記載の方法を用いて以下の変異体を生成した。E492T、N503D、 E492T+N503D、K538H、E542D、D494N+E495Q+T496A、E495Q+T496A、N403K、K541A及びK541N。実施例15の記載に従ってSPR分析を実施した。結果を図26及び27に示す。
実施例1に記載の方法を用いて以下の変異体を生成した。shFcRnに対する結合性を、材料及び方法の欄の記載に従って決定した。結果を表22に示す。
実施例1の記載に従って調製された変異体アルブミン融合体及び変異体アルブミンの選択を用いて、実施例4の記載に従って競合結合試験を実施した。結果を図28〜31に示す。
実施例1に記載の方法を用いて以下の変異体を生成した。HSA E492G+K573A、HSA E492G+N503K+K573A、HSA E492G+N503H+K573A、HSA E492G+K573P、HSA E492G+N503K+K573P、HSA E492G+N503H+K573P。材料及び方法の欄の記載に従ってSPR分析を実施した。その結果(図32)は、全てのHSA変異体が、野生型HSAと比較して、shFcRnに対するpH5.5での結合がより強かったことを示している。
Claims (18)
- アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドを調製する方法であって、
a)配列番号2に対して少なくとも80%の配列同一性を有する親アルブミンをコードする核酸を用意する工程、
b)以下から選択される配列番号2の置換に対応する1又は2以上の置換を有するアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドをコードするように、工程a)の配列を修飾する工程、
Q417A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y;
H440A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
A490C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y
E492A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
V493A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T.W,Y:
D494A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
E495A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
T496A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y;
P499A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y;
K500A,C,D,E,F,G,H,I,,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y;
E501A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
N503A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
A504C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
E505A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
T506A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y;
H510A,C,D,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
H535A,C,D,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
K536A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
P537A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y;
K538A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
T540A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,,V,W,Y;
K541A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
E542A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
D550A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
K573A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
K574A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
Q580A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y;
A581C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
A582C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;又は
G584A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
c)工程b)で修飾した配列を適切な宿主細胞に導入する工程、
d)前記細胞を、適切な成長培地において、前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドが発現される条件下で培養する工程、及び、
e)前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドを、成長培地から回収する工程を含み、
前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドが、親アルブミン、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、改変された血漿中半減期を有する、方法。 - アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドであって、親アルブミン、その断片、又は、前記親アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチドと比べて、改変された血漿中半減期を有し、且つ、573、500、550、492、580、574、417、440、464、490、493、494、495、496、499、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、575、577、578、579、581、582及び584から選択される配列番号2の位置に対応する位置に置換を有し、但し、前記変異体は、配列番号2において置換D494N、E501K、K541E、D550G,A、K573E又はK574Nを有する配列からなる変異体ではない、アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
- 親アルブミンよりも血漿中半減期が長い、請求項2に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
- 配列番号2における以下の置換に相当する1又は2以上の置換を有する:K573Y,W,P,H,F,V,I,T,N,S,G,M,C,A,E,Q,R,L,D、K573P+K574N+A577T+A578R+S579C+Q580K+A581D+G584A、
K573P+A577E+A578S+Q580K+A582T、K573P+A578S+S579T+G584A、K573P+L575F+G584A、E492G、N503K、K500R N503H、D550E、K574N、Q580K及びE492G+N503K、E492G+N503H、E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E、E492G+K573A、E492G+N503K+K573A、E492G+N503H、E492G+K573P、E492G+N503K+K573P、E492G+N503H+K573P、
請求項3に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド - 親アルブミンよりも血漿中半減期が短い、請求項2に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
- 配列番号2における以下の置換に相当する1又は2以上の置換を有する:K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R、D550N、H464Q、H510Q、H535Q、D494N,Q,A、E495Q,A、T496A、E492G+V493P、K541G,D、D494N+E495Q+T496A、E495Q+T496A、E492G+V493P+K538H+K541N+E542D、N503K,D P499A、K541A,N、D494E+Q417H、Q417A、E492T+N503D、A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D、K536A、P537A、E501A,Q、E492G+K538H+K541N+E542D、
請求項5に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド - 表面にチオ基を生じる1又は2以上の更なる改変を含む、請求項1〜6の何れか一項に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
- 前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドの配列番号2に対する配列同一性が、80%超、好ましくは90%超、より好ましくは95%超、より好ましくは96%超、よりいっそう好ましくは97%超、より好ましくは98%超、最も好ましくは99%超である、請求項1〜7の何れか一項に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。アルブミンの変異体断片、又は、アルブミンの変異体断片を含む融合ポリペプチドであって、前記断片が、少なくとも20アミノ酸、好ましくは少なくとも50アミノ酸、好ましくは少なくとも100アミノ酸、より好ましくは少なくとも200アミノ酸、より好ましくは少なくとも300アミノ酸、より好ましくは少なくとも400アミノ酸、最も好ましくは少なくとも500アミノ酸である、請求項1〜7の何れか一項に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド。
- 請求項2に記載のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項2に記載の変異アルブミン又はその断片と、有用な治療用部位とを含むコンジュゲート。
- 請求項2に記載の変異アルブミン又はその断片と、有用な治療用部位とを含むアソシエート。
- 請求項2に記載の変異アルブミン又はその断片と、融合パートナーポリペプチドとを含む融合ポリペプチド。
- アルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、又は、前記アルブミンの変異体を含むコンジュゲート、を含む組成物であって、FcRnに対する結合が、対応するアルブミン又はその断片、又は、前記アルブミン又はその断片を含む融合ポリペプチド、又は、前記アルブミンを含むコンジュゲートよりも強い、組成物。
- FcRnに対する結合が、HSAのFcRnに対する結合よりも強い、請求項13に記載の組成物。
- 前記のアルブミンの変異体、その断片、又は、前記アルブミンの変異体又はその断片を含む融合ポリペプチド、又は、前記アルブミンの変異体を含むコンジュゲートの、FcRnに対する結合係数が、HSAに対して0.9X KD未満、より好ましくはHSAに対して0.5X KD未満、より好ましくはHSAに対して0.1X KD未満、よりいっそう好ましくはHSAに対して0.05X KD未満、よりいっそう好ましくはHSAに対して0.02X KD未満、最も好ましくはHSAに対して0.01X KD未満である、請求項14に記載の組成物。
- 請求項1に記載の変異アルブミン又はその断片、請求項10に記載のコンジュゲート、請求項11に記載のアソシエート、又は、請求項12に記載の融合ポリペプチドを含む、請求項12〜15の何れか一項に記載の組成物。
- 請求項1に記載の変異アルブミン又はその断片を含むとともに、ABDと医薬的に有用な部位とを含む化合物を更に含む、請求項13〜16の何れか一項に記載の組成物。
- 医薬組成物である、請求項13〜17の何れか一項に記載の組成物。
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