JP2002539082A - 血管内皮増殖因子２ - Google Patents

血管内皮増殖因子２

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−２ポリペプチドならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用する方法に関する。詳細には、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドおよびＶＥＧＦ−２ポリペプチドを用いて網膜性障害を処置する方法が、提供される。光受容体の損傷または変性を処置するための方法であって、この方法は、そのような光受容体の損傷または変性を罹患する被験体に治療的有効量の血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）を投与する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に
関する。本発明のポリペプチドは、血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーとし
て同定された。より具体的には、本発明のポリペプチドは、ヒト血管内皮増殖因
子２（ＶＥＧＦ２）である。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻
害することに関する。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体に
関する。本発明はまた、光受容細胞の障害または損傷の処置のための、血管内皮
増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの投与に関す
る。
【０００２】 （関連技術） 新たな血管の形成、すなわち脈管形成は、胚の発生、それに続く成長、および
組織修復のために必須である。脈管形成はまた、新形成（すなわち、腫瘍および
神経膠腫）のような特定の病的状態に必須な部分でもある。異常な脈管形成は、
炎症、慢性関節リウマチ、乾癬、および糖尿病性網膜症のような他の疾患に関連
する（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３５：４４２〜４４７（１９８７））。
【０００３】 酸性および塩基性の両方の線維芽細胞増殖因子分子は、内皮細胞および他の細
胞型についてのマイトジェンである。アンギオトロピン（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉ
ｎ）およびアンギオゲニンは脈管形成を誘導し得るが、これらの機能は不明であ
る（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｌｅａ ａｎｄ
Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、１５３〜１７０頁（１９９３））。血管内皮細
胞に対して高度に選択的なマイトジェンは、血管内皮増殖因子、すなわちＶＥＧ
Ｆであり（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３：１９〜３２
（１９９２））、これはまた、血管透過因子（ＶＰＦ）としても公知である。
【０００４】 血管内皮増殖因子は、その標的細胞特異性が血管内皮細胞に制限されているよ
うである、分泌される脈管形成マイトジェンである。マウスＶＥＧＦ遺伝子は、
特徴付けられ、そして胚形成におけるその発現パターンが解析された。ＶＥＧＦ
の持続的な発現が、有窓内皮に隣接する上皮細胞において（例えば、脈絡叢およ
び腎糸球体において）観察された。このデータは、内皮細胞の増殖および分化の
多機能性レギュレーターとしてのＶＥＧＦの役割に一致した（Ｂｒｅｉｅｒ，Ｇ
．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１４：５２１〜５３２（１９９２））。
【０００５】 ＶＥＧＦは、ヒト血小板由来増殖因子、ＰＤＧＦａおよびＰＤＧＦｂと、配列
相同性を共有する（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３０
６〜１３０９（１９８９））。相同性の程度は、それぞれ約２１％および２３％
である。ジスルフィド結合形成に寄与する８つのシステイン残基は、これらのタ
ンパク質に厳密に保存される。これらは類似するが、ＶＥＧＦとＰＤＧＦとの間
には特異的な差異が存在する。ＰＤＧＦは結合組織に対する主要な増殖因子であ
るのに対して、ＶＥＧＦは内皮細胞に高度に特異的である。選択的スプライシン
グされたｍＲＮＡが、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、およびＰＤＧＦのいずれにおいても
同定されており、そしてこれらの異なるスプライシング産物は、生物学的活性お
よびレセプター結合特異性が異なる。ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦは、ホモ二量体ま
たはヘテロ二量体として機能し、そしてレセプターに結合する。このレセプター
は、レセプターの二量体化の後に内因性のチロシンキナーゼ活性を顕すレセプタ
ーに結合する。
【０００６】 ＶＥＧＦは、選択的スプライシングによる、１２１、１６５、１８９、および
２０６アミノ酸の４つの異なる形態を有する。ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１
６５は、可溶性でありそして脈管形成を促進し得る。一方、ＶＥＧＦ１８９およ
びＶＥＧＦ２０６は、細胞表面中のヘパリン含有プロテオグリカンに結合される
。ＶＥＧＦの時期的および空間的な発現は、血管の生理学的増殖に相関していた
（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，Ｃ．Ｍ．およびＣａｒｂｏｎ，Ｓ．Ｊ．、Ｃｅｌｌ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．１３９：５７０〜５７９（１９８９）；ＭｃＮｅｉｌ，Ｐ．Ｌ．ら
、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９：８１１〜８２２（１９８９））。その高親
和性結合部位は、組織切片において内皮細胞上のみに位置付けられる（Ｊａｋｅ
ｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：２４４〜２５３（１９８
９））。この因子は下錘体細胞およびいくつかの腫瘍細胞株から単離され得、そ
してある種のヒト神経膠腫と関係している（Ｐｌａｔｅ，Ｋ．Ｈ．、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５９：８４５〜８４８（１９９２））。興味深いことに、ＶＥＧＦ１２１
またはＶＥＧＦ１６５の発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に、ヌードマ
ウス中で腫瘍を形成する能力を与える（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１６０〜１７０（１９９３））。抗ＶＥＧＦモノクロー
ナル抗体によるＶＥＧＦ機能の阻害は、免疫欠損マウスにおける腫瘍増殖を阻害
することが示された（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１〜８４
４（１９９３））。さらに、ＶＥＧＦレセプターのドミナントネガティブ変異体
が、マウスにおける膠芽腫増殖を阻害することが示された。
【０００７】 血管透過因子（ＶＰＦ）はまた、傷害の停止後でさえも血漿タンパク質に対す
る持続的な微小血管の高透過性（ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｐｅ
ｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）（これは、正常な創傷治癒の特徴的な特性である）を担
うことが見出されている。これは、ＶＰＦが、創傷治癒における重要な因子であ
ることを示唆する。Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：
１３７５−１３７９（１９９２）。
【０００８】 ＶＥＧＦの発現は、血管新生した組織（例えば、肺、心臓、胎盤、および固形
腫瘍）において高く、そして時間的および空間的の両方で脈管形成に相関する。
ＶＥＧＦはまた、インビボで脈管形成を誘導することが示されている。脈管形成
は正常組織、特に血管組織の修復に必須であるので、ＶＥＧＦは血管組織修復を
促進させることにおける使用が提案されてきた（例えば、アテローム性動脈硬化
症において）。
【０００９】 Ｃｈｅｎらに１９９１年１２月１７日に発行された米国特許第５，０７３，４
９２号は、適切な環境において内皮細胞の増殖を相乗的に増強するための方法を
開示する。この方法は、環境にＶＥＧＦ、エフェクター、および血清由来因子を
添加する工程を包含する。また、血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットＤＮＡが
、ポリメラーゼ連鎖反応技術により調製された。このＤＮＡは、ヘテロ二量体ま
たはホモ二量体のいずれとしても存在し得るタンパク質をコードする。このタン
パク質は、哺乳動物血管内皮細胞マイトジェンであり、そして、１９９２年９月
３０日に公開された欧州特許出願第９２３０２７５０．２号に開示されるように
、それ自体が血管の発達および修復の促進のために有用である。
【００１０】 （網膜） 分化した網膜は、７つの細胞型から構成される：感覚（網膜杵体お
よび網膜錘体の光受容体）、グリア（ミュラー細胞）、および２つの型のニュー
ロン、介在ニューロン、（水平、双極性、および無軸索）、ならびに突出ニュー
ロン（神経節細胞）。網膜における種々の細胞型の発達は、網膜錘体の大部分、
ならびに出生前に発達する神経節および水平細胞と同調しては起こらない。対照
的に、ラット網膜における主要な細胞型である、大部分の網膜杵体の分化は、出
生後に起こる。網膜前駆細胞の子孫のクローン分析は、これらの先祖細胞が種々
の組合せの網膜細胞型を産生し得ることを実証し、このことは、少なくともいく
らかの先祖が多能性であることを示す。さらに、インビボおよびインビトロの両
方の研究からの知見は、細胞の最終表現型が大部分は系列に依存しないことを示
唆し、このことは、網膜内の微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）を
変化させることが、先祖細胞、および子孫の分化した表現型の細胞ポテンシャル
を決定する際に役割を有することを提唱する。
【００１１】 インビトロで、網膜細胞の増殖および分化は、種々の因子（例えば、ＦＧＦ−
２、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＴＧＦ、レチノイン酸、およびＢＤＮＦ）、ならびに細
胞外マトリックスおよび細胞接着分子（例えば、ｓ−ラミニン）によって調節さ
れる。ＹａｎｇおよびＣｅｐｋｏ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６（１９）：６０
８９〜６０９９（１９９６））ならびにより最近にはＷｅｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７３（４）：２０９０〜２０９７（１９９８））は、ＶＥＧＦＲ−
２／ＦＬＫ−１（ＶＥＧＦレセプターファミリーのメンバー）を同定し、そして
その発現パターンを特徴付けた。ＶＥＧＦＲ転写物は、最初に、発達中の網膜血
管系および神経網膜の中心領域に関連して、Ｅ１１．５において検出される（Ｙ
ａｎｇおよびＣｅｐｋｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６（１９）：６０８９〜６
０９９（１９９６））。２つの事象が関連するか否かは知られていないが、この
発達周期もまた、神経節細胞の発達の発生によって、特徴づけられる。発達日Ｅ
１５まで、ＶＥＧＦＲ−２発現は網膜の周囲に広がり、網膜発達の外向きの勾配
に一致する。ＶＥＧＦＲ−２発現は、神経発生がそのピークにあり、そして多数
の有糸分裂後のニューロンが形成され始める場合に、周産期の間に血管のゾーン
に大きく局在化した。
【００１２】 ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦスーパーファミリーは、現在７つのメンバーを含む。ＶＥ
ＧＦサブファミリーの５つのメンバーは、異なるが重なる特異性で、４つの異な
るＶＥＧＦチロシンキナーゼレセプターに結合する。ＶＥＧＦ（基本型のファミ
リーメンバーである３４〜３６ｋＤａのホモ二量体糖タンパク質）は、ＶＥＧＦ
Ｒ−１およびＶＥＧＦＲ−２に結合する。ＶＥＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦ−Ｄは、
それぞれＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−３のみに結合する。ＶＥＧＦ−Ｃ、
ＶＥＧＦ−２がＶＥＧＦＲ−３に対して最も高い親和性を有するが、これはまた
、より低い親和性でＶＥＧＦＲ−２にも結合する。一旦活性化されると、ＶＥＧ
Ｆレセプターは、シグナル伝達経路の下流の多数のタンパク質（ホスファチジル
イノシトール３−キナーゼ、ホスホリパーゼＣ、ＧＡＰ、およびＮｃｋを含む）
を、チロシンリン酸化する。
【００１３】 遺伝性の網膜変性疾患（「ＨＲＤ疾患」）は、一群の遺伝した状態であり、こ
こで、網膜構造体の進行性の両側性の退化が、網膜機能の損失をもたらす；これ
らの疾患としては、例えば、加齢性黄斑変性（初老における視覚障害の主要な原
因）；レーバー先天性黒内障（これは、その犠牲者を生まれながらに盲目にする
）；および色素性網膜炎（「ＲＰ」）が挙げられる。ＲＰとは、光フラッシュに
対する網膜の電気的応答（すなわち、網膜電位図（「ＥＲＧ」））の振幅が減少
した、網膜の光受容体（網膜杵体および網膜錘体）の損失により特徴付けられる
、遺伝した網膜症に与えられた名称である。この疾患が進行するにつれて、患者
は網膜小動脈の減衰を示し、そして頻繁に、網膜の「骨小棘」色素沈着および光
学ディスクのロウ状蒼白を示す。
【００１４】 合衆国におけるＲＰの発生数は、約１：３５００出生と見積もられている。家
族性の場合のＲＰは、通常、周辺網膜における網膜杵体の損失に起因して、夜盲
および中周辺（ｍｉｄｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）視野の損失を伴って、小児期に存
在する。この状態が進行するにつれて、視野の収縮が最終的に、失明をもたらす
。進行した段階の眼底試験における兆候としては、網膜血管の減衰、周辺眼底に
おける網膜内色素、および光学ディスクのロウ状蒼白が挙げられる。眼底試験の
視覚の異常の非存在下での初期の段階においてさえ、患者は、網膜からの異常な
光誘発の電気的な応答（すなわち、網膜電位図（「ＥＲＧ」））を有する。組織
病理学的研究は、進行した段階における光受容体の広範にわたる損失を明らかに
した。従って、光受容細胞の疾患および傷害を処置する方法が、当該分野におい
て必要とされる。
【００１５】 （発明の要旨） 本発明のポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦに対するアミノ酸配列相同性に基づい
て、新規な血管内皮増殖因子として推定的に同定された。
【００１６】 本発明の１つの局面によれば、新規な成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に
活性な、そして診断的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナログ、お
よび誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のポリペプチドで
ある。
【００１７】 本発明の別の局面によれば、配列番号２または４にそれぞれ示されるアミノ酸
配列、あるいは１９９５年５月１２日のＡＴＣＣ受託番号９７１４９または１９
９４年３月４日のＡＴＣＣ受託番号７５６９８として、細菌宿主中に寄託された
ｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペ
プチド（全長または短縮）をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核
酸分子が提供される。
【００１８】 本発明はまた、生物学的に活性であり、診断的にまたは治療的に有用な、ＶＥ
ＧＦ−２のフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。
【００１９】 本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術によっ
て産生するためのプロセスが提供され、このプロセスは、組換え原核生物宿主細
胞および／または真核生物宿主細胞を培養する工程、本発明のポリペプチドをコ
ードする核酸配列を、上記タンパク質の発現および引き続く上記タンパク質の回
収を促進する条件下で、接触させる工程を包含する。
【００２０】 本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体および
このような抗体を産生するためのプロセスが提供される。
【００２１】 本発明の別の局面によれば、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズする
に十分な長さの核酸分子を含む、核酸プローブが提供される。
【００２２】 本発明の別の局面によれば、本発明の核酸配列およびこのような核酸配列によ
りコードされるタンパク質における変異に関する疾患またはこのような疾患に対
する感受性を診断する方法が提供される。
【００２３】 本発明のなおさらなる局面によれば、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡ
ベクターの製造に関するインビトロの目的で、このようなポリペプチド、または
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセ
スが提供される。
【００２４】 本発明のなおさらなる局面によれば、例えば、光受容細胞の増殖を保護または
刺激するための、治療目的で、このようなポリペプチドまたはこのようなポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。
【００２５】 本発明のなお別の局面によれば、例えば、光受容体増殖を阻害または防止する
ために使用され得る、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供さ
れる。
【００２６】 本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ
るべきである。
【００２７】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明の１局面によれば、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するＶ
ＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分
子が提供され、この推定アミノ酸配列はクローン化されたｃＤＮＡを配列決定す
ることによって決定された。配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、ｃＤＮ
Ａクローンを配列決定することによって得られ、これは、１９９５年５月１２日
に、バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ １０８０１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９
が付与された。
【００２８】 本発明の別の局面によれば、図２（配列番号４）の推定アミノ酸配列を有する
短縮型ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子が提供され、この推定アミノ酸配列はクローン化されたｃＤＮＡを配
列決定することによって決定された。配列番号３に示されるヌクレオチド配列は
、ｃＤＮＡクローンを配列決定することによって決定され、これは、１９９４年
３月４日に、バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ １０８０１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号７
５６９８が付与された。
【００２９】 他に指示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって
決定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシーケンサー（例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ３７３）を使
用して決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によってコードされ
るポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定されたＤＮＡ配列の
翻訳によって予測された。それ故に、この自動化アプローチによって決定された
任意のＤＮＡ配列について当該分野で公知であるように、本明細書中で決定され
た任意のヌクレオチド配列は、幾つかの誤差を含み得る。自動化によって決定さ
れたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列
に対して、代表的には、少なくとも約９０％同一であり、より代表的には、少な
くとも９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。この実際の配列は、当該分
野において周知の手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより
正確に決定され得る。同様に当該分野で公知であるように、実際の配列と比較し
て決定されたヌクレオチド配列の単一の挿入または欠失は、そのヌクレオチド配
列の翻訳において、決定されたヌクレオチド配列によってコードされた推定アミ
ノ酸配列が、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされたアミノ酸配
列とは全く異なるように、そのような挿入または欠失の位置で始まるフレームシ
フトを生じる。
【００３０】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、初期段階のヒト胚（
８週〜９週）骨巨細胞腫、成人心臓または幾つかの乳癌細胞株から得られ得る。
本発明のポリヌクレオチドは、初期段階ヒト胚（９週）由来のｃＤＮＡライブラ
リーに発見された。それは、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーに構造的に関連する
。約４１９個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームを含み、このうちおよそ最初の２３のアミノ酸残基は推定リーダー配列で
あり、その結果成熟タンパク質は３９６個のアミノ酸を含み、そしてこのタンパ
ク質は、ヒト血管内皮増殖因子（３０％同一性）、続いて、ＰＤＧＦａ（２４％
）およびＰＤＧＦｂ（２２％）に対して、最高のアミノ酸配列相同性を示す（図
４を参照のこと）。全ての８個のシステインは、ファミリーの全ての４のメンバ
ーに保存されることは特に重要である（図３の四角領域を参照のこと）。さらに
、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのためのシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）
、ＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣＮ（配列番号８）は、ＶＥＧＦ−２に保存される
（図３を参照のこと）。ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦおよび２つのＰＤＧＦの間の相
同性は、タンパク質配列レベルにある。ヌクレオチド配列相同性は全く検出され
得ず、それ故に低いストリンジェンシーハイブリダイゼーションのような単純な
アプローチによってＶＦＧＦ−２を単離することは困難である。
【００３１】 本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、その全長ポリペプチドおよび任意のリ
ーダー配列および全長ポリペプチドの活性フラグメントについてコードするポリ
ヌクレオチド配列を含むことを意味する。活性フラグメントは、配列番号２に示
されるような全長アミノ酸配列の全４１９アミノ酸より少ないアミノ酸を有する
全長アミノ酸の任意の部分を含むことを意味するが、図３に示される保存される
８個のシステイン残基をさらに含み、そしてさらにＶＥＧＦ−２活性を有する。
【００３２】 通常の組織に存在する少なくとも２つの選択的にスプライシングされたＶＥＧ
Ｆ−２ｍＲＮＡ配列が存在する。図７、レーン５の２つのバンドは、本発明のＶ
ＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの
存在を示す。
【００３３】 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得、こ
のＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二
本鎖か、一本鎖であり得る。この一本鎖はコード鎖であり得るか、または非コー
ド（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は
、図１または図２に示されるコード配列、または寄託されたクローンのコード配
列と同一であり得るか、または遺伝子コードの重複性または縮重性の結果として
、図１、図２、または寄託されたｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする
異なるコード配列であり得る。
【００３４】 図１または図２の成熟ポリペプチドについて、または寄託されたｃＤＮＡによ
ってコードされた成熟ポリペプチドについてコードするポリヌクレオチドには、
成熟ポリペプチドについてのコード配列のみ；成熟ポリペプチドについてのコー
ド配列および付加的コード配列（リーダー配列もしくは分泌配列またはプロタン
パク質配列）；成熟ポリペプチドについてのコード配列（および必要に応じて、
付加的コード配列）および非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペ
プチドについてのコード配列の非コード配列５’および／または３’）が挙げら
れ得る。
【００３５】 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドについてのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、および付加的コード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００３６】 本発明はさらに、図１または２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体についてコードする本明細書中に記載され
るポリヌクレオチド、または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされ
るポリペプチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオ
チドの天然に存在する対立遺伝子の改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在
しない改変体であり得る。
【００３７】 従って、本発明は、図１または２に示されるものと同じ成熟ペプチドまたは寄
託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、ならびに図１または２のポリペプチドまたは寄託され
たクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導
体、またはアナログについてコードするこのようなポリヌクレオチドの改変体を
含む。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加
改変体または挿入改変体を含む。
【００３８】 本明細書中の上記に示されるように、ポリヌクレオチドは、図１または２に示
されるコード配列、または寄託されたクローンのコード配列の、天然に存在する
対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。
【００３９】 当該分野で公知であるように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレオチド
の置換、欠失または付加を有するポリヌクレオチド配列の代替の形態であり、こ
れは、コードされたポリペプチドの機能を実質的に変更しない。
【００４０】 本発明はまた、ポリヌクレオチドを含み、ここで、成熟ポリペプチドについて
のコード配列は、宿主細胞由来のポリペプチドの発現および分泌を援助するポリ
ヌクレオチド（例えば、細胞由来のポリペプチドの輸送を制御するための分泌配
列として機能するリーダー配列）と同じリーディングフレームに融合され得る。
リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、ポリペプチドの
成熟した形態を形成するために宿主細胞によって切断されたリーダー配列を有し
得る。このポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質および付加的５’アミノ酸
残基であるプロタンパク質についてコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパ
ク質は、プロタンパク質であり、そしてそのタンパク質の不活性な形態である。
一旦プロ配列が切断されると、活性成熟タンパク質が残存する。
【００４１】 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質について、ま
たはプロ配列を有するタンパク質について、またはプロ配列およびプレ配列（リ
ーダー配列）の両方を有するタンパク質について、コードし得る。
【００４２】 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列に対して、インフレームで融合されたコード配列を有し得る。この
マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精
製を提供するためにｐＱＥ−９ベクターによって供給されたヘキサヒスチジンタ
グであり得るか、または哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される
際に、このマーカー配列は赤血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、
インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓ
ｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））。
【００４３】 本発明のさらなる実施形態は、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有
するが、Ｎ末端メチオニンに欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の約１〜約３９６の位置にアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれる
ｃＤＮＡクローンによってコードされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤ
ＮＡクローンによってコードされたアミノ酸配列を有する成熟ＶＥＧＦ−２ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）
、（ｄ）、もしくは（ｅ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチ
ド配列、に対して少なくとも９５％同一であり、より好ましくは少なくとも９６
％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドを含む単離された核酸分子を含む。
【００４４】 本発明のさらなる実施形態は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有
するが、Ｎ末端メチオニンに欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号４の約１〜約３２６の位置にアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれる
ｃＤＮＡクローンによってコードされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤ
ＮＡクローンによってコードされたアミノ酸配列を有する成熟ＶＥＧＦ−２ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）
、（ｄ）、もしくは（ｅ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチ
ド配列、に対して少なくとも９５％同一であり、より好ましくは少なくとも９６
％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドを含む単離された核酸分子を含む。
【００４５】 ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば
、少なくとも９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによ
り、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の１００ヌク
レオチドごとに５つまでの変化を含み得ることを除いて、そのポリヌクレオチド
のヌクレオチド配列が、参照配列に同一であることを意図する。換言すると、参
照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌ
クレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの５％までが、欠失または、
別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列の合計ヌクレオチド残基の
５％までの幾らかのヌクレオチドが、その参照配列に挿入され得る。参照配列の
これらの変化は、参照ヌクレオチド配列の５Ｎ末端位置かまたは３Ｎ末端位置で
か、あるいはこれらの末端位置間のどこかで生じ得、参照配列の残基間で個々に
か、または参照配列内で１個以上連続する群としてかのいずれかで間に散在する
。
【００４６】 実際的な問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１または３
に示されるヌクレオチド配列、あるいは寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオ
チド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であ
るかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎ
ｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉ
ｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープロ
グラムを使用して従来のように決定され、２つの配列の間の相同性の最良のセグ
メントを見出し得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間で相同性の高いセグメン
トを見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９，１９８１
）の局所アルゴリズムを使用する。特定の配列が、本発明に従う参照配列に、例
えば９５％同一かどうか決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列
アライメントプログラムを使用する場合、もちろん、参照ヌクレオチド配列の全
長に渡って同一性の百分率が算出されるように、そして参照配列中のヌクレオチ
ドの合計の数の５％までの相同性のギャップが許容されるように、パラメーター
は設定される。
【００４７】 ＶＥＧＦ−２改変体は、コード領域、非コード領域、または両方における変化
に関与し得る。特に好ましくは、サイレントな置換、付加および欠失を産生する
変化を含むポリヌクレオチド改変体であるが、コードされるポリペプチドの特性
または活性を変化しない。遺伝コードの縮重に起因するサイレント置換によって
産生されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、５〜１０、１〜５または
１〜２アミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加される改変体もま
た、好ましい。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド改変体は、例えば、特定の宿主の
ためのコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンをＥ．ｃｏｌｉの
ような細菌宿主によって好ましいコドンへ変化させる）ために、種々の理由によ
って産生され得る。
【００４８】 例えば、ＶＥＧＦ−２のアミノ酸レベルでの部位指向性変化は、特定のアミノ
酸を保存的アミノ酸へ置換することによって作製され得る。好ましい保存的変異
は、以下を含む：配列番号２のＭ１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置
換した；Ｈ２を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｓ３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、
またはＶに置換した；Ｌ４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ｇ５を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ６を、Ｗ、またはＹ
に置換した；Ｆ７を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｓ８をＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ
、またはＶに置換した；Ｖ９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した
；Ａ１０を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ１２を、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ１３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶに置換した；Ｌ１４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した
；Ａ１５を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ１６を、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ１７を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶに置換した；Ｌ１８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した
；Ｌ１９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ２１を、Ａ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ２３を、Ｈ、またはＫに置換した；
Ｅ２４を、Ｄに置換した；Ａ２５を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換
した；Ａ２７を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ２８を、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ２９を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶに置換した；Ａ３０を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換
した；Ａ３１を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ３２を、Ｗ
、またはＹに置換した；Ｅ３３を、Ｄに置換した；Ｓ３４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ３５を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｌ３６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ３７を
、Ｅに置換した；Ｌ３８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ
３９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ４０を、Ｅに置換し
た；Ａ４１を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ４２を、Ｄに
置換した；Ｄ４４を、Ｅに置換した；Ａ４５を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶに置換した；Ｇ４６を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ
４７を、Ｄに置換した；Ａ４８を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｔ４９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ５０を、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｙ５１を、Ｆ、またはＷに置換した
；Ａ５２を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ５３を、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ５４を、Ｈ、またはＲに置換した；
Ｄ５５を、Ｅに置換した；Ｌ５６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換
した；Ｅ５７を、Ｄに置換した；Ｅ５８を、Ｄに置換した；Ｑ５９を、Ｎに置換
した；Ｌ６０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ６１を、Ｈ
、またはＫに置換した；Ｓ６２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｖ６３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｓ６４を、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ６５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ
、またはＶに置換した；Ｖ６６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換し
た；Ｄ６７を、Ｅに置換した；Ｅ６８を、Ｄに置換した；Ｌ６９を、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｍ７０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、また
はＶに置換した；Ｔ７１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｖ
７２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｌ７３を、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｙ７４を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｅ７
６を、Ｄに置換した；Ｙ７７を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｗ７８を、Ｆ、また
はＹに置換した；Ｋ７９を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｍ８０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した；Ｙ８１を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｋ８２
を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｑ８４を、Ｎに置換した；Ｌ８５を、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ８６を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｋ８
７を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｇ８８を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
に置換した；Ｇ８９を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｗ９０
を、Ｆ、またはＹに置換した；Ｑ９１を、Ｎに置換した；Ｈ９２を、Ｋ、または
Ｒに置換した；Ｎ９３を、Ｑに置換した；Ｒ９４を、Ｈ、またはＫに置換した；
Ｅ９５を、Ｄに置換した；Ｑ９６を、Ｎに置換した；Ａ９７を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ９８を、Ｑに置換した；Ｌ９９を、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ１００を、Ｑに置換した；Ｓ１０１を
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ１０２を、Ｈ、またはＫに
置換した；Ｔ１０３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ１０
４を、Ｄに置換した；Ｅ１０５を、Ｄに置換した；Ｔ１０６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｉ１０７を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｋ１０８を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｆ１０９を、Ｗ、または
Ｙに置換した；Ａ１１０を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ
１１１を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ１１２を、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｈ１１３を、Ｋ、またはＲに置換した
；Ｙ１１４を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｎ１１５を、Ｑに置換した；Ｔ１１６
を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ１１７を、Ｄに置換した
；Ｉ１１８を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ１１９を、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ１２０を、Ｈ、またはＲに置換
した；Ｓ１２１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｉ１２２を
、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ１２３を、Ｅに置換した；
Ｎ１２４を、Ｑに置換した；Ｅ１２５を、Ｄに置換した；Ｗ１２６を、Ｆ、また
はＹに置換した；Ｒ１２７を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｋ１２８を、Ｈ、また
はＲに置換した；Ｔ１２９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ｑ１３０を、Ｎに置換した；Ｍ１３２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに
置換した；Ｒ１３４を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｅ１３５を、Ｄに置換した；
Ｖ１３６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｉ１３８を、Ａ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ１３９を、Ｅに置換した；Ｖ１４
０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｇ１４１を、Ａ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ１４２を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｅ
１４３を、Ｄに置換した；Ｆ１４４を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｇ１４５を、
Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｖ１４６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ａ１４７を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
に置換した；Ｔ１４８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ１
４９を、Ｑに置換した；Ｔ１５０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換
した；Ｆ１５１を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｆ１５２を、Ｗ、またはＹに置換
した；Ｋ１５３を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｖ１５７を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、またはＭに置換した；Ｓ１５８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｖ１５９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｙ１６
０を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｒ１６１を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｇ１６
３を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ１６４を、Ａ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ１６７を、Ｑに置換した；Ｓ１６８を、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ１６９を、Ｄに置換した；Ｇ
１７０を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ１７１を、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ１７２を、Ｎに置換した；Ｍ１７４
を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した；Ｎ１７５を、Ｑに置換した
；Ｔ１７６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ１７７を、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｔ１７８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ１７９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｙ１８０を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｌ１８１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ１８２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｋ１８３を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｔ１８４を、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ１８５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶに置換した；Ｆ１８６を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｅ１８７を、Ｄに置
換した；Ｉ１８８を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｔ１８９
を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｖ１９０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｌ１９２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶに置換した；Ｓ１９３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ｑ１９４を、Ｎに置換した；Ｇ１９５を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｋ１９７を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｖ１９９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｔ２００を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｉ２０１を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ
２０２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ２０３を、Ｗ、ま
たはＹに置換した；Ａ２０４を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した
；Ｎ２０５を、Ｑに置換した；Ｈ２０６を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｔ２０７
を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ２０８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ２１０を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｍ２
１２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した；Ｓ２１３を、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ２１４を、Ｈ、またはＲに置換した；
Ｌ２１５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ２１６を、Ｅに
置換した；Ｖ２１７を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｙ２１
８を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｒ２１９を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｑ２２
０を、Ｎに置換した；Ｖ２２１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換し
た；Ｈ２２２を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｓ２２３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
Ｍ、またはＶに置換した；Ｉ２２４を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｉ２２５を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ２２６
を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｒ２２７を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｓ２２８
を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ２２９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ２３１を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶに置換した；Ｔ２３２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ｌ２３３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ２３５を、Ｎに
置換した；Ｑ２３７を、Ｎに置換した；Ａ２３８を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶに置換した；Ａ２３９を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｎ２４０を、Ｑに置換した；Ｋ２４１を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｔ２４
２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｔ２４５を、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ２４６を、Ｑに置換した；Ｙ２４７を、
Ｆ、またはＷに置換した；Ｍ２４８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置
換した；Ｗ２４９を、Ｆ、またはＹに置換した；Ｎ２５０を、Ｑに置換した；Ｎ
２５１を、Ｑに置換した；Ｈ２５２を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｉ２５３を、
Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ２５５を、Ｈ、またはＫに置
換した；Ｌ２５７を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ２５８
を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ２５９を、Ｎに置換した
；Ｅ２６０を、Ｄに置換した；Ｄ２６１を、Ｅに置換した；Ｆ２６２を、Ｗ、ま
たはＹに置換した；Ｍ２６３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した
；Ｆ２６４を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｓ２６５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ
、またはＶに置換した；Ｓ２６６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換
した；Ｄ２６７を、Ｅに置換した；Ａ２６８を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶに置換した；Ｇ２６９を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ｄ２７０を、Ｅに置換した；Ｄ２７１を、Ｅに置換した；Ｓ２７２を、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｔ２７３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、
またはＶに置換した；Ｄ２７４を、Ｅに置換した；Ｇ２７５を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ２７６を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｈ２７
７を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｄ２７８を、Ｅに置換した；Ｉ２７９を、Ａ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ２８１を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ２８３を、Ｑに置換した；Ｋ２８４を、Ｈ、または
Ｒに置換した；Ｅ２８５を、Ｄに置換した；Ｌ２８６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ２８７を、Ｅに置換した；Ｅ２８８を、Ｄに置換し
た；Ｅ２８９を、Ｄに置換した；Ｔ２９０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｑ２９２を、Ｎに置換した；Ｖ２９４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭに置換した；Ｒ２９６を、Ｈ、またはＫに置換した；Ａ２９７を、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ２９８を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ２９９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
に置換した；Ｒ３００を、Ｈ、またはＫに置換した；Ａ３０２を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ３０３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、また
はＶに置換した；Ｇ３０５を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ｈ３０７を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｋ３０８を、Ｈ、またはＲに置換した；
Ｅ３０９を、Ｄに置換した；Ｌ３１０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｄ３１１を、Ｅに置換した；Ｒ３１２を、Ｈ、またはＫに置換した；
Ｎ３１３を、Ｑに置換した；Ｓ３１４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｑ３１６を、Ｎに置換した；Ｖ３１８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
またはＭに置換した；Ｋ３２０を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｎ３２１を、Ｑに
置換した；Ｋ３２２を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｌ３２３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ３２４を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｓ３２
６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ３２７を、Ｎに置換し
た；Ｇ３２９を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ３３０を、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ３３１を、Ｑに置換した；Ｒ
３３２を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｅ３３３を、Ｄに置換した；Ｆ３３４を、
Ｗ、またはＹに置換した；Ｄ３３５を、Ｅに置換した；Ｅ３３６を、Ｄに置換し
た；Ｎ３３７を、Ｑに置換した；Ｔ３３８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｑ３４０を、Ｎに置換した；Ｖ３４２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭに置換した；Ｋ３４４を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｒ３４５を、
Ｈ、またはＫに置換した；Ｔ３４６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｒ３４９を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｎ３５０を、Ｑに置換した；Ｑ
３５１を、Ｎに置換した；Ｌ３５３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｎ３５４を、Ｑに置換した；Ｇ３５６を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶに置換した；Ｋ３５７を、Ｈ、またはＲに置換した；Ａ３５９を、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ３６１を、Ｄに置換した；Ｔ３６３
を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ３６４を、Ｄに置換した
；Ｓ３６５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ３６７を、Ｎ
に置換した；Ｋ３６８を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｌ３７０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ３７１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶに置換した；Ｋ３７２を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｇ３７３を、Ａ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ３７４を、Ｈ、またはＲに置換した；
Ｋ３７５を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｆ３７６を、Ｗ、またはＹに置換した；
Ｈ３７７を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｈ３７８を、Ｋ、またはＲに置換した；
Ｑ３７９を、Ｎに置換した；Ｔ３８０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｓ３８２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｙ３８
４を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｒ３８５を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｒ３８
６を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｔ３８９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｎ３９０を、Ｑに置換した；Ｒ３９１を、Ｈ、またはＫに置換し
た；Ｑ３９２を、Ｎに置換した；Ｋ３９３を、Ｈ、またはＲに置換した；Ａ３９
４を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ３９６を、Ｄに置換し
た；Ｇ３９８を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ３９９を、
Ｗ、またはＹに置換した；Ｓ４００を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｙ４０１を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｓ４０２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ４０３を、Ｄに置換した；Ｅ４０４を、Ｄに置
換した；Ｖ４０５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｒ４０７
を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｖ４０９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ
に置換した；Ｓ４１１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｙ４
１２を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｗ４１３を、Ｆ、またはＹに置換した；Ｑ４
１４を、Ｎに置換した；Ｒ４１５を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｑ４１７を、Ｎ
に置換した；Ｍ４１８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した；およ
び／またはＳ４１９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した。
【００４９】 生じた構築物は、本明細書中を通じて記載される活性または機能について慣用
的にスクリーニングされ得、そして当該分野において公知である。好ましくは、
生じた構築物は、増加したおよび／または減少したＶＥＧＦ−２活性または機能
を有するが、残存するＶＥＧＦ−２活性または機能は、維持される。さらに好ま
しくは、生じた構築物は、１より多い増加したおよび／または減少したＶＥＧＦ
−２活性または機能を有するが、残存するＶＥＧＦ−２活性または機能は、維持
される。
【００５０】 保存的アミノ酸置換に加えて、ＶＥＧＦ−２の改変体は、以下を含む：（ｉ）
１つ以上の非保存的アミノ酸残基との置換（ここで、この置換されたアミノ酸は
遺伝コードによってコードされてもされなくてもよい）、または（ｉｉ）置換基
を有する１つ以上のアミノ酸残基との置換、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチド
の別の化合物との融合（例えば、ポリペプチドの安定性および／または可溶性を
増加する化合物（例えば、ポリエチレングリコール））、または（ｉｖ）ポリペ
プチドのさらなるアミノ酸との融合（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド、
またはリーダー配列もしくは分泌配列、または精製を容易にする配列）。このよ
うな改変体ポリペプチドは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると認めら
れる。
【００５１】 例えば、荷電したアミノ酸の他の荷電したアミノ酸または中性のアミノ酸との
アミノ酸置換を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチド改変体は、改善された特性（例え
ば、凝集しにくい）を有するタンパク質を産生し得る。薬学的処方物の凝集は、
凝集体の免疫原性活性に起因して、活性を減少し、そしてクリアランスを増加す
る。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−
３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８
４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１
９９３））。
【００５２】 例えば、好ましいＶＥＧＦ−２の非保存的な置換としては、以下が挙げられる
：配列番号２の、Ｍ１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｈ２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ７
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｓ８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｖ９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ａ１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｃ１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｓ１２（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１３（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１４
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ
１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ａ１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ａ１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｌ１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｌ１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｐ２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｇ２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ２２（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで
置換される）；Ｒ２３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ２４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２５
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ
２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、またはＣで置換される）；Ａ２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｅ３３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ３５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ３７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ
３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｓ３９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｄ４０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ４２（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ４３
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、またはＣで置換される）；Ｄ４４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ４５（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ４６（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ４７（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ａ４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｔ４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ａ５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ５３（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ５４（Ｄ
、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｄ５５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ５７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｅ５８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ５９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ６０（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ６１（Ｄ
、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｓ６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｖ６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｓ６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｓ６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ６７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ６８（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｌ６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｍ７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｔ７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ７５（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ま
たはＣで置換される）；Ｅ７６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ７７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｗ７８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｋ７９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｋ８２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ８４（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｌ８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｒ８６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ８７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ
８８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｇ８９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｗ９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ９２（Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｎ９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ９４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ９５（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｑ９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ９７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｌ９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｎ１００（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１０２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｔ１０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｅ１０４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１０５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１０
６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｉ１０７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｋ１０８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ１０９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１１０（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１１１
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ
１１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｈ１１３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ１１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ１１５（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｔ１１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｅ１１７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ１１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１１９（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１２０（
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｓ１２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｉ１２２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ１２３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ１２４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｅ１２５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ１２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｒ１２７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｋ１２８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ１３０（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｃ１３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｍ１３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ１３３（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、または
Ｃで置換される）；Ｒ１３４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１３５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｖ１３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｃ１３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｉ１３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ１３９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｖ１４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｇ１４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｋ１４２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１４３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｆ１４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ１４５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１４７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ１４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｔ１５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｆ１５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ１５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１
５３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｐ１５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｐ１５５（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、または
Ｃで置換される）；Ｃ１５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｖ１５７（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１５８（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１５９
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ
１６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｒ１６１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ１６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置
換される）；Ｇ１６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｇ１６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｃ１６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｃ１６６（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、また
はＰで置換される）；Ｎ１６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１６９（Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｇ１７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｌ１７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｑ１７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ１７３（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、または
Ｐで置換される）；Ｍ１７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｎ１７５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１７６（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１７７（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１７
８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｓ１７９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｙ１８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１８３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ
１８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｌ１８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｆ１８６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１８７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ１８
８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｔ１８９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｖ１９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｐ１９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｌ１９２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ１９４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｇ１９５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｐ１９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｋ１９７（Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｐ１９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｖ１９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２００（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ２０１（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２０２（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ２
０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ａ２０４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ２０５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ２０６（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｔ２０７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｓ２０８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｃ２０９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｒ２１０（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｃ２１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｍ２１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２１４（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｌ２１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｄ２１６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ２１８（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｒ２１９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ２２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２２１
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ
２２２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｓ２２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ２２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ２２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ２２６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ２
２７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｓ２２８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ２３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ａ２
３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｔ２３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｌ２３３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｐ２３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｑ２３５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｃ２３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ２３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ
２３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ａ２３９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｎ２４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２４１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２４
２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｃ２４３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｐ２４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｔ２
４５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｎ２４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ２４７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ２４８（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ２４９
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｎ２５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ２５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｈ２５２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ２５３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ２５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；
Ｒ２５５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｃ２５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｌ２５７（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２５
８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｑ２５９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ２６０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２６１（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｆ２６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ２６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ２６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｓ２６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｓ２６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｄ２６７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ２６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２７０（Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｄ２７１（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２７４（Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｇ２７５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｆ２７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ２７７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｄ２７８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ２７９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ２８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；
Ｇ２８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｐ２８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｎ２８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ
２８４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｅ２８５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２８６（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２８７（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｅ２８８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ２８９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｔ２９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｃ２９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ２９２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｃ２９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｖ２９４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ２９５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換され
る）；Ｒ２９６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２９７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ２９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３００（Ｄ、Ｅ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｐ３０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ａ３０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３０４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置
換される）；Ｇ３０５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｐ３０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｈ３０７（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｋ３０８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ３０９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ３１０（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ３
１１（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｒ３１２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ３１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｓ３１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｃ３１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ３１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｃ３１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｖ３１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換
される）；Ｋ３２０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ３２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ３２
２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｌ３２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｆ３２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ３２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで
置換される）；Ｓ３２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｑ３２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３２８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置
換される）；Ｇ３２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ａ３３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｎ３３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３３２（Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｅ３３３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ３３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ３３５
（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｅ３３６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ３３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｔ３３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｃ３３９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ３４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｃ３４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｖ３４２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３４３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換
される）；Ｋ３４４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３４５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ３４６（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３
４７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｐ３４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｒ３４９
（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｎ３５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ３５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｐ３５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｌ３５３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ３５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｐ３５５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｇ３５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ３５７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ
３５８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ａ３５９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；
Ｅ３６１（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｔ３６３
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ
３６４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ３６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｑ３
６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｋ３６８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで
置換される）；Ｌ３７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｌ３７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｋ３７２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ３７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ３７４（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｋ３７５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ３７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ３７７
（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｈ３７８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ３７９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｔ３８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｃ３８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｓ３８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換
される）；Ｙ３８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３８５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３８６（
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｐ３８７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｃ３８８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置
換される）；Ｔ３８９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｎ３９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３９１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｑ３９２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ３９３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ３９４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３９５
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、またはＰで置換される）；Ｅ３９６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ３９７（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、または
Ｃで置換される）；Ｇ３９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｆ３９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ４００（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ４０１（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｓ４０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｅ４０３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ４０４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｖ４０５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｃ４０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｒ４０７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ
４０８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｖ４０９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ４１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；
Ｓ４１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｙ４１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ４１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ４１４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｒ４１５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ４１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される
）；Ｑ４１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ４１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；および／またはＳ４１９（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）。
【００５３】 得られる構築物は、本明細書の全体にわたって記載された活性または機能、お
よび当該分野において公知の活性または機能について慣用的にスクリーニングさ
れ得る。好ましくは、得られる構築物は、残存しているＶＥＧＦ−２活性または
ＶＥＧＦ−２機能を維持しながら、増加および／または減少されたＶＥＧＦ−２
活性またはＶＥＧＦ−２機能を有する。さらに好ましくは、得られる構築物は、
残存しているＶＥＧＦ−２活性またはＶＥＧＦ−２機能を維持しながら、１つよ
り多くの増加および／または減少されたＶＥＧＦ−２活性またはＶＥＧＦ−２機
能を有する。
【００５４】 以下に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドは、ポリクロナール抗
体およびモノクロナール抗体を惹起するために使用され得、これはＶＥＧＦ−２
タンパク質発現を検出する診断アッセイにおいて、またはＶＥＧＦ−２タンパク
質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用で
ある。さらに、このようなポリペプチドは、本発明に従う候補アゴニストおよび
候補アンタゴニストでもあるＶＥＧＦ−２タンパク質結合タンパク質を「捕捉」
するための、酵母の二ハイブリッドシステムにおいて使用され得る。この酵母の
二ハイブリッドシステムは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３４
０：２４５−２４６（１９８９）に記載されている。
【００５５】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトー
プは、本発明のポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープであ
る。「免疫原性エピトープ」とは、そのタンパク質全体が免疫原である場合、抗
体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピト
ープは、分子上のいくつかの場所に限定されると考えられる。一方では、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タン
パク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少
ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。
【００５６】 抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが、当該分野で周知である。例えば、Ｓｕ
ｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−
６６６頁を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパ
ク質の一次配列で頻繁に示され、一連の単純な化学的法則により特徴付けられ得
、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトー
プ）にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。非常に疎水
性であるペプチド、および６個以下のペプチドは、模倣されたタンパク質に結合
する抗体を誘導するにおいて無効である；より長く、可溶性のペプチドであり、
（特にプロリン残基を含むペプチド）は、通常効果的である。Ｓｕｔｃｌｉｆｆ
ｅら、前出、６６１頁。例えば、これらの指針に従って設計された２０個のペプ
チドのうちの１８個（インフルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ１ポリぺプチド
鎖の７５％の配列を包含する８〜３９残基を含む）は、ＨＡ１タンパク質または
インタクトなウイルスと反応する抗体を誘導し；そしてＭｕＬＶポリメラーゼ由
来の１２／１２のペプチドおよび狂犬病糖タンパク質由来の１８／１８は、個々
のタンパク質を沈殿させる抗体を誘導した。
【００５７】 従って、抗原性エピトープを保有する本発明のペプチドおよびポリぺプチドは
、本発明のポリぺプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）
を惹起させるために有用である。従って、抗原エピトープを保有するペプチドで
免疫されたドナー由来の脾臓細胞の融合により得られた、高い割合のハイブリド
ーマは、概してネイティブのタンパク質と反応性の抗体を分泌する。Ｓｕｔｃｌ
ｉｆｆｅら、前出、６６３頁。抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリ
ぺプチドによって惹起された抗体は、模倣されたタンパク質を検出するために有
用であり、そして異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プロセシングを受ける
タンパク質前駆体の種々の領域の運命を追跡するために使用され得る。ペプチド
および抗ペプチド抗体は、模倣されたタンパク質についての種々の定性的アッセ
イまたは定量的アッセイ（例えば、競合アッセイ）において使用され得る。なぜ
ならば、短いペプチド（例えば、約９アミノ酸）さえも、免疫沈降アッセイにお
いて結合し得、そしてより大きなペプチドと置換し得ることが示されているから
である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４
）、７７７頁を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体はまた、例えば、当該分野
で周知の方法を使用する吸着クロマトグラフィーによる模倣されたタンパク質の
精製に有用である。
【００５８】 上記の指針に従って設計された、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよ
びポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好まし
くは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは約
１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。しかし、本発明のポリぺプチドの
アミノ酸配列のより大きな部分（約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０
、１００、または１５０アミノ酸を含む）、または本発明のポリぺプチドの全ア
ミノ酸配列までおよび全アミノ酸配列を含む任意の長さを含む、ペプチドあるい
はポリぺプチドはまた、本発明のエピトープ保有ペプチドまたはポリぺプチドと
考えられ、そしてまた、模倣されたタンパク質と反応する抗体を誘導するために
有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒
における実質的な溶解性を提供するために選択され（すなわち、配列は、比較的
親水性の残基を含み、そして高度に疎水性の配列を好ましくは避ける）；そして
プロリン残基を含む配列が特に好ましい。
【００５９】 ＶＥＧＦ−２特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリぺプチドま
たはペプチドの非限定的な例には、以下が含まれる：配列番号２におけるおよそ
ｌｅｕ−３７〜およそＧｌｕ−４５、配列番号２におけるおよそＴｙｒ−５８〜
およそＧｌｙ−６６、配列番号２におけるおよそＧｌｎ−７３〜およそＧｌｕ−
８１、配列番号２におけるおよそＡｓｐ−１００〜およそＣｙｓ−１０８、配列
番号２におけるおよそＧｌｙ−１４０〜およそＬｅｕ−１４８、配列番号２にお
けるおよそＰｒｏ−１６８〜およそＶａｌ−１７６、配列番号２におけるおよそ
Ｈｉｓ−１８３〜およそＬｙｓ−１９１、配列番号２におけるおよそＩｌｅ−２
０１〜およそＴｈｒ−２０９、配列番号２におけるおよそＡｌａ−２１６〜およ
そＴｙｒ２２４、配列番号２におけるおよそＡｓｐ−２４４〜およそＨｉｓ−２
５４、配列番号２におけるおよそＧｌｙ−２５８〜およそＧｌｕ−２６６、配列
番号２におけるおよそＣｙｓ−２７２〜およそＳｅｒ−２８０、配列番号２にお
けるおよそＰｒｏ−２８３〜およそＳｅｒ−２９１、配列番号２におけるおよそ
Ｃｙｓ−２９６〜およそＧｌｎ−３０４、配列番号２におけるおよそＡｌａ−３
０７〜およそＣｙｓ−３１６、配列番号２におけるおよそＶａｌ−３１９〜およ
そＣｙｓ−３３５、配列番号２におけるおよそＣｙｓ−３３９〜およそＬｅｕ−
３４７、配列番号２におけるおよそＣｙｓ−３６０〜およそＧｌｕ−３７３、配
列番号２におけるおよそＴｙｒ−３７８〜およそＶａｌ−３８６、および配列番
号２におけるおよそＳｅｒ−３８８〜およそＳｅｒ−３９６のアミノ酸残基を含
むポリペプチド。これらのポリぺプチドフラグメントは、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏ
ｌｆ抗原性指標の分析によりＶＥＧＦ−２タンパク質の抗原性エピトープを保有
することが、決定されている。
【００６０】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリぺプチドは、本発明の核酸分子を
使用して、組換え手段を含むペプチドまたはポリぺプチドを作製するための任意
の従来の手段により生成され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は
、抗ペプチド抗体を生成するために、組換え生成および精製の間、ならびに免疫
の間キャリアとして作用するより大きなポリぺプチドと融合され得る。エピトー
プ保有ぺプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して、合成され得る。例え
ば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチドの合成のための単純な方法を、記載し
ており、例えば、ＨＡ１ポリぺプチドのセグメントの単一アミノ酸改変体を提示
する、１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドは、４週間未満で、調
製され、そして（ＥＬＩＳＡ型結合研究により）特徴付けられた。Ｈｏｕｇｈｔ
ｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｇ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８２：５１３１−５１３５。この「同時多重ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」プ
ロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎらへの米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６
）にさらに記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための
個々の樹脂は、別々の溶媒浸透性パケット内に含まれ、固相法に関与する多くの
同一の反復する工程の最適な使用を可能にする。完全に手動の手順は、５００〜
１０００以上の合成を同時に行うことを可能にする。Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出
、５１３４頁。
【００６１】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野で周知の方
法に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，
前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら
，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこ
と。一般に、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体
力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ
）または破傷風トキソイド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得
る。例えば、システインを含むペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリア
に結合され得る。その一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グ
ルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。
【００６２】 ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチドまたはキャリ
ア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１００ｍｇのペ
プチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含む）の腹腔
内注射および／または皮内注射により免疫される。数回のブースター注射が、抗
ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で、必要
とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを用いる
ＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチ
ド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法に従う
固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）により上
昇し得る。
【００６３】 本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、そのタンパク質の全体
が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の部分）は、当該分野で公
知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（前出）は、酵素結合免
疫吸着アッセイにおいて反応するために十分な純度の数百のペプチドの、固体支
持体上での迅速な同時合成のための手順を開示する。次いで、合成されたペプチ
ドと抗体との相互作用は、それらを支持体から除去することなしに、容易に検出
される。この様式において、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有する
ペプチドは、当業者により慣用的に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスのコ
ートタンパク質中の免疫学的に重要なエピトープは、このタンパク質の全２１３
アミノ酸配列を含む、全ての２０８の可能なヘキサペプチドの重複したセットの
合成により、７アミノ酸分解能で、Ｇｅｙｓｅｎらにより位置付けられた。次い
で、全ての２０アミノ酸が、エピトープ内の全ての位置で順番に置換されたペプ
チドの完全な置換セットが、合成され、そして抗体との反応の特異性を与える特
定のアミノ酸が、決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプ
チドアナログは、この方法により慣用的に作製され得る。Ｇｅｙｓｅｎに対する
米国特許第４，７０８，７８１号（１９８７）は、所望のタンパク質の免疫原性
エピトープを保有するペプチドを同定するこの方法を、さらに記載する。
【００６４】 さらになお、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第５，１９４，３９２号（１９９
０）は、モノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列（これは、目的の抗体の
特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的なエピトープの組織分布的 等価物（すなわち、「ミモトープ（Ａｍｉｍｏｔｏｐｅ」）である）を検出また
は決定する一般的な方法を記載する。より一般には、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国
特許第４，４３３，０９２号（１９８９）は、目的の特定のレセプターのリガン
ド結合部位に相補的なリガンドの位相学的等価物であるモノマーの配列を検出ま
たは決定する方法を記載する。同様に、過アルキル化されたオリゴペプチドの混
合物（Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ
）についてのＨｏｕｇｈｔｏｎ，Ｒ．Ａ．らに対する米国特許第５，４８０，９
７１号（１９９６）は、直鎖状のＣ1〜Ｃ7アルキルの過アルキル化されたオリゴ
ペプチドならびにそのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに目
的のアクセプター分子に優先的に結合する過アルキル化されたオリゴペプチドの
配列を決定するためにそのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを用
いる方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドア
ナログもまた、これらの方法によって慣用的に作製され得る。
【００６５】 当業者が理解するように、上記の本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドおよびそ
のエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの
部分と組み合わせられ得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク
質は、精製を容易にし、そしてインビボでの半減期の延長を示す。これは、例え
ば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブ
リンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質
について示されている（ＥＰＡ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。本発明に従って、ＶＥＧＦ−
２の新規な改変体がまた、記載される。これらは、ＶＥＧＦ−２の１つ以上のア
ミノ酸を欠失させるかまたは置換することにより作製され得る。天然の変異体は
、対立遺伝子変異と呼ばれる。対立遺伝子変異は、サイレント（コードされるポ
リぺプチドに変化がない）であり得るか、または変更されたアミノ酸配列を有し
得る。
【００６６】 ネイティブＶＥＧＦ−２の特徴を改善または変化させるために、タンパク質操
作が、使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術が、新規ポリペプチドを
作製するために使用され得る。ムテインおよび欠失は、例えば、増強された活性
または上昇した安定性を示し得る。さらに、これらは高収率で精製され得、そし
て少なくとも特定の精製および貯蔵条件下において、より良い溶解性を示す。以
下に、構築され得る変異の例を示す。
【００６７】 （アミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失） さらに、ＶＥＧＦ−２は、発現の際にタンパク質分解切断されると思われ、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動する場合、以下のサイズのポリぺプチドフラグメン
トを生じる（サイズはおおよそ）（例えば、図６〜８を参照のこと）：８０、５
９、４５、４３、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３１、２９、２１、お
よび１５ｋＤａ。これらのポリぺプチドフラグメントは、タンパク質のＮ末端部
分およびＣ末端部分の両方での、タンパク質分解切断の結果である。これらのタ
ンパク質分解生成フラグメントは、特に２１ｋＤａのフラグメントが、活性を有
すると思われる。
【００６８】 さらに、タンパク質操作は、ネイティブＶＥＧＦ−２の１つ以上の特徴を、改
善するかまたは変更するために、使用され得る。カルボキシ末端アミノ酸の欠失
は、タンパク質の活性を増強し得る。１つの例は、インターフェロンγであり、
これは、このタンパク質のカルボキシ末端から１０アミノ酸残基を欠失させるこ
とにより、１０倍までのより高い活性を示す（Ｄｏｅｂｅｌｉら、Ｊ．ｏｆ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。従って、本発
明の１つの局面は、ネイティブＶＥＧＦ−２ポリぺプチドと比較して（例えば、
代表的なｐＨ、熱条件または他の保存条件にさらされた場合に）増強された安定
性を示す、ＶＥＧＦ−２のポリぺプチドアナログおよびこのようなアナログをコ
ードするヌクレオチド配列を提供することである。特に、好ましいＶＥＧＦ−２
ポリぺプチドは、以下に示される（ナンバリングは、このタンパク質における最
初のアミノ酸（Ｍｅｔ）で始まる）（図１（配列番号２））：
【００６９】
【化１】 好ましい実施形態は、以下の欠失変異体を含む：（図１（配列番号２））の
【００７０】
【化２】 ＮＢ末端およびＣ末端の両方から欠失されるアミノ酸を有する欠失変異体はま
た、本発明に含まれる。このような変異体は、上記のＮ末端欠失変異体およびＣ
末端欠失変異体の全ての組合せを含む。それらの組合せは、当業者に公知の組換
え技術を使用して作製され得る。
【００７１】 特に、ＶＥＧＦ−２ポリぺプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ−３９６により記
述され得、ここでｍは、−２３〜３８８の整数であり、ここでｍは、配列番号２
において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、Ｎ末端欠失体
は、図３の保存される囲まれた（ｂｏｘｅｄ）範囲（ＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣ
ＣＮ）（配列番号８）を保持し、そして以下の残基のアミノ酸配列を含むポリぺ
プチドを含む：配列番号２の
【００７２】
【化３】 。これらのＮ末端欠失変異体をコードするポリヌクレオチドもまた、好ましい。
【００７３】 さらに、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＣ末端欠失はまた、一般式−２３〜ｎに
よって記載され得、ここで、ｎは１５から３９５の整数であり、ここで、ｎは配
列番号２において同定されるアミノ酸残基の位置に一致する。好ましくは、Ｃ末
端欠失は、図３のボックスで囲んだ保存された領域（ＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣ
ＣＮ）（配列番号８）を有し、そして配列番号２の以下の残基のアミノ酸配列を
含むポリペプチドを含む：
【００７４】
【化４】 これらのＣ末端欠失変異体をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。好ま
しくは、上に列挙したＮ末端欠失またはＣ末端欠失のいずれかが組み合わされ、
保存されたボックスドメインを有する、Ｎ末端欠失およびＣ末端欠失のＶＥＧＦ
−２ポリペプチドを生成し得る。
【００７５】 さらに本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方からの１つ以上
のアミノ酸が欠失されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、一般に、
配列番号２の残基ｍ〜ｎを有するように記載され得る（ここで、ｎおよびｍは上
記のような整数である）。
【００７６】 多数のポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号１に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連ポリヌクレオチドは、本発明の範囲か
ら特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って好ましく
は、本発明から、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａ
は配列番号１の１〜１６６０の任意の整数であり、ｂは１５〜１６７４の整数で
あり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１に示されるヌクレオチド残基の位置
に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレ
オチドが除外される。
【００７７】 従って、１つの局面において、Ｎ末端欠失変異体が本発明によって提供される
。このような変異体としては、少なくとも最初の２４個のＮ末端アミノ酸残基の
欠失（すなわち、少なくともＭｅｔ（１）〜Ｇｌｕ（２４）の欠失）（ただし、
図１（配列番号２）の最初の１１５個以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失）を除い
て図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を含む変異体が挙げられる。ある
いは、最初の２４個のＮ末端アミノ酸残基の欠失（すなわち、少なくともＭｅｔ
（１）〜Ｇｌｕ（２４）の欠失）（ただし、図１（配列番号２）の最初の１０３
個以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失）などを除いて図１（配列番号２）に示され
るアミノ酸配列を含む変異体など。
【００７８】 別の局面において、Ｃ末端欠失変異体が本発明によって提供される。このよう
な変異体としては、少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基（Ｓｅｒ（４１９）の
欠失（ただし、図１（配列番号２）の最後の２２０個以下のＣ末端アミノ酸残基
（すなわち、アミノ酸残基（Ｖａｌ（１９９）〜Ｓｅｒ（４１９）の欠失））を
除いて図１（配列番号２）に示されるアミノ酸を含む変異体が挙げられる。ある
いは、この欠失は、図１（配列番号２）の、少なくとも最後のアミノ酸残基（た
だし、最後の２１６個以下のＣ末端アミノ酸残基）を含む。あるいは、この欠失
は、図１（配列番号２）の、少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基（ただし、最
後の２０４個以下のＣ末端アミノ酸残基）を含む。あるいは、この欠失は、図１
（配列番号２）の、少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基（ただし、最後の１９
２個以下のＣ末端アミノ酸残基）を含む。あるいは、この欠失は、図１（配列番
号２）の、少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基（ただし、最後の１５６個以下
のＣ末端アミノ酸残基）を含む。あるいは、この欠失は、図１（配列番号２）の
、少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基（ただし、最後の１０８個以下のＣ末端
アミノ酸残基）を含む。あるいは、この欠失は、図１（配列番号２）の、少なく
とも最後のＣ末端アミノ酸残基（ただし、最後の５２個以下のＣ末端アミノ酸残
基）を含む。
【００７９】 さらに別の局面において、Ｎ末端残基およびＣ末端残基の両方からアミノ酸が
欠失された欠失変異体もまた本発明に含まれる。このような変異体は、上記のＮ
末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせを含む。
【００８０】 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を生成する際に含まれるＤＮＡのセグメン
トを意味する；それは、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）
、ならびに個々のコード領域セグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロ
ン）を含む。
【００８１】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。本明細書中で議論されるように、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド
配列または配列番号１もしくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する
、単離された核酸分子のフラグメントによって、診断上のプローブおよびプライ
マーとして有用な、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）長、そしてより好ま
しくは、少なくとも約２０ｎｔ長、さらにより好ましくは、少なくとも約３０ｎ
ｔ長、そしてなおより好ましくは、少なくとも約４０ｎｔ長のフラグメントが意
図される。当然ながら、以下：５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、
２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、
４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、
６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、
８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１
０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２
５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２
５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００
、１６２５、１６５０、または１６７４のより大きなヌクレオチド長のフラグメ
ントもまた、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１もしくは
配列番号３に示されるヌクレオチド配列の（全てでなくても）大部分に対応する
フラグメントと同様に、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも２０ヌ
クレオチド長のフラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列
または配列番号１もしくは配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列由来の
、２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される。
【００８２】 さらに、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドフラグメントの代表的な実施例は、例
えば、配列番号１または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡの約１〜５０、
５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３
００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５
０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８
００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、または９５１から末
端までのヌクレオチド数に由来する配列を有するフラグメントを含む。この文脈
において、「約」は、いずれかの末端でかまたは両端で、数個（５、４、３、２
、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、または小さい、特に言及された範囲
を含む。好ましくは、これらのフラグメントは生物学的活性を有するポリペプチ
ドをコードする。
【００８３】 本発明の全長遺伝子のフラグメントは、ｃＤＮＡライブラリーのためのハイブ
リダイゼーションプローブとして使用され、その全長ｃＤＮＡを単離し、そして
その遺伝子に対する高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する、他のｃ
ＤＮＡを単離し得る。この型のプローブは、好ましくは、少なくとも３０個の塩
基を有し、そして例えば５０個以上の塩基を含み得る。このプローブはまた、全
長転写物に対応するｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローン、あるいは調節領域
またはプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含
むクローンを同定するために使用され得る。スクリーニングの例は、オリゴヌク
レオチドプローブを合成するために公知のＤＮＡ配列を使用して、遺伝子のコー
ド領域を単離する工程を包含する。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有す
る、標識されたオリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍ
ＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用され、ライブラリーのど
のメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。
【００８４】 ＶＥＧＦ−２「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で、配列番号１に含まれる配列、または、例えばＡＴＣＣ寄託
番号９７１４９または７５６９８に含まれるｃＤＮＡクローン、その相補体にハ
イブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。「ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件」とは、５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ
７．６）、５×デンハルト溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０μｇ／
ｍｌ 変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、４２℃での一晩のインキュベ
ーション、それに次ぐ０．１×ＳＳＣ中での約６５℃でのフィルターの洗浄をい
う。
【００８５】 より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でＶＥＧＦ−２ポ
リヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた考慮される。ハイブリダイ
ゼーションのストリンジェンシーにおける変化およびシグナル検出は、主に、ホ
ルムアミドの濃度（ホルムアミドの割合の低下は、ストリンジェンシーの低下を
生じる）；塩条件、または温度の操作によって達成される。例えば、より低いス
トリンジェンシー条件は、以下：６Ｘ ＳＳＰＥ（２０Ｘ ＳＳＰＥ＝３Ｍ Ｎ
ａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）、０
．５％ ＳＤＳ、３０％ ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ブロッキ
ングＤＮＡ；を含む溶液中における３７℃での一晩のインキュベーション、その
後の１ＸＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、
なおより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩の濃度（例えば、５×ＳＳＣ
）で行われ得る。
【００８６】 上記の条件における変動は、代替のブロッキング試薬（ハイブリダイゼーショ
ン実験におけるバックグラウンドを抑えるために用いられる）の含有および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意のこと。代表的なブロッキング試薬と
しては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、およ
び市販の適切な処方物が挙げられる。特定のブロッキング試薬の包含は、適合性
に伴う問題によって、上記のハイブリダイゼーション条件の変更を必要とし得る
。
【００８７】 当然ながら、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの、任意の３
’末端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））のみにハイブリダイズするか、またはＴ（
またはＵ）残基の相補ストレッチにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「
ポリヌクレオチド」の定義には含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオ
チドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補ストレッチ（例えば、実質的に、
任意の二重鎖ｃＤＮＡクローン）を含む、任意の核酸分子にハイブリダイズする
からである。
【００８８】 ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照ポリヌクレオチドの、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてよ
り好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも３０ｎｔ
、そしてなおより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレ
オチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、上で議論さ
れたように、そして以下でより詳細に議論されるように、診断上のプローブおよ
びプライマーとして有用である。
【００８９】 例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの部分によって、参照
ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたは配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列）のヌクレオチド配列由来の、２０以上の連続するヌクレオチド
が意図される。当然ながら、ポリＡ配列（例えば、配列番号１または配列番号３
に示されるＶＥＧＦ−２ ｃＤＮＡの、３Ｎ末端ポリ（Ａ）領域）にのみハイブ
リダイズするか、またはＴ（またはＵ）残基の相補ストレッチにハイブリダイズ
するポリヌクレオチドは、本発明の核酸の部分にハイブリダイズするために用い
られる本発明のポリヌクレオチドには含まれない。なぜなら、このようなポリヌ
クレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補ストレッチ（例えば、実質
的に、任意の二重鎖ｃＤＮＡクローン）を含む、任意の核酸分子にハイブリダイ
ズするからである。
【００９０】 本出願は、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列、または寄託さ
れたｃＤＮＡの核酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または
９９％同一な核酸分子（それらがＶＥＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコー
ドするか否かに関わらない）に関する。なぜなら、たとえ特定の核酸分子がＶＥ
ＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードしない場合でも、当業者は、例えば
、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プラ
イマーとしての、核酸分子の使用法を依然として心得ているからである。ＶＥＧ
Ｆ−２活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用は、特
に以下を含む：（１）ｃＤＮＡライブラリー中でのＶＥＧＦ−２遺伝子またはそ
の対立遺伝子改変体の単離；（２）ＶＥＧＦ−２遺伝子の正確な染色体位置を提
供するための、中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）へのインサイチュでのハ
イブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記
載される）；および、特定の組織におけるＶＥＧＦ−２ ｍＲＮＡ発現を検出す
るためのノザンブロット分析 。
【００９１】 しかし、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列、または寄託され
たｃＤＮＡの核酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９
９％同一な配列を有する核酸分子は好ましく、このような核酸分子は実際、ＶＥ
ＧＦ−２タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする。「ＶＥＧＦ−２活
性を有するポリペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいてＶＥＧＦ
−２活性を示すポリペプチドが意図される。例えば、ＶＥＧＦ−２タンパク質活
性は、例えば、マイトジェンアッセイおよび内皮細胞移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
）アッセイを使用して測定され得る。例えば、Ｏｌｏｆｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２５７６〜２５８１（１９９６）
およびＪｏｕｋｏｖら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：２９０〜２９８（１９９６）を参照
のこと。
【００９２】 当然ながら、遺伝子コードの縮重によって、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列ま
たは配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列に少なくとも９０％、９
５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を有する多数の核酸分
子が、「ＶＥＧＦ−２タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすること
を、当業者は即座に理解する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は
、全て、同じポリペプチドをコードするので、このことは、上記の比較アッセイ
を行わなくても当業者には明らかである。縮重改変体ではないような核酸分子に
ついて、相当数がまたＶＥＧＦ−２タンパク質活性を有するポリペプチドをコー
ドすることは、当該分野においてさらに理解される。なぜなら、当業者は、タン
パク質の機能をあまり有意にもたらすようではないか、または有意にもたらさな
いようであるかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸
を第２の脂肪族アミノ酸と置換する）について、熟知しているからである。
【００９３】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は
、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇ
ｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らはタン
パク質がアミノ酸置換に対して驚くほど耐性であることを示す。
【００９４】 従って、本発明は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、およびそのフラグメント（このフラグメントは、少なくとも
３０個の塩基、そして好ましくは５０個の塩基を有する）、ならびにこのような
ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに、少なくとも７０％の同
一性、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％、
９６％、９７％、または９８％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。
【００９５】 「同一性」は、本来、当該分野で理解される意味を有し、そして公開された技
術を用いて算出され得る。（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕ
ｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ
、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆ
ｉｎ、Ｈ．Ｇ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、（
１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、（１９８７）；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅ
ｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、（編）、Ｍ Ｓｔ
ｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９９１）を参照のこと。）
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間の同一性を測定するた
めの多数の方法が存在し、用語「同一性」は当業者に周知である。（Ｃａｒｉｌ
ｌｏ、Ｈ．、およびＬｉｐｔｏｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａ
ｔｈ．４８：１０７３（１９８８）。）２つの配列の間の同一性または類似性を
決定するために一般に用いられる方法としては、以下に開示される方法が挙げら
れるがこれらに限定されない：「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒｓ」、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、（１９９４）、ならびにＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ．、およびＬ
ｉｐｔｏｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３
（１９８８）。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを整列するための方法は、
以下を含むコンピュータープログラム中に体系化されている：ＧＣＧプログラム
パッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、
ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５
：４０３（１９９０）、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏ
ｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ
、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ３５７１１（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔ
ｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ
２：４８２〜４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用する）。
本発明の参照ヌクレオチド配列に、少なくとも、例えば９５％「同一な」ヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチドによって、このポリヌクレオチド配列が、
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００個のヌ
クレオチドにつき、５つまでの点変異を含み得ることを除いて、このポリヌクレ
オチドのヌクレオチド配列は参照配列に同一である、ということが意図される。
言い換えると、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の５％までのヌクレオ
チドが欠失されるか、または別のヌクレオチドで置換され、あるいは多数のヌク
レオチドが、参照配列中の全ヌクレオチドの５％まで、参照配列に挿入され得る
。問い合わせ配列は、配列番号１の配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフ
レーム）、または本明細書中に記載されるように特定される任意のフラグメント
であり得る。
【００９６】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従
来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も
良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもまた参照される）を決定する
ための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ
．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコン
ピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ
配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵからＴ
に変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性
パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列の
ＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝
Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１
、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒ
ｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓ
ｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）であ
る。
【００９７】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’およ
び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩
基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。
【００９８】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００９９】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。
【０１００】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、配列番号２または４に示され
るアミノ酸配列に対して、または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされ
るアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または９９％同一であるか否かは、従来的に、公知のコンピュータープログラ
ムを使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間
での最良の全体的な一致（全体的配列整列としても参照される）を決定するため
の好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１
９９０）６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュー
タープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列お
よび対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配
列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセン
トで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは
：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎ
ａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉ
ｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ
Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００ま
たは対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０１０１】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基位置のみが、対象配列の最も遠
いＮ末端およびＣ末端残基の外側に位置する。
【０１０２】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１０３】 （ＶＥＧＦ−２ポリペプチド） 本発明はさらに、図１もしくは２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、
または寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体
に関する。
【０１０４】 用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」とは、図１もしくは２
のポリペプチド、または寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド
をいう場合、図３に示されるようなＶＥＧＦタンパク質の保存されたモチーフを
保持し、そして本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを
意味する。
【０１０５】 本発明において「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２に含まれるか
、または寄託されたクローン中に含まれるｃＤＮＡによってコードされる、短い
アミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔ
ａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（このフラ
グメントが、部分または領域を（最も好ましくは単一の連続した領域として）形
成する）に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例として
は、例えば、コード領域のアミノ酸番号、およそ１〜２０、およそ２１〜４０、
およそ４１〜６０、およそ６１〜８０、およそ８１〜１００、およそ１０２〜１
２０、およそ１２１〜１４０、およそ１４１〜１６０、およそ１６１〜１８０、
およそ１８１〜２００、およそ２０１〜２２０、およそ２２１〜２４０、およそ
２４１〜２６０、およそ２６１〜２８０またはおよそ２８１〜末端までに由来す
るフラグメントが挙げられる。さらに、ポリぺプチドフラグメントは、長さが約
２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、
１３０、１４０または１５０のアミノ酸であり得る。この状況において、「およ
そ（または約）」は、いずれかの末端もしくは両方の末端で、具体的に列挙され
る範囲（いくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のアミノ酸だけ大きいまた
は小さい範囲）を含む。
【０１０６】 好ましいポリペプチドフラグメントには、分泌されたＶＥＧＦ−２タンパク質
ならびにその成熟型が含まれる。さらに好ましいポリペプチドフラグメントには
、アミノ末端もしくはカルボキシ末端またはその両方から欠失した連続した一連
の残基を有する分泌されたＶＥＧＦ−２タンパク質またはその成熟型が含まれる
。例えば、１〜６０の範囲の任意の数のアミノ酸が、分泌されたＶＥＧＦ−２ポ
リペプチドまたはその成熟型のいずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に
、１〜３０の範囲の任意の数のアミノ酸が、分泌されたＶＥＧＦ−２タンパク質
またはその成熟型のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、上記のアミノ末
端の欠失およびカルボキシ末端の欠失の任意の組合せが好ましい。同様に、これ
らのＶＥＧＦ−２ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドフラ
グメントもまた、好ましい。
【０１０７】 構造的または機能的ドメインによって特徴付けられるＶＥＧＦ−２ポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチドフラグメント（例えば、α−へリックスおよびα−へ
リックス形成領域、β−シートおよびβ−シート形成領域、ターンおよびターン
形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性
領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高い
抗原性指標領域を含むフラグメント）もまた、好ましい。保存性ドメインの中に
含まれる配列番号２のポリペプチドフラグメントは、本発明によって特に意図さ
れる（図２参照のこと）。さらに、これらのドメインをコードするポリヌクレオ
チドフラグメントもまた、意図される。
【０１０８】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＶＥＧＦ−２フラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの活性と必
ずしも同一でないが、類似の活性を示すフラグメントである。このフラグメント
の生物学的活性は、改善された所望の活性または減少された望ましくない活性を
含み得る。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドま
たは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【０１０９】 ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造ま
たは機能の有意な影響を伴わずに改変され得ることは、当該分野において認識さ
れる。配列中にこのような相違が意図される場合、活性を決定するタンパク質の
重要な領域が存在することが記憶されるべきである。
【０１１０】 従って、本発明はさらに、実質的なＶＥＧＦ−２ポリペプチド活性を示すか、
または、以下に議論されるタンパク質部分のようなＶＥＧＦ−２タンパク質の領
域を含む、ＶＥＧＦ−２ポリペプチド改変体を含む。このような変異体は、欠失
、挿入、反転、反復、および置換型を含む。上記のように、表現型的にサイレン
トでありそうなアミノ酸変化に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、
「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕ
ｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１
９９０）において見い出され得る。
【０１１１】 従って、図１または２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ
、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存されたか
または保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で
置換され、そしてこのように置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコード
される残基であってもよいし、またはなくてもよい、ポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体またはアナログ；あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、置換
基を含む、ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ；あるいは（ｉ
ｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させ
る化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合される、ポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体またはアナログ；あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、リ
ーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製のために使用される
配列またはプロタンパク質配列のような、成熟ポリペプチドと融合される、ポリ
ペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログ；あるいは（ｖ）配列番号２
または４に示される、より少ないアミノ酸残基を含み、そして保存されたモチー
フを保持し、さらになおＶＥＧＦファミリーのポリペプチドの活性の特徴を保持
する、ポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログ、であり得る。こ
のようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書における教示から当
業者の範囲内であるとみなされる。
【０１１２】 特定の目的は、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸および中性アミノ
酸または負に荷電したアミノ酸での置換である。後者は、ＶＥＧＦ−２タンパク
質の特徴を改善するために減少された正の荷電を有するタンパク質を生じる。凝
集の予防は、非常に望まれる。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるのみな
らず、薬学的処方物を調製する場合に問題であり得る。なぜなら、これらは免疫
原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．２：３３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅ
ｓ ３６：８３８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ
．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０
：３０７〜３７７（１９９３））。
【０１１３】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。
Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、ＴＮ
Ｆ−ａの、ＴＮＦレセプターの２つの公知の型の１つのみへの選択的結合を生じ
る特定の変異を記載している。従って、本発明のＶＥＧＦ−２は、天然の変異か
、またはヒトの操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加
を含み得る。
【０１１４】 示されたように、タンパク質のフォールディングまたは活性に有意に影響しな
い保存的なアミノ酸の置換のような、重要でない性質の変化が好ましい（表１お
よび２を参照のこと）。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
【表２】 もちろん、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、上記の因子を含む多くの因
子に依存する。一般的に言えば、任意の所定のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの置換
の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５または３より多くない
。
【０１１７】 機能のために必須である、本発明のＶＥＧＦ−２タンパク質におけるアミノ酸
は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニン走査変
異誘発）によって同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））。後者の手順は、単一
のアラニン変異を分子内のあらゆる残基に導入する。次いで、得られる変異型分
子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合またはインビトロまたはインビト
ロ増殖活性）について試験される。リガンド−レセプター結合のために重要な部
位はまた、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識法のような構造分析によって
決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０４
（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６〜３１２
（１９９２））。
【０１１８】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形
態で提供され、そして好ましくは、均一に精製される。
【０１１９】 用語「単離された」は、物質が、その本来の環境（例えば、タンパク質が天然
に存在する場合には、天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、
生存している動物において存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは、単離されないが、天然系においていくつかのまたは全ての共存す
る物質から分離された同様のポリヌクレオチドもしくはＤＮＡまたはポリペプチ
ドは、単離される。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、
そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一
部であり得、そしてこのようなベクターまたは組成物が、その天然の環境の一部
でない場合もなお単離される。
【０１２０】 特定の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ
、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または７．５ｋｂ
未満の長さである。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、
ＶＥＧＦ−２コード配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むが、
任意のＶＥＧＦ−２イントロンの全てまたは一部を含まない。別の実施形態にお
いて、ＶＥＧＦ−２コード配列を含む核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲ
ノム中のＶＥＧＦ−２遺伝子の５’または３’）のコード配列を含まない。
【０１２１】 本発明のポリペプチドは、配列番号２および４のポリペプチド（特に、成熟ポ
リペプチド）ならびに配列番号２および４のポリペプチドに対して少なくとも７
０％の類似性（好ましくは、少なくとも７０％の同一性）、およびより好ましく
は、配列番号２および４のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似性（よ
り好ましくは、少なくとも９５％の同一性）、ならびになおより好ましくは、配
列番号２および４のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性（なおより
好ましくは、少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そして
また、一般的に少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは、少なくとも５０
アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの一部を有するこのようなポリペプチド
の一部を含む。当該分野において公知のように、２つのポリペプチド間の「類似
性」は、アミノ酸配列と第２のポリペプチドの配列に対する１つのポリペプチド
のその保存されたアミノ酸置換とを比較することにより決定される。
【０１２２】 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは一部は、ペプチド合成により対応
する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る；従って、このフラグメン
トは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明の
ポリヌクレオチドのフラグメントまたは一部を用いて、本発明の全長ポリヌクレ
オチドを合成し得る。
【０１２３】 本発明のポリペプチドとしては、リーダーを含む寄託されたｃＤＮＡによりコ
ードされるポリペプチド；リーダーのない寄託されたｃＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；配列番号２におけるアミノ
酸約−２３〜約３９６を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸約−２
２〜約３９６を含むポリペプチド；配列番号２におけるアミノ酸約１〜約３９６
を含むポリペプチド；ならびに上記のポリペプチドに対して少なくとも９５％の
同一性、およびより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９
％の同一性であるポリペプチドが挙げられ、そして少なくとも３０アミノ酸およ
びより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一
部もまた含む。
【０１２４】 （ＶＥＧＦ−２誘導体） ＶＥＧＦ−２野生型およびアナログはさらに、通常はこのタンパク質の部分で
ないさらなる化学的部分を含むように改変され得る。それらの誘導体化部分は、
このタンパク質の溶解性、生物学的半減時間または吸収を改善し得る。この部分
はまた、このタンパク質の任意の所望の副作用などを減少または排除し得る。こ
れらの部分についての概要は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴ
ＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に見出され得る。
【０１２５】 誘導体化に最も適切な化学的部分としては、水溶性ポリマーが挙げられる。水
溶性ポリマーは、付着されるこのタンパク質が水性環境（例えば、生理学的環境
）において沈降しないので、望ましい。好ましくは、このポリマーは、治療的産
物または治療的組成物の調製について薬学的に受容可能である。当業者は、ポリ
マー／タンパク質結合体が治療的に使用されるか否かというような考慮に基づい
て、そして使用される場合、所望の投薬量、循環時間、タンパク分解への耐性お
よび他の考慮に基づいて、所望のポリマーを選択し得る。この誘導体化の有効性
は、所望の形態（すなわち、浸透ポンプまたはより好ましくは注射または注入に
よるか、あるいはさらに、経口、肺または他の送達経路について処方される）に
おいて、この誘導体を投与すること、およびその有効性を決定することによって
確認され得る。
【０１２６】 適切な水溶性ポリマーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコ
ールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルア
ルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３
，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホ
モポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたは
ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコ
ールホモポリマー、プロリルプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー
、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコ
ール、ならびにそれらの混合物。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド
は、水中でのその安定性に起因して、製造の際に利点を有し得る。
【０１２７】 このポリマーは、任意の分子量あり得、そして分岐状または非分岐状であり得
る。ポリエチレングリコールについては、好ましい分子量は、取り扱いおよび製
造における容易さのために、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である（用語「
約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子が、記載され
た分子量よりも重く、いくつかが、述べられた分子量よりも小さい重さであるこ
とを示す）。他のサイズが、所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続
性放出の持続時間、もしあれば生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、
抗原性の程度または欠落および治療的タンパク質または改変体におけるポリエチ
レングリコールの他の公知の効果）に依存して、使用され得る。
【０１２８】 このように付着されたポリマー分子の数は、変化し得、そして当業者は、機能
に対する効果を確認し得る。同じかまたは異なる化学部分（例えば、ポリマー（
例えば、異なる重さのポリエチレングリコール））で、モノ誘導体化し得るか、
またはジ−、トリ−、テトラ−、もしくはいくつかの組み合わせの誘導体化を提
供し得る。タンパク質（またはペプチド）分子に対するポリマー分子の比率は、
反応混合物のそれらの濃度が変化するにつれて、変化する。一般的に、最適比（
（反応していない過剰のタンパク質またはポリマーが存在しない）という反応効
率に関する）を、因子（例えば、誘導体化（例えば、モノ、ジ−、トリ−、など
）の所望の程度）、選択されたポリマーの分子量、このポリマーが分岐状かまた
は非分岐状であるか否か、および反応条件）により決定する。
【０１２９】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、タンパク質の機能ド
メインまたは抗原性ドメインにおける効果を考慮して、タンパク質に付着される
べきである。当業者に利用可能な多くの付着方法がある。例えば、ＥＰ ０ ４
０１ ３８４（この開示は、本明細書中によって参考として援用される）（Ｇ−
ＣＳＦへのＰＥＧのカップリング）を参照のこと、Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅ
ｍａｔｏｌ ２０：１０２８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓ
ｙｌ）を用いるＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を報告している
）もまた参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、反応基（例えば、遊
離アミノ基またはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基に共有結合され得る。
反応基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合され得る基である。遊離ア
ミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が
挙げられ得る。遊離カルボキシル基を有する残基としては、アスパラギン酸残基
、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基が挙げれる。スルフドリル基は
また、ポリエチレングリコール分子を付着するための反応基として使用され得る
。治療の目的のために、アミノ基での付着（例えば、Ｎ末端またはリジン基での
付着）が、好ましい。レセプター結合について重要な残基での付着は、レセプタ
ー結合が所望される場合、避けられるべきである。
【０１３０】 Ｎ末端で化学的に改変されたタンパク質を特に所望し得る。本発明の組成物の
例示としてポリエチレングリコールを用いて、種々のポリエチレングリコール分
子（分子量、分岐状などによって）、反応混合物中のタンパク質（またはペプチ
ド）分子に対するポロエチレングリコール分子の比率、実施されるペグ化反応の
型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質を得る方法から選択し得る。Ｎ末
端でペグ化された調製物を得る方法（すなわち、必要な場合、他のモノペグ化部
分からのこの部分を分離する）は、ペグ化タンパク質分子の集団からＮ末端ペグ
化物質の精製によってであり得る。選択的Ｎ末端化学改変を、特定のタンパク質
における誘導体化に利用可能な、異なる型の一級アミノ基の示差的反応性（リジ
ン対Ｎ末端）を利用する還元的アルキル化によって達成し得る。適切な反応条件
下で、カルボニル基含有ポリマーによるＮ末端でのタンパク質の実質的な選択的
誘導体化を、達成する。例えば、タンパク質のリジン残基のεアミノ基とＮ末端
残基のαアミノ基のそれとの間のｐＫａの差異を利用し得るｐＨで反応を行うこ
とにより、このタンパク質を選択的にＮ末端でペグ化し得る。このような選択的
誘導体化によって、水溶性ポリマーのタンパク質への付着は、制御され：このポ
リマーでの結合体化は、タンパク質のＮ末端で優先的に起こり、そして他の反応
基（例えば、リジン側鎖のアミノ基）の有意な改変が、起こらない。還元的アル
キル化を用いて、この水溶性ポリマーは、上記の型であり得、そしてこのタンパ
ク質にカップリングするために、１個の反応性アルデヒドを有するべきである。
１個の反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを
、使用し得る。
【０１３１】 本発明は、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に結合される誘導体
（原核生物で発現されるＶＥＧＦ−２またはその改変体）の使用、ならびにアシ
ル結合またはアルキル結合を介して１つ以上のポリエチレングリコール分子に付
着されるＶＥＧＦ−２またはその改変体の使用を意図する。
【０１３２】 ペグ化を、当該分野で公知のペグ化反応のいずれかによって実行し得る。例え
ば、Ｆｏｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３（２）：４−１０（１
９９２）；ＥＰ ０ １５４ ３１６（この開示は本明細書中で参考として援用
される）；ＥＰ ０ ４０１ ３８４；およびペグ化に関する本明細書中に引用
される他の刊行物を参照のこと。このペグ化を、反応性ポリエチレングリコール
分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化
反応を介して実行し得る。
【０１３３】 アシル化によるペグ化は一般的に、ＶＥＧＦ−２タンパク質または改変体とポ
リエチレングリコールの活性エステル誘導体とを反応させる工程を包含する。任
意の公知の反応性ＰＥＧ分子またはその後発見された反応性ＰＥＧ分子を使用し
て、ＶＥＧＦ−２タンパク質または改変体のペグ化を実行し得る。好ましい活性
化ＰＥＧエステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドへエステル化されたＰＥＧ
である。本明細書中で使用される場合、「アシル化」とは、治療的タンパク質と
水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間の以下の型の結合：アミド、カルバメ
ート、ウレタンなどを含むがこれらに限定しないように意図される。Ｂｉｏｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４）を参照のこと。反
応条件は、ペグ化の分野で公知の条件のいずれかまたはその後開発された条件か
ら選択され得るが、改変されるべきＶＥＧＦ−２または改変体を不活性化する温
度条件、溶媒条件およびｐＨ条件を避けるべきである。
【０１３４】 アシル化によるペグ化は、一般的に、ポリペグ化ＶＥＧＦ−２タンパク質また
は改変体を生じる。好ましくは、連結結合は、アミドである。また好ましくは、
生じた産物は、実質的にモノ−、ジ−、またはトリペグ化のみ（例えば、＞９５
％）行われる。しかし、より高い程度のペグ化を有するいくつかの種が、使用さ
れる特定の反応条件に依存する量で形成され得る。所望の場合、より精製された
ペグ化種は、標準精製技術（数ある中で、透析、塩析、限外濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動を含む）によっ
て、混合物、特に未反応種から分離され得る。
【０１３５】 アルキル化によるペグ化は、一般的に、還元剤の存在下でＶＥＧＦ−２タンパ
ク質または改変体とＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とを反応させる工程を包含す
る。アルキル化によるペグ化はまた、ポリペグ化ＶＥＧＦ−２タンパク質または
改変体を生じ得る。さらに、ＶＥＧＦ−２タンパク質または改変体のＮ末端のア
ミノ基のみで実質的なペグ化（すなわち、モノペグ化タンパク質）をもたらす反
応条件を操作し得る。モノペグ化またはポリペグ化のいずれかの場合において、
ＰＥＧ基を、好ましくは、−−ＣＨ２−−ＮＨ−−基を介してタンパク質に付着
させる。−−ＣＨ２−−基について特に参照すると、この型の結合は、本明細書
中で「アルキル」結合としていわれる。
【０１３６】 モノペグ化産物を生成するための還元的アルキル化を介する誘導体化は、誘導
体化に利用可能な異なる型の１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を
利用する。この反応を、レジン残基のεアミノ基とたんぱく質のＮ末端残基のα
アミノ基のそれとの間のｐＫａの差異の利用を可能にし得るｐＨで行う。このよ
うな選択的誘導体化によって、反応基（例えば、アルデヒド）を含む水溶性ポリ
マーのタンパク質への付着は、制御される：ポリマーとの結合体化が、このタン
パク質のＮ末端で優先的に起こり、そして他の反応基（例えば、リジン側鎖アミ
ノ基）の有意な改変が、起こらない。１つの重要な局面において、本発明は、モ
ノポリマー／ＶＥＦＧ−２タンパク質（または改変体）結合体分子の実質的に均
質な調製物（ポリマー分子が単一の位置のみ（すなわち、＞９５％）で実質的に
付着されるＶＥＧＦ−２タンパク質または改変体を意味する）の使用を意図する
。より詳細には、ポリエチレングリコールが使用される場合、本発明はまた、ポ
リエチレングリコールが使用される場合、本発明はまた、ペグ化ＶＥＧＦ−２タ
ンパク質または改変体（潜在的な抗原性結合基を欠き、そしてＶＥＧＦ−２タン
パク質または改変体に直接的にカップリングされたポリエチレングリコール分子
を有する）の使用を含む。
【０１３７】 従って、本発明に従って使用されるべきＶＥＧＦ−２は、ペグ化ＶＥＧＦ−２
タンパク質または改変体（ここで、ＰＥＧ基は、アシル基またはアルキル基を介
して付着される）を含み得ることが意図される。上記の議論のように、このよう
な産物は、モノペグ化またはポリペグ化され得る（例えば、２〜６ＰＥＧ基、好
ましくは２〜５ＰＥＧ基を含む）。ＰＥＧ基は、一般的に、アミノ酸のαアミノ
基またはεアミノ基でタンパク質に付着されるが、このＰＥＧ基は、タンパク質
に付着される任意のアミノ基に付着され得、このアミノ基は、適切な反応条件下
でＰＥＧ基に付着されるために十分反応性であることもまた意図される。
【０１３８】 アシル化アプローチおよびアルキル化アプローチの両方において使用されるポ
リマー分子は、上記のような水溶性ポリマーの中から選択され得る。選択される
ポリマーは、単一の反応基（例えば、アシル化についての活性エステルまたはア
ルキル化についてのアルデヒド）を有するように改変されるべきであり、好まし
くはその結果、ポリマー化の程度は、本方法において提供されるように制御され
得る。例示の反応性ＰＥＧアルデヒドは、水に安定であるポリエチレングリコー
ルプロピオンアルデヒド、あるいはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシまたはその
アリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）
）。このポリマーは、分岐状または非分岐状であり得る。アシル化反応について
、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。本発明
の還元アルキル化について、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基
を有するべきである。一般的に、水溶性ポリマーは、天然に存在するグリコシル
残基から選択されない。何故なら、水溶性ポリマーは通常、哺乳動物組換え発現
系によってより簡便に作製されるためである。このポリマーは、任意の分子量で
あり得、そして分岐状または非分分岐状であり得る。
【０１３９】 本明細書中において使用するための特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチ
レングリコールである。本明細書中で使用される場合、ポリエチレングリコール
は、他のタンパク質（例えば、アルコキシポリエチレングリコールまたは（モノ
−（Ｃ１〜Ｃ１０））アリールオキシポリエチレングリコール）を誘導体化する
ように使用されているＰＥＧの形態のいずれかを含むように意味される。
【０１４０】 一般的に、化学的誘導体化は、活性化ポリマー分子と生物学的に活性な物質を
反応させるために使用される任意の適切な条件下で行われ得る。ペグ化ＶＥＧＦ
−２タンパク質または改変体を調製するための方法は、一般的に、（ａ）タンパ
ク質が１つ以上のＰＥＧ基に付着される条件下で、ＶＥＦＧ−２タンパク質また
は改変体をポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはア
ルデヒド誘導体）と反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程、を包
含する。一般的に、アシル化反応についての最適な反応条件は、公知のパラメー
タおよび所望の結果に基づいて、場合に応じて決定される。例えば、ＰＥＧ：タ
ンパク質の比が大きくなると、ポリペグ化産物の百分率は、大きくなる。
【０１４１】 モノポリマー／ＶＥＧＦ−２タンパク質（または改変体）結合体分子の実質的
に均一な集団を生成するための還元アルキル化は、一般的に、（ａ）還元アルキ
ル化条件下で、上記のＶＥＧＦ−２タンパク質または改変体のアミノ末端でα−
アミノ基の選択的改変を可能にするための適切なｐＨにて、ＶＥＧＦ−２タンパ
ク質または改変体を反応性ＰＥＧ分子と反応させる工程；および（ｂ）反応生成
物を得る工程、を包含する。
【０１４２】 モノポリマー／ＶＥＧＦ−２タンパク質（または改変体）結合体分子の実質的
に均一な集団について、還元アルキル化反応条件は、水溶性ポリマー部分のＶＥ
ＧＦ−２タンパク質または改変体のＮ末端への選択的付着を可能にする条件であ
る。このような反応条件は、一般的に、リジンアミノ基とＮ末端でのαアミノ基
との間のｐＫａ（このｐＫａは、アミノ基の５０％がプロトン化され、そして５
０％がプロトン化されないｐＨである）の差異を提供する。このｐＨはまた、使
用されるべきタンパク質に対するポリマーの比率に影響を及ぼす。一般的に、ｐ
Ｈがより低い場合、タンパク質に対してより過剰のポリマーが望ましい（すなわ
ち、Ｎ末端のαアミノ基の反応性が低ければ低いほど、最適条件を達成するため
により多くのポリマーが必要とされる）。ｐＨがより高い場合、ポリマー：タン
パク質の比率は、大きくある必要はない（すなわち、より多くの反応基が利用可
能であり、それ故、より少ないポリマー分子が必要とされる）。本発明の目的の
ために、ｐＨは、一般的に３〜９、好ましくは３〜６の範囲内である。
【０１４３】 別の重要な考慮は、このポリマーの分子量である。一般的に、このポリマーの
分子量が大きければ大きいほど、ますます少ないポリマー分子が、このタンパク
質に付着され得る。同様に、ポリマーの分岐は、これらのパラメーターを最適化
する場合、考慮される。一般的に、分子量が大きくなればなるほど（または分岐
が多くなればなるほど）、ポリマー：タンパク質の比率は、ますます高くなる。
一般的に、本明細書中で意図されるペグ化反応について、好ましい平均分子量は
、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。好ましい平均分子量は、約５ｋＤａ〜約
５０ｋＤａであり、特に好ましくは、約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。ＶＥ
ＧＦ−２タンパク質または改変体に対する水溶性ポリマーの比率は、一般的に１
：１〜１００：１の範囲であり、好ましくは（ポリペグ化について）１：１〜２
０：１、そして１：１〜５：１（モノペグ化について）である。
【０１４４】 上記で示された状態を使用して、還元的アルキル化は、任意のＶＥＧＦ−２タ
ンパク質またはアミノ末端にαアミノ基を有する改変体へのポリマーの選択的結
合を提供し、そしてモノポリマー／ＶＥＧＦ−２タンパク質（または改変体）結
合体の実質的に同質な調製物を提供する。用語「モノポリマー／ＶＥＧＦ−２タ
ンパク質（または改変体）結合体」は、本明細書中で用いられ、ＶＥＧＦ−２タ
ンパク質またはＶＥＧＦ−２改変体タンパク質の分子に結合した単一のポリマー
分子からなる組成物を意味する。このモノポリマー／ＶＥＧＦ−２タンパク質（
または改変体）結合体は、好ましくは、Ｎ末端に位置するポリマー分子を有する
が、リジンアミノ側鎖上に位置するポリマー分子は有さない。この調製物は、好
ましくは、モノポリマー／ＶＥＧＦ−２タンパク質（または改変体）結合体が９
０％よりも多く、そしてより好ましくは、モノポリマー／ＶＥＧＦ−２タンパク
質（または改変体）結合体が９５％よりも多く、観察できる分子の残りの部分は
、反応されていない（すなわち、ポリマー部分を欠如するタンパク質）。
【０１４５】 本発明の還元的アルキル化について、還元剤は、水溶液中で安定であるべきで
あり、そして好ましくは、還元的アルキル化の最初の工程において形成されるシ
ッフ塩基のみを還元し得るべきである。好ましい還元剤は、ホウ化水素ナトリウ
ム、シアノホウ化水素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボ
ランおよびピリジンボランから選択され得る。特に好ましい還元剤は、シアノホ
ウ化水素ナトリウムである。他の反応パラメーター（例えば、溶媒、反応時間、
温度など）および産物の精製手段は、水溶性ポリマーでのタンパク質の誘導体化
に関する公表された情報に基づいて、その場その場で決定され得る（本明細書中
で引用された刊行物を参照のこと）。 （エピトープおよび抗体） 本発明は、配列番号２もしくは４のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピ
トープ、あるいはＡＴＣＣ受託番号９７１４９もしくは７５６９８において含ま
れるポリヌクレオチド配列によってコードされるか、または以前に定義されたよ
うなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより低いストリ
ンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは３の配列ま
たはＡＴＣＣ受託番号９７１４９もしくは７５６９８において含まれる配列の相
補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
配列のエピトープを含むか、あるいはこのエピトープからなるポリペプチドを包
含する。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列のエピトープをコードする
ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１または３に開示される配列のような
）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌク
レオチド配列、および以前に定義されたようなストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条
件下で、相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を包含する。
【０１４６】 特定のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦ−２タンパク質（配列番号２）に対し
て惹起された。これらのモノクローナル抗体は、以下の名称を与えられている：
１２Ｅ２；１３Ａ２；１５Ｃ２；１３Ｄ６；１３Ｅ６；１９Ａ３；８Ｇ１１；１
１Ａ８、１５Ｅ１０、９Ｂ４および１３Ｇ１１。モノクローナル抗体１５Ｃ２、
１３Ｄ６および１５Ｅ１０は、１９９９年６月８日にグループとして寄託され、
そしてＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１９８を与えられた。モノクローナル抗体１３
Ｄ６はまた、１９９９年７月２９日にそれ自身によって寄託され、そしてＡＴＣ
Ｃ受託番号ＰＴＡ−４３５を与えられた。モノクローナル抗体１３Ａ２、１３Ｅ
６および９Ｂ４は、１９９９年６月８日にグループとして寄託され、そしてＡＴ
ＣＣ受託番号ＰＴＡ−１９９を与えられた。モノクローナル抗体８Ｇ１１、１２
Ｅ２および１３Ｇ１１は、１９９９年６月８日にグループとして寄託され、そし
てＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２００を与えられた。モノクローナル抗体１１Ａ８
および１９Ａ３は、１９９９年６月８日にグループとして寄託され、そしてＡＴ
ＣＣ受託番号ＰＴＡ−２０１を与えられた。混合物において寄託された抗体は、
その特徴（例えば、実施例において記載されるようなエピトープマップ位置、親
和性、種）に基づいて単離され得る。
【０１４７】 上記に列挙されたモノクローナル抗体が特異性を有するエピトープは、ＶＥＧ
Ｆ−２タンパク質にマップされる（図２４を参照のこと）。さらに、各々のモノ
クローナル抗体の状態（例えば、相対的な親和性ならびにＥＬＩＳＡ活性および
ウエスタン活性）は、モノクローナル抗体の各々について開示されている（図２
５を参照のこと）。
【０１４８】 本明細書中で用いられるように、用語「エピトープ」とは、動物（好ましくは
哺乳動物、最も好ましくはヒト）において抗原性活性または免疫原性活性を有す
るポリペプチドの一部をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピトー
プを含むポリペプチド、ならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含む。本明細書中で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、当該分野
で公知の任意の方法によって（例えば、上記で定義された抗体を産生するための
方法によって）決定されるような、動物において抗体応答を誘発するタンパク質
の一部として規定される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８〜４００２（１９８３）を参照のこと）
。本明細書中で使用される場合、用語「抗原性エピトープ」は、当該分野で周知
の任意の方法（例えば、本明細書中に記載のイムノアッセイによる）によって決
定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得る、タンパク質の一部
として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合を除外するが、他の抗原と
の交差反応は必ずしも除外しない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性であ
る必要はない。
【０１４９】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。さらに、米国特
許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【０１５０】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なく
とも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸の配列を含み、より好ましくは、
少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１
２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少な
くとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０アミノ酸の配列
を含み、そして最も好ましくは約１５と約３０との間のアミノ酸の配列を含む。
免疫原性または抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくと
も１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５
、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである
。さらなる非排他的に好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される抗
原性エピトープならびにその一部を含む。抗原性エピトープは、例えば、エピト
ープを特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有
用である。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される抗原性エピト
ープ、ならびに２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任意の組合わ
せを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子として使用
され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９
８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１
９８３）を参照のこと）。
【０１５１】 同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従
う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら
，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３
４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、
本明細書中で開示される免疫原性エピトープ、ならびにこれらの免疫原性エピト
ープの２、３、４、５またはそれ以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上の免
疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブ
ミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に、抗体応答を誘発する
ために提示され得るか、またはこのポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも
約２５アミノ酸）は、このポリペプチドは、キャリアなしで提示され得る。しか
し、８〜１０程度の少なさのアミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくとも
変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分で
あることが示されている（例えば、ウェスタンブロッティングにおいて）。
【０１５２】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およ
びＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９
８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用い
て免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチド
を結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプ
チドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ
Ｓ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチ
ドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに
結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチド
またはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１
００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントも
しくは免疫応答を刺激することに関して公知の任意の他のアジュバントを含む）
の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブースター
注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間
隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチ
ドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中
の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の
方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出による）
により上昇し得る。
【０１５３】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、もしくはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの部分）と融合
し得、これがキメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を
容易にし得、そしてインビボにおいて半減期を増加し得る。これは、ヒトＣＤ４
ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖ま
たは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を示す。例えば
、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８
４〜８６（１９８８）を参照のこと。上皮性関門を横切って免疫系への、抗原の
増強された送達は、ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧフラグメントまた
はＦｃフラグメント）に結合体化した抗原（例えば、インスリン）について実証
されている（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ ９９／０
４８１３を参照のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合に起因してジスルフィ
ド架橋二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドま
たはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより
効果的であることが見出されている。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８〜３９６４（１９９５）を参照のこと。
上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、血球凝集
素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ ｔａｇ））として目的の遺
伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例
えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒト細胞株において発現
される非変性融合タンパク質の前精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１
９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８
９７）。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレ
ームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳的に融合されるよ
うに、ワクシニア組換えプラスミド中でサブクローン化される。このタグは、融
合タンパク質に対するマトリックス結合ドメインとして働く。組換えワクシニア
ウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ2+ニトリロ三酢酸酸性アガロース
カラムにロードされ、そしてヒスチジンタグ化したタンパク質は、イミダゾール
含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１５４】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化された活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリ
ペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許
第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１
号、同第５，８３４，２５２号および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々が、本明細書によってその全体において参考
として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１または
３に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリペプチドによってコードされ
るポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシ
ャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡ
セグメントのアセンブリを含み、ポリヌクレオチド配列における変化を生じさせ
る。別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペ
プチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダ
ムヌクレオチド挿入または他の方法による、ランダム変異誘発に供されることに
よって改変され得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、
部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、
モチーフ、区切り、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【０１５５】 （抗体） 本発明のさらなるポリペプチドは、抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ
）に関する。この抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）は、免疫特異的に
、本発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメントまたは配列番号２または４
の改変体および／あるいはエピトープを結合する（特異的抗体−抗原結合をアッ
セイするための、当該分野で周知のイムノアッセイにより決定されるような）。
本発明の抗体には、以下が含まれるが、それらに限定されない：ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメ
ラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発
現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ
）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記の
任意のエピトープ結合フラグメント。本明細書中で使用されるような、用語「抗
体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分（
すなわち、免疫特異的に抗原を結合する、抗原結合部位を含む分子）をいう。本
発明の免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３
、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラス
であり得る。
【０１５６】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨ
ドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。
単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下の
全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２および
ＣＨ３ドメイン。また、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３
ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗原結合フラグメントが、本発明に含
まれる。本発明の抗体は、任意の動物起源（鳥類および哺乳動物を含む）に由来
し得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウスおよびラット）、
ロバ、ウサギ（ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマま
たはニワトリである。本明細書中で使用されるように、「ヒト」抗体には、ヒト
免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体、およびヒト免疫グロブリンライブ
ラリーから単離された抗体、または前述、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａ
ｔｉらによる、米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるような、１つ以上
のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内因性免疫グ
ロブリンを発現しない動物から単離された抗体が挙げられる。
【０１５７】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異的であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピト
ープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドならびに異種の
エピトープ（例えば、異種ポリペプチド）もしくは固体支持体物質の両方に特異
的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ ９２／０
８８０２；ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，
８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、第５，５７
３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１５８】 本発明の抗体は、抗体が認識するかまたは特異的に結合する本発明のポリペプ
チドのエピトープまたは部分の点で記載されるかまたは特定され得る。このエピ
トープまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置により、
連続するアミノ酸残基におけるサイズにより、本明細書中に記載される様に、ま
たは表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の好ましいエピト
ープとしては、以下が挙げられる：配列番号２におけるＬｅｕ−３７〜およそＧ
ｌｕ−４５、配列番号２におけるおよそＴｙｒ−５８〜およそＧｌｙ−６６、配
列番号２におけるおよそＧｌｎ−７３〜およそＧｌｕ−８１、配列番号２におけ
るおよそＡｓｐ−１００〜およそＣｙｓ−１０８、配列番号２におけるおよそＧ
ｌｙ−１４０〜およそＬｅｕ−１４８、配列番号２におけるおよそＰｒｏ−１６
８〜およそＶａｌ−１７６、配列番号２におけるおよそＨｉｓ−１８３〜およそ
Ｌｙｓ−１９１、配列番号２におけるおよそＩｌｅ−２０１〜およそＴｈｒ−２
０９、配列番号２におけるおよそＡｌａ−２１６〜およそＴｙｒ−２２４、配列
番号２におけるおよそＡｓｐ−２４４〜およそＨｉｓ−２５４、配列番号２にお
けるおよそＧｌｙ−２５８〜およそＧｌｕ−２６６、配列番号２におけるおよそ
Ｃｙｓ−２７２〜およそＳｅｒ−２８０、配列番号２におけるおよそＰｒｏ−２
８３〜およそＳｅｒ−２９１、配列番号２におけるおよそＣｙｓ−２９６〜およ
そＧｌｎ−３０４、配列番号２におけるおよそＡｌａ−３０７〜およそＣｙｓ−
３１６、配列番号２におけるおよそＶａｌ−３１９〜およそＣｙｓ−３３５、配
列番号２におけるおよそＣｙｓ−３３９〜およそＬｅｕ−３４７、配列番号２に
おけるおよそＣｙｓ−３６０〜およそＧｌｕ−３７３、配列番号２におけるおよ
そＴｙｒ−３７８〜およそＶａｌ−３８６、配列番号２におけるおよそＳｅｒ−
３８８〜およそＳｅｒ−３９６、ならびにこれらのエピトープをコードするポリ
ヌクレオチド。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合す
る抗体はまた排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的
に結合し、そしてこれの排除を可能にする抗体を含む。
【０１５９】 本発明の抗体はまた、これらの交差反応性の点で記載されるかまたは特定され
得る。本発明のポリペプチドのいかなる他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏ
ｌｏｇ）またはホモログとも結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチド
と少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％
、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％
、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野において公知の
方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリ
ペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、
本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウスホモログ、ラットホモログおよび／ま
たはウサギホモログならびにそれに対応するエピトープと交差反応する。本発明
のポリペプチドと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未
満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同
一性（当該分野において公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて
計算される場合）を有するポリペプチドを結合しない抗体はまた、本発明に含ま
れる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、本明細書中に記載の任意
の単一特異的抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３
、４、５以上の特異的抗原性ペプチド、および／もしくは免疫原性ポリペプチド
の組合わせに関する。本発明には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下（本明細書中に記載される）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗体が、さ
らに含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するこれらの結
合親和性の点で記載されるかまたは特定され得る。好ましい結合親和性としては
、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4Ｍ
、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ
、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10 Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、
１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍまたは１０-15Ｍ未満の
解離定数すなわちＫｄを伴う結合親和性が挙げられる。
【０１６０】 本発明はまた、競合的結合を決定するための、当該分野で公知の任意の方法（
例えば、本明細書に記載のイムノアッセイ）によって決定されるような、抗体の
本発明のエピトープへの結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施
形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも
８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも
６０％または少なくとも５０％までのエピトープへの結合を、競合的に阻害する
。
【０１６１】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を、部分的にまたは全体的にのどちらかで、中断する抗体を含む
。好ましくは、本発明の抗体は、本明細書中に開示される抗原性エピトープかま
たはその一部を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異
的抗体の両方を特徴とする。本発明はまた、リガンド結合は妨げないが、レセプ
ター活性化を妨げる、レセプター特異的抗体を、特徴とする。レセプター活性化
（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載されるか、そうでなければ当
該分野において公知である技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化
は、レセプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）、あ
るいは（例えば、前述のように）免疫沈降に続くウエスタンブロット分析により
、その基質を検出することによって、決定され得る。特定の実施形態において、
抗体は、抗体の非存在下における活性の、少なくとも９５％、少なくとも９０％
、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％
、少なくとも６０％または少なくとも５０％までのリガンド活性あるいはレセプ
ター活性の阻害を提供する。
【０１６２】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
いレセプター特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し
、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結
合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合す
ることを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体
を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例
えば、レセプターの二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性
化の生物学的活性化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性
化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物
学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆ア
ゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法
を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第
５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９
８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６
８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４
）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８
（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９
７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１
９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１
２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４
）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（
９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、全て、その全体が参考
として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１６３】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有す。例えば、Ｈａｒｌｏ
ｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第
２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこ
と。
【０１６４】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、Ｎ末端でもし
くはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプチ
ドもしくは他の化合物へ化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され
得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子お
よび異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分
子へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４
９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，
９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１６５】 本発明の抗体は、改変される誘導体を含み、すなわち、この誘導体は、共有結
合が、この抗体の抗イディオタイプ応答の発生を妨げないように、任意の型の分
子のこの抗体への共有結合により改変される。例えば、この抗体誘導体は、例え
ば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、
アミド化、公知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）による
誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結
合などによって改変される抗体を含むが、これらに限定されない。任意の多数の
化学的改変が公知の技術によって実行され得、これらの技術は、特異的化学切断
、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むが、これら
に限定されない。さらに、この誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得
る。
【０１６６】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与され得、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。種々のアジュバント
が、免疫学的応答を増加させるために使用され得、宿主種に依存し、そしてフロ
イント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉ
ｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック（ｐ
ｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホール
リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−
ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような強
力に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジ
ュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１６７】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（上記の参考文献は、その全体
が参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「
モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定
されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、また
はファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノク
ローナル抗体が生成される方法ではない。
【０１６８】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体に対して産生およびスクリーニングす
る方法は、慣用的であり、そして当該分野において周知であり、そして実施例中
に詳細に議論される。非限定な例において、マウスを、本発明のポリペプチドま
たはこのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫化し得る。一旦、免疫応答
が検出される（例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中に検出される
）と、マウスの脾臓を回収し、そして脾細胞を単離する。次いで、脾細胞は、周
知の技術によって、任意の適切なミエローマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可
能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）へ融合される。ハイブリドーマを、限定希釈に
より選択およびクローン化する。次いで、ハイブリドーマクローンを本発明のポ
リペプチドを結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野に公知の方法に
よってアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含む腹水を、ポジティブなハイ
ブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することにより、産生し得る。
【０１６９】 従って、本発明は、モノクローナル抗体、および本発明の抗体を分泌するハイ
ブリドーマ細胞を培養する工程を含む方法によって産生される抗体を、産生する
方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、ミエローマ細胞を
有する本発明の抗原を用いて免疫化されたマウスから単離された脾細胞を融合す
ることにより、次いで、本発明のペプチドを結合し得る抗体を分泌するハイブリ
ドーマクローンについて、その融合から生じるハイブリドーマをスクリーニング
することにより、産生される。
【０１７０】 特異的エピトープを認識する抗体フラグメントを、公知の技術により産生し得
る。例えば、本発明のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは
、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’
）２フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、免疫グロブリン分
子のタンパク質分解性切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメント
は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１７１】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野に公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的な抗体
ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を送達するファージ粒子
の表面上に提示される。特定の実施形態において、このようなファージを、レパ
ートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、
ヒトまたはマウス）から発現されるドメインを結合する抗原を提示するために利
用し得る。目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原
を用いて、（例えば、標識化抗原、あるいは固体表面または固体ビーズへ結合ま
たは捕捉された抗原を使用して）選択および同定し得る。これらの方法において
使用されるファージは、代表的に、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファ
ージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖ
またはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現
されたドメインに結合するｆｄおよびＭ１３を含む糸状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕ
ｓ）ファージである。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディ
スプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍ
ａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０（１９９５
）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜１８
６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９
〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ ５７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開 ＰＣＴ／ＧＢ９１
／０１１３４；ＰＣＴ公開 ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；Ｗ
Ｏ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５
／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６
号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，
７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８
２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第
５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号
；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらのそれぞ
れは、その全体が参考として本明細書中に援用される）。
【０１７２】 上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体
をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体、または任意の他の所望の抗原
結合フラグメントを作製するために単離および使用され得、そして例えば、以下
に詳細に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細
菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’お
よびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的産生するための技術はまた、当該分
野で公知の方法を用いて利用され得る。この方法は、例えば、以下に開示される
方法である：ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗ
ａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（上記の参考文献は、
その全体が参考として援用される）。
【０１７３】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビト
ロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体または
ヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体は、この抗体の異なる部分が異
なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域
およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生す
るための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，
７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照
のこと（これらは、本明細書中でその全体が参照として援用される）。ヒト化抗
体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブ
リン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する、非ヒト種抗
体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレーム
ワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換され、抗原結合を改
変（好ましくは、改善）する。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知
の方法により同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定す
るためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、ならびに特定
の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（
例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）（これらは本明細書中でその全
体が参考として援用される）を参照のこと）。抗体は、例えば、以下を含む当該
分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−グラフティング（ｇ
ｒａｆｔｉｎｇ）（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開 ＷＯ９１／０９
９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同
第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサー
フェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州
特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ
ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１
９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））
、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特
許第５，５６５，３３２号）。
【０１７４】 完全なヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置に対して特に望ましい。ヒト抗体は
、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得、これらの方法としては、ヒ
ト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプ
レイ方法が挙げられる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６
，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３
、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ
９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（これらの各々は、その全体が
参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０１７５】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。この改変された胚性幹細胞を増殖させ、そして胚盤胞
に微量注入して、キメラマウスを産生する。次に、このキメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部
）を用いて通常の様式で免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は、従
来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ
得る。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間のトランスジェニック
マウスの再編成によってかくまわれ（ｈａｒｂｏｒｅｄ）、そしてその後、クラ
ススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によ
って、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の
産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏ
ｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５
−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産
生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコール
の詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２
／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０
５９８ ８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６
号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，
０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８
８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号
を参照のこと（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。さ
らに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈ
ａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術
を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０１７６】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら
、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１７７】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために
順々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥ
Ｂ Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照
のこと）。例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ）および／または本発明のポリペプチドのリガンドに対する
結合を競合的に阻害する抗体を用いて、このポリペプチドのマルチマー化および
／または結合ドメインを「模倣し」、そして結果として、ポリペプチドおよび／
またはそのリガンドに結合し、そして中和する抗イディオタイプを生成し得る。
このような中和抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフ
ラグメントは、治療レジメンにおいて使用されて、ポリペプチドリガンドを中和
し得る。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペ
プチドを結合し得るか、そして／またはそのリガンド／レセプターを結合し得、
それによって、その生物学的活性をブロックし得る。
【０１７８】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（
例えば、上記のような）、抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドへ特異的に
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号２または
４のアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドに結合する抗体をコードするポリヌ
クレオチド、に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０１７９】 当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ得
、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば
、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレ
オチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例え
ば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９
４）に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部
分を含むオーバーラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチド
のアニーリングおよび連結、ならびに次いでＰＣＲによるこの連結されたオリゴ
ヌクレオチドの増幅を含む。
【０１８０】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、
化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブ
ラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体
の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブ
ラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、
例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定
するために、その配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プ
ライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって作製された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１８１】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製
し得る。
【０１８２】 特定の実施形態において、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン
のアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野
において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、
他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによ
って）調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが
、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するため
に、ヒトフレームワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天
然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好
ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワ
ーク領域については、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５
７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およ
びＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペ
プチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるよ
うに、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして
好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに
、このような方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生
成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイ
ン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオ
チドへの他の変更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含され
る。
【０１８３】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄ
ａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。
上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり
、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の
可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０１８４】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１８５】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって、
特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生さ
れ得る。
【０１８６】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法としては、例
えば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換
えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本
発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可
変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供す
る。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８
６／０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１
２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そして
この抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベ
クターにクローニングされ得る。
【０１８７】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、次いで、この
トランスフェクトされた細胞は、本発明の抗体を産生するために、従来技術によ
って培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された
、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコ
ードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての
好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以
下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同
時発現され得る。
【０１８８】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プ
ロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムス
ターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現
系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃ
ｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０１８９】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍ
ｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１
９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９
（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させる
ために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そし
て溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着お
よび結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され
得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は
、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１９０】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０１９１】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０１９２】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。タン
パク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例え
ば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タ
ンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特徴的
で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タンパ
ク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この目
的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の正確
なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され得る
。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯ
Ｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８３、
Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、ならび
に、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株
、を含むがこれらに限定されない。
【０１９３】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモー
ター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）
、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。異
種ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させら
れ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能
マーカーは、選択したものに耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色
体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はク
ローニングし得、細胞株に拡張され得ることを可能にする。この方法は、抗体分
子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作さ
れた細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリー
ニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０１９４】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純疱疹ウイルスチミジンキナー
ゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン
−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙ
ｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２
（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗ
ｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、こ
れらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ
使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使
用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇ
ｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；
Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５
２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与える
（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１
８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８
−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９
９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘ
ｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ
Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（
１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５
）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える（Ｓ
ａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術
の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用
され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋ
ｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、
ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇ
ａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これらは
その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０１９５】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと
）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能である場合、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子
のコピーの数を増加する。増副領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。
【０１９６】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得
る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリ
ペプチドをコードし、そして発現可能である。このような状況において、過剰の
毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））
。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る
。
【０１９７】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、免疫グロブリン分子の精製のための、当該
分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。
【０１９８】 本発明は、組換えにより融合され、または化学的に本発明のポリペプチド（も
しくはその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、
４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）に結合さ
れて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成する抗
体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起
こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましくはこ
のポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０
、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば
、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを特定
の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に、本発明のポリペプチドを融合または
結合させることによって、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチド
を標的にするために、抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または
結合される抗体はまた、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を
使用する精製方法において使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およ
びＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／２１２３２号；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍ
ｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特
許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ８９：１４２８−１４
３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４
５２（１９９１）を参照のこと。これらは、その全体が参考として援用される。
【０１９９】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。この抗体の本発明の
ポリぺプチドに融合された部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分任
意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融合
または結合され得、多重体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合さ
れたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成し
得る。より高度の多重体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融
合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合ま
たは結合させるための方法は、当該分野において公知である。米国特許第５，３
３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第
５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号
；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／
０４３８８号；第ＷＯ９１／０６５７０号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。
【０２００】 上で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配
列番号２または配列番号４の変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプ
チドのインビボ半減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用す
る免疫学的アッセイにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合
され得る。さらに、配列番号２または配列番号４に対応するポリぺプチドを、上
記の抗体部分に融合または結合して、精製を容易にし得る。１つの報告された例
は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グ
ロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク
質を記載している（ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（Ｉｇ
Ｇに起因する）を有する抗体に融合または結合される、本発明のポリぺプチドも
また、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分
子に結合しそして中和するのにさらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋ
ｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多
くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、
従って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２
，２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製され
た後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫
化のための抗原として使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得
る。例えば、薬物の発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩ
Ｌ−５のアンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセ
イの目的のためにＦｃ部分と融合されてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａ
ｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５
）を参照のこと）。
【０２０１】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）に記
載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提
供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素
タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌ
ｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限定
されない。
【０２０２】 本発明はさらに、診断剤または治療剤に結合される抗体またはそのフラグメン
トを含む。この抗体は、例えば、臨床試験の手順の一部（例えば、所定の治療レ
ジメンの有効性を決定するための）として、腫瘍の発生または進行をモニターす
るために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリング
することによって容易にされ得る。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠
分子群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽子射出断層
撮影法を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられ
る。この検出可能な物質は、当該分野で公知の技術を用いて、抗体（または、そ
のフラグメント）に直接的にか、または中間体（例えば、当該分野で公知のリン
カーなど）を介して間接的にかのいずれかで、カップリングまたは結合され得る
。本発明に従う診断剤として使用するための抗体に結合され得る金属イオンにつ
いては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の
例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクト
シダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子群複
合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げ
られ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレ
セインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレ
セイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例
には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフ
ェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射性物質の例には、１２
５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０２０３】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制剤ま
たは細胞破壊剤）、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α線放射体（ａｌ
ｐｈａ−ｅｍｉｔｔｅｒ）（例えば、２１３Ｂｉなど））のような治療的な部分
と結合され得る。細胞毒または細胞毒性の薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含
む。例には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウム
ブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐ
ｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン
、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラ
マイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコ
イド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロ
マイシンならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤として
は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チ
オグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤
（例えば、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔ
ｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）および
ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉ
ｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅ
ｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白
金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙ
ｃｌｉｎｅ）（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、およびドキ
ソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシ
ン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒ
ａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン
およびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答の改変のために使用され得、この治療
剤または薬物部分は、古典的な化学治療剤に制限されると解釈されるべきではな
い。例えば、この薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質または
ポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因
子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来
成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤（例えば、ＴＮＦ
−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開番号ＷＯ ９７／３３８９９を参照の
こと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開番号ＷＯ ９７／３４９１１を参照のこと）、
Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：１５
６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開番号ＷＯ ９９／２３１０
５を参照のこと）、血栓剤または抗脈管形成剤（例えば、アンジオスタチン（ａ
ｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）またはエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ））のよ
うなタンパク質；あるいは、生物学的応答改変剤（例えば、リンホカイン、イン
ターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、
インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または
他の増殖因子など）が挙げられ得る。
【０２０５】 抗体はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に
付着され得る。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリル
アミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げ
られるが、これらに限定されない。
【０２０６】 このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒ
ｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１
９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ
Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃｎａｃｅｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、
３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒ
ｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐ
ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこ
と。
【０２０７】 あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。
【０２０８】 単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合される治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬と
して使用され得る。
【０２０９】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられる（例
えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ
，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこと）。
【０２１０】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を起こし得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを
可能にする。
【０２１１】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについて名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬ
ＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫
沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ
、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテイン
Ａイムノアッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系
が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、
そして当該分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）
。例示的なイムノアッセイが、以下に簡潔に記載される（しかし、これらは限定
を目的とすることが意図されない）。
【０２１２】 免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロ
テアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン
酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２での０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、１％ Ｔｒ
ａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体
を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュ
ベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズ
を細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でインキュベートする工程、溶
解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、ならびにＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビー
ズを再懸濁する工程を含む。目的の抗体の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、
例えば、ウエスタンブロット分析により、アッセイされ得る。当業者は、抗体の
抗原への結合を増加させ、そしてバックグラウンドを減少させるように改変され
得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれ
いにすること）に関して、精通している。免疫沈降プロトコルに関するさらなる
考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．
１を参照のこと。
【０２１３】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、タ
ンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８
％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動する工程、タンパク質サンプルをそ
のポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのよ
うな膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉乳を
有するＰＢＳ）中でその膜をブロッキングする工程、その膜を洗浄緩衝液（例え
ば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を有するその膜をブロッキングする工程、その
膜を洗浄緩衝液中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質
（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるい
は放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体
を認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いてその膜をブロッキングする工程、洗
浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を
含む。当業者は、検出されるシグナルを増加させ、そしてバックグラウンドノイ
ズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、精通している。ウエス
タンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０２１４】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は
、検出可能な化合物に結合されている必要はない；その代わり、検出可能な化合
物に結合した二次抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さら
に、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングさ
れ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した二次抗体が、コーティングされ
たウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出される
シグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において
公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、精通している。ＥＬＩＳＡに
関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１１．２．１を参照のこと。
【０２１５】 抗体の抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート
（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッ
セイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、漸
増量の非標識抗原の存在下での標識した抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と
目的の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出
を含む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、
スキャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。二次抗体との競
合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、増
化性の量の非標識二次抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１
２５Ｉ）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２１６】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ま
しくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それら
のフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコード
する核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログお
よび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるがこれらに限定
されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または
活性に関連する疾患、障害または状態（本明細書中に記載する任意の１つ以上の
疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予
防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または
活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾
患、障害または状態に関連した症状を緩和することを含むがこれに限定されない
。本発明の抗体は、当該分野で公知であるように、または本明細書中に記載され
るように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０２１７】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的に
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクタ
ー細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これら
のアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供さ
れる教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタ
リングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法を理
解する。
【０２１８】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体、ま
たはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２１９】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０２２０】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に対するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメ
ント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメン
ト、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性
としては、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、
１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、
１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ
、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１
０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０- 15 Ｍよりも小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２２１】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与
により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらの
コードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２２２】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２２３】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２２４】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、あるいはそのフラグメントもしくはキメ
ラタンパク質、またはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それにより抗体をコードする核酸
の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９
）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）
）。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいは
この核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはその
フラグメントを含む。
【０２２５】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０２２６】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、
そしてそれを細胞内になるように投与することによるか（例えば、欠損性または
弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０
，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射によるか、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏ
ｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質もしくは細胞表面レ
セプターでコーティングするか、または薬剤をトランスフェクトするか、リポソ
ーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプセル化によるか、あるいは
、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与することにより
、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与する
ことによる（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４
２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異的に発現する細
胞の型を標的にするために用いられ得る）など）のいずれかにより達成され得る
。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、リガン
ドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性
ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする。さらに別
の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的化することにより、細
胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化され得る（例えば、Ｐ
ＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第ＷＯ９
２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２２１号
を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換え
により、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅｒおよび
Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８
９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：
４３５−４３８（１９８９））。
【０２２７】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要な構成要素を含
む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以上のベ
クター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にする。レ
トロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅ
ｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療法に対し
てより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するための、レ
トロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療における
レトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である：Ｃｌｏ
ｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；
Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏ
ｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１
２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（
１９９３）。
【０２２８】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治
療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３
−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイ
ルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９
９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）
；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２
３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。
好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２２９】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２３０】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選択下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。
【０２３１】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ま
しくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。
【０２３２】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。
【０２３３】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２３４】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
【０２３５】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫によりその核酸配列が発現可能である
ように細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにイン
ビボで投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いら
れる。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞
および／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得
る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎ
ｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａ
ｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰ
ｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１
：７７１（１９８６）を参照のこと）。
【０２３６】 具体的な実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コー
ド領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、その核
酸の発現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可
能である。
【０２３７】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定する
ために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイ
が挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そ
して化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サン
プルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０２３８】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、
ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限
定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましく
はヒトである。
【０２３９】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０２４０】 様々な送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発
現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合
物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注
射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を
包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０２４１】 具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必
要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではない
が、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み
合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプ
ラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよ
うな膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達
成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパ
ク質が吸収されない材料を使用するように注意が払われなければならない。
【０２４２】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２４３】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：
５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５
７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いら
れ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅ
ｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ
（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅ
ｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５
１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１
９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出シ
ステムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみ
を必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１
１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０２４４】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒによる総説（Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：１５２７−１５３３（１９９０））において議論される。
【０２４５】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより）、そのコードされたタ
ンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、
細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内
に組み込まれ得る。
【０２４６】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、穀粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グ
リセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グ
リコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば
、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物
は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物など
の形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのような
キャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマン
ニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナト
リウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。
適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。こ
のような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切
な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。
処方物は、投与形態に適するべきである。
【０２４７】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２４８】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンを有して形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンを有して形成される塩が挙げられる。
【０２４９】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の処置、抑制および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じ
て使用されて、最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用
されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依
存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量応答曲線から
外挿され得る。
【０２５０】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、ヒト体内で、他種由来の抗体よりも長い半減
期を有する。従って、ヒト抗体のより低い投薬量および頻度のよりｓ低い投与は
、しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改
変（例えば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込み
および組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０２５１】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０２５２】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診
断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出に
ついて提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を
使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする
工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルとを比
較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるア
ッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を
示す。
【０２５３】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルとを比較する工程、を包含し、こ
れによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド
遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由
来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生の素因を示し
得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供し得
る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること、ま
たは早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらなる進
行を予防する。
【０２５４】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な
抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、
グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１
Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１
１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノー
ル）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならび
にビオチンが挙げられる。
【０２５５】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値に対して、
検出された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され
得る。
【０２５６】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断画像を生じるために
必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解され
る。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、
通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化抗体
または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優先的
に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉ
ｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅ
ｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」（Ｔ
ｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第１３章，Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ
．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９
８２）において記載される。
【０２５７】 用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して
、標識分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして非結合性の標識分子がバッ
クグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与後の時間間隔は、６
〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態におい
ては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
【０２５８】 １つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、疾患または障
害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最初の
診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。
【０２５９】 標識分子の存在は、当該分野において公知のインビボ走査の方法を用いて、患
者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存する。当業者
は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法に
おいて用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされないが、コンピュ
ーター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影法（ＰＥＴ）
のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が挙げられる。
【０２６０】 特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線反応性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光反応性の走査機器を用いて患者から検出される。別の
実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断
層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態に
おいては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を
用いて患者から検出される。
【０２６１】 （キット） 本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形
態においては、キットは、１以上の容器に入った本発明の抗体（好ましくは精製
された抗体）を含む。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキッ
トに含まれる抗体に対して特異的に免疫反応性のエピトープを含む、実質的に分
離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプ
チドと反応しないコントロール抗体を、さらに含む。別の特定の実施形態におい
ては、本発明のキットは、抗体の目的のポリペプチドとの結合を検出するための
手段（例えば、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物
または発光化合物）と結合し得る抗体、または検出可能な基質と結合し得る第一
の抗体を認識する第二の抗体）を含む。
【０２６２】 別の特定の本発明の実施形態においては、このキットは、増殖性および／また
は癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清
をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目
的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を含み得る。このようなキット
は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体に対して特異的に免疫反応性のエ
ピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を含み得る。さらに、こ
のようなキットは、この抗体の抗原への結合を検出するための手段（例えば、フ
ローサイトメトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのよ
うな蛍光化合物と結合し得る抗体）を含む。特定の実施形態においては、このキ
ットは、組み換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポ
リペプチド抗原を含み得る。このキットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体
に付着され得る。
【０２６３】 より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識抗ヒト抗体を含む。この実施形態においては、抗体のポリペプチド抗原
との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。
【０２６４】 さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む
血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫活性な、実質的に単
離された抗体、およびポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗体との結合
を検出する手段を含む。１つの実施形態においては、抗体は、固体支持体に付着
される。特定の実施形態においては、その抗体は、モノクロナール抗体であり得
る。このキットの検出手段は、第二の標識モノクロナール抗体を含み得る。ある
いは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競合抗原を含み得る。
【０２６５】 １つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面
結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ
、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合す
る抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試
薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗
体を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が
決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または
比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をイン
キュベートすることにより検出される酵素である。
【０２６６】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着さ
せるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に
、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な
基（例えば、活性なカルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）と
のタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的
には、遊離アミノ基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンで
コートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０２６７】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組み換え抗原を有する支持体、
および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒ
ト抗体を含む。
【０２６８】 （融合タンパク質） 任意のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、融合タンパク質を産生するために使用さ
れ得る。例えば、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、第２のタンパク質と融合される
場合、抗原性タグとして使用され得る。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対して惹起
される抗体は、ＶＥＧＦ−２に結合することによって、第２のタンパク質を間接
的に検出するために使用され得る。さらに、分泌されるタンパク質は、細胞位置
を輸送シグナルに基づいて標的化するので、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、他の
タンパク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
【０２６９】 ＶＥＧＦ−２ポリペプチドと融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列
のみならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である
必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０２７０】 さらに、融合タンパク質はまた、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの特徴を改良する
ために操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、
宿主細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を
改良するためにＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＮ末端へ付加され得る。また、ペプ
チド部分は精製を容易にするためにＶＥＧＦ−２ポリペプチドへ付加され得る。
このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチド
の取り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られる
慣用の技術である。
【０２７１】 さらに、ＶＥＧＦ−２ポリペプチド（フラグメント、および特定のエピトープ
を含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わせられ
、キメラポリぺプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、
そしてインビボにおける増大した半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣ
Ｄ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの
重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載し
ている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７； Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
３３１： ８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧ
に起因する）を有する融合タンパク質もまた、モノマー分泌タンパク質またはタ
ンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに
効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０
：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０２７２】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応特許第２０４５８６９
号）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発
見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニス
トを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分
と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）
。
【０２７３】 さらに、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドはマーカー配列（例えば、ＶＥＧＦ−２の
精製を容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい実施形態において、マー
カーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベ
クター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａ
ｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これら
の多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９
）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精
製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏ
ｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））。
【０２７４】 従って、任意のこれら上記の融合物は、ＶＥＧＦ−２のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドを使用して操作され得る。 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびそ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製する方法、および組換え技術によるＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対するそ
れらの使用のための方法に関する。
【０２７５】 宿主細胞は、一般に、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベク
ターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入されるか、
または形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）される。ベクターは
、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作さ
れた宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または本発明
のＶＥＧＦ２遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地において培
養され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択される
宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。
【０２７６】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため
に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターの任意の１つに含まれ得る。このようなベクタ
ーは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列（例えば
、ＳＶ４０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；
酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベク
ター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のような
ウイルスＤＮＡ）を含む。しかし、宿主中で複製可能で、そして存続可能である
限り、他の任意のプラスミドまたはベクターも使用され得る。
【０２７７】 適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベクター中に挿入され得る。一般に、
ＤＮＡ配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に
挿入される。そのような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えら
れる。
【０２７８】 発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動
的に連結されて、ｍＲＮＡの合成を指示する。そのようなプロモーターの代表的
な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．
ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、λファージＰLプロモーター、および原核生物
細胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御する
ことが公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリ
ボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、発現を増
幅するための適切な配列を含み得る。
【０２７９】 さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため
の表現型形質を提供する少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含む。このよう
なマーカーには、真核細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌の培
養については、テトラサイクリンまたはアンピシリンの耐性遺伝子が挙げられる
。
【０２８０】 本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列ならびに適切なプロモーター配列ま
たは制御配列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換して、宿主にタンパク質
を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２お
よびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ま
たはＢｏｗｅｓ黒色腫）；ならびに植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細
書の教示により当業者の範囲内であると考えられる。
【０２８１】 より詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組
換え構築物を含む。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウ
イルスベクター）を含み、このベクターの中には、本発明の配列が正方向または
逆方向に挿入されている。この実施形態の好ましい局面では、構築物はさらに、
配列に作動可能に連結された、調節配列（例えば、プロモーターを含む）を含む
。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購
入可能である。以下のベクターが例として提供される：細菌性：ｐＱＥ７０、ｐ
ＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）、ｐＢＳベクター、Ｐｈａ
ｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮ
Ｈ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）
；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０
、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。好ましい真核生物ベクター
としては以下である：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、
およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。他の適切なベクター
は、当業者に容易に明かである。
【０２８２】 本発明の実施における発現ベクターの使用に加え、本発明は、目的のタンパク
質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたオペレーターエレメン
トおよびプロモーターエレメントを含む、新規の発現ベクターをさらに含む。こ
のようなベクターの１つの例は、以下に詳細に記載されるｐＨＥ４ａである。
【０２８３】 図１６および１７に要約するように、ｐＨＥ４ａベクター（配列番号９）の構
成要素としては、以下が挙げられる：１）選択マーカーとしてのネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージ
プロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダルガ
ーノ配列、６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）、および
７）多重クローニング部位リンカー領域。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＣＵ１９
（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）由来である。プロモーター配列お
よびオペレーター配列は、合成的に作製された。核酸配列の合成生成物は、当該
分野で周知である（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ９５／９６Ｃａｔａｌｏｇ、２１５−２
１６頁、ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ、１０２０Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ
、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ９４３０３）。ｐＨＥ４ａベクターは、ＡＴＣＣに
１９９８年２月２５日に寄託され、そして受託番号２０９６４５を与えられた。
【０２８４】 ＶＥＧＦ−２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、ＮｅｄＩ、お
よびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８のいずれかを用いて
ベクターを制限消化し、そしてゲルにおいて大きなフラグメント（多重クローニ
ング部位領域は、約３１０ヌクレオチドである）を単離することにより、ｐＨＥ
４ａのプロモーターおよびオペレーターに作動可能に連結される。適切な制限部
位を有するＶＥＧＦ−２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、例え
ば、実施例１に記載のＰＣＲプロトコルに従って、ＮｅｄＩ（５’プライマー）
、およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８のいずれか（３
’プライマー）についての制限部位を有するＰＣＲプライマーを用いて、生成さ
れる。ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入
物およびベクターを標準的なプロトコルに従って連結する。
【０２８５】 上述のように、ｐＨＥ４ａベクターは、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む。ｌａｃＩｑ
は、ｌａｃＩ遺伝子の対立遺伝子であり、ｌａｃオペレーターの強固な調節を付
与する。Ａｍａｎｎ，Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１〜３１５（１９８８）；
Ｓｔａｒｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ５１：２５５〜２６７（１９８７）。ｌａｃＩｑ
遺伝子は、ｌａｃオペレーター配列に結合し、そして下流（すなわち、３’）配
列の転写を阻止する、リプレッサータンパク質をコードする。しかし、ｌａｃＩ
ｑ遺伝子産物は、ラクトースかまたは特定のラクトースアナログ（例えば、イソ
プロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））のいずれかの存在下で
、ｌａｃオペレーターから分離する。従って、ＶＥＧＦ−２は、ｐＨＥ４ａベク
ターを含む非誘導宿主細胞において、感知可能な量で産生されない。しかし、Ｉ
ＰＴＧのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、ＶＥＧＦ−２コー
ド配列の発現を生じる。
【０２８６】 ｐＨＥ４ａベクターのプロモーター／オペレーター配列（配列番号１０）は、
Ｔ５ファージプロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列を含む。１つの
オペレーターは、転写開始部位の５’側に配置され、そして他方は、同部位の３
’側に位置する。これらのオペレーターは、ｌａｃＩｑ遺伝子産物と組合せて存
在する場合、ｌａｃオペロンインデューサー（例えば、ＩＰＴＧ）の非存在下で
の、下流配列の強固な抑制を与える。このｌａｃオペレーターから下流に位置す
る作動可能に連結された配列の発現は、ｌａｃオペロンインデューサー（例えば
、ＩＰＴＧ）の添加により誘導され得る。ｌａｃＩｑタンパク質へのｌａｃイン
デューサーの結合は、ｌａｃオペレーター配列からのそれらの解放、および作動
可能に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のｌａｃオペロン調節
は、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ．、ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
ＷＩＴＨ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳ、第４版（１９９７
）、８０２〜８０７頁に概説される。
【０２８７】 ｐＨＥ４シリーズのベクターは、ＶＥＧＦ−２コード配列を除くｐＨＥ４ａベ
クターの全ての構成要素を含む。ｐＨＥ４ａベクターの特徴は、最適化された合
成Ｔ５ファージプロモーター、ｌａｃオペレーター、およびシャイン−ダルガー
ノ配列を含む。さらに、これらの配列はまた、最適に間隔を空けられ、その結果
、挿入された遺伝子の発現は，強固に調節され得、そして高レベルの発現が誘導
に際して生じる。
【０２８８】 本発明のタンパク質の産生における使用のために適切な公知の細菌プロモータ
ーの中には、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩプロモーターおよびｌａｃＺプロモーター
、Ｔ３プロモーター、Ｔ５プロモーター、およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロ
モーター、λＰＲプロモーターおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモ
ーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモ
ーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモ
ーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（
ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、
マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）が挙げられる。
【０２８９】 ｐＨＥ４ａベクターはまた、シャインダルガーノ（ＳＤ）配列を５’〜ＡＵＧ
開始コドンに含む。ＳＤ配列は、一般にＡＵＧ開始コドンから約１０ヌクレオチ
ド上流（すなわち、５’）に配置される短い配列である。これらの配列は、本質
的にＡＵＧ開始コドンに原核生物リボソームを指向する。従って、本発明はまた
、本発明のタンパク質の産生のために有用な発現ベクターに関する。本発明のこ
の局面は、ｐＨＥ４ａベクター（配列番号９）により実証される。
【０２９０】 プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベ
クターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子か
ら選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７で
ある。特に有名な細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７
、ｇｐｔ、ラムダＰR、ＰLおよびｔｒｐが挙げられる。真核生物プロモーターと
しては、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初
期および後期のＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲおよびマウ
スメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選
択は、十分に、当業者のレベルの範囲内である。さらなる実施形態において、本
発明は、上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核生物
細胞（例えば、哺乳動物細胞）もしくは下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）
であり得るか、または宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得
る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形
質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る（Ｄａｖｉｓ、Ｌら、Ｂａ
ｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８
６））。
【０２９１】 宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生する
ための従来の様式で用いられ得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来の
ペプチドシンセサイザーにより合成的に生成され得る。
【０２９２】 成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細
菌、または他の細胞において発現され得る。無細胞翻訳系はまた、本発明のＤＮ
Ａ構築物由来のＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を産生するために使用され
得る。原核生物宿主および真核生物宿主を用いる使用のための適切なクローニン
グベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）（この開示は、参考として本明細書に
おいて援用されている）に記載されている。
【０２９３】 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ターへのエンハンサー配列の挿入により増大される。エンハンサーは、ＤＮＡの
転写を増大するようにプロモーター上で作用するＤＮＡのシス作用性エレメント
（通常、約１０〜３００ｂｐ）である。例としては、複製起点の後期側にＳＶ４
０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモータ
ーエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウ
イルスエンハンサーが挙げられる。
【０２９４】 概して、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能に
する選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．
ｃｅｒｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子）、ならびに構造配列の下流の転写を志向
する高度に発現された遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモータ
ーは、なかでも、グリコール酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ（
ＰＧＫ）、ａ−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質）をコ
ードするオペロンに由来し得る。この異種構造配列は、翻訳開始配列および終止
配列、そして好ましくはリーダー配列（細胞膜周辺腔または細胞外媒介物へ翻訳
タンパク質の分泌を指向し得る）と適切な相でアセンブルされる。必要に応じて
、この異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または
簡易精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【０２９５】 細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターとともに作動可能
な読取り相において、適切な翻訳開始シグナルおよび終止シグナルと一緒に、所
望のタンパク質をコードする構造的ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される
。このベクターは、ベクターの維持を保証し、そして所望の場合には宿主内の増
幅を提供するための、１つ以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。形
質転換に適切な原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍならびにＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ属の種々の種が挙げられるが、他のものもまた選択の物質として使用さ
れ得る。
【０２９６】 代表であり、非限定的な例であるが、細菌の使用のための有用な発現ベクター
は、選択可能マーカーおよび市販のプラスミド（周知のクローニングベクターｐ
ＢＲ３２２の遺伝子エレメント（ＡＴＣＣ ３７０１７）を含む）由来の細菌性
複製起点を含み得る。このような市販のベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２
３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ
，Ｓｗａｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部位は、適
切なプロモーターおよび構造配列と組み合わされて発現される。
【０２９７】 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖の後、選択さ
れたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘導）により
抑制され、そして細胞は、さらなる期間培養される。
【０２９８】 細胞は、代表的に遠心分離により回収され、物理的手段または化学的手段によ
り破壊され、そして得られた粗抽出物は、さらなる精製のために保持される。タ
ンパク質の発現において使用される微生物細胞は、当業者に周知の、任意の便利
な方法（凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用
を含む）により破壊され得る。
【０２９９】 種々の哺乳動物細胞培養系がまた、組換えタンパク質の発現に使用され得る。
哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９
８１）に記載のサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合したベクターを
発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢ
ＨＫの細胞株）が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロ
モーターおよびエンハンサーを含み、そしてまた任意の必須のリボソーム結合部
位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、転写
終止配列、ならびに５’隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来の
ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプラ
イス部位、およびポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供
するために使用され得る。
【０３００】 本明細書に考察されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加えて
、本発明はまた、脊椎動物起源（特に哺乳動物起源）の初代、二次および不死化
の宿主細胞を包含する。これは、内因性遺伝子物質（例えば、ＶＥＧＦ−２配列
）を欠失または置換するように、そして／または本発明のＶＥＧＦ−２配列と作
動可能に会合し、そして内因性ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドを活性化、変更お
よび／または増幅する遺伝物質（例えば、異種プロモーター）を含むように操作
されている。例えば、当該分野で公知の技術が用いられ、相同組換えを介して、
異種制御領域および内因性ポリヌクレオチド配列（例えば、ＶＥＧＦ−２をコー
ドする配列）に作動可能に会合され得る（例えば、１９９７年６月２４日発行、
米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日発行、国際公開番号Ｗ
Ｏ ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日発行、国際公開番号ＷＯ ９４／
１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：４３５〜４３８（１９８９）（このそれぞれの開示は、その
全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【０３０１】 この宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由
来細胞））または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または
宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。挿入された遺伝子
配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を改変および処
理する宿主株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導物
質の存在下で上昇され得る；従って、遺伝子操作されたポリペプチドの発現は、
制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロ
セシングおよび修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、切断）のための特徴お
よび特定の機構を有する。適切な細胞株が、発現されたタンパク質の所望の修飾
およびプロセシングを保証するように選択され得る。
【０３０２】 このポリペプチドは、従来用いられる方法により組換え細胞培養物から回収お
よび精製され得る。この方法としては、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール
沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロ
ースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチ
ンクロマトグラフィーが挙げられる。精製の間存在するカルシウムイオン濃度は
低い（約０．１〜５ｍＭ）ことが好ましい（Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２４４：９１７（１９６９））。成熟タンパク質の立体配置を完成する際
に、必要な場合、タンパク質折り畳み工程が使用され得る。結局、最終精製工程
のためには、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が使用され得る。
【０３０３】 本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、または化学合成手順の産物
であり得、または原核生物宿主もしくは真核生物宿主（例えば、培養中の細菌細
胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞により）から組換
え技術によって産生され得る。組換え産生手順において使用される宿主に依存し
て、本発明のポリペプチドは、哺乳動物もしくは他の真核生物炭水化物とグリコ
シル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。本発明の
ポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【０３０４】 （ＶＥＧＦ−２のアゴニストおよびアンタゴニスト） 本発明はまた、ＶＥＧＦ−２アゴニストまたはアンタゴニストである化合物を
同定するための化合物スクリーニングの方法に関する。例えば、このような方法
は、ＶＥＧＦ−２がコミトゲン（ｃｏｍｉｔｏｇｅｎ）ＣｏｎＡの存在下でヒト
内皮細胞の増殖を有意に刺激する能力を利用する。内皮細胞を得て、そしてＣｏ
ｎ−Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を補充した反応混合
物中で、９６ウェル平底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍ
Ａ）中で培養する。Ｃｏｎ−Ａ、本発明のポリペプチドおよびスクリーニングさ
れるべき化合物を添加する。３７ＥＣでのインキュベーション後、１ＦＣｉの3
［Ｈ］チミジン（５ Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７ ＢＧｑ；ＮＥＮ）を用い
て、3［Ｈ］を取りこむのに十分な時間、培養物をパルスし、そしてガラスファ
イバーフィルター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔ
ｏｗｎ，ＭＡ）上に回収する。三連の培養物の平均3［Ｈ］チミジン取りこみ（
ｃｐｍ）を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて決定する。化合物が除去される場合
のコントロールアッセイと比較して、有意な3［Ｈ］チミジン取り込みは、内皮
細胞増殖の刺激を示す。
【０３０５】 アンタゴニストについてアッセイするため、上記のアッセイを実行する。そし
て化合物がＶＥＧＦ−２の存在下で3［Ｈ］チミジン取り込みを阻害する能力は
、この化合物がＶＥＧＦ−２に対するアンタゴニストであることを示す。あるい
は、ＶＥＧＦ−２アンタゴニストは、ＶＥＧＦ−２および可能性のあるアンタゴ
ニストを、膜結合ＶＥＧＦ−２レセプターまたは組換えレセプターと、競合阻害
アッセイに適した条件下で組み合わせることにより検出され得る。ＶＥＧＦ−２
は、放射能などにより標識され得、その結果レセプターに結合するＶＥＧＦ−２
分子の数は可能性のあるアンタゴニストの効力を決定し得る。
【０３０６】 あるいは、ＶＥＧＦ−２とレセプターとの相互作用後の公知のセカンドメッセ
ンジャー系の反応を測定し、そして化合物の存在下または非存在下で比較する。
このようなセカンドメッセンジャー系としては、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ
、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられるがこれらに限定
されない。別の方法では、ＶＥＧＦ−２レセプターを発現する哺乳動物細胞また
は膜調製物を、化合物の存在下で標識したＶＥＧＦ−２とインキュベートする。
次いで、化合物がこの相互作用を増強またはブロックする能力を測定し得る。
【０３０７】 可能性のあるＶＥＧＦ−２アンタゴニストとしては、抗体、またはある場合に
はオリゴヌクレオチド（ポリペプチドに結合し、そしてＶＥＧＦ−２機能を効果
的に排除する）が挙げられる。あるいは、可能性のあるアンタゴニストは、ＶＥ
ＧＦ−２レセプターに結合する密接に関連したタンパク質であり得るが、それら
はポリペプチドの不活性形態であり、そしてこれによりＶＥＧＦ−２の作用を阻
害する。これらのアンタゴニストの例としては、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのネ
ガティブドミナントな変異体が挙げられる。たとえば、ＶＥＧＦ−２のヘテロ二
量体形態の１つの鎖は、ドミナントであり得、そして生物学的活性が保持されな
いように変異され得る。ネガティブドミナントな変異体の例としては、別の二量
体と相互作用して野生型ＶＥＧＦ−２を形成し得るが、得られたホモ二量体は不
活性であり、そして特徴的なＶＥＧＦ活性を示し得ない、二量体ＶＥＧＦ−２の
短縮型が挙げられる。
【０３０８】 別の可能性のあるＶＥＧＦ−２アンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて
調製されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、三重鎖形成または
アンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ（この両方の方法は、ＤＮＡま
たはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく）を通じて遺伝子発現を制御す
るために用いられ得る。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列の５’コード部分は、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチド
は、転写に関する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（３重らせん−Ｌ
ｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎ
ｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、これにより
ＶＥＧＦ−２の転写および産生を防ぐ。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
は、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてＶＥＧＦ−２ポリペプチド
へのｍＲＮＡ分子の翻訳をブロックする（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−Ｏｋａｎｏ，Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｏｇｏｄｅｏｘｙｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏ
ｎ，ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮ
ＡまたはＤＮＡがインビボで発現されて、ＶＥＧＦ−２の産生を阻害し得るよう
に細胞に送達され得る。可能性のあるＶＥＧＦ−２アンタゴニストはまた、この
ポリペプチドの活性部位に結合し、これを占有して、これにより正常な生物学的
活性が妨害されるように触媒部位を基質に接近不能にさせる、小分子を含む。小
分子の例としては、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるがこれらに限
定されない。
【０３０９】 アンチセンスオリゴヌクレオチド技術は、遺伝子発現を阻害するための新規な
アプローチを提供する（一般的には、Ａｇｒａｗａｌ（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：１５２；Ｗａｇｎｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３７２：３３３〜３３５；およびＳｔｅｉｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６１：１００４〜１０１２を参照のこと）。相補的な核酸配列（センス鎖）
への結合により、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡのスプライシングお
よび翻訳を阻害し得る。この方式で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タン
パク質発現を阻害し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮ
Ａに結合し、３重鎖を形成し、そして転写を阻害することが示されている。さら
に、１７マー塩基の配列は、統計上、ヒトゲノムにおいて一回だけ存在し、そし
てこれにより特定の配列の非常に正確な標的化が、このようなアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いて可能である。
【０３１０】 アンタゴニストは、固形腫瘍転移に必要な新脈管形成を制限するために使用さ
れ得る。ＶＥＧＦ−２の同定は、血管内皮増殖因子の特定のインヒビターの生成
のために使用され得る。新脈管形成および新血管形成は、固形腫瘍増殖における
本質的工程であるので、血管内皮増殖因子の血管形成活性の阻害は、固形腫瘍の
さらなる増殖を防止、遅延または退行さえもするために非常に有用である。ＶＥ
ＧＦ−２の発現のレベルは、乳房を含む正常組織において非常に低いが、悪性腫
瘍に由来する少なくとも２つの乳房腫瘍細胞株において中程度のレベルで発現さ
れることが見出され得る。従って、ＶＥＧＦ−２が腫瘍の新脈管形成および増殖
に関与する可能性がある。
【０３１１】 神経膠腫はまた、本発明のアンタゴニストで処置され得る型の新形成である。
【０３１２】 アンタゴニストはまた、増大した血管浸透性により生じる慢性炎症を処置する
ために用いられ得る。これらの障害に加えて、アンタゴニストはまた、糖尿病、
慢性関節リウマチおよび乾癬に関連する網膜症を処置するために使用され得る。
【０３１３】 このアンタゴニストは、例えば、本明細書中において以降に記載のように、薬
学的に受容可能なキャリアと組み合わせて使用され得る。
【０３１４】 内皮性細胞増殖を活性化し得ない二量体を形成するように野生型ＶＥＧＦ２と
相互作用し得る、従って内因性ＶＥＧＦ２を不活化するＶＥＧＦ２の短縮型がま
た産生され得る。または、ＶＥＧＦ２の変異形態は、二量体自体を形成し、そし
て、標的細胞表面上の適切なチロシンキナーゼレセプターのリガンド結合ドメイ
ンを占有するが、細胞増殖を活性化し得ない。
【０３１５】 あるいは、本発明のポリペプチドが通常結合するレセプターに結合する、本発
明のポリペプチドに対するアンタゴニストが、使用され得る。このアンタゴニス
トは、密接に関係したタンパク質であり得、それによりアンタゴニストは、天然
のタンパク質のレセプター部位を認識しそれに結合する。しかしアンタゴニスト
は、天然のタンパク質の不活性形態であり、それにより、レセプター部位が占有
されるので、ＶＥＧＦ２の作用を阻害する。これらの方法において、ＶＥＧＦ２
の作用は、妨げられ、そしてアンタゴニスト／インヒビターは、ＶＥＧＦ２によ
り認識される腫瘍のレセプター部位を占有することにより、またはＶＥＧＦ２自
体を不活性化することにより、抗腫瘍薬物として治療的に用いられ得る。このア
ンタゴニスト／インヒビターはまた、ＶＥＧＦ２の増大した血管浸透作用に起因
して、炎症を防止するために用いられ得る。このアンタゴニスト／インヒビター
はまた、固形腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、乾癬および慢性関節リウマチを処置す
るために用いられ得る。
【０３１６】 このアンタゴニスト／インヒビターは、例えば、本明細書中において上記に記
載のように、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて使用され得る。さらに
、実施例９に示されるように、ＶＥＧＦ２に特異的な抗体は、ＶＥＧＦ−２ポリ
ペプチドと組み合わされ、内皮細胞反応を増大させ得る。ＶＥＧＦ−２ポリペプ
チドとＶＥＧＦ−２特異的抗体との組み合わせに応答する内皮細胞は、血管また
はリンパ管を含む。ＶＥＧＦ−２特異的抗体とＶＥＧＦ−２ポリペプチドとの組
み合わせは、本明細書を通じて記載されるように、内皮細胞の増殖の増大（例え
ば、新脈管形成および／またはリンパ管形成）の必要な個体を処置するために用
いられ得る。
【０３１７】 （ＶＥＧＦ−２の治療的適用） 以下の節で使用される場合、「ＶＥＧＦ−２」は、本明細書中で記載されるＶ
ＥＧＦ−２のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの全長形態および成熟形態、
ならびに本明細書中で記載されるＶＥＧＦ−２のアナログ、誘導体、および変異
体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを言及することを意図される。
【０３１８】 本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、光受容細胞のマイトジェンである。図
１２〜１５に示されるように、ＶＥＧＦ−２は、網膜培養物において細胞数、細
胞生存、ロドプシン発現、およびロドプシン細胞数を増加させる。
【０３１９】 従って、ＶＥＧＦ−２は、損傷および疾患を含む眼の障害を処置するために使
用され得る。これらの障害としては、以下が挙げられる：網膜色素線条、色素性
網膜炎、キーンズ症候群、色素パターンジストロフィー（ｐｉｇｍｅｎｔ ｐａ
ｔｔｅｒｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ）、網膜穿孔（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｅｒｆ
ｏｒａｔｉｏｎ）、網膜炎、脈絡網膜炎、サイトメガロウイルス網膜炎、急性網
膜壊死症候群、中心肺胞性脈絡膜ジストロフィー（ｃｅｎｔｒａｌ ａｌｖｅｏ
ｌａｒ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、優性ドルーゼ（ｄｏｍｉ
ｎａｎｔ ｄｒｕｓｅｎ）、遺伝性出血性黄斑変性、ノースカロライナ性黄斑変
性（Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ｍａｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、
中心周囲脈絡膜ジストロフィー（ｐｅｒｉｃｅｎｔｒａｌ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ
ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、成人窩黄斑変性（ａｄｕｌｔ ｆｏｖｅｏｍａｃｕｌ
ａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、良性同心輪状黄斑変性（ｂｅｎｉｇｎ ｃｏｎｃ
ｅｎｔｒｉｃ ａｎｎｕｌａｒ ｍａｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、中心
オーレオール色素上皮ジストロフィー（ｃｅｎｔｒａｌ ａｕｒｅｏｌａｒ ｐ
ｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、先天性黄斑部欠
損、優性遺伝性類嚢胞黄斑水腫、家族性中心窩網膜分離（ｆａｍｉｌｉａｌ ｆ
ｏｖｅａｌ ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｉｓ）、有窓性光輝黄斑変性（ｆｅｎｅｓ
ｔｒａｔｅｄ ｓｈｅｅｎ ｍａｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、進行性中
心窩ジストロフィー（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｆｏｖｅａｌ ｄｙｓｔｒｏｐ
ｈｙ）、遅進行性黄斑変性、ソーズビー偽炎症性ジストロフィー、網膜錐体−杆
状体ジストロフィー、進行性網膜錐体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、
ゴールドマン−ファーヴル症候群、バルデー−ビードル症候群、バッセン−コル
ンツヴァイク症候群（無β−リポ蛋白血症）、ベスト病（卵黄様ジストロフィー
）、コロイデレミア（ｃｈｏｒｏｉｄｅｍｉａ）、回転状萎縮、先天性黒内障、
レフスム症候群、シュタルガルト病およびアッシャー症候群。ＶＥＧＦ−２投与
から利益を享受し得る他の網膜症としては、以下が挙げられる：加齢性黄斑変性
（乾性および湿性形態）、糖尿病性網膜症、周辺硝子体網膜症、光性網膜症、外
科手術誘導性網膜症、ウイルス性網膜症（例えば、ＡＩＤＳに関連したＨＩＶ網
膜症）、虚血性網膜症、網膜剥離および外傷網膜症。
【０３２０】 ＶＥＧＦ−２は、眼細胞に対して治療性である他のタンパク質と共に投与され
得、これらとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：レチン酸、マ
イトジェン（例えば、インスリン、インスリン様成長因子、上皮成長因子、血管
作用性成長因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、およびソマ
トスタチン）；神経栄養性因子（例えば、グリア細胞系列由来神経栄養性因子、
脳由来神経栄養性因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４／５
、ニューロトロフィン−６、インスリン様成長因子、毛様体神経栄養性因子、酸
性および塩基性線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子−５、トランスフォー
ミング成長因子−β、およびコカイン−アンフェタミン調節転写物（ｃｏｃａｉ
ｎｅ−ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）
（ＣＡＲＴ））；および、他の成長因子（例えば、上皮成長因子、白血病抑制因
子、インターロイキン、インターフェロン、およびコロニー刺激因子）；ならび
に、これらの因子と機能的に等価である分子および物質。
【０３２１】 加えて、特定の個体における腫瘍の存在を検出するためのイムノアッセイにお
いて、抗体がさらに使用され得る。酵素イムノアッセイを、個体の血液サンプル
から実施し得る。上昇したレベルのＶＥＧＦ２が、癌の診断に考慮され得る。
【０３２２】 （薬学的組成物） 本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、適切な薬学的
キャリアと組み合わせて使用されて、薬学的組成物を包含し得る。このような組
成物は、治療的有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはア
ンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤（ｅｘｃｉｐｉ
ｅｎｔ）を含む。このようなキャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色剤、香料および希釈剤（ｄｉｌｕｔｉｎ
ｇ ａｇｅｎｔ）、乳化剤、懸濁剤、溶媒、賦形剤（ｆｉｌｌｅｒ）、バルク剤
（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤（ｄｉｌｕｅ
ｎｔ）、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、ならびに／または薬学的アジュバント
。処方は、投与の様式に適合すべきである。例えば、適切なビヒクルとしては、
生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ル、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０３２３】 ビヒクル中の主な溶媒は、本質的に水性または非水性のいずれであってもよい
。さらに、ビヒクルは、処方物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、清澄度、呈色、
無菌性、安定性、溶解度、または匂いを改変または維持するために、他の薬学的
に受容可能な賦形剤を含み得る。同様に、ビヒクルは、ＶＥＧＦ−２の放出速度
を改変もしくは維持するためにか、または眼の膜を通したＶＥＧＦ−２の吸収も
しくは透過を促進するために、さらに他の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る
。このような賦形剤は、単回用量形態または複数回用量形態のいずれかの非経口
投与のための投薬量を処方するために、通常そして通例的に使用されるような物
質である。
【０３２４】 一旦、治療用組成物が処方されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジ
ョン、固形、または脱水もしくは凍結乾燥させた粉末として、滅菌バイアル中に
保存され得る。このような処方物は、使用準備の整った形態（ｒｅａｄｙ ｔｏ
ｕｓｅ ｆｏｒｍ）、または投与前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結
乾燥された）のいずれかで保存され得る。
【０３２５】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を表す。さらに、本発明のポリペプチド、アゴニスト、
およびアンタゴニストを他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【０３２６】 ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、１つ以上の薬学的に受
容可能な賦形剤と組み合わせた薬学的組成物において投与され得る。ヒト患者に
投与される場合、本発明の薬学的組成物の総一日用法は、適正な医学判断の範囲
内で、主治医によって決定されることが理解される。任意の特定の患者に対する
特定の治療的有効用量レベルは、種々の因子（達成されるべき応答の型および程
度；（あるならば）使用される他の薬剤の特定の組成物；患者の年齢、体重、全
身の健康状態、性別、および食餌療法；投与時間、投与経路、および組成物の排
泄速度；処置期間；特定の組成物と組み合わせてかまたは同時に使用される薬物
（例えば、化学療法剤）；ならびに、当該医学分野で周知の同様の因子を含む）
に依存する。当該分野において公知の適切な処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出され得る。
【０３２７】 治療において使用されるＶＥＧＦ−２組成物は、個々の患者の臨床的状態（特
に、ＶＥＧＦ−２単独での処置の副作用）、ＶＥＧＦ−２組成物の送達部位、投
与方法、投与スケジュール、および実践者に公知の他の因子を考慮して、適正な
医学的実践と調和する様式で処方および投薬される。従って、本明細書中での目
的のためのＶＥＧＦ−２の「有効量」は、このような考慮により決定される。
【０３２８】 薬学的組成物は、都合の良い様式（例えば、経口経路、局所的経路、静脈内経
路、腹腔内経路、筋内経路、関節内経路、皮下経路、鼻腔内経路、気管内経路、
眼内経路、または皮内経路による）において投与され得る。薬学的組成物は、特
定の徴候の処置および／または予防のために有効な量で投与される。多くの場合
、ＶＥＧＦ−２投薬量は、投与経路、症状などを考慮して、一日あたり約１μｇ
／ｋｇ体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重である。しかし、投薬量は、０．００１μｇ
／ｋｇ程度に少量であり得る。例えば、局所的投与の特定の場合では、投薬量は
、好ましくは、１ｃｍ2あたり約０．０１μｇ〜９ｍｇを投与される。眼内投与
の場合、投薬量は、好ましくは、約０．００１μｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、
そしてより好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌを投与される。
【０３２９】 一般的提案として、より好ましくは用量当り、非経口的に投与されるＶＥＧＦ
−２の合計薬学的有効量は、患者体重に関して約１μｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ
／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のように、これは治療的裁量に委ねられる。連
続投与される場合、代表的には、ＶＥＧＦ−２を、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５
０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（
例えば、ミニポンプ（ｍｉｎｉ−ｐｕｍｐ）を用いる）のいずれかにより投与す
る。静脈内用のバッグ溶液またはボトル溶液もまた使用され得る。
【０３３０】 ＶＥＧＦ−２はまた、徐放性系により適切に投与される。徐放性組成物の適切
な例としては、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の半透
過性ポリマーマトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスとしては、ポリラ
クチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミ
ン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎ，Ｕ
．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（
２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＲ．Ｌａ
ｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン
ビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、同上）またはポリ−Ｄ−（−）−３−
ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。徐放性ＶＥＧＦ−２組成
物はまた、リポソームに封入されたＶＥＧＦ−２を包含する。ＶＥＧＦ−２を含
有するリポソームは、それ自体、公知である方法により調製される：ＤＥ３，２
１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；Ｅ
Ｐ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；
ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，
４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２，３２
４。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００オングストローム）ユニラ
メラ型であり、ここで脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、
選択される割合は、最適ＶＥＧＦ−２治療のために調整される。
【０３３１】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、ＶＥＧＦ−２は、そ
れを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち用いる投薬量
および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、かつ処方物の他の成分と適合
性であるもの）と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液またはエマルジ
ョン）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、
酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが既知の他の化合物を含ま
ない。
【０３３２】 特定の実施形態では、ＶＥＧＦ−２は経口的に投与される。この様式で投与さ
れるＶＥＧＦ−２は、カプセル化され得、そして固体投薬形態の配合において通
例的に使用されるようなキャリアを伴ってかまたは伴わずに処方され得る。カプ
セルは、バイオアベイラビリティを最大化され、そして前全身性（ｐｒｅ−ｓｙ
ｓｔｅｍｉｃ）分解が最小化される場合に、胃腸管内の場所において処方物の活
性部分を放出するように設計され得る。さらなる賦形剤が、ＶＥＧＦ−２の吸収
を容易にするために含められ得る。希釈剤、香料、低融点ろう、植物油、潤滑剤
、懸濁剤、錠剤分解剤（ｔａｂｌｅｔ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ａｇｅ
ｎｔ）および結合剤もまた使用され得る。
【０３３３】 ＶＥＧＦ−２はまた、動物およびヒトにおける光受容体の損傷、障害、および
病状を処置するために、滴剤としてか、または軟膏剤、ゲル、リポソーム、微小
粒子もしくは生体適合性のポリマーディスク、ペレット剤（ｐｅｌｌｅｔ）中で
眼に投与され得るか、あるいはコンタクトレンズ内に保持され得る。眼内組成物
はまた、当業者が従来の判定基準を用いて選択し得るような、生理的に適合性の
眼用ビヒクルを含み得る。ビヒクルは、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない公知の眼用ビヒクルから選択され得る：水、ポリエーテル（例えば、ポリエ
チレングリコール４００）、ポリビニル（例えば、ポリビニルアルコール）、ポ
ビドン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセル
ロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース）、石油誘導体（例えば、鉱
油および白色ワセリン）、動物性脂肪（例えば、ラノリン）、植物性脂肪（例え
ば、ピーナッツ油）、アクリル酸ポリマー（例えば、カルボキシルポリメチレン
ゲル）、ポリサッカリド（例えば、デキストランおよびグリコサミノグリカン）
、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化亜鉛、ならびに緩衝剤（
例えば、炭酸水素ナトリウムまたは乳酸ナトリウム）。高分子量分子もまた使用
され得る。組成物中に存在するＶＥＧＦ−２を不活化しない生理的に適合性の保
存薬としては、アルコール（例えば、クロロブタノール）、塩化ベンザルコニウ
ム（ｂｅｎｚａｌｋｎｏｎｉｕｍ）およびＥＤＴＡ、または当業者に公知の任意
の他の適切な保存薬が挙げられる。
【０３３４】 例えば、ＶＥＧＦ−２は、単回注射または複数回注射において約１μｇ／眼〜
約１ｍｇ／眼で眼内に直接的に投与され得る。眼用の溶液、懸濁液、および軟膏
剤を含む局所的な眼用調製物の処方は、当業者に周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、第８６
章、第１５８１〜１５９２頁、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ、１９９０を参照のこと）。他の投与様式（房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ
）注射（これは、前房内に直接的にかまたは硝子体腔内に直接的になされ得る）
、結膜下注射および眼球後注射を含む）が利用可能であり、そしてこのような投
与様式に適切な眼用調製物を生成するための方法および手段もまた周知である。
ＶＥＧＦ−２はまた、光受容体層と色素性網膜上皮層との間の網膜下空間内に投
与され得る。
【０３３５】 本明細書中で使用される場合、「眼球外」は、眼の表面および眼球と眼瞼との
間の（外部）空間をいう。眼球外領域の例としては、眼瞼円蓋または盲嚢、結膜
表面および角膜表面が挙げられる。この位置は、すべての眼組織に対して外部で
あり、そしてこの領域にアクセスするために侵襲性手順は必要とされない。眼球
外系の例としては、挿入物、および「局所的に」適用される滴剤、ゲルまたは軟
膏剤（これらは、これらの領域に治療用物質を送達するために使用され得る）が
挙げられる。眼球外デバイスは一般的に、患者によってでさえ、容易に取り外し
可能である。
【０３３６】 以下の特許は、眼球外領域に薬物を投与するために使用される眼球外系を開示
する。Ｈｉｇｕｃｈｉらは、米国特許第３，９８１，３０３号、同第３，９８６
，５１０号、および同第３，９９５，６３５号において、薬物を含む生分解性の
眼用挿入物を開示する。この挿入物は、眼球の盲嚢、眼球と眼瞼との間の眼球外
空間における保持のために異なる形態で作製され得る。いくつかの一般的な生体
適合性ポリマーが、このデバイスを製作する際に使用するために適切であるとし
て開示されている。これらのポリマーとしては、アルギン酸亜鉛、ポリ（乳酸）
、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（無水物）、およびポリ（グリコール酸）が
挙げられる。これらの特許はまた、薬物およびその薬物処方物を保持する中空チ
ャンバーへの透過を減少させた膜コーティングデバイスを記載する。
【０３３７】 米国特許第４，２１７，８９８号は、制御された薬物送達のために使用される
細孔リザーバーを開示する。これらのデバイスは、眼の盲嚢内において眼球外に
配置される。とりわけ目的のポリマー系は、ポリ（ビニルクロリド）−コ−ポリ
（ビニルアセテート）コポリマーである。Ｋａｕｆｍａｎは、米国特許第４，８
６５，８４６号および同第４，８８２，１５０号において、少なくとも１つの生
体腐食可能な（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）物質または結膜嚢のための軟膏キャ
リアを含む眼用薬物送達系を開示する。この特許は、適切な送達系として、ポリ
（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ビニルアルコール）、および架橋コ
ラーゲンのようなポリマー系を開示する。
【０３３８】 現在記載された、網膜の疾患または損傷の処置に関するＶＥＧＦ−２の使用に
おいて、局所的に適用される眼用処方物が、眼内への治療用薬剤の浸透または輸
送を促進するための薬剤を含むこともまた有利である。このような薬剤は、当該
分野において公知である。例えば、Ｋｅら（米国特許第５，２２１，６９６号）
は、角膜を通した眼用調製物の浸透を増強するための物質の使用を開示する。
【０３３９】 眼内系は、眼自体の組織層内、眼自体の組織層間、または眼自体の組織層周辺
の任意の組織画分における使用に適切であるような系である。これらの位置とし
ては、結膜下（眼球に隣接した眼の粘膜の下）、眼窩（眼球の後ろ側）、および
房内（眼球自体の房内）が挙げられる。眼球外系とは対照的に、注射または移植
からなる侵襲性の手順が、これらの領域にアクセスするために必要とされる。
【０３４０】 以下の特許は、眼内デバイスを開示する。Ｗｏｎｇ（米国特許第４，８５３，
２２４号）は、眼の房内に導入するためのマイクロカプセル化された薬物を開示
する。この系において使用されるポリマーとしては、ポリエステルおよびポリエ
ーテルが挙げられる。Ｌｅｅ（米国特許第４，８６３，４５７号）は、治療用薬
剤の徐放のために眼内に外科的に移植された生分解性デバイスを開示する。この
デバイスは、結膜（眼球の粘膜）の下での外科的移植のために設計される。Ｋｒ
ｅｚａｎｃａｋｉ（米国特許第４，１８８，３７３号）は、ヒト体温でゲル化す
る薬学的ビヒクルを開示する。このビヒクルは、薬物およびゴムの水性懸濁物ま
たはセルロース誘導性合成誘導体である。Ｈａｓｌａｍらは、米国特許第４，４
７４，７５１号および同第４，４７４，７５２号において、室温で液体であり、
そして体温でゲル化するポリマー−薬物系を開示する。この系において使用され
る適切なポリマーとしては、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンが
挙げられる。Ｄａｖｉｓらは、米国特許第５，３８４，３３３号において、長期
間の薬物放出を提供する生分解性の注射可能な薬物送達ポリマーを開示する。こ
の薬物組成物は、生分解性のポリマーマトリクス中で薬学的に活性な薬剤から構
成され、ここでポリマーマトリクスは、２０ＥＣ〜３７ＥＣの範囲の温度で固体
であり、そして３８ＥＣ〜５２ＥＣの範囲の温度で流動可能（ｆｌｏｗａｂｌｅ
）である。薬物送達ポリマーは、可溶性または液体の薬物処方物の送達に限定さ
れない。例えば、ポリマーは、注射の部位で、薬物を含有するミクロスフェア、
リポソーム、または他の粒子結合薬物を安定化および保持するためのマトリクス
として使用され得る。
【０３４１】 眼内注射のために特に適切なビヒクルは滅菌蒸留水であり、ここでＶＥＧＦ−
２は、無菌性の等張性溶液として処方され、そして適切に保存される。さらに別
の眼用調製物は、タンパク質（これは、次いで、蓄積注射として送達され得る）
の緩徐または持続的な放出を提供する薬剤（例えば、注射可能なミクロスフェア
またはリポソーム）を伴うＶＥＧＦ−２の処方物を含み得る。ＶＥＧＦ−２の眼
内導入のための他の適切な手段としては、ＶＥＧＦ−２を含有する移植可能な薬
物送達デバイスが挙げられる。
【０３４２】 本発明の眼用調製物（特に、局所的調製物）は、他の成分（例えば、当該分野
において周知のような、眼に受容可能な保存剤、張度剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａ
ｇｅｎｔ）、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝化剤、抗菌剤、抗酸化剤、および界
面活性化剤）を含み得る。例えば、適切な張度増強剤としては、ハロゲン化アル
カリ金属（好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、
ソルビトールなどが挙げられる。十分な張度増強剤が、有利に添加され、その結
果、眼内に滴下される処方物は、低張性または実質的に等張性である。適切な保
存剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：塩化ベンザルコニ
ウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベ
ン、クロルヘキシジン、ソルビン酸など。過酸化水素もまた、保存剤として使用
され得る。適切な共溶媒としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：グリセリン、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコール。適切な
錯化剤としては、以下が挙げられる：カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−
シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン。適
切な界面活性剤または湿潤剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、
トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポールなど。緩衝剤は、ホ
ウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩またはＴｒｉｓ−ＨＣｌのような従来
の緩衝剤であり得る。
【０３４３】 処方物成分は、眼球外または眼内の投与部位に受容可能である濃度で存在する
。例えば、生理的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ（代表的には、約５〜約８の範囲
のｐＨ）に組成物を維持するために、緩衝剤が使用される。
【０３４４】 さらなる処方成分としては、局所的接触を最大にし、かつ吸収を促進するよう
に、眼球外に投与される治療剤の長期化した眼での持続期間を提供する物質が挙
げられ得る。適切な物質としては、眼科用調製物の増加した粘性を提供する材料
を形成する、ポリマーまたはゲルが挙げられる。キトサンは、持続性放出の液体
眼科用薬物処方物中の眼科用放出速度制御剤として特に適切な物質である（米国
特許第５，４２２，１１６号、Ｙｅｎらを参照のこと）。眼における眼科用処置
薬剤の制御放出（例えば、持続性かつ長期化した送達）についての本発明の処方
物の適合性は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ ６：３６７−３７３（１９８７）に記載されるように、当該分野で公
知の種々の手順およびそのバリエーションにより決定され得る。
【０３４５】 なお別の眼科用調製物は、錠剤の製造に適切な非毒性の眼科的に受容可能な賦
形剤と混合して、有効量のＶＥＧＦ−２を含み得る。滅菌水または他の適切なビ
ヒクル中に錠剤を溶解することによって、眼科用溶液を単位用量形態で調製し得
る。適切な賦形剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：不活
性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウ
ム、ラクトース、またはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン
、ゼラチンまたはアラビアゴム）；または滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネ
シウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０３４６】 一般に、処方物は、ＶＥＧＦ−２と、液体キャリアまたは微細に分配された個
体キャリアまたはその両方とを、一様にかつ密接に接触させることにより調製さ
れる。次いで、必要であれば、この産物を、所望の処方物に成型する。好ましく
は、キャリアは、非経口的キャリアであり、より好ましくは、レシピエントの血
液と等張性の溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理
食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非水性ビヒクル
（例えば、不揮発性油およびオレイン酸エチルならびにリポソーム）はまた、本
明細書中で有用である。当該分野で公知である適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（最新版）、Ｍａ
ｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出され
得る。
【０３４７】 キャリアは、適切には、少量の添加剤（例えば、等張性および化学的安定性を
増強する物質）を含む。このような物質は、使用される投薬量および濃度におい
てレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらの物質としては、以下のよ
うな緩衝液が挙げられる：リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸
、またはそれらの塩；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量（約１０
残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）
；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親
水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン
、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン）；モノサッカライド、ジサ
ッカライド、および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体を含む）、グル
コース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖
アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、
ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート
、ポロキサマーまたはＰＥＧ）。
【０３４８】 ＶＥＧＦ−２は、代表的には、約０．０１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好
ましくは０．０１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、こ
のようなビヒクル中に処方される。前述の特定の賦形剤、キャリア、または安定
化剤の使用は、ＶＥＧＦ−２塩の形成を生じる。
【０３４９】 治療的投与のために使用されるＶＥＧＦ−２は、無菌でなければならない。無
菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通しての濾過により容易に
達成される。治療的ＶＥＧＦ−２組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有す
る容器（例えば、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バ
ッグまたはバイアル）中に配置される。
【０３５０】 ＶＥＧＦ−２は、通常、単一用量容器または複数用量容器（例えば、密封され
たアンプルまたはバイアル）中に、水溶液としてまたは再構成のための凍結乾燥
処方物として保存される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに５
ｍｌの滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）ＶＥＧＦ−２水溶液を満たし、そして得られ
る混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、静菌性注射用水を使用して、凍結乾燥し
たＶＥＧＦ−２を再構成することにより調製される。
【０３５１】 （遺伝子治療方法） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するための遺伝子治療方
法に関する。この遺伝子治療法は、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの発現を
達成するために、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）配列を動物へ導入することに関する。この方法は、プロモーター、および標
的組織によるこのポリペプチドの発現のために必要な任意の他の遺伝的エレメン
トに作動可能に連結された、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達の技術は、当該分野で公
知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第
５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔ
ａ Ｈ．ら（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−
４７９、Ｃｈａｏ，Ｊ．ら（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６
）：５１７−５２２、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕ
ｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．ら（１
９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１、Ｔｓｕｒｕｍｉ，
Ｙ．ら（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３２９
０（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０３５２】 以下により十分に議論されるように、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド配列は、
好ましくは、細胞により取り込まれた後に、治療的効果を有する。それ自体が治
療剤であるポリヌクレオチドの例は、アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ；アンチ
センスＲＮＡをコードするＤＮＡ；または欠損性もしくは欠乏性の内因性分子を
置換するｔＲＮＡもしくはｒＲＮＡをコードするＤＮＡである。例えば、プロモ
ーターは、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結され得
る。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリ
ダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする（Ｏｋａ
ｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５６：５６０（１９９１））。アンチセンスＲ
ＮＡは、その標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げるために十分長くかつ相補的でなければ
ならない。
【０３５３】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでＶＥＧＦ−２ポリヌクレオ
チドに作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）を用いて操作され得、この操作された細胞は次いで、このポリペプチ
ドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野で周知であ
る。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎｓｔ．８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら，
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆ
ｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−
４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０
：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，
Ｌ．ら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）；
Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６−
１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらの文
献は、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態では、操作される細
胞は、光受容細胞である。これらの操作される細胞は、その起源の組織、その起
源の組織周辺の組織、静脈もしくは動脈への直接注射によって、またはカテーテ
ル注射によって患者に再度導入され得る。１つの実施形態において、操作された
細胞は、強膜に付着されて、硝子体液中に直接、ＶＥＧＦ−２タンパク質を生成
および放出する。
【０３５４】 網膜疾患または損傷に起因して欠損細胞または喪失された細胞を置換するよう
に設計された光受容細胞移植研究は、網膜変性の動物モデルにおいて首尾よく行
われた（ＳｉｌｖｅｒｍａｎおよびＨｕｇｈｅｓ，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａ
ｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３０：１６８４−１６９０（１９８９）；Ｇｏｕｒ
ａｓら，Ｎｅｕｒｏ−Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１０：１６５−１７６（１９９０
））。光受容細胞が、ドナーの眼から得られ得、そして本明細書中に記載の培養
物において維持されることが意図される。次いで、この細胞は、網膜下腔を介し
て網膜の疾患または損傷に罹患した患者の網膜に移植される、精製光レセプター
の供給源として使用される。これらの患者を免疫抑制治療で処置して、移植され
た細胞の免疫学的応答および拒絶を排除する。エキソビボドナーの網膜は、移植
された細胞の増殖および生存を増強するために、ＶＥＧＦ−２の存在下で培養さ
れる。光受容細胞移植を受ける患者は、移植された光レセプターの生存および成
熟を促進するために必要な硝子体内ＶＥＧＦ−２で処置される。
【０３５５】 以下でより詳細に考察するように、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、
注射可能な物質を動物の細胞へ送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉
、皮膚、肺、肝臓など）の間隙空間への注射）によって送達され得る。ＶＥＧＦ
−２ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリアに
て送達され得る。
【０３５６】 １つの実施形態では、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチ
ドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、
細胞への侵入を補助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒク
ル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または
沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオ
チドはまた、リポソーム処方物中で送達され得、そしてリポフェクチン処方物な
どは、当業者に周知の方法によって調製され得る。このような方法は、例えば、
本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５
，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号に記載される。
【０３５７】 遺伝子治療方法において使用されるＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドベクター構
築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含ま
ない、構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手
可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶ
Ｌ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ
３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者
に容易に明白である。
【０３５８】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ＶＥＧＦ−２ ＤＮＡの発現を
駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプ
ロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロ
モーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイ
ルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプ
ロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチ
ミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホ
ルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、ＶＥＧＦ−２につ
いてネイティブなプロモーターであり得る。
【０３５９】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０３６０】 ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺
、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢
、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含す
る）の間隙空間に送達され得る。眼が特に好ましい。この組織の間隙空間は、器
官組織の細網線維間の、細胞間の液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁におけ
る弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃ
ｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ
ｃｅｌｌ）内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の
血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。ＶＥＧＦ
−２ポリヌクレオチド構築物は、これらの細胞を含む組織への注射により好都合
に送達され得る。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化し
た永続性の非分裂細胞に送達され、そして発現されるが、送達および発現は、非
分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚
線維芽細胞）において達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチ
ドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。
【０３６１】 裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬
量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好まし
くは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識
するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切
かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態
および投与経路に依存し得る。
【０３６２】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸のＶＥＧＦ−２ＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順におい
て用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。裸のポリヌクレオチドは
、局所投与およびいわゆる「遺伝子銃」により送達され得る。これらの送達方法
は、当該分野で公知である。
【０３６３】 この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈澱剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。
【０３６４】 特定の実施形態において、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、リポソー
ム調製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は
、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製
物を包含する。しかし、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強
固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチ
オン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細書中で
参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された転写因
子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．（１９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介すること
が示されている。
【０３６５】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして商標ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもとにＧ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参考と
して援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと）より入手可
能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０３６６】 当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明に関して、例
えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用さ
れる）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、
例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３〜７４１７を参照のこ
と。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し
得る。
【０３６７】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。
そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホ
スファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、
ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得
る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知であ
る。
【０３６８】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを作製し得る。従って、
例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの
各５０ｍｇを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。この
サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次
いで、浴を１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ）
プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓモデル３５０超音波処理器を使用
して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。あるいは
、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得るか、
または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出すこ
とにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知であ
りそして利用可能である。このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小
さな単膜小胞（ＳＵＶ）または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶ
が好ましい。当該分野で周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体
が調製される。例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎ
ｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）１０１：
５１２〜５２７を参照のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチュー
ブの壁面にリン脂質の薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物
質の溶液で水和することによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処
理により調製され、単膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質
を、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。
【０３６９】 カチオン性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水
または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶
液中に再懸濁し、超音波処理し、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと
直接混合する。正に荷電したリポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して
、リポソームおよびＤＮＡは非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸
フラグメントについての用途を見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法
により調製される。一般に使用される方法としては、Ｃａ2+−ＥＤＴＡキレート
化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１
７：７７）；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓ
ｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７
７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およ
びＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（
Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；
Ｓｚｏｋａ，Ｆ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅ
ｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ
、これらの文献は本明細書中で参考として援用される。
【０３７０】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
【０３７１】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
【０３７２】 特定の実施形態において、ＶＥＧＦ−２をコードする配列を含むＲＮＡを含む
レトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。
レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとしては、モロ
ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ
肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫
不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、
これらに限定されない。
【０３７３】 このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５〜１４（１９
９０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、φ−２、φ−ＡＭ、ＰＡ
１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、φＣＲＥ、φＣＲＩＰ、ＧＰ
＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これら
に限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケ
ージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーシ
ョン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、それらに限定
されない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリ
ポソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る
。
【０３７４】 このプロデューサー細胞株は、ＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドを
含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロ
ウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのいずれかにおい
て、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は、ＶＥ
ＧＦ−２を発現する。
【０３７５】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるＶＥＧＦ
−２ポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。
アデノウイルスは、それがＶＥＧＦ−２をコードし、そして発現し、それと同時
に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるよ
うに操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染色
体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽
減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れ
た安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら、（１９７
４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３−２３８）。最終的
に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトン（ｃｏｔｔｏｎ）ラットの肺へ
のα−１−抗トリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証され
ている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２
：４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３
〜１５５）。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しよ
うとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら（１９７９
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：６６０６）。
【０３７６】 本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターは、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：
１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
ｔ．Ｔｈｅｒ．４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ．７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ
３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４
号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば、ア
デノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖され
得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的にＥｌ
ａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝子の
産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、
他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、
本発明において有用である。
【０３７７】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的
のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠
損アデノウイルスは、以下の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまた
はＬ１からＬ５までのすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る。
【０３７８】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、分裂中ではな
い細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３
００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み
込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのよ
うなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許
第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８
号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，
７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０３７９】 例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して、
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次い
で、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを
含む、任意の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパー
ウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘ
ルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニア
ウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がト
ランスフェクトおよび感染されると、それらはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構
築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはイ
ンビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入
する。この形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたＶＥＧＦ−２ポリヌクレ
オチド構築物を含み、そしてＶＥＧＦ−２を発現する。
【０３８０】 遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領
域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、ＶＥＧＦ−２をコードしている
配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在してい
るが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベルで発現
する、遺伝子の活性化を含む。
【０３８１】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、ＶＥＧＦ−２の所望される内
在性ポリヌクレオチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換
えに際して、プロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
【０３８２】 このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０３８３】 裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記でより詳細に記載されるような
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモ
ーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記でより詳細に記載する。
【０３８４】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性ＶＥＧＦ−２配列は
、このプロモーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在
性ＶＥＧＦ−２配列の発現を駆動する。
【０３８５】 好ましくは、ＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質
の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配列は、ポ
リヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で発現され
る、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列は、目的
のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランスフェクト
される細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当該分野で公知の方法
を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
【０３８６】 その投与様式によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子
が発現される限り、上記の任意のポリヌクレオチド構築物の任意の投与様式が使
用され得る。これは、直接針注入、全身注射、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉ
ｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォー
ムスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅｐｏｔ）物質、浸透圧
ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐剤用の固形（錠剤また
は丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティングまたは局所適用を含む。
例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈殿した裸のプラス
ミドの直接注入、または門脈へのタンパク質被覆プラスミド直接注入は、ラット
肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４３：３７５（１９８９））。
【０３８７】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域中に直接注入により
投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物
の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメ
ートルで注射することをいう。
【０３８８】 局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこ
のポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはそ
の構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。
【０３８９】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソー
ムを含む。
【０３９０】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７〜１
１２８１、１９９２を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐える
能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成す
ることにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当
該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられ
る。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレ
オチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０３９１】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、
１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康お
よび病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイ
ミングは、主治医または主治獣医により決定される。
【０３９２】 本発明の治療的組成物は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投
与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、ヒトが特に好ましい。
【０３９３】 （核酸の有用性） ＶＥＧＦ−２核酸配列およびＶＥＧＦ−２ポリペプチドをまた、科学的研究、
ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロの目的のため
、ならびにヒトの疾患を治療するための診断薬および治療薬の産生のために使用
し得る。例えば、ＶＥＧＦ−２を、光受容細胞のインビトロでの培養のために使
用し得、ここで、ＶＥＧＦ−２は１０ｐｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で馴化
培地に添加される。
【０３９４】 全長ＶＥＧＦ−２遺伝子のフラグメントを、ｃＤＮＡライブラリーのためのハ
イブリダイゼーションプローブとして使用して、この遺伝子に対する高い配列類
似性または同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離し得る。このタイプの
プローブは、一般に、少なくとも５０塩基対を有するが、それらはさらに多数の
塩基を有し得る。このプローブをまた、全長転写物に対応するｃＤＮＡクローン
、ならびに調節領域およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含
む完全なＶＥＧＦ−２遺伝子を含むゲノムクローンを同定するために使用し得る
。スクリーニングの例として、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公
知のＤＮＡ配列を使用することにより、ＶＥＧＦ−２遺伝子のコード領域を単離
する工程が挙げられる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識した
オリゴヌクレオチドを使用して、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡ
のライブラリーをスクリーニングし、このライブラリーのどのメンバーがこのプ
ローブとハイブリダイズするかを決定する。
【０３９５】 本発明は、ＶＥＧＦ−２レセプターの同定のための方法を提供する。このレセ
プターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンドパ
ンニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２），第５章、（１９９１）））
によって同定され得る。好ましくは、発現クローニングを使用し、ここで、ポリ
アデニル化されたＲＮＡをＶＥＧＦ−２に応答する細胞から調製し、そしてこの
ＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをプールに分割し、そしてＣＯＳ細胞
またはＶＥＧＦ−２に応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用す
る。ガラススライド上で増殖するトランスフェクトされた細胞を、標識したＶＥ
ＧＦ−２に曝す。ＶＥＧＦ−２を、部位特異的プロテインキナーゼについての認
識部位のヨウ素化または封入を含む、種々の手段によって標識し得る。固定およ
びインキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析に供す
る。陽性のプールを同定し、そしてサブプールを調製し、そして反復サブプール
化および再スクリーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトし、最終的に
推定のレセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０３９６】 レセプター同定のための別のアプローチとして、標識したＶＥＧＦ−２は、細
胞膜に光学的親和的に結合され得るか、またはレセプター分子を発現する抽出調
製物であり得る。架橋した材料をＰＡＧＥによって分離し、そしてＸ線フィルム
に曝す。次いで、ＶＥＧＦ−２を含有する標識した複合体を取り出し、ペプチド
フラグメントに分解し、そしてタンパク質微量配列決定に供する。微量配列決定
から得られたアミノ酸配列を使用して、縮重オリゴヌクレオチドプローブのセッ
トを設計し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定のレセプターをコ
ードする遺伝子を同定する。
【０３９７】 （実施例） 本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はそのよ
うな実施例に限定されないことを理解されたい。全ての部または量は、他に明記
しない限り重量基準である。
【０３９８】 以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および
／または用語を記載する。
【０３９９】 「プラスミド」は、大文字および／または数字の前および／または後の小文字
のｐにより示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるかまたは制限
無く公的に入手可能であるかのいずれかであり、または公開された手順に従って
入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価
のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
【０４００】 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でＤＮＡ
を触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は
、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当
業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１ｍｇのプラスミド
またはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに約２０Ｆｌの緩衝溶液中で
使用される。プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する目的には、
代表的には５〜５０ｍｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で、より大きな容量
中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者
により特定される。３７℃にての約１時間のインキュベーション時間が通常使用
されるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変動し得る。消化後、反応物を
ポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
【０４０１】 切断されたフラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）により記載された８％
ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
【０４０２】 「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相
補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ
れ得る。そのような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキ
ナーゼの存在下でリン酸とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメント
に連結する。
【０４０３】 「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエステル結合を形
成するプロセスをいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）１４６頁）。他に提供されていなければ、連結は
公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント
０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達
成され得る。
【０４０４】 他に記載しない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒ
Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記
載のように実施した。
【０４０５】 （実施例１） （ヒト組織および乳癌細胞株におけるＶＥＧＦ−２の発現パターン） ノーザンブロット解析を、ヒト組織およびヒト組織における乳癌細胞株におけ
るＶＥＧＦ−２の発現レベルを試験するために行なった。全細胞性ＲＮＡサンプ
ルを、ＲＮＡｚｏｌTM Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．）を用いて単離した。各々の特定された乳房組織および細胞株から
単離された約１０ｍｇの全ＲＮＡを、１％アガロースゲルで分離し、そしてナイ
ロンフィルター上にブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））。標識反応は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って５０ｎｇのＤＮＡフラグメントを用いて行
なった。標識したＤＮＡを、５ Ｐｒｉｍｅ ÷ ３ Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．（
Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）からのＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムを用いて精製した
。次いで、フィルターを、放射標識した全長ＶＥＧＦ−２遺伝子と、１，０００
，０００ ｃｐｍ／ｍｌで０．５Ｍ ＮａＰＯ4および７％ＳＤＳ中で６５℃で
一晩ハイブリダイズした。０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、室温で２回およ
び６０℃で２回洗浄した後、次いでフィルターを増感スクリーンとともに−７０
℃で一晩曝露した。１．６Ｋｄのメッセージが２つの乳癌細胞株において観察さ
れた。図５、レーン番号４は、増殖についてエストロゲン非依存性である、非常
に腫瘍形成性の細胞株を示す。
【０４０６】 また、１０個のヒト成体組織由来の１０ｍｇの総ＲＮＡを、アガロースゲル上
で分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした。次いで、このフィルタ
ーを、放射標識したＶＥＧＦ−２プローブとともに、７％ＳＤＳ、０．５Ｍ Ｎ
ａＰＯ４、ｐＨ７．２；１％ ＢＳＡ中で６５℃で一晩ハイブリダイズした。０
．２×ＳＳＣ中で６５℃で洗浄した後、このフィルターを、増感スクリーンとと
もに−７０℃で２４日間フィルムに曝露した。図６を参照のこと。
【０４０７】 （実施例２：インビトロ転写および翻訳によるＶＥＧＦ−２（配列番号４）の
短縮型形態の発現） ＶＥＧＦ−２ ｃＤＮＡを、インビトロで転写および翻訳して、ＶＥＧＦ−２
および部分ＶＥＧＦ−２ ｃＤＮＡの短縮型形態によってコードされる翻訳可能
なポリペプチドのサイズを決定した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫベクターに
おけるＶＥＧＦ−２の２つの挿入物を、以下の３対のプライマーを用いてＰＣＲ
増幅した：１）Ｍ１３逆方向プライマーＭ−１３正方向プライマー；２）Ｍ１３
逆方向プライマーおよびＶＥＧＦプライマーＦ４および；３）Ｍ１３−逆方向プ
ライマーおよびＶＥＧＦプライマーＦ５。これらのプライマーの配列は、以下の
通りである。 Ｍ１３−２逆方向プライマー：５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ−
３’（配列番号１１）。
【０４０８】 この配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにおけるＶＥＧＦ−２ ｃＤＮ
Ａ挿入物の５’末端の下流に位置し、そしてｃＤＮＡとアンチセンス方向である
。
【０４０９】 Ｔ３プロモーター配列は、このプライマーとＶＥＧＦ−２ ｃＤＮＡとの間に
位置する。 Ｍ１３−２正方向プライマー：５’ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−
３’（配列番号１２）。
【０４１０】 この配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにおけるＶＥＧＦ−２ ｃＤＮ
Ａ挿入物の３’末端の上流に位置し、そしてｃＤＮＡ挿入物とアンチセンス方向
である。 ＶＥＧＦプライマーＦ４：５’−ＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡ
−３’（配列番号１３）。
【０４１１】 この配列は、ｂｐ１２５９から１２３９のアンチセンス方向でＶＥＧＦ−２
ｃＤＮＡ内に位置し、これは、停止コドンの３’末端から離れて約１６９ｂｐ、
およびｃＤＮＡの最後のヌクレオチドの前の約２６６ｂｐである。
【０４１２】 ３つ全てのプライマー対とのＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ挿入物の前のＴ３プロモ
ーター配列との増幅産物を産生する。プライマーの第１および第３の対は、配列
位番号４に示されるＶＥＧＦ−２のポリペプチドをコードするＰＣＲ産物を産生
する。プライマーの第２の対は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＣ−末端で３６ア
ミノ酸のコード配列を欠失するＰＣＲ産物を産生する。
【０４１３】 プライマーの第１の対からの約０．５ｍｇのＰＣＲ産物、プライマーの第２の
対からの１ｍｇの産物、プライマーの第３の対からの１ｍｇの産物を、インビト
ロ転写／翻訳に使用した。インビトロ転写／翻訳反応を、２５Ｆｌの容量で、Ｔ N ＴＪ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＡＴ＃Ｌ４９５０）を使用して行った。具体的には
、この反応は、以下を含む：１２．５ＦｌのＴNＴウサギ網状赤血球、２Ｆｌの
ＴNＴ反応緩衝液、１ＦｌのＴ３ポリメラーゼ、１Ｆｌの１ｍＭアミノ酸混合物
（メチオニンを含まない）、４Ｆｌの35Ｓ−メチオニン（＞１０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）、１ＦＬの４０Ｕ／μｌ；ＲＮａｓｉｎリボヌクレア
ーゼインヒビター、０．５または１ｍｇのＰＣＲ産物。ヌクレアーゼを含まない
Ｈ2Ｏを添加して、２５Ｆｌの容量にした。この反応を、３０℃にて２時間イン
キュベートした。５マイクロリットルの反応産物を、４〜２０％勾配のＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲル上で分析した。２５％イソプロパノールおよび１０％酢酸中での固
定後、このゲルを乾燥させ、そしてＸ線フィルムに一晩７０℃にて曝露した。
【０４１４】 図７に示すように、短縮ＶＥＧＦ−２ ｃＤＮＡ（すなわち、配列番号３に示
される）および３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）において２６６ｂｐを欠失する
ｃＤＮＡを含むＰＣＲ産物は、同じ長さの翻訳産物を産生し、これは、分子量が
、３８〜４０ｄｋであると推定される（レーン１および３）。３’ＵＴＲを全て
欠失し、かつＣ−末端の３６アミノ酸をコードする配列を欠失するｃＤＮＡは、
３６〜３８ｋｄの推定分子量を有するポリペプチドに翻訳された（レーン２）。
【０４１５】 （実施例３：バキュロウイルス発現系を用いるＶＥＧＦ−２のクローニングお
よび発現） Ｎ末端で４６アミノ酸を除いたＶＥＧＦ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配
列（ＡＴＣＣ受託番号９７１４９を参照のこと）を、遺伝子の５’配列および３
’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した： ５’プライマーは、配列ＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＣＧＧＡＴ
ＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＴＡＴＧＣ（配列番号１４）を有
し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位（太字）、およびＶＥＧＦ−２（ヌクレオチ
ド１５０−１６６）の５’配列に相補的な１７ヌクレオチド配列を含む。
【０４１６】 ３’プライマーは、配列ＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＧＴＧ
ＧＴＣＴ（配列番号１５）を有し、制限酵素ＸｂａＩの切断部位、および停止コ
ドンおよび停止コドンの前の１５ヌクレオチド配列を含むＶＥＧＦ−２の３’配
列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０４１７】 増幅された配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」，ＢＩＯ １０１
，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、１％アガロースゲルから単離
した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで
消化し、次いで再び１％アガロースゲル上で精製した。このフラグメントを、Ｂ
ａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位でｐＡｃＧＰ６７Ａバキュロウイルス移入ベクター
（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に連結した。この連結によって、ＶＥＧＦ−２ ｃＤ
ＮＡをバキュロウイルスｇｐ６７遺伝子のシグナル配列とともにインフレームで
クローン化し、そしてベクター中のシグナル配列の３’末端に配置した。これを
ｐＡｃＧＰ６７Ａ−ＶＥＧＦ−２と称する。
【０４１８】 発現のためにｐＲＧ１ベクターにｇｐ６７遺伝子のシグナル配列とともにＶＥ
ＧＦ−２をクローン化するために、シグナル配列およびいくつかの上流の配列を
有するＶＥＧＦ−２を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素により、ＶＥＧＦ−２
ｃＤＮＡの上流に位置するＸｈｏ制限エンドヌクレアーゼ部位、およびＸｂａ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位で、ｐＡｃＧＰ６７Ａ−ＶＥＧＦ−２プラスミド
から切り出した。このフラグメントを１％アガロースゲル上で残りのベクターか
ら分離し、そして「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」キットを使用して精製した。このフラ
グメントを、Ｆ２と称した。
【０４１９】 ＰＲＧ１ベクター（ｐＶＬ９４１ベクターの変異体）を、バキュロウイルス発
現系を、用いるＶＥＧＦ−２タンパク質の発現のために用いる（総説については
、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．１９８７，「Ａ Ｍａ
ｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅｓ」，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５，（１９８７）を参照のこ
と）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核
多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに
続く制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ、お
よびＡｓｐ７１８の認識部位を含む。制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩについて
の部位は、ＢａｍＨＩ部位の上流に位置する。ＸｈｏＩとＢａｍＨＩとの間の配
列は、ＰＡｃＧｐ６７Ａ（テープ上で変化なし）ベクター中のその配列と同じで
ある。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的なポリア
デニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シ
グナルが続くポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列
を、同時トランスフェクトした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えの
ためにウイルス配列により両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベク
ターが、ｐＲＧ１の代わりに用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４
１、およびｐＡｃＩＭ１（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．
Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９（１９８９））。
【０４２０】 プラスミドを制限酵素ＸｂｏＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで当該分野で公
知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、市販
のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）を使用して、ＤＮＡを１％アガロースゲルより単離した。このベクタ
ーＤＮＡをＶ２と称する。
【０４２１】 フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そし
て酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて、ＶＥＧＦ−２遺伝子を有するプラス
ミド（ｐＢａｃ ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２）を含む細菌を同定した。クローン化
フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０４２２】 ５ｍｇのプラスミドｐＢａｃ ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２を、リポフェクション
法（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４
：７４１３−７４１７（１９８７））を用いて、１．０ｍｇの市販の線状化した
バキュロウイルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮ
Ａ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）で同時トランスフ
ェクトした。
【０４２３】 １ｍｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５ｍｇのプラスミドｐ
Ｂａｃ ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２を、５０ｍｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０ｍｌ
リポフェクチンおよび９０ｍｌのＧｒａｃｅ培地を添加し、混合し、そして室温
にて１５分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を
、血清を有さないＧｒａｃｅ培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に
播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加えた。
プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振盪した。次いで
プレートを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクシ
ョン溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌの
Ｇｒａｃｅ昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そして２
７℃で４日間培養を続けた。
【０４２４】 ４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によ
る記載と同様にプラークアッセイを行なった。改変法として、「Ｂｌｕｅ Ｇａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ）とともにアガロースゲルを用いた。これは、青く染色されたプラークの容
易な単離を可能とする。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇにより配布
される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）に
おいても見い出され得る）。連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加し、青く
染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換
えウイルスを含む寒天を、２００ｍｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペンドルフチ
ューブに再懸濁した。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換えバ
キュロウイルスを含む上清を使用して、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９
細胞に感染させた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４
℃で保存した。
【０４２５】 Ｓｆ９細胞を、１０％熱非動化ＦＢＳを補充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させ
た。細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）１で組換えバキュロウイルスＶ−ｇｐ６７−
ＶＥＧＦ−２で感染させた。６時間後、培地を除去し、そしてメチオニンおよび
システインを除いたＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２時間後、５ｍＣ
ｉの35Ｓ−メチオニンおよび５ｍＣｉの35Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を
添加した。細胞を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離に
より回収し、そして標識されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジ
オグラフィーにより可視化した。
【０４２６】 培地およびＳｆ９細胞の細胞質由来のタンパク質を、還元条件下または非還元
条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。それぞれ、図８Ａおよび８Ｂを参
照のこと。培地を、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）に対して透析した。透析の
後に沈澱を得、そして１００ｍＭクエン酸Ｎａ（ｐＨ５．０）中に再懸濁した。
再懸濁した沈澱を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって再度分析し、そしてクマシーブリ
リアントブルーで染色した。図９を参照のこと。
【０４２７】 培地の上清をまた、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．８）中で１：１０に希釈し、
そして１ｍｌ／分の流速でＳＰ−６５０Ｍカラム（１．０×６．６ｃｍ、Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ）に適用した。タンパク質を、２００、３００、および５００ｍＭ
ＮａＣｌでの段階勾配で溶出した。ＶＥＧＦ−２を、５００ｍＭでの溶出を用
いて得た。溶出物を還元剤β−メルカプトエタノールの存在下または非存在下で
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そしてクマシーブリリアントブルーで染色した。
図１０を参照のこと。
【０４２８】 （実施例４：ＣＯＳ細胞における組換えＶＥＧＦ−２の発現） プラスミドＶＥＧＦ−２−ＨＡの発現を、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導する。ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは以下を含
む：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複
製起点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部
位が続くＣＭＶプロモーター。完全なＶＥＧＦ−２前駆体、およびその３’末端
にインフレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、ベク
ターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発現は
ＣＭＶプロモーター下で指向される。ＨＡタグは、先に記載されたようなインフ
ルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ
ら、Ｃｅｌｌ ３７，７６７（１９８４））。標的タンパク質へのＨＡタグの導
入により、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検
出が可能になる。
【０４２９】 プラスミド構築ストラテジーを以下に記述する： ＶＥＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第９７１４９号）を
、２つのプライマーを用いるＰＣＲにより構築した：５’プライマー（ＣＧＣ
ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＴ ＧＴＡ ＣＴＣ ＴＡＣ ＣＣＡ）（配列番
号１６）は、ＢａｍＨＩ部位、それに続く開始コドンから始まるＶＥＧＦ−２コ
ード配列の１８ヌクレオチドを含む；３’配列（ＣＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣ
Ａ ＡＧＣ ＧＴＡ ＧＴＣ ＴＧＧ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＴＡ ＴＧＧ ＧＴ
Ａ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＣＴ３’）（配列番
号１７）は、ＸｂａＩ部位、ＨＡタグ、ＸｈｏＩ部位、およびＶＥＧＦ−２コー
ド配列の最後の１５ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含
む。それゆえ、ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ部位、ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアー
ゼ部位およびインフレーム融合したＨＡタグが続くコード配列、ＨＡタグに隣接
する翻訳終結停止コドン、およびＸｂａＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグ
メントおよびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ
制限酵素で消化し、そして連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ
，ＣＡ ９２０３７）に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地
プレートにプレーティングし、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮ
Ａを形質転換体より単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試験
した。組換えＶＥＧＦ−２の発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲ
ＡＮ法により発現ベクターでトランスフェクトした（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ
．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））。ＶＥＧＦ−２−ＨＡタンパ
ク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した。（Ｅ．Ｈａｒｌｏ
ｗ，およびＤ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細胞を、トランスフェクションの２日後、35 Ｓ−システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面
活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％
ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７
．５））で溶解した（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））
。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降さ
せた。沈降したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。
【０４３０】 （実施例５：アミノ末端およびカルボキシ末端欠失変異体の構築） 生物学的に活性なＶＥＧＦ−２ポリペプチドを同定および分析するために、Ｖ
ＥＧＦ−２の欠失変異体のパネルを、発現ベクターｐＨＥ４ａを使用して構築し
た。
【０４３１】 （１．ｐＨＥ４におけるＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｌ２１５の構築） ＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｌ２１５（図１または配列番号２におけるアミノ酸
１０３〜２１５）のポリメラーゼ連鎖反応に指向される増幅およびＥ．ｃｏｌｉ
タンパク質発現ベクターｐＨＥ４へのサブクローニングを可能にするために、Ｖ
ＥＧＦ−２の所望の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以
下の塩基配列を用いて合成した： ５’プライマー（ＮｄｅＩ／ＳＴＡＲＴ、および１８ｎｔのコード配列）： ５’−ＧＣＡ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＣＴ Ａ
ＴＡ ＡＡＡ−３’（配列番号１８） ３’プライマー（Ａｓｐ７１８、ＳＴＯＰ、および１５ｎｔのコード配列）： ５’−ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＴＴ ＡＧＡ Ｃ
ＡＴ ＧＣＡ−３’（配列番号１９）。
【０４３２】 上記の５’プライマー（配列番号１８）は、ＮｄｅＩ制限部位を組込み、そし
て上記の３’プライマー（配列番号１９）は、Ａｓｐ７１８制限部を組み込む。
５’プライマー（配列番号１８）はまた、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、か
つそれとインフレームで、ＡＴＧ配列を含み、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニン
グされたフラグメントの翻訳を可能にし、一方、３’プライマー（配列番号１９
）は、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、かつそれとインフレームで１つの停止
コドン（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて利用される）を含み、Ｅ．ｃｏｌｉ
における正確な翻訳終結を確実にする。
【０４３３】 ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、および例えば、実施
例３においてテンプレートとして構築されたような成熟ＶＥＧＦ−２（配列番号
２におけるアミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列を使用して行った。得ら
れたアンプリコンを、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＮｄｅ
Ｉ／Ａｓｐ７１８で消化したｐＨＥ４ａ発現ベクターにサブクローニングした。
【０４３４】 （２．ｐＨＥ４におけるＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築） ＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｒ２２７（図１または配列番号２におけるアミノ酸
１０３〜２２７）のポリメラーゼ連鎖反応に指向される増幅およびＥ．ｃｏｌｉ
タンパク質発現ベクターｐＨＥ４へのサブクローニングを可能にするために、Ｖ
ＥＧＦ−２の所望の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以
下の塩基配列を用いて合成した： ５’プライマー（ＮｄｅＩ／ＳＴＡＲＴ、および１８ｎｔのコード配列）： ５’−ＧＣＡ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＣＴ Ａ
ＴＡ ＡＡＡ−３’（配列番号２０） ３’プライマー（Ａｓｐ７１８、ＳＴＯＰ、および１５ｎｔのコード配列）： ５’−ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＣＡ ＡＣＧ ＴＣＴ ＡＡＴ Ａ
ＡＴ ＧＧＡ−３’（配列番号２１）。
【０４３５】 上記のプライマーの場合、ＮｄｅＩまたはＡｓｐ７１８制限部位を、それぞれ
５’プライマーおよび３’プライマーに組み込んだ。５’プライマー（配列番号
２０）はまた、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、かつそれとインフレームで、
ＡＴＧ配列を含み、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされたフラグメントの翻
訳を可能にし、一方、３’プライマー（配列番号２１）は、ＶＥＧＦ−２コード
領域に隣接し、かつそれとインフレームで１つの停止コドン（好ましくは、Ｅ．
ｃｏｌｉにおいて利用される）を含み、Ｅ．ｃｏｌｉにおける正確な翻訳終結を
確実にする。
【０４３６】 ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、および例えば、実施
例３においてテンプレートとして構築されたような成熟ＶＥＧＦ−２（配列番号
２におけるアミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列を使用して行った。得ら
れたアンプリコンを、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＮｄｅ
Ｉ／Ａｓｐ７１８で消化したｐＨＥ４ａタンパク質発現ベクターにサブクローニ
ングした。
【０４３７】 （３．ｐＡ２ＧＰにおけるＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｌ２１５の構築） この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２ ＧＰを使
用して、Ｎ末端およびＣ末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質（図１または配列番号
２におけるアミノ酸１０３〜２１５）をコードするクローン化されたＤＮＡをバ
キュロウイルス内に挿入して、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉ
ｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕ
ｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載のような、バキュロウイルス
リーダーおよび標準的方法を使用して、そのＮ末端およびＣ末端欠失ＶＥＧＦ−
２タンパク質を発現させる。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリン
プロモーター、続いてバキュロウイルスｇｐ６７タンパク質の分泌シグナルペプ
チド（リーダー）ならびにＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような
都合の良い制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデ
ニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容
易な選択のために、このプラスミドは、同方向にある弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ
プロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続い
てポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は、
両方の側で、このクローン化されたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイ
ルスを生成するために、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのた
めのウイルス配列と隣接される。
【０４３８】 多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、その構築物が転写
、翻訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグ
ナルペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上
記のベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃ
ｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０４３９】 図１において、Ｎ末端で１０２アミノ酸およびＣ末端で２０４アミノ酸を含ま
ないＶＥＧＦ−２タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配
列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増
幅した。
【０４４０】 ５’プライマーは、以下の配列
【０４４１】
【化５】 を有し、これは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（太字）、それに続く、ベクター供給
シグナルペプチドとインフレームに位置させるための１スペーサーヌクレオチド
、およびＶＥＧＦ−２タンパク質の１７ヌクレオチドのコード配列塩基を含む。
３’プライマーは、以下の配列
【０４４２】
【化６】 を有し、ＸｂａＩ制限部位（太字）、それに続く、終止コドンおよびＶＥＧＦ−
２の３’コード配列に相補的な１７ヌクレオチドを含む。
【０４４３】 増幅された配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」，ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲルから単
離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ
で消化し、次いで再び１％アガロースゲルで精製した。このフラグメントを、ｐ
Ａ２ ＧＰバキュロウイルストランスファーベクター（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ）へＢ
ａｍＨ１およびＸｂａＩ部位で連結した。この連結によって、Ｎ末端およびＣ末
端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質（図１または配列番号２におけるアミノ酸１０３
〜２１５）を表すＶＥＧＦ−２ ｃＤＮＡを、バキュロウイルスＧＰ遺伝子のシ
グナル配列とインフレームでクローン化し、そしてこのベクターのシグナル配列
の３’末端に位置付けした。これを、ｐＡ２ＧＰＶＥＧＦ−２．Ｔ１０３−Ｌ２
１５と名付ける。
【０４４４】 （４．ｐＡ２ＧＰにおけるＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築） 図１において、Ｎ末端で１０２アミノ酸およびＣ末端で１９２アミノ酸を含ま
ないＶＥＧＦ−２タンパク質（すなわち、配列番号２のアミノ酸１０３〜２２７
）をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応す
るＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。
【０４４５】
【化７】 プライマーは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（太字）、それに続く、ベクター供給シ
グナルペプチドとインフレームに位置させるための１スペーサーヌクレオチド、
およびＶＥＧＦ−２タンパク質の２６ヌクレオチドのコード配列塩基を含む配列
（配列番号２４）を有する。３’プライマーは、以下の配列
【０４４６】
【化８】 を有し、これは、ＸｂａＩ制限部位（太字）、それに続く、終止コドンおよびＶ
ＥＧＦ−２の３’コード配列に相補的な２１ヌクレオチドを含む。
【０４４７】 増幅された配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」，ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲルから単
離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ
で消化し、次いで、再び１％アガロースゲルで精製した。このフラグメントを、
ｐＡ２ ＧＰバキュロウイルストランスファーベクター（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ）へ
ＢａｍＨ１およびＸｂａＩ部位で連結した。この連結によって、Ｎ末端およびＣ
末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質（図１または配列番号２におけるアミノ酸１０
３〜２２７）を表すＶＥＧＦ−２ ｃＤＮＡを、バキュロウイルスＧＰ遺伝子の
シグナル配列とインフレームでクローン化し、そしてこのベクターのシグナル配
列の３’末端に位置付けした。この構築物を、ｐＡ２ＧＰＶＥＧＦ−２．Ｔ１０
３−Ｒ２２７と名付ける。
【０４４８】 （５．ｐＣ１におけるＶＥＧＦ−２の構築） 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：４３８−４４７（１９８５年３月））＋ＣＭＶ−エン
ハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０
（１９８５））を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位Ｂ
ａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクロー
ニングを容易にする。このベクターはさらに、ラットプレプロインスリン遺伝子
の３Ｎイントロン、ポリアデニル化シグナル、および終結シグナルを含む。
【０４４９】 このベクターｐＣ１を、ＶＥＧＦ−２タンパク質の発現のために使用する。プ
ラスミドｐＣ１は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４
６）の誘導体である。両プラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマ
ウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされたチャ
イニーズハムスター卵巣細胞またはジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を欠く他の細
胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地（α−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において細胞を増殖させることによって選択され
得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）耐性細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、
よく実証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．，
Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．，１９７８、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およ
びＭａ，Ｃ．１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１
０９７：１０７−１４３、Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ
．１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８を参照のこと）。漸
増濃度のＭＴＸにおいて増殖された細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として
、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって、この薬物に対する耐性を発生
する。第２の遺伝子が、ＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、これは、通常、同時
増幅および過剰発現される。１，０００コピーを超える遺伝子を保有する細胞株
を発生させることは、技術水準である。結果として、メトトレキサートが除去さ
れた場合、細胞株は、染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む。
【０４５０】 プラスミドｐＣ１は、目的の遺伝子発現のために、ラウス肉腫ウィルスの長末
端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８５：４３８
−４４７）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期遺伝子のエンハ
ンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０、１９８５）から
単離されたフラグメントを含む。このプロモーターの下流には、遺伝子の組み込
みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位：ＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩＩおよび
ＮｒｕＩが存在する。これらのクローニング部位の後ろに、このプラスミドは、
３つ全てのリーディングフレームにおける翻訳終止コドン、それに続く、３Ｎイ
ントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化部位を含む。
他の高い効率のプロモーターもまた、発現のために使用され得る（例えば、ヒト
β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたは後期プロモーター
、あるいは他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末
端反復）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト増
殖ホルモンまたはグロビン遺伝子由来の）もまた、同様に使用され得る。
【０４５１】 染色体に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株もまた、選択マー
カー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８またはハイグロマイシン）との同時トランスフ
ェクションに際して選択され得る。最初に１より多い選択マーカー（例えば、Ｇ
４１８およびメトトレキサート）を使用することが有利である。
【０４５２】 プラスミドｐＣ１を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで、当該分野で公知
の手順によってウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次いで、ベク
ターを１％アガロースゲルから単離する。
【０４５３】 ＶＥＧＦ−２（ＡＴＣＣ登録番号９７１４９）をコードするＤＮＡ配列を、Ｖ
ＥＧＦ−２遺伝子の５’末端および３’末端に対応する２つのプライマーを使用
するＰＣＲによって構築した：５’プライマー（５’−ＧＡＴ ＣＧＡ ＴＣＣ
ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＡＣ ＴＣＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＣＴ
ＧＴＧ ＧＣＧ ＴＧＴ ＴＣＴ ＣＴＧ ＣＴＣ Ｇ−３’（配列番号２６）
）は、Ｋｌｅｎｏｗで充填されたＢａｍＨＩ部位および開始コドンから始まる４
０ヌクレオチドのＶＥＧＦ−２コード配列を含む；３’プライマー（５’−ＧＣ
Ａ ＧＧＧ ＴＡＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＴ
Ｔ ＧＴＧ ＧＴＣ ＴＴＴ−３’（配列番号２７））は、ＢａｍＨＩ部位およ
び終止コドンを含まない１６ヌクレオチドのＶＥＧＦ−２コード配列を含む。
【０４５４】 ＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントを、上記のように１％アガロースゲルか
ら単離し、次いで、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで、１％アガ
ロースゲル上で再度精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸
化したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ１を含む細菌を同定する。
挿入された遺伝子の配列および方向を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。この
構築物を、ｐＣ１ＶＥＧＦ−２と名付ける。
【０４５５】 （６．ｐＣ４ＳｉｇＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｌ２１５の構築） プラスミドｐＣ４Ｓｉｇは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ部分ならびにタンパク質シグナ
ル配列を含むプラスミドｐＣ４（登録番号２０９６４６）である。
【０４５６】 ポリメラーゼ連鎖反応指向性増幅およびＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｌ２１５（
図１または配列番号２におけるアミノ酸１０３〜２１５）のｐＣ４Ｓｉｇへのサ
ブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望の領域に相補的な２つ
のオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を用いて合成した： ５’プライマー（ＢａｍＨＩおよび２６ヌクレオチドのコード配列）： ５’−ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＣＴ Ａ
ＴＡ ＡＡＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＣ−３’（配列番号２８） ３’プライマー（ＸｂａＩ、ＳＴＯＰおよび１５ヌクレオチドのコード配列）：
５’−ＣＧＴ ＣＧＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＴＴ ＡＧＡ Ｃ
ＡＴ ＧＣＡ ＴＣＧ ＧＣＡ Ｇ−３’（配列番号２９） ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、およびテンプレートと
して成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列（例えば、
実施例３において構築されたような）を使用して行った。得られたアンプリコン
を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消
化したｐＣ４Ｓｉｇベクターにサブクローニングした。
【０４５７】 （７．ｐＣ４ＳｉｇＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築） ポリメラーゼ連鎖反応指向性増幅およびＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｌ２１５（
図１または配列番号２におけるアミノ酸１０３〜２２７）のｐＣ４Ｓｉｇへのサ
ブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望の領域に相補的な２つ
のオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を用いて合成した： ５’プライマー（ＢａｍＨＩおよび２６ヌクレオチドのコード配列）： ５’−ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＣＴ Ａ
ＴＡ ＡＡＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＣ−３’（配列番号２０） ３’プライマー（ＸｂａＩ、ＳＴＯＰおよび２１ヌクレオチドのコード配列）：
５’−ＧＣＡ ＧＣＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＡＣＧ ＴＣＴ ＡＡＴ Ａ
ＡＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＡＡＣ−３’（配列番号３１）。
【０４５８】 ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、およびテンプレート
として成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列（例えば
、実施例３において構築されたような）を使用して行った。得られたアンプリコ
ンを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで
消化したｐＣ４Ｓｉｇベクターにサブクローニングした。
【０４５９】 （８．ｐＣ４ＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｍ２６３の構築） 発現ベクターｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）
（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，４３８−４４７（１９８５年３月））＋ＣＭＶ−エンハンサーのフラグ
メント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を
含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、Ｘｂａ
Ｉ、およびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にす
る。ベクターはさらに、ラットプレプロインスリン遺伝子の３Ｎイントロン、ポ
リアデニル化シグナル、および終結シグナルを含む。
【０４６０】 この例示的な実施例において、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｍ２６３タン
パク質（図１または配列番号２におけるアミノ酸１〜２６３）をコードするクロ
ーン化されたＤＮＡを、プラスミドベクターｐＣ４に挿入し、Ｃ末端欠失ＶＥＧ
Ｆ−２タンパク質を発現させる。
【０４６１】 ポリメラーゼ連鎖反応指向性増幅、およびＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｍ２６３の発
現ベクターｐＣ４へのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所
望の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を
用いて合成した： ５’プライマー ５’−ＧＡＣ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＣＡＴ Ｇ
ＣＡ ＣＴＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＣ−３’（配列番号３２
） ３’プライマー ５’−ＧＡＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＣＡ Ｔ
ＡＡ ＡＡＴ ＣＴＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＣ−３’（配列番号３３）。
【０４６２】 上記の５’プライマーの場合、ＢａｍＨＩ制限部位を組み込み、一方、３’プ
ライマーの場合、Ａｓｐ７１８制限部位を組み込んだ。この５’プライマーはま
た、６ヌクレオチド、ＶＥＧＦ−２コード配列の２０ヌクレオチド、およびＥ．
ｃｏｌｉにおけるクローン化されたフラグメントの翻訳を可能にするための、Ｖ
ＥＧＦ−２コード領域に隣接し、かつこの領域とインフレームのＡＴＧ配列を含
む。一方、３’プライマーは、２ヌクレオチド、ＶＥＧＦ−２コード配列の２０
ヌクレオチド、およびＥ．ｃｏｌｉにおける正確な翻訳終結を確実にする、ＶＥ
ＧＦ−２のコード領域に隣接し、かつこの領域とインフレームの１つの終止コド
ン（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて利用される）を含む。
【０４６３】 ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、およびテンプレート
として成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列（例えば
、実施例３において構築されたような）を使用して行った。得られたアンプリコ
ンを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／Ａｓｐ
７１８で消化したｐＣ４タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。この
構築物を、ｐＣ４ＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｍ２６３と名付ける。
【０４６４】 （９．ｐＣ４ＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｄ３１１の構築） この例示的な実施例において、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｄ３１１タン
パク質（図１または配列番号２におけるアミノ酸１〜３１１）をコードするクロ
ーン化されたＤＮＡを、プラスミドベクターｐＣ４に挿入し、Ｃ末端欠失ＶＥＧ
Ｆ−２タンパク質を発現させる。
【０４６５】 ポリメラーゼ連鎖反応指向性増幅、およびＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｄ３１１の発
現ベクターｐＣ４へのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所
望の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を
用いて合成した： ５’プライマー ５’−ＧＡＣ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＣＡＴ Ｇ
ＣＡ ＣＴＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＣ−３’（配列番号３４
） ３’プライマー ５’−ＧＡＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＧＴ Ｃ
ＴＡ ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＧＧＧ Ｇ−３’（配列番号３５）。
【０４６６】 上記の５’プライマーの場合、ＢａｍＨＩ制限部位を組み込み、一方、３’プ
ライマーの場合、Ａｓｐ７１８制限部位を組み込んだ。この５’プライマーはま
た、６ヌクレオチド、ＶＥＧＦ−２コード配列の２０ヌクレオチド、およびＥ．
ｃｏｌｉにおけるクローン化されたフラグメントの翻訳を可能にするための、Ｖ
ＥＧＦ−２コード領域に隣接し、かつこの領域とインフレームのＡＴＧ配列を含
む。一方、３’プライマーは、２ヌクレオチド、ＶＥＧＦ−２コード配列の２０
ヌクレオチド、およびＥ．ｃｏｌｉにおける正確な翻訳終結を確実にする、ＶＥ
ＧＦ−２のコード領域に隣接し、かつこの領域とインフレームの１つの終止コド
ン（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて利用される）を含む。
【０４６７】 ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、およびテンプレート
として成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列（例えば
、実施例３において構築されたような）を使用して行った。得られたアンプリコ
ンを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／Ａｓｐ
７１８で消化したｐＣ４タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。
【０４６８】 （１０．ｐＣ４ＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｑ３６７の構築） この例示的な実施例において、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｄ３１１タン
パク質（配列番号２におけるアミノ酸１〜３１１）をコードするクローン化され
たＤＮＡを、プラスミドベクターｐＣ４に挿入し、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２タン
パク質を発現させる。
【０４６９】 ポリメラーゼ連鎖反応指向性増幅、およびＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｄ３１１の発
現ベクターｐＣ４へのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所
望の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を
用いて合成した： ５’プライマー ５’−ＧＡＣ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＣＡＴ Ｇ
ＣＡ ＣＴＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＣ−３’（配列番号３６
） ３’プライマー ５’−ＧＡＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＴＣ ＡＴＴ ＡＣＴ Ｇ
ＴＧ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＴＴ Ｃ−３’（配列番号３７）。
【０４７０】 上記の５’プライマーの場合、ＢａｍＨＩ制限部位を組み込み、一方、３’プ
ライマーの場合、Ａｓｐ７１８制限部位を組み込んだ。この５’プライマーはま
た、６ヌクレオチド、ＶＥＧＦ−２コード配列の２０ヌクレオチド、およびＥ．
ｃｏｌｉにおけるクローン化されたフラグメントの翻訳を可能にするための、Ｖ
ＥＧＦ−２コード領域に隣接し、かつこの領域とインフレームのＡＴＧ配列を含
む。一方、３’プライマーは、２ヌクレオチド、ＶＥＧＦ−２コード配列の２０
ヌクレオチド、およびＥ．ｃｏｌｉにおける正確な翻訳終結を確実にする、ＶＥ
ＧＦ−２のコード領域に隣接し、かつこの領域とインフレームの１つの終止コド
ン（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて利用される）を含む。
【０４７１】 ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、およびテンプレート
として成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列（例えば
、実施例３において構築されたような）を使用して行った。得られたアンプリコ
ンを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／Ａｓｐ
７１８で消化したｐＣ４タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。この
構築物を、ｐＣ４ＶＥＧＦ−２ Ｍ１−Ｑ３６７と名付ける。
【０４７２】 （実施例６） （ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの生成のために遺伝子治療を使用する処置方法−
インビボ） ＶＥＧＦ−２をコードするｍＲＮＡの生成に適切なテンプレートＤＮＡを、標
準的組換えＤＮＡの方法論に従って調製する。滅菌されかつ内毒素を含まないオ
リゴヌクレオチドを、Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＳＳ
、Ａｌｃｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ、Ｔｅｘ．）に、眼の房水（ａｑｕｅｏｕ
ｓ）または硝子体液（ｖｉｔｒｅｏｕｓ）と同じｐＨおよび電解質濃度を有する
ように希釈する。Ｅｍａｌｐｈｏｒ ＥＣ６２０（２．５％、ＧＡＦ Ｃｏｒｐ
．）（Ｂｕｒｓｅｌｌら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２８
７２〜２８７６）（石油製品）を添加して、粘度を変化させ、そして送達特性を
補助する。０．１μＭ〜１００μＭの範囲の硝子体内濃度を達成するための用量
を、投与する。送達される容量は、１μｌと１ｍｌとの間であり、これは、眼の
体積に依存する。
【０４７３】 挿管した患者に、フルオラン（ｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔する。顔および眼に
ベタジン（ｂｅｔａｄｉｎｅ）スクラブを調製し、そして通常の滅菌様式の布で
覆う。ビヒクルを伴うこの滅菌ポリヌクレオチドを、滅菌シリンジに付けた３３
ゲージ針を用いて、後ろの縁（毛様体輪（ｐａｒｓ ｐｌａｎａ））に注射し、
強膜の全厚みを通して硝子体中に通す。漏出がない限り、閉鎖縫合は必要とされ
ない。ゲンタマイシン軟膏またはエリスロマイシン軟膏を含む抗生物質点滴剤を
、１日あたり数回、眼瞼裂の球表面に、創傷閉鎖が完了するまで適用する。注射
頻度は、一日おきから６ヶ月以下に１回までの範囲であり、これは、その疾患過
程の重篤度、眼内の炎症の程度、そのビヒクルの特徴（すなわち、徐放性の特徴
）、および注射に対する眼の許容性に依存する。この注射から可能な網膜剥離に
ついて、短期および長期の追跡チェックが必要である。
【０４７４】 拡大させた眼を、炎症、感染、および光受容体の成長の徴候について、網膜お
よび底を見るための直像検眼鏡および倒像検眼鏡の両方によって、モニタリング
する。モニタリングは、未熟な幼児が網膜剥離の徴候を示す場合は、毎日程度の
頻度であり得る。モニタリングの頻度は、疾患の消散とともに減少する。
【０４７５】 この患者を、適切なビヒクル（ＢＳＳ、Ｅｍａｎｆｏｕｒ）に再懸濁した、０
．１〜１００μＭの範囲内の濃度のポリヌクレオチドを、毎週眼内注射して処置
する。この処置に、ポリヌクレオチドの全身送達（すなわち、静脈内、皮下、ま
たは筋肉内）を１日２〜５回から１月に１回まで追加し得る。
【０４７６】 （実施例７） （遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ相同組換え） 光受容体細胞を、被験体から生検によって得る。得た組織を、ＤＭＥＭ＋１０
％ウシ胎仔血清中に置く。対数増殖期または定常期初期の繊維芽細胞をトリプシ
ン処理し、そしてプラスチック表面から栄養培地でリンスする。この細胞懸濁液
のアリコートを計数用に取り除き、そして残りの細胞を遠心分離に供する。その
上清を吸引し、そしてそのペレットを、エレクトロポレーション緩衝液（２０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７
ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）５ｍｌ中に再懸濁する。この細胞
を再度遠心分離し、そしてその上清を吸引し、そしてその細胞を、１ｍｇ／ｍｌ
のアセチル化ウシ血清アルブミンを含むエレクトロポレーション緩衝液中に再懸
濁する。この最終細胞懸濁液は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポ
レーションは、再懸濁直後に実施すべきである。
【０４７７】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。ＶＥＧＦ−２遺伝子座を
標的とするプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅ
ｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。そのＣ
ＭＶプロモーターを、５’末端のＸｂａＩ部位および３’末端のＢａｍＨＩ部位
を用いるＰＣＲによって増幅する。２つのＶＥＧＦ−２非コード配列を、ＰＣＲ
を介して増幅する：一方のＶＥＧＦ−２非コード配列（ＶＥＧＦ−２フラグメン
ト１）を、５’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端のＸｂａＩ部位を用い
て増幅し；もう一方のＶＥＧＦ−２非コード配列（ＶＥＧＦ−２フラグメント２
）を、５’末端のＢａｍＨＩ部位および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて
増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびＶＥＧＦ−２フラグメントを、適切な
酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ＶＥＧＦ−２フラグメ
ント１−ＸｂａＩ；ＶＥＧＦ−２フラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、そし
て一緒に連結する。生じた連結産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。
【０４７８】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを有する滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的には少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞を
含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を、
穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ、
９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生存
が減少するが、導入されたＤＮＡをそれらのゲノム中に安定に組み込む生存細胞
の割合が劇的に増加する。これらのパラメーターを仮定すると、約１４〜２０ｍ
Ｓｅｃのパルス時間が観察されるはずである。
【０４７９】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次に、このキュ
ベットの中身を、滅菌した移送用ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍディッシュ中の予め温めた栄養培地（１５％仔ウシ血清を含むＤＭ
ＥＭ）１０ｍｌに直接添加し、そして３７℃にてインキュベートする。その次の
日、この培地を吸引し、そして新鮮な培地１０ｍｌと交換し、そしてさらに１６
〜２４時間インキュベートする。
【０４８０】 次いで、この操作した光受容体細胞を、宿主に注射する。このとき、この光受
容体細胞は、このタンパク質産物を産生する。
【０４８１】 （実施例８） （網膜細胞に対するＶＥＧＦ−２の活性） 網膜は、ニューロン細胞型および非ニューロン細胞型がより未分化（ｐｒｉｍ
ｉｔｉｖｅ）な神経上皮細胞から発達することの調節における、内因性因子およ
び外因性因子の役割を研究するための有利な実験モデルであることが示されてい
る。分化した網膜は、以下の７つの細胞型から構成される：感覚（杆体光受容体
および錐体光受容体）、グリア（ミュラー細胞）、および２つの型のニューロン
、介在ニューロン（水平細胞、双極細胞およびアマクリン細胞）、および放射（
ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）ニューロン（神経節細胞）（概説については、Ｄｏｗｌ
ｉｎｇ、１９８７を参照のこと）。網膜における種々の細胞型の発生は、出生前
に発生する網膜錐体の大多数ならびに神経節細胞および水平細胞と同時には生じ
ない（概説については、Ａｌｔｓｈｕｌｅｒら、１９９１；Ｈａｒｒｉｓ、１９
９１；Ｒｅｈ、１９９１を参照のこと）。対照的に、ラット網膜における主な細
胞型である、網膜杆細胞の大多数の分化は、出生後に生じる。網膜前駆体細胞の
子孫のクローン分析によって、この前駆体細胞が、網膜細胞型の種々の組み合わ
せを生じ得ることが示されており、このことは、この前駆体が、試験される発生
齢に依存して、全能性または多能性のいずれかであることを示す（Ｔｕｒｎｅｒ
およびＣｅｐｋｏ、１９８７；Ｔｕｒｎｅｒら、１９９０；ＷｅｔｔｓおよびＦ
ｒａｓｅｒ、１９９８）。さらに、インビボ研究およびインビトロ研究の両方か
らの知見によって、網膜細胞の最終的表現型は、主として系列非依存性であるこ
とが示され、このことは、網膜内の変化する微小環境が、前駆体細胞の細胞の潜
在能力ならびに子孫の分化した表現型を決定する際に役割を有することを示す（
ＷａｔａｎａｂｅおよびＲａｆｆ、１９９０、１９９２；Ｈａｒｒｉｓ、１９９
１；Ｒｅｈ、１９９１；Ｅｚｚｅｄｄｉｎｅら、１９９７）。
【０４８２】 インビトロにおいて、網膜細胞の増殖および分化は、種々の因子によって調節
される。この因子は、例えば、以下である：ＦＧＦ−２（ＨｉｃｋｓおよびＣｏ
ｕｒｔｏｉｓ、１９９２）、ＣＮＴＦ（Ｅｚｚｅｄｄｉｎｅら、１９９７；Ｆｕ
ｈｒｍａｎｎら、１９９５）、ＬＩＦ（Ｅｚｚｅｄｄｉｎｅら、１９９７）、Ｔ
ＧＦ＿（ＬｉｌｌｅｅｎおよびＣｅｐｋｏ、１９９２）、レチノイン酸（Ｋｅｌ
ｌｙら、１９９４）およびＥＧＦ（Ｌｉｌｌｉｅｎ、１９９５）。最近、Ｙａｎ
ｇおよびＣｅｐｋｏ（１９９６）が、発達中の網膜および成体の網膜における、
ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１の発現パターンを同定し、そして特徴付けた。ＶＥ
ＧＦＲ転写物は、最初に、発達中の網膜血管および神経性網膜（ｎｅｕｒａｌ
ｒｅｔｉｎａ）の中心領域に関連して、Ｅ１１．５にて検出される。発達日 Ｅ
１５までに、ＶＥＧＦＲ−２の発現は、網膜発達の外側への勾配と一致して、網
膜の末梢に拡大する（Ｙｏｕｎｇ、１９８５；Ｌａ Ｖａｉｌら、１９９１）。
ＶＥＧＦＲ−２の発現は、神経発生がそのピークにあり、そして大多数の有糸分
裂後のニューロンが形成されている、周産期の間に、主に心室帯に局在した。
【０４８３】 以下に示されるように、ＶＥＧＦのインビトロでの主な効果は、発生初期の間
であり、そして多能性前駆体細胞の増殖に関与する。なぜなら、ＢｒｄＵのレベ
ルならびに光受容体細胞およびアマクリン細胞の数が増加するからである。ＶＥ
ＧＦ−２は、Ｅ１５の胚に由来する網膜細胞の増殖を増大し、そしてその応答の
大きさは齢とともに増加した。ＶＥＧＦ−２投与に対する初期の増殖応答は、Ｃ
ＮＴＦによって影響されなかった。しかし、ＣＮＴＦは、誘導されたＶＥＧＦ−
２がロドプシンタンパク質のレベルを増加することを阻害した。
【０４８４】 （実験手順） （動物）ちょうどよい時期に妊娠している動物を、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇ
ｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手する。動物に
関する全手順を、承認された制度上のプロトコルに厳密に従って、そしてＧｕｉ
ｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ刊行物第８６−２３号、１９８５）に記載される動
物の世話および使用に関する規定に従って、実行する。
【０４８５】 （網膜培養物）網膜組織を、胚後期ラットまたは新生児ラットのいずれかから
得る。０．２５％トリプシン中でこの組織を３７℃にて６分間インキュベートす
ることによって、解離した初代細胞を調製する。このトリプシンのインキュベー
ションに続いて、増殖培地（Ｆ１２：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＥＭＥ）
（１％ウシ胎仔血清、１％ホルモンサプリメント（Ｎ２、Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉ
ｎ、１９８３）、１％グルタミン酸および０．５％ペニシリン−ストレプトマイ
シン（それぞれ、１０，０００単位／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ、
Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含み、５０μｇ／ｍｌデオキシリボヌクレ
アーゼＩ型（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む））中で５分間のイ
ンキュベーションを行い、この組織フラグメントを、直径約１ｍｍの圧縮（ｃｏ
ｎｓｔｒｉｃｔｅｄ）チップを備えたパスツールピペットに繰り返し通す。この
解離した細胞を、遠心分離（８００×ｇ、５分）により収集し、そして増殖培地
中に再懸濁する。この細胞を、ポリ−Ｌ−リジン（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ
）およびラミニン（１０μｇ／ｍｌ Ｇｉｂｃｏ）で予め被覆した９６ウェルプ
レート中に播種する。他に述べない限り、密度は、４２５細胞／ｍｍ2である。
この培養物を、一日おきに培地の１／２を変えることによって、血清を含まない
増殖培地へと次第に変化させる。栄養因子（ｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）は
、各培地変化で補充する。
【０４８６】 （海馬の星状細胞）星状細胞の精製培養物を、以前に記載された方法（Ｇｒｅ
ｅｎｅら、１９９８）を使用して、ラットの海馬から調製する。
【０４８７】 （ロドプシン免疫組織化学手順および細胞計数手順）免疫組織化学染色のため
に、これらの培養物を、４％スクロースを含む４％パラホルムアルデヒド中で一
晩固定する。ロドプシンおよびシンタキシン染色のために、この培養物を、ＰＢ
Ｓ中の０．０５％サポニンで３０分間透過処理する。この細胞を、５％ウマ血清
および２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中にて室温で３時間インキュベートするこ
とによって、非特異的ＩｇＧ結合を阻害する。次いで、５％ウマ血清および２％
ＢＳＡを含有するＰＢＳに希釈した、抗ロドプシン（１：１０，０００、Ｒｈ
ｏ ４Ｄ２、Ｍｏｌｄａｙ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ
Ｃｏｌｕｍｂｉａ）または抗シンタキシン（１：１０，０００、Ｓｉｇｍａ）
とともに、この培養物を４℃にて一晩インキュベートする（Ｍｏｌｄａｙ、１９
８９）。一次抗体を除去した後、この培養物を、ビオチン化抗マウス抗体（１：
２，５００）とともに９０分間インキュベートする。次いで、５％ウマ血清およ
び２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に１：５０希釈したアビジン−ビオチン−ペ
ルオキシダーゼ複合体を、６０分間添加する。結合したペルオキシダーゼを可視
化するために、ジアミノベンジジンを、２．５％硫酸ニッケルを含有する０．１
Ｍ酢酸緩衝液中、最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌで使用する。１ウェルあたりの免疫
陽性細胞の数を、そのウェルの総表面積のうちの１１％を示す面積中の標識細胞
を計数することによって決定し、次いで総表面積について補正する。
【０４８８】 （ＢｒｄＵ免疫組織化学）この網膜細胞を、ＢｒｄＵとともに４時間インキュ
ベートし、その後、ＰＢＳで２回洗浄する。次いで、この培養物に増殖培地を添
加し、次いでこれを種々の時間間隔でインビトロで維持する。インキュベーショ
ン期間の終わりに、この培養物を固定し、そして製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の指示書通りに、取
り込まれたＢｒｄＵについて免疫組織化学染色する。
【０４８９】 （ロドプシンＥＬＩＳＡおよびＧＦＡＰ ＥＬＩＳＡ）ロドプシンＥＬＩＳＡ
のために、この培養物をＰＢＳでリンスし、そして４％スクロースを含有する４
％パラホルムアルデヒドで一晩固定する。次いで、この培養物をＰＢＳでリンス
し、そしてＰＢＳ中の０．０５％サポニンを用いて室温で３０分間透過処理する
。５％ウマ血清および２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ブロッキング緩衝液）中で
、この細胞を少なくとも３時間インキュベートすることによって、非特異的タン
パク質結合部位を抑制する。この培養物を、マウス抗ロドプシン抗体（ブロッキ
ング緩衝液中に１：５００希釈）とともに一晩インキュベートし、次いでその後
、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（ブロッキング溶
液中に１：２，５００希釈）とともに一晩インキュベートする。この培養物をＰ
ＢＳで広範に洗浄し、次いで、基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジン）をウェルに添加し、そしてプレートを暗所で６０分間インキュベートする
。２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添加することによってこの反応を停止させ、そして形成した
生成物の量を、４５０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量する。ブラン
ク試薬の吸収は、０．１〜０．１５の範囲であった。このブランク試薬の吸光度
は、示された値から差し引かない。ＧＦＡＰ ＥＬＩＳＡは、以前に記載された
（Ｇｒｅｅｎｅら、１９９８）のと本質的に同様に実施する。
【０４９０】 （カルセインＡＭ測定に基づく細胞生存アッセイ）インキュベーション期間の
終わりに、この培養物をハムのＦ−１２で１回リンスした。カルセイン（ｃａｌ
ｃｅｉｎ）ＡＭを、ハムのＦ−１２ １００μｌ中で最終濃度２μＭになるまで
添加し、そしてこの培養物を３７℃で６０分間インキュベートした。このインキ
ュベーション期間の終わりに、この培養物をリンスした。５３０ｎｍでの吸光度
をＥＬＩＳＡリーダープレートにより決定した。
【０４９１】 （高親和性ＧＡＢＡ取り込み）高親和性ＧＡＢＡ取り込みのレベルを、以前に
記載された（Ｇｒｅｅｎｅら、１９９８）ように決定する。
【０４９２】 （[3Ｈ]チミジン取り込み）この培養物を、栄養因子で２４時間処理し、そし
て最後の４時間の間に、この細胞を最終濃度０．３３μＭの[3Ｈ]チミジン（２
５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、
ＩＬ）で標識する。取り込まれた[3Ｈ]チミジンを、１０％の氷冷トリクロロ酢
酸で２４時間沈殿させる。その後、この細胞を氷冷水でリンスする。０．５Ｍ
ＮａＯＨ中での溶解後、その溶解物およびＰＢＳリンス（５００μｌ）をプール
し、そして計数する。
【０４９３】 （結果） 光受容体細胞の発生に対するＶＥＧＦの調節的役割を、出生後１日目（ＰＮ１
）の動物由来の培養物を使用してまず調査する。以前の報告によって、多能性前
駆体が、この発生期間の間に存在し、そして光受容体細胞および他の網膜細胞型
へとインビトロで分化する能力を保持することが示された（Ｍａｒｒｏｗら、１
９９８）。ＶＥＧＦ−２またはＶＥＧＦ−１（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ
、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）での処理によって、網膜培養物中のロドプシ
ンタンパク質のレベルの用量依存性および時間依存性の増加が誘導される(図１
４Ａ）。ＶＥＧＦに誘導されるロドプシンの増加の時間経過は、比較的遅く、こ
れは、光受容体細胞の公知の発生プロフィールと一致する。処理の５日後に、１
０〜１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−２によるロドプシンタンパク質の２５〜４０
％の増加が記録される。しかし、処理の７〜９日まで、これらの同じ濃度のＶＥ
ＧＦ−２は、ロドプシンタンパク質の２００〜２５０％の増加を生じた。さらに
、これらの後期の時点で、１ｎｇ／ｍｌ程度の低いＶＥＧＦ濃度によって、ロド
プシンレベルが有意に増加した。ロドプシンの量の変化は、このロドプシンタン
パク質の発現レベルの変化または光受容体細胞の数の変化、あるいはその両方を
反映し得る。ＶＥＧＦ処理が網膜細胞の総数に影響したか否かを確認するために
、カルセインＡＭの発光レベルをモニターする。カルセイン発光の約２５〜５０
％の増加が、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−２での処理の５〜７日後に
観察される（図１４Ｂ）。カルセイン発光の基底レベルの顕著な増加が、７日目
と９日目との間の網膜培養物にて記録される。このことは、外因性ＶＥＧＦと独
立している網膜細胞の増殖が、この後期の時点まで増加したことを示す。ＶＥＧ
Ｆ−２の存在によって、１００ｎｇ／ｍｌ程度の高い濃度であってさえ、９日間
、網膜細胞の数はさらに増加しなかった。しかし、培養９日後に、付随するロド
プシンタンパク質の基底レベルの増加は存在しない。このことは、他の細胞型の
増殖がカルセイン発光のレベルの増加の原因であることを示唆する（図１４Ａ）
。ＶＥＧＦ−１での処理によって、ＶＥＧＦ−２について記載したのと同様の、
ロドプシンレベルの変化およびカルセイン発光のレベルの変化が誘導された（そ
れぞれ、図１４Ｃおよび図１４Ｄ）。
【０４９４】 ロドプシン含量およびカルセイン発光の増加が光受容体細胞の数の増加を反映
したのか否かを決定するために、培養物を、ＶＥＧＦ−１またはＶＥＧＦ−２で
９日間処理し、次いで、ロドプシンについて免疫組織化学染色する。ＶＥＧＦ処
理の効果を定量化するために、細胞の計数を行う。ロドプシン免疫陽性細胞の数
は、濃度の関数として増加し、ＶＥＧＦ−１およびＶＥＧＦ−２について、それ
ぞれ、０．２５ｎｇ／ｍｌおよび１．５ｎｇ／ｍｌというＥＣ５０値を有する応
答を伴った（図１５）。ＶＥＧＦ−２の飽和濃度において、杆体細胞の数の２．
４倍の増加が観察される。さらに、この応答は、１００ｎｇ／ｍｌ程度の高いＶ
ＥＧＦ−２の濃度の存在下で安定であり、このことは、ＶＥＧＦ−２が、生物学
的応答の脱感作を容易には誘導しないことを示唆する。ＶＥＧＦ−１について観
察される用量応答は、ＶＥＧＦ−２を用いて得られるものと類似し、このことは
、ロドプシンＥＬＩＳＡからの結果と一致する。
【０４９５】 ＶＥＧＦ−２が光受容体細胞数の増加を誘導する機構は、前駆体細胞の増殖の
増加、分化した光受容体細胞の生存の増加、および／または杆体細胞系列経路の
再方向付け（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）に関与し得る。ＶＥＧＦ−２が網膜細胞
についてのマイトジェンであるか否かを調査するために、この培養物をプレーテ
ィングの４時間後に因子で処理し、続いて２４時間後、４８時間後、または７２
時間後に、ＢｒｄＵで標識する。最終標識期間（７２時間）の終わりに、この培
養物を固定し、そして取り込まれたＢｒｄＵを免疫組織化学検出する。ＢｒｄＵ
標識細胞数の有意な増加は、処理の４８時間後まで観察されない。処理の４８時
間後には、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−２またはＶＥＧＦ−１は、２倍および３
倍の増加を誘導した（ぞれぞれ、図１６Ａおよび１６Ｂ）。この応答のＥＣ５０
値は、１ｎｇ／ｍｌと計算される。この４８時間時点がほぼ最大のようであった
。なぜなら、７２時間のインキュベーション後に、ＢｒｄＵ取り込みのレベルが
、濃度に関わらず、ＶＥＧＦ処理培養物で減少したからである。しかし、免疫陽
性細胞数のこの減少は、ＶＥＧＦ投与とは特に関連しない。ＢｒｄＵ取り込みの
基底レベルは、１ウェルあたり１３００個から７００個の免疫陽性細胞に減少し
た。このことは、網膜前駆体細胞の増殖活性の一般的損失が、この時間の間に生
じていることを示唆する。この後期の時点での培養物のより低い全体の増殖活性
にも関わらず、ＶＥＧＦ投与によってなお、ＢｒｄＵで標識された細胞の数の２
倍の増加を生じた。類似の結果が、[3Ｈ]チミジン取り込みを使用して得られる
（図１６Ｃ）。
【０４９６】 インビトロ培養期間の初期の間のＶＥＧＦについての役割についてさらに特徴
付けるために、ロドプシンタンパク質のレベルに対する、培養物への因子の添加
の遅延が有する効果を試験した。ＶＥＧＦの最初の添加を、プレーティングした
４時間、２４時間、４８時間後に行い、そしてその後に、培養物を９日間維持し
、次いでロドプシンのＥＬＩＳＡのために調製した。細胞の単離と因子の最初の
添加との間の時間経過の関数としての、ＶＥＧＦ−２またはＶＥＧＦ−１に対す
る応答の消失を、それぞれ、図１７Ａおよび１７Ｂに示す。細胞のプレーティン
グの４時間以内の因子の添加は、ロドプシンのレベルにおいて、３倍の上昇を生
じた。しかし、２４時間または４８時間程度のＶＥＧＦでの最初の処理の遅延は
、それぞれ、２８％および４３％程度の最大応答の減少を生じた。さらに、４８
時間の遅延後に、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−２での処理のみが、ロドプシン
含量において有意な増加を誘導した。したがって、網膜細胞に対してＶＥＧＦが
有する増殖効果は、発生的に制限され、そして光受容前駆体の増殖に関与するこ
とを示唆する。
【０４９７】 ＶＥＧＦが出生後に生まれる他の網膜細胞型（例えば、アマクリン細胞および
ミュラー細胞）に働く可能性もまた、調査される。シンタキシン（ｓｙｎｔａｘ
ｉｎ）のそれらの発現に基づいて同定される、アマクリン細胞の形態が、試験さ
れる（データを示さず）。いずれかのＶＥＧＦでの処理は、シンタキシン免疫陽
性細胞の数において用量依存性の増加を誘導し、ビヒクル処理コントロールと比
較した場合、１０ｎｇ／ｍｌでおよそ２．４倍の最大の増加を誘導した（図１８
Ａ）。ロドプシンのＥＬＩＳＡおよび細胞数での結果とは対照的に、１００ｎｇ
／ｍｌのＶＥＧＦ−１またはＶＥＧＦ−２が、１０ｎｇ／ｍｌで観察されるより
も、シンタキシン免疫陽性細胞の数においてより小さな増加を誘導した。アマク
リン細胞の表現型に対するＶＥＧＦ−２処理の効果をさらに特徴付けるために、
高親和性ＧＡＢＡ取り込みのレベルを測定する。図１８Ｂは、ＶＥＧＦにより誘
導されるＧＡＢＡ取り込みにおける用量依存性の増加を示す。用量応答曲線は、
それぞれ、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−２で生じるＧＡＢＡ
取り込みにおける有意な増加および飽和の終点として免疫陽性シンタキシン細胞
の数を使用する場合に観察されるものと類似する。
【０４９８】 ミュラーグリア細胞は、グリアフィビラリー（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｉｌｌａｒ
ｙ）酸性タンパク質のそれらの発現に基づいて同定される（Ｂｊｅｕｒｋｌｕｎ
ｄら、１９８５）。ＶＥＧＦ−２がミュラー細胞の数に対するまたは分化のレベ
ルに対する効果を有するかを決定するために、ＧＦＡＰタンパク質の量が、ＥＬ
ＩＳＡによって測定される。培養の７日後には、ビヒクルコントロールに対して
因子での処理と比較した場合に、ＧＦＡＰのレベルにおいて有意な差異は、存在
しない（図１８Ｃ）。さらに、ＶＥＧＦ−２での処理は、網膜培養物中において
免疫陽性細胞である内皮細胞の数を増加させなかった（データを示さず）。
【０４９９】 ＶＥＧＦ応答の発生パターンをさらに特徴付けるために、網膜細胞は、異なる
発生期に単離され、そしてＶＥＧＦ−２に対するマイトジェン応答が、培養物を
［3Ｈ］チミジンで標識することによって４８時間後に定量される。さらに、光
受容細胞のインビトロでの分化は、密度に依存することが以前に留意されている
ので、ＶＥＧＦへの応答に対してプレーティングの密度が有する効果もまた、調
査される。
【０５００】 培養物がＥ１５動物に由来し、そして２１２細胞／ｍｍ2の密度でプレートさ
れる場合、［3Ｈ］チミジン取り込みの基礎レベルは、１５８９±９４ｄｐｍ／
ウェルであり、そしてＶＥＧＦ−２での処理は、５０％の最大増加を誘導した（
図１９Ａ）。飽和が１０ｎｇ／ｍｌで生じるＰ１培養物で観察される用量応答と
は対照的に、Ｅ１５培養物における増殖性応答は、１ｎｇ／ｍｌの濃度にて飽和
する。さらに、プレーティング密度とＶＥＧＦ−２に対するマイトジェン応答と
の間には、逆の関係が存在する。３１８細胞／ｍｍ2の密度では、用量応答曲線
における左側への移動が、１ｎｇ／ｍｌよりも高い濃度で観察され、これは、応
答の脱感作を引き起こす。試験された最高の密度（４２５細胞／ｍｍ2）では、
網膜細胞は、ＶＥＧＦ−２に非応答性である。Ｐ１培養物においてＶＥＧＦ−２
と同様の生物学的活性を有するＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）（以下を参照のこ
と）が、より高い密度の培養物において、６２％の程度の多さによってＥ１５培
養物における増殖を阻害したことに注目することは興味深い（データ示さず）。
【０５０１】 Ｅ２０動物由来の培養物において、２１２細胞／ｍｍ2のプレーティング密度
での［3Ｈ］チミジン取り込みの基礎レベルは、３３６１±１９２であり、そし
てＶＥＧＦ−２処理による［3Ｈ］チミジン取り込みの刺激のレベルは、より低
いプレーティング密度では、一般的に、より大きく８０〜１００％までの範囲に
わたる（図１９Ｂ）。ＶＥＧＦ−２が最高の密度でプレートされた培養物におけ
る効果をさほど有しないというさらなる傾向が存在する。しかし、阻害効果は、
ましてや顕著ではない。［3Ｈ］チミジン取り込みの基礎レベルが４７８±３３
であるＰ１によって、用量応答において左側への移動が存在し、ここで飽和が、
１０ｎｇ／ｍｌで生じて、そして最大増加の程度が、３００％の範囲においてよ
り大きい（図１９Ｃ）。さらに、ＶＥＧＦ−２への応答に対するプレーティング
密度の識別可能な効果は、存在しない。
【０５０２】 杆状体または杆状体前駆細胞の応答性をより十分に特徴付けるために、網膜細
胞の数に対する、およびロドプシンタンパク質のレベルに対する、ＥＧＦ、ＦＧ
Ｆ−２またはＴＧＦβ−１が有する効果は、ＶＥＧＦ−２で達成される効果と比
較される。ＥＧＦ（種々の細胞型についてのマイトジェン）は、網膜細胞の数に
おいて３１％の増加を誘導し、ここでこの応答は、１ｎｇ／ｍｌで飽和し、そし
て１００ｎｇ／ｍｌまで安定なままである（図２０Ａ）。しかし、ＥＧＦ処理培
養物において、ロドプシンタンパク質のレベルにおいて同時の増加は、存在しな
い（図２０Ｂ）。１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲におけるＦＧＦ−２は、網膜
細胞の数において小さな増加（１３％）を誘導する。さらに、ＦＧＦレセプター
の数を活性化するＦＧＦ−２は、ロドプシンタンパク質のレベルにおける増加を
誘導する。ロドプシンのレベルにおける４５％の増加が、１ｎｇ／ｍｌ程度の低
さのＦＧＦ−２の濃度で観察され、このことは、０．５ｎｇ／ｍｌの範囲におい
て、この応答に対するＥＣ５０値を生じる。ＴＧＦβ−１での処理は、網膜細胞
の数およびロドプシンタンパク質のレベルの両方において減少を生じる。０．１
ｎｇ／ｍｌの濃度にて、ＴＧＦβ−１は、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）の発現
およびロドプシンタンパク質のレベルを、それぞれ、４０％および９０％程度、
最大で減少した。
【０５０３】 ＢｒｄＵ標識実験からの結果は、ＶＥＧＦ−２が網膜前駆細胞の増殖速度を増
強することを実証する。光受容細胞の発生経路は、独立した系列であり、従って
、環境因子の調節下にあると考えられるので（Ｅｚｚｅｄｄｉｎｅ ＺＤら、１
９９７）、ＶＥＧＦはまた、さらに下流の部位で光受容細胞の発生を調節し得る
。ＣＮＴＦは、両極細胞系列に対してそれらの表現型を再指向させることによっ
て、それらの発生経路において比較的後期に、光受容細胞の分化を阻害すること
が、以前に決定されている。光受容細胞の誘導について飽和している濃度および
ＣＮＴＦの種々の濃度にて、網膜培養物とＶＥＧＦ−２とを同時処理することに
よって、２つの因子の潜在的相互作用を調査する。ＶＥＧＦ−２により誘導され
たロドプシンタンパク質における増加は、用量依存性の様式においてＣＮＴＦに
よって阻害される（図２１Ａ）。この阻害応答は、０．４ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０
値を有し、そして１００ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦでの処理は、ＶＥＧＦ−２応答の
完全な阻害を生じた。しかし、ＣＮＴＦでの処理が、この培養物における網膜細
胞の総数を変化させなかった（図２１Ｂ）。ＣＮＴＦの阻害効果が初期または後
期の事象であるか否かを決定するために、ＶＥＧＦ−２により誘導される［3Ｈ
］チミジン取り込みのレベルの増加に対してＣＮＴＦの同時投与が有する効果が
、試験される。以前の結果とは対照的に、ＣＮＴＦの添加は、ＶＥＧＦ誘導増殖
性応答を阻害しなかった（図２１Ｃ）。これらの知見はさらに、これら２つの因
子が系列経路において異なる位置で光受容細胞の発生を調節することを立証する
。
【０５０４】 （考察） 上記の実験は、インビトロで、網膜細胞に対するＶＥＧＦ−１およびＶＥＧＦ
−２の効果を同定し、そして特徴付ける。ナノモル濃度未満の範囲におけるＶＥ
ＧＦでの処理は、光受容細胞およびアマクリン細胞の数における増加を誘導し、
そしてロドプシンタンパク質および高親和性ＧＡＢＡ取り込みのレベルを増加さ
せた。経時的な研究は、ＶＥＧＦがその添加の４８時間以内に［3Ｈ］チミジン
取り込みにおける最大の増加を誘導し、そして２４〜４８時間での培養物の処理
の遅れは、増殖性応答および分化応答の損失を生じることを実証する。マイトジ
ェン応答は、Ｅ１５、Ｅ２０およびＰ１動物由来の細胞で［3Ｈ］チミジン取り
込みにおける増大を誘導するＶＥＧＦ−２により、発生的に調節された。他の栄
養因子ファミリーのメンバーと比較して、ＶＥＧＦ−２およびＦＧＦ−２での処
理に対する応答は、両方の因子が培養の９日後に細胞総数における増加を誘導す
ることなくロドプシンタンパク質のレベルを増加した応答と類似した。ＣＮＴＦ
とＶＥＧＦ−２との同時投与は、ロドプシンのレベルにおいてＶＥＧＦ誘導性増
加の阻害を生じたが、増殖性応答においては阻害を生じなかった。
【０５０５】 ＶＥＧＦレセプターファミリーは、現在、４つのメンバーから構成される（総
説については、ＫｌａｇｓｂｒｕｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ、１９９６；Ｗｅｎら
、１９９８）を参照のこと）。このレセプターは、異なるがなお重複するリガン
ド特異性を実証する。ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（Ｆ
ｌｋ−１）は、種々の形態のＶＥＧＦ−１を結合する；一方、ＶＥＧＦＲ−２お
よびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）は、ＶＥＧＦ−２を結合する。従って、ＶＥ
ＧＦ−１およびＶＥＧＦ−２の両方は、ＶＥＧＦＲ−２を活性化し（Ｊｏｕｋｏ
ｖら、１９９８）、そして両方のリガンドは、網膜培養物において同様の生物学
的活性を有する。最近、ＹａｎｇおよびＣｅｐｋｏ（１９９６）は、網膜におけ
るＶＥＧＦＲ−２の発生発現パターンを記載した。新たに形成する脈管構造に対
するレセプターの予測される発現の程度から、レセプターはまた、神経網膜の成
分上に存在した。この発現パターンは、発生の間、維持される。なぜなら、網膜
は、求心性の様式において増殖するからである。
【０５０６】 網膜前駆細胞のＶＥＧＦへの応答に対する発生年齢の効果は、レセプターの発
生発現パターンと一致する（ＹａｎｇおよびＣｅｐｋｏ、１９９６）。［3Ｈ］
チミジン取り込み研究に基づくＶＥＧＦのマイトジェン効果は、試験した最も初
期の発生時点であるＥ１５、ならびにＥ２０およびＰ１に注目された。増殖性効
果の大きさは、Ｐ１によりピークに達する年齢とともに増加した。ＶＥＧＦ−２
は、Ｐ１よりも、Ｅ１５およびＥ２０培養物に対してより効率的である。なぜな
ら、その応答は、それぞれ、１０ｎｇ／ｍｌとは対照的に１ｎｇ／ｍｌで飽和し
たからである。さらに、インビトロでの増殖の基礎レベルはまた、発生年齢とと
もに変化して、ここで最高のレベルが、Ｅ１７で観察された。増殖の基礎レベル
が、Ｅ１５では比較的低いが、細胞密度における２倍の増加とともに４倍に増加
（他の発生年齢で観察されたより大きな比例増加）するという知見は、内因性マ
イトジェンがＥ１５培養物におけるＶＥＧＦ−２処理で生じる脱感作の根底にあ
り得ることを示唆する。さらに、これらのデータは、初期の発生の間に増加した
レベルのＶＥＧＦが光受容細胞の分化に対して負の影響を有し得ることを示す。
他の増殖因子への網膜前駆細胞の応答に対する発生年齢の影響もまた、観察され
ている（ＡｌｔｓｈｕｌｅｒおよびＣｅｐｋｏ、１９９２）。Ｌｉｌｌｉｅｎお
よびＣｅｐｋｏ（１９９２）は、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２に対する単層培養
物における網膜細胞の増殖性応答がより初期の在胎齢（例えば、Ｅ１５およびＥ
１８）でより大きくなり、そしてＥ２１およびＰ０で、用量応答曲線において右
側への移動が、明らかになったことを報告した。
【０５０７】 キンギョおよびカエルにおける以前の研究は、アマクリン細胞の発生は、細胞
間接触によって調節されることを示唆した（Ｎｅｇｉｃｈｉら、１９８２；Ｒｅ
ｈおよびＴｕｌｌｙ、１９８６）。最近、光受容細胞のインビトロでの発生のた
めの細胞間接触の重要性はまた、再凝集した培養物において、Ｗａｔａｂｅおよ
びＲａｆｆ（１９９０、１９９２）によって、次いで後に、コラーゲンゲルにプ
レートされた解離した網膜細胞では、ＡｌｔｓｈｕｌｅｒおよびＣｅｐｋｏ（１
９９２）によって記載された。前者の研究において、Ｅ１５網膜細胞が、５０倍
過剰の新生児網膜細胞を用いて再凝集された場合、ロドプシン免疫陽性細胞が観
察された場合に、発生時間における変化は、存在しなかった。しかし、光受容細
胞へと最終的に分化したＥ１５細胞の割合において有意な増加が存在した。本研
究で使用される単層培養物の場合には、光受容細胞のＶＥＧＦ−２誘導性初期増
殖性応答と後の分化との間に引き離しが存在した。例えば、ＶＥＧＦ−２は、２
１２細胞／ｍｍ2程度の低さの密度で播種された培養物において、３〜４倍程度
、［3Ｈ］チミジン取り込みを増大させ、そして７日間の処理は、より高いプレ
ーティング密度（例えば、４２５細胞／ｍｍ2）で達成された密度に等価な細胞
の密度を生じた。しかし、これらの培養物において、検出可能なロドプシンタン
パク質または免疫陽性細胞は、存在しなかった。これらの結果は、光受容細胞の
発生に必要な重要な細胞間相互作用が存在するのみではなく、細胞接触を介して
生じる刺激がおそらく必要である間に、時間枠もまた存在することを示唆する。
【０５０８】 ロドプシンタンパク質の出現の発生の時間経過に対する、ＶＥＧＦ誘導性増殖
の時間経過の比較は、この２つの事象の間におよそ５日間の遅れが存在すること
を示す。ロドプシンタンパク質の出現は、おそらく、遺伝子の転写の誘導を反映
する。なぜなら、この２つの事象は、密接に関連することが示されているからで
ある（Ｔｒｅｉｓｍａｎら、１９８８）。この時間間隔は、Ｅ２０〜Ｐ３の範囲
にある年齢以内の動物に由来する前駆細胞を考慮する場合に、インビボおよびイ
ンビトロ研究において、Ｍｏｒｒｏｗら（１９９８）によって観察された時間間
隔に類似する。さらに、インビトロで５日と９日との間に、本発明者らは、ロド
プシンタンパク質のレベルにおいて最大の増加を観察した。そしてこの期間は、
インビボでの、生後発生期（６〜１０日）内であり、この期間内に、ロドプシン
免疫陽性細胞がはっきりと出現する（Ｍｏｒｒｏｗら、１９９８）。これらの発
生時間ウインドウにおける相関性は、ＶＥＧＦ−２が光受容前駆細胞の増殖を誘
導するが、これは、光受容細胞の分化において有意な遅延を誘導しないことを示
唆する。前駆細胞が細胞周期を休止することを妨げられる場合が、予期され得る
。
【０５０９】 他の栄養因子のファミリーのメンバーと比較して、ＶＥＧＦ−２への応答は、
両方の因子が、インビトロで９日後に網膜細胞の総数において比較的小さな増加
を誘導しつつロドプシンタンパク質のレベルを増加するという点で、ＦＧＦ−２
の応答に類似する。さらに、［3Ｈ］チミジン取り込みおよび細胞数に基づく、
ＦＧＦ−２に対する増殖応答は、Ｐ３程度の遅さであると、Ｌｉｌｌｉｅｎおよ
びＣｅｐｋｏ（１９９２）によって留意されており、このことは、ＦＧＦ−２が
生後の培養物においていくらかのマイトジェン活性を保持することを示唆する。
ＶＥＧＦ−２に関する本発明者らの知見とは対照的に、Ｆｏｎｔａｉｎｅら（１
９９８）は、ＦＧＦ−２もまたＰ５動物に由来する光受容細胞に対する生存効果
を有することを実証する（データを示さず）。ＴＧＦβ−１処理は、網膜細胞の
数およびロドプシンタンパク質のレベルの両方において減少を生じた。Ｋｉｍｉ
ｃｈｉら（１９８８）は、ヒト胎児性網膜培養物を使用して、ヒト細胞に関する
最大阻害がげっ歯類培養物において必要とされる０．１ｎｇ／ｍｌ未満と比較し
て０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ−１を必要とするという例外を伴う類似する観察
を報告した。
【０５１０】 サイトカインの神経促進（ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｔｉｃ）ファミリーのメンバー
である、ＣＮＴＦは、インビトロおよびインビボで光受容細胞の発生をもたらす
こと、および光誘導性損傷後に光受容細胞の生存を増強することが公知である（
ＵｎｏｋｉおよびＬａＶａｉｌ、１９９４；Ｆｕｈｒｍａｎら、１９９５；Ｅｚ
ｚｅｄｄｉｎｅら、１９９７；Ｃａｙｏｕｅｔｔｅら、１９９８）。ＣＮＴＦと
は対照的に、ＶＥＧＦ−２は、一定の光により誘導される損傷モデルにおいて光
受容細胞をレスキューしなかった（ＬａＶａｉｌら、１９９２；Ｗｅｎら、１９
９５；Ｒ．ＷｅｎおよびＲ．Ａｌｄｅｒｓｏｎ、未公開データ）。生後ラットの
網膜外植片培養物のＣＮＴＦでの処理は、ロドプシンを発現する細胞の集団にお
ける損失とともに、両極細胞マーカーを発現する細胞の数における増加を生じる
。［3Ｈ］チミジン標識されたＰ０網膜細胞の発生運命に対するＣＮＴＦの効果
の分析は、サイトカインがこの細胞集団の増殖を誘導しないか、またはこの細胞
の生存を増加しないことを示唆する（Ｅｚｚｅｄｄｉｎｅら、１９９７）。さら
に、ＣＮＴＦの効果の開始は、細胞が有糸分裂後になり、かつロドプシンを発現
し始める時間頃に生じた。これらのデータは、ＣＮＴＦが、培養の５日と７日と
の間に観察されるロドプシンタンパク質のＶＥＧＦ誘導性増加を阻害するが、１
日と２日との間に観察される、そのマイトジェン活性を阻害しないを実証する。
【０５１１】 網膜における発達の経過の間に、酸素レベルは、次いで、網膜ニューロンの分
化バターンと一致する網膜脈管（ｒｅｔｉｎａｌ ｖｅｓｓｅｌ）の微細構築を
制御する（Ｃｈａｎ−Ｌｉｎｇら、Ｐｈｅｌｐｓ、１９９０）。Ｓｔｏｎｅら（
１９９５）は、網膜において、星状細胞および小膠細胞が、次いで、脈管形成を
誘導するＶＥＧＦを合成かつ分泌することによって、低酸素症に応答することを
実証した。本明細書中で報告された研究は、ＶＥＧＦにより調節された初期の分
化事象が脈管形成のみならず光受容前駆細胞の増殖にもまた関与することを示唆
する。これは、最終的に、網膜における多数の細胞型の同調的な発生を生じ得る
。
【０５１２】 （実施例９） （ＶＥＧＦ−２および抗体の同時処理に対する内皮細胞の増強された応答） ＨＧＳにより作成された抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイによりＶＥＧＦ−２に結
合することが示されているが、レセプター相互作用に関与する部位に結合しない
と考えられる。モノクローナル１３Ｄは、この分子のＮ末端側にエピトープをマ
ッピングされ、そしてモノクローナル１３Ａ２は、Ｃ末端にエピトープをマッピ
ングされた。（図２４を参照のこと）。ポリクローナル抗体は、多数の異なる部
位を認識するが、このレセプターと相互作用する活性タンパク質のセグメントに
結合しないと考えられる。これらの抗体を使用して、ＶＥＧＦ−２および上記の
抗体で同時処理することによって、ウシリンパ球内皮細胞（ＬＥＣ）の増殖の刺
激または阻害を定量的に決定した。
【０５１３】 ａｌａｍａｒ ｂｕｌｅ ＬＥＣ増殖アッセイ（これは、代謝活性の検出に基
づいて蛍光分析増殖指示薬を取り込む）を使用した。このＡｌａｍａｒ ｂｕｌ
ｅは、細胞増殖から生じる増殖培地の化学的還元に応答して蛍光を発しかつ色を
変化させる両方である酸化−還元指示薬である。細胞が培養物において増殖する
につれて、生得的な代謝活性は、すぐ周囲の環境の化学的な還元を生じる。増殖
に関連する還元は、指示薬が酸化された（非蛍光性青色）形態から還元（蛍光性
赤色）形態に変化することを引き起こす。すなわち、刺激された増殖は、より強
いシグナルを生成し、そして阻害された増殖は、より弱いシグナルを生成し、そ
してシグナル全体は、細胞の総数に比例する。
【０５１４】 ａｌａｍａｒ ｂｕｌｅ ＬＥＣ増殖アッセイに使用された材料には、以下が
含まれる：Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ カタログ番号ＤＡＬ
１１００）；ＤＭＥＭ １０％ ＦＢＳ＋ＰｅｎｎＳｔｒｅｐ＋グルタミン＋７
５ｍｇ ＢＢＥ＋４５ｍｇヘパリン（増殖培地）；ＤＥＭＥ １０％ ＦＢＳ＋
ＰｅｎｎＳｔｒｅｐ＋グルタミン（Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ）；ＤＭ
ＥＭ ０．５％ ＦＢＳ＋ＰｅｎｎＳｔｒｅｐ＋グルタミン（サンプル希釈培地
）；ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅリーダー；９６ウェルプレ
ート；ならびにＬＥＣ細胞。
【０５１５】 ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイを、以下の通りに行った。時間的調節な趣旨
については、水曜日に９６ウェルプレート上に細胞を播種し、木曜日に飢餓培地
に変更し、金曜日にサンプルを接種し、週末にわたってインキュベートし、次い
でａｌａｍａｒ ｂｕｌｅを添加し、インキュベートし、そして月曜日に読み取
ることが最良である。
【０５１６】 ＬＥＣ細胞を、９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルの密度で、増殖培
地中に播種し、そして３７℃で一晩置いた。ＬＥＣ細胞の一晩のインキュベーシ
ョン後に、この増殖培地を除去し、そして飢餓培地と交換し、そして３７℃でさ
らに２４時間インキュベートした。２回目の２４時間のインキュベーションの後
に、三連のウェルにおいてタンパク質サンプルの適切な希釈物（ＤＭＥＭ＋０．
５％ ＦＢＳにおいて調製される）を、細胞に接種した。一旦、この細胞にこの
サンプルを接種すると、このプレートを、３日間、３７℃インキュベーターに戻
して置いた。
【０５１７】 ３日後に、１０μｌのストックａｌａｍａｒ ｂｕｌｅを、各ウェルに添加し
、そしてこのプレートを、４時間、３７℃インキュベーターに戻して置いた。次
いで、このプレートを、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーを使用して、５３０ｎ
ｍの励起および５９０ｎｍ放射にて読み取った。直接的な出力を、相対的な蛍光
単位において記録した。
【０５１８】 活性のバックグランドレベルを、飢餓培地単独で観察した。これは、陽性コン
トロールサンプル（ＶＥＧＦ−１および／またはｂＦＧＦ）ならびにＨＧＳタン
パク質希釈物から観察された出力と比較する。
【０５１９】 ＨＧＳにより作成された３つの異なる抗体調製物（２つのマウスモノクローナ
ル（１３Ａ２、１３Ｄ６）およびウサギポリクローナル抗体）を、ＶＥＧＦ−２
媒介性活性化に対するＬＥＣの応答を調節するそれらの能力について評価した。
ＬＥＣの増殖性応答が１０００ｎｇ／ｍｌの濃度のＶＥＧＦ−２にて観察され得
ることが以前に実証された。従って、ＤＭＥＭ中で濃度１０００ｎｇ／ｍｌでの
ＶＥＧＦ−２サンプルを、３つの異なる抗ＶＥＧＦ−２抗体（１０μｇ/ｍｌ）
のうちの１つと予め混合し、そしてａｌａｍａｒ ｂｕｌｅアッセイ系において
使用して、ＬＥＣ増殖における影響を決定した。初めの実験におけるコントロー
ルは、ＶＥＧＦ−２単独（１０００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、
陽性コントロール）、ＩＬ−２（無関係のタンパク質の陰性コントロール）およ
び飢餓培地（アッセイの陰性コントロール）を含んだ。この反復実験はまた、陰
性コントロールとして抗体単独（１０μｇ／ｍｌ）を含んだ。
【０５２０】 図２２に示されるように、濃度１０００ｎｇ／ｍｌでのＬＥＣのＶＥＧＦ−２
処置は、陰性コントロールと比較して増殖性応答を生じ、このことは、これらの
細胞を用いて実施された、以前の増殖性アッセイと一致した。ＶＥＧＦ−２およ
びモノクローナル１３Ａ２を用いるＬＥＣの同時処置は、ＶＥＧＦ−２単独で達
成されたレベルを超えて増殖性応答を増強しなかった。しかし、増強された増殖
性応答を、１３Ｄ６モノクローナルで観察し、そしてより少ない程度で、ウサギ
ポリクローナル抗体で観察した。
【０５２１】 図２３に示されるように、実験を、開始細胞濃度として１０００細胞／ウェル
を使用して、よりストリンジェントな条件下で繰り返し、そしてこの実験は、Ｌ
ＥＣに対する抗体の可能な直接的効果について制御するために、抗体単独を用い
る刺激を包含した。この実験は、ＶＥＧＦ−２の増強が、ＶＥＧＦ−２または抗
体単独で観察された増殖性応答を超えて１３Ｄ６抗体およびポリクローナル抗体
による増殖を媒介したことを示した。以前の実験において観察されるように、１
３Ａ２抗体は、増強された増殖性応答を誘導しなかった。
【０５２２】 これらの観察は、レセプター（ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３）に結合した
ＶＥＧＦ−２分子の架橋を媒介する抗体が、レセプター二量体化を誘導し得るこ
とを示唆する。このようなプロセスを使用して、そのレセプターに対するＶＥＧ
Ｆ−２結合から生じるシグナル伝達を増強し得る。
【０５２３】 （実施例１０：モノクローナル抗体産生のためのマウス免疫） 動物は、個々に収容され、そして食物および水を適宜受ける。全ての操作を、
無菌技術を使用して実施する。この実験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ
ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って実施する。
【０５２４】 ３５０μｌのリン酸緩衝化溶液（ＰＢＳ）または他の中性緩衝液中のタンパク
質の濃度を、最終タンパク質濃度０．４３ｍｇ／ｍｌまで希釈する。０．３５ｍ
ｌのフロイント完全アジュバントを用いて、このアジュバントおよびタンパク質
の溶液を、２つの３ｃｃのガラスシリンジおよびディスポーザブルの３方コック
（Ｂａｘｔｅｒカタログ番号２Ｃ６２４０）を使用して１０分の間乳化する。乳
濁物を、質について試験するために、５０μｌの乳濁物をビーカー中の冷水の表
面上に置く。この乳濁物が、インタクトな白色液滴として残らない場合、さらな
る混合が必要である。
【０５２５】 この乳濁物の全てを一方のシリンジ中に引きこみ、そして２７ゲージ針を使用
して、総量２００μｌの乳濁物を、４〜８つの部位（腋窩領域および鼡径領域、
頸部の後ろならびに背部沿いを含む）に分けてマウスに皮下注射する。
【０５２６】 ２〜３週間後、（フロイント完全アジュバントに対して）代わりにフロイント
不完全アジュバントを用いて、上記の注射を繰り返す。
【０５２７】 さらに２〜３週間後、３回目の注射を、上記に概説されるように与え、フロイ
ント不完全アジュバントの使用を確実にする。
【０５２８】 ３回目の注射の１０〜１４日後、尾の静脈出血によって、このマウスから１０
０〜２００μｌの血液を得る。この血液を３７℃で６０分間インキュベートし、
次いで、一晩４℃にて冷却させた。４℃でのインキュベーション後、この血液を
１０分間遠心分離する。その血清を新たなチューブに移し、そしてマウス血清力
価について試験する。力価が低いことが見出される場合、腹腔内（ｉｐ）注射は
、隔週間隔で与えられ得る。ｉｐ注射のために、マウス１匹あたり２００〜４０
０μｌのＰＢＳの容量で、マウス１匹あたり１０〜２０μｇのタンパク質を調製
する。１ｃｃのシリンジおよび２６ゲージ針を使用して、その溶液をマウスに注
射する。注射の１０〜１４日後に２回目の尾の出血を行い、そしてそのマウス血
清力価を再試験する。
【０５２９】 （実施例１１：マウス血清力価ＥＬＩＳＡ） ＥＬＩＳＡプレートを、２μｇ／ｍｌのＰＢＳで、５０μｌ／ウェル精製した
抗原でコートする。このＥＬＩＳＡプレートをパラフィルムで覆い、そして加湿
チャンバ中で４℃にて一晩インキュベートする。インキュベーション後、このプ
レートを１回の洗浄あたり２００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて、４回洗浄する
。３％ＢＳＡを２００μｌ／ウェルで、室温にて６０分間ブロックする。ブロッ
キング溶液を振り落とす。
【０５３０】 ２回連続で、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に希釈した１０-2、１０-3、１０ -4 、１０-5、１０-6および１０-7の希釈で血清サンプル（５０μｌ／ウェル）を
加える。上記の希釈物に、緩衝液のブランクならびに陽性コントロール血清およ
び陰性コントロール血清を含む。室温にて１〜２時間インキュベートする。ＰＢ
ＳＴ（０．０５％ ｔｗｅｅｎを有するＰＢＳ）を用いて、２５０μｌ／ウェル
で４回洗浄する。
【０５３１】 ５０μｌ／ウェルのビオチン化抗マウスＩｇＧを、０．１％ＢＳＡおよび２％
ウマ血清を含有するＰＢＳＴ中に、０．５μｇ／ｍｌの濃度で添加する。室温に
て３０〜６０分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴを用いて４回洗浄す
る。
【０５３２】 ５０μｌ／ウェルのＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒカタログ番号ＰＫ−６１００）
を、このプレートに添加し、そして室温にて３０分間インキュベートする。プレ
ートをＰＢＳＴを用いて６回洗浄する。
【０５３３】 ５ｍｌのｄｄＨ2Ｏ中に１テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド（ＴＭＢ
）タブレット（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ−３４０５）を溶解することによって
、ＥＬＩＳＡ検出のための基質を調製する。５ｍｌの０．１Ｍリン酸クエン酸緩
衝液（２５．７ｍｌの０．２Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム、２４．３ｍｌの０．
１Ｍクエン酸一水和物（ｐＨ５．０））を添加する。２μｌの新鮮な３０％過酸
化水素を添加し、ボルテックスし、そして直ちに使用する。
【０５３４】 このプレートのインキュベーションおよび洗浄後、１００μｌの基質溶液を添
加し、そして室温にて約１５〜３０分間インキュベートする。２５μｌ／ウェル
の２Ｍ Ｈ2ＳＯ4の添加によってその反応を停止させ、そして３０分以内に、コ
ントロールに対してこのプレートを４５０ｎｍで読み取る。
【０５３５】 （実施例１２：ハイブリドーマ産生のための融合プロトコル） 融合工程の１週間前に、Ｐ３Ｘ増殖培地（１×ＤＭＥＭ ０％（Ｇｉｂｃｏカ
タログ番号１１９６５−０１９）、５〜１０％ウシ胎仔血清、１×Ｌ−グルタミ
ン（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓカタログ番号３００）、および１×ピルビン酸ナトリウ
ム（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓカタログ番号３３３）を作製する。Ｐ３Ｘマウス黒色腫
細胞の新たなバイアルを６−ウェル皿の１つのウェルに解凍し（解凍プロトコル
、下記を参照のこと）、そしてこれらをＰ３Ｘ増殖培地中に展開し始める。生存
度が翌日に良好であれば、１００ｍｍ皿に移す。細胞密度は、１０6細胞／ｍｌ
を超えてはならない。さらに、これらの細胞の膜は、顆粒状に見えるべきではな
い。融合手順の日までに、５〜８×１０5細胞／ｍｌで６〜８プレートが存在す
るべきである。ＨＡＴ培地中でいくつかのＰ３Ｘ細胞を試験することは、よい考
えである。全ての細胞は、約４日以内に死ぬはずである。そうでなければ、Ｐ３
Ｘ細胞を、１５μｌ／ｍｌの８−アザグアニンを含有するＰ３Ｘ培地中で増殖し
て、復帰変異体を排除するべきである。
【０５３６】 融合手順の４日前に、マウスを、約１０μｇの高純度タンパク質のｉｐ注射を
用いて免疫するべきである。
【０５３７】 融合の１日前に、Ｐ３Ｘ細胞を分け、そしてこれらに、必要に応じて、新鮮な
培地を与え、その結果、細胞は、健常であり、そして翌日に対数期に増殖する。
【０５３８】 融合手順の日に、５０ｍｌのＰ３Ｘ培地、ＰＥＧ溶液およびＨＡＴ培地（１×
ＤＭＥＭ ０％、２０％ウシ胎仔血清、４％ハイブリドーマ補充（Ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）−ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ ＨＩ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１×Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×ピ
ルビン酸ナトリウム、１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ０２６２）、１×
０．０５Ｍ ２ＭＥ、および１×ペニシリン−ストレプトマイシン）を３７℃の
水浴中に置く。利用可能な約１００ｍｌの冷ＤＭＥＭ ０％を有する。
【０５３９】 全てのＰ３Ｘプレートを、可能な夾雑について、および細胞の健康状態を評価
するためにチェックする。４つのプレートまたはフラスコから細胞を再懸濁し、
そして５０ｍｌチューブ中で合わせる。２００×Ｇで１０分間遠心分離する。そ
の上清を吸引する。各チューブを１０ｍｌのＤＭＥＭ ０％とともに再懸濁し、
そしてプールする。トリパンブルー生存度染色を使用して、生存細胞を計数する
（生存度は、９０％よりも大きいべきである）。細胞の総数は、２〜４×１０7
細胞であるべきである。細胞が十分に存在しない場合は、いくつかのより多いプ
レートを用いてこのプロセスを繰り返す。細胞を、将来の工程に必要とされるま
で、周囲室温温度（ＡＲＴ）に置いておく。
【０５４０】 以下を用いて脾臓が除去される、フード（ｈｏｏｄ）を調製する：７０％ Ｅ
ｔＯＨ、篩およびプランジャーを備える滅菌装置、１０ｍｌのＤＭＥＭ ０％を
含有する２つのペトリ皿、ならびに１５ｍｌの遠心分離チューブ（２）。
【０５４１】 マウスを屠殺し、次いでその脾臓を、その死体から採取する。この脾臓を、Ｄ
ＭＥＭ ０％を含有するペトリ皿に置く。１０ｍｌのＤＭＥＭ ０％を含有する
他の皿に篩を置き、そしてプレートの蓋で覆う。この脾臓を、フォアセップ（ｆ
ｏｒｅｓｅｐｓ）の滅菌対を使用し、および針つきシリンジを使用して、この篩
に移し、この脾臓を離して、その結果、細胞を、培地中に溢れ出させる。次いで
、他のプランジャーを使用して、篩を通してこの脾臓を穏やかに潰す。これは激
しい線維芽細胞増殖を生じる場合、篩を通る脾臓器官組織の粉砕を回避する。
【０５４２】 この篩を除去し、そして脾臓細胞懸濁物を１５ｍｌの遠心分離チューブに移す
。５ｍｌのＤＭＥＭ ０％を用いて残りの細胞を皿から洗浄し、そしてこのチュ
ーブに添加する。このチューブを５分間静置して、大きな細片を底に沈降させる
。次いで、この細胞懸濁物（小さな細片）を第２の１５ｍｌチューブに移す。こ
の細胞を１０分間２００×Ｇで遠心分離する。ｓ／ｎを吸引し、そしてこの脾臓
細胞を５ｍｌのＤＭＥＭ ０％中に再懸濁する。さらに５ｍｌのＤＭＥＭ ０％
を添加し、そしてその全容量を５０ｍｌチューブに移す。
【０５４３】 １０μｌの脾臓細胞懸濁物を取り出し、そして５００μｌのトリパンブルーに
添加して、リンパ球を計数する（注記：通常、脾臓は、１０8個のリンパ球を一
貫して生じる）。
【０５４４】 （融合） 脾臓細胞を含有する５０ｍｌの遠心分離チューブに、十分なＰ３Ｘ細胞を添加
して、５：１の比のリンパ球対Ｐ３Ｘ細胞を作製する（例えば、１０8個のリン
パ球について、２×１０7個のＰ３Ｘ細胞が必要である）。総容量をＤＭＥＭ
０％を用いて４５〜５０ｍｌまでにし、そして２００×Ｇで１０分間遠心分離す
る。タイマー、温ＰＥＧ、温Ｐ３Ｘ細胞、および約３８〜４０℃の水のビーカー
を有する移動フードを調製する。全ての上清をＰ３Ｘ−リンパ球ペレットから吸
引し、そしてこのチューブを軽くはじく（ｆｌｉｃｋ）ことによってペレットを
緩めることを試みる。そのチューブを小さな水浴中に置く。その融合チューブを
温水中に保持し、そして穏やかに振盪しながら、１ｍｌのＰＥＧを１分にわたっ
て滴下する。次いで、１〜２分間時々振盪させながら静置し、その後、１ｍｌの
Ｐ３Ｘ培地を、１分にわたって滴下する。次に、３ｍｌのＰ３Ｘ培地を１分にわ
たって滴下し、続いて、１０ｍｌのＰ３Ｘ培地を１分にわたって滴下する。
【０５４５】 Ｐ３Ｘ培地を穏やかに添加して、総容量４５ｍｌにする。このチューブを１０
分間静置させ、次いで、２００×Ｇで１０分間遠心分離する。その上清を吸引し
、そして５ｍｌ以下のＨＡＴ培地中でそのペレットを穏やかに再懸濁する。その
細胞懸濁物を４００ｍｌのＨＡＴ培地を含有する瓶に移し、そして旋回して混合
する。いくらかの細胞懸濁物を滅菌リザーバーに注ぐ。
【０５４６】 濾過チップを有する１２チャネルピペッターを使用して、９６ウェルプレート
中に２００μｌ／ウェルで細胞を置く（ｐｌａｎｔ）。プレートをインキュベー
ターの中に置く。プレートを毎日、ハイブリドーマ増殖または夾雑についてモニ
ターする。プレートを３日間インキュベートさせる。第１の補給（培地の交換）
を、約７日に、８つの位置を有する（８−ｐｏｓｉｔｉｏｎ）マニホルドを使用
して、各ウェルにおいて約半分の培地を吸引することによって行い、そしてその
培地を１００〜１５０μｌ／ウェルのＨＴ培地で置換する。補給の１週間ほど前
に、第１のスクリーニングは、融合していないリンパ球細胞によって産生される
任意の抗体を希釈することを助け、この細胞は、培養の２週間後に抗体を産生し
続けることが見出された。ほとんどまたは全てのウェルは、コロニーがウェルの
半分よりも多く満たされ、そしてその上清が、橙色／黄色に色を変化する場合に
、融合の２週間後以内のスクリーニングのためのサンプリングの用意ができてい
る。
【０５４７】 （実施例１３：マウスハイブリドーマのＥＬＩＳＡスクリーニング） マウスハイブリドーマをスクリーニングするために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｉ
ｍｍｕｌｏｎ ２「Ｕ」底マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈカタロ
グ番号０１１−０１０−３５５５））を、２μｇ／ｍｌ ＰＢＳで５０μｌ／ウ
ェルの抗原を用いてコートする。このＥＬＩＳＡプレートを、プラスチックシー
ルで覆い、そして４℃にて一晩インキュベートする。インキュベーション後、こ
のプレートを、１回の洗浄あたり２００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて４回洗浄
する。３％ ＢＳＡ（２００μｌ／ウェル）を用いて６０分間室温にてブロック
する。ブロッキング溶液をふるい落とす。
【０５４８】 ハイブリドーマ上清（１５０μｌ／ウェル）を、Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ウェル
アッセイプレートに添加し、次いで、５０μｌの各上清を、このＣｏｒｎｉｎｇ
アッセイプレートからＥＬＩＳＡプレートに移す。培養培地ならびに陽性マウス
血清コントロールおよび陰性マウス血清コントロールのブランクを含む。室温に
て１〜２時間、または一晩４℃にてインキュベートする。ＰＢＳＴ（０．０５％
ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ）を用いて、２５０μｌ／ウェルで４回洗浄する
。
【０５４９】 ０．１〜０．３％ ＢＳＡおよび１％ウマ血清を含有するＰＢＳＴ中に、５０
μｌ／ウェルのビオチン化抗マウスＩｇＧ Ｈ＋Ｌを、０．５μｇ／ｍｌの濃度
で添加する。室温にて３０〜６０分インキュベートする。プレートを、ＰＢＳＴ
を用いて４回洗浄する。
【０５５０】 ５０μｌ／ウェルのＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒカタログ番号ＰＫ−６１００）
をこのプレートに添加し、そして室温にて３０分間インキュベートする。プレー
トを、ＰＢＳＴを用いて６回洗浄する。
【０５５１】 ５ｍｌのｄｄＨ2Ｏ中に１テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド（ＴＭＢ
）タブレット（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ−３４０５）を溶解することによって
、ＥＬＩＳＡ検出のための基質を調製する。５ｍｌの０．１Ｍリン酸クエン酸緩
衝液（２５．７ｍｌの０．２Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム、２４．３ｍｌの０．
１Ｍクエン酸一水和物（ｐＨ５．０））を添加する。２μｌの新鮮な３０％過酸
化水素を添加し、ボルテックスし、そして直ちに使用する。
【０５５２】 このプレートのインキュベーションおよび洗浄後、１００μｌの基質溶液を添
加し、そして室温にて約１５〜３０分間インキュベートする。２５μｌ／ウェル
の２Ｍ Ｈ2ＳＯ4の添加によってその反応を停止させ、そして３０分以内に、コ
ントロールに対してこのプレートを４５０ｎｍで読み取る。
【０５５３】 （実施例１４：培養上清由来のモノクローナルの相対的親和性の試験） （Ａ．抗原コーティング濃度の決定） 約１ｍｌの抗原を、ＰＢＳ中に濃度４μｇ／ｍｌで作製する。マイクロ希釈（
ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）チューブに移す。０．５ｍｌ ＰＢＳを、９個の
マイクロ希釈チューブの各々に置き、次いで、４μｇ／ｍｌのチューブから開始
して、チューブからチューブに０．５ｍｌを移すことによって、１／２の連続希
釈を行った。ここで、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６、
０．０３、０．０１５および０．００７５μｇ／ｍｌを含有するチューブを有す
る。プレートを、上記の濃度を用いて、各６ウェル、５０μｌ／ウェルでコート
する。
【０５５４】 覆い、そして一晩４℃にてインキュベートする。インキュベーション後、この
プレートを、１回の洗浄あたり２００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて、４回洗浄
する。３％ＢＳＡ、２００μｌ／ウェルを用いて室温にて６０分間ブロックする
。ブロッキング溶液を振り落とす。
【０５５５】 マウス血清の滴定曲線をみると、これは、抗原について陽性である。滴定曲線
のちょうど頂点である血清希釈を決定する。陽性マウス血清を、０．１％ ＢＳ
Ａを含有するＰＢＳ中に、５０μｌ／ウェルでこの希釈で添加する（行Ｂ〜Ｄ、
列２〜１１）。陰性コントロール血清を、行Ｅ〜Ｇ、列２〜１１で、上記の希釈
で含む。一晩４℃でインキュベートする。インキュベーション後、陰性コントロ
ール血清の値を、陽性コントロール血清の値から減じる。平均値（Ｏ．Ｄ．４５
０）を、線形目盛で抗原濃度に対してプロットする。準最大Ｏ．Ｄ．を与える抗
原コーティング濃度を決定する。これは、相対的な親和性アッセイのために使用
するためのコーティング濃度である。
【０５５６】 （Ｂ．Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｋ
ｉｔ「Ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ」（カタログ番号１３３３ １５１）を
使用する、ハイブリドーマ上清サンプルのマウスＩｇＧ濃度の決定） コーティング緩衝液濃縮物を、ｄｄＨ2Ｏを用いて、１／１０の濃度に希釈す
る。１０〜２０ｍｌが必要である。捕捉抗体のアリコートを得る。３つのチュー
ブのコーティング後緩衝液濃縮物（Ｐｏｓｔ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）（ブロッキング溶液）を解凍する。標準のためおよび
試験されるべき各上清について４〜６ウェルのために、１２ウェルが必要である
。５０μｌ／ウェルのコーティング容量を仮定する際に必要な、希釈した捕捉抗
体のｍｌ数を計算する。以下の比例式において、捕捉抗体を希釈する：
【０５５７】
【数１】 Ｎｕｎｃプレートを、この溶液を用いてコートし、そして振盪器上で室温にて
３０分間インキュベートする。ｄｄＨ2Ｏ中に、濃縮したコーティング後緩衝液
（Ｐｏｓｔ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）１／１０を希釈する。このプレー
トを、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．９％ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｅｎ
２０）を用いて洗浄し、そして室温にて１５分間、２００μｌ／ウェルのコーテ
ィング後緩衝液（Ｂｌｏｃｋ溶液）を用いてブロックする。
【０５５８】 ＩｇＧ標準を、以下の濃度までコーティング後緩衝液（ブロッキング溶液）中
に希釈する：コーティング後緩衝液中で０．２、０．１、０．０５、０．０２５
、０．０１２５および０．００６２５μｇ／ｍｌ。
【０５５９】 上清を、ブロッキング緩衝液中に希釈して、最終濃度１／１００および１／１
０００を作製する。ブロッキング工程後、このプレートを洗浄し、そして２回連
続で５０μｌ／ウェルの希釈したＩｇＧ標準および希釈した上清を添加する。振
盪器上で３０分間室温にてインキュベートする。
【０５６０】 結合体溶液を、以下の比例式に従って、コーティング後緩衝液（ブロック溶液
）中に希釈する：
【０５６１】
【数２】 このプレートを洗浄し、そして５０μｌ／ウェルの結合体を添加する。このプ
レートを、振盪器上で３０分間室温にてインキュベートする。
【０５６２】 １つの基質タブレットを、５ｍｌの基質緩衝液中に溶解する。このプレートを
洗浄し、そして５０μｌ／ウェルの基質を添加する。振盪器上で３０分間室温に
てインキュベートし、そして４０５ｎｍで読み取る。
【０５６３】 （Ｃ．相対的親和性アッセイ） 適切なＥＬＩＳＡプレートを、一晩４℃にて、以前に決定された濃度の抗原を
用いてコートする。プレートを上記のようにブロックする。ＰＢＳ＋０．１％Ｂ
ＳＡ中への試験上清の１／３の連続希釈を、作製する。
【０５６４】 ５０μｌ／ウェルの上清サンプルの希釈物（希釈されていないサンプルを含む
）を、ＥＬＩＳＡプレートに、２回連続または３回連続で添加する。陽性コント
ロールは、抗原コーティング濃度を決定するために使用されたのと同じ濃度で、
数ウェルの陽性コントロールマウス血清からなる。陰性コントロールは、数ウェ
ルの希釈緩衝液からなる。覆い、そして一晩４℃にてインキュベートする。
【０５６５】 平均値に対する各上清のＩｇＧ濃度（Ｏ．Ｄ．４５０）を、４つのパラメータ
ー曲線適合でプロットする。左寄りの上清の曲線は、最も高い親和性を有する上
清である。
【０５６６】 （実施例１５：マウスにおける腹水の産生） ハイブリドーマ細胞は、健常であり、そして腹水の産生について増殖の対数期
にある。細胞を、１５ｍｌチューブに移し、そして計数する。４×１０6個の細
胞を含む容量を決定し、その容量を第２のチューブに移し、そしてこの細胞を遠
心分離する。そのペレットを、０．９ｍｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液
（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ））中に懸濁
し、そしてエッペンドルフチューブに移す。
【０５６７】 １ｃｃのシリンジを、その細胞懸濁物で満たし、そして以下のようにマウスに
ｉｐ注射する：元々の細胞数が４×１０6個であった場合、マウス１匹あたり０
．２ｃｃ、および元々の細胞数が３×１０6個であった場合、マウス１匹あたり
０．３ｃｃ。風船のように、腹が非常に膨張し、そして接触にわずかに慣らされ
た場合（通常、９日目または１０日目であるが、時々１４日目程度に遅い）、こ
れが、「マウスをタップ（ｔａｐ）する」時である。
【０５６８】 （Ａ．タッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）：） マウスを左手に持ち、そしてアルコールパッドを使用して、マウスの左後肢の
真上の腹の領域を拭き取る。開けた１５ｍｌの遠心分離チューブの上にこのマウ
スを保持しながら、１９ゲージ針をその腹に挿入する。腹水は、直ちに針の末端
から遠心分離チューブへ垂れ始めるはずである。平均のマウスは、３〜６ｍｌの
腹水を生じるはずである。
【０５６９】 （Ｂ．腹の処理および保存：） 群（全て同じハイブリドーマを用いて注射される）中の各マウスから収集した
腹水をプールし、そして室温にて１〜２時間放置するか、または３７℃で１５〜
３０分間置く。次いで、この腹水を４℃にて一晩置いて、凝固形成させる。凝固
した腹水を１０分間遠心分離する。腹水を５０ｍｌの遠心分離チューブに移し、
そしてこのチューブを−２０℃で保存する。引き続くタップは、この５０ｍｌチ
ューブに添加され得る。全てのマウスが屠殺される場合、プールされた腹水が解
凍され得、再スピンされ得、そして−２０℃〜−７０℃で長時間保存のために小
分けされ得る。腹水は、ＥＬＩＳＡによって滴定されるべきである。
【０５７０】 （実施例１６：マウスハイブリドーマ細胞およびマウス骨髄腫細胞を凍結およ
び解凍するためのプロトコル） （Ａ．凍結） 凍結されるべき細胞は、健常であり、増殖の対数期にあり、そして概算で濃度
５〜８×１０5細胞／ｍｌであるべきである。６ウェルプレートまたはフラスコ
から細胞を再懸濁し、１５ｍｌのチューブに移し、そして計数する。細胞の総数
を計算し、そしてバイアルあたり１〜３×１０-6細胞に分けて、凍結されるべき
バイアルの数を決定する。
【０５７１】 この細胞を、２００〜３００×Ｇで５〜１０分間ペレット化する。上清をこの
ペレットから吸引し、そして十分な冷凍結培地（ＤＭＥＭ中、５０％ ＦＢＳ、
１０％ ＤＭＳＯ；またはＯｒｉｇｅｎ ＤＭＳＯ Ｆｒｅｅｚｅ Ｍｅｄｉｕ
ｍ（ＩＧＥＮ）、Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＩＧ−５０−０７１５）中に再懸濁
して、１ｍｌあたり所望の数の細胞／バイアルを達成する（細胞密度は、５×１
０5〜１×１０7細胞／バイアルの範囲にあるべきである）。直ちに、細胞懸濁物
を、低温バイアル（ｃｒｙｏｂｉａｌ）に、バイアルあたり１ｍｌで移し、そし
て氷上に置く。このバイアルを、制御された速度の冷凍機に移し、そしてこの冷
凍機を−７０℃で一晩置く。２４時間後、このバイアルを、液体窒素タンクに移
すか、または長期間保存のために−１３０℃の冷凍機に移す。
【０５７２】 （Ｂ．解凍） １０ｍｌの冷培地（例えば、Ｐ３Ｘ培地）を１５ｍｌチューブに添加する。冷
凍した細胞の低温バイアルを回収し、そして解凍する準備ができるまでドライア
イス上に保存する。細胞を、３７℃の水浴中で迅速に解凍する。バイアルを解凍
の間保持し、そしてバイアル中にほんの小さい氷塊が残るまで、穏やかに振盪し
続ける。この内容物を、４℃を超えて温めてはならない。アルコールを、低温バ
イアルの外に出す。
【０５７３】 滅菌パスツールピペットを使用して、そして低温バイアルの先端に触れること
なく、このバイアル中の細胞懸濁物を１０ｍｌの冷培地に移す。２００〜３００
×Ｇで５〜１０分間スピンする。その上清を吸引し、そしてそのペレットを、６
ｍＬのＨＴ クローニング培地（上記）中に再懸濁する。６ウェル皿の１つのウ
ェルに移す。２４時間後の生存度を評価する。生存度は、５０％以上であるべき
である。
【０５７４】 （実施例１７：脈管形成タンパク質活性についてのインビトロアッセイ） 以下のアッセイを、脈管形成タンパク質活性、好ましくは、ＶＥＧＦ−２活性
を検出するために設計する。例えば、キメラレセプターは、Ｆｌｔ−４レセプタ
ーの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド（配列番号２７）（Ｇａｌｌａｎ
ｄら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３（２）：４７５−４７８（１９９２）、これは、
その全体において本明細書中で参考として援用される）を、Ｆｌｋ−１の膜貫通
ドメインおよび細胞内ドメインをコードするヌクレオチド（配列番号２８）（Ｄ
ａｖｉｓ−Ｓｍｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ １５（１８）：４９１９−４９２７（
１９９６）、これは、その全体において本明細書中で参考として援用される）へ
融合することによって、生成される。従って、このキメラレセプターは、それぞ
れ、配列番号２８のアミノ酸７６５〜１３５６に融合される配列番号２７のアミ
ノ酸１〜７７５を含む。
【０５７５】 あるいは、このキメラレセプターを、上記に概説されるように設計し得るが、
Ｐａｃｉｆｉｃｉら、ＪＢＣ ２６９（３）：１５７１−１５７４（１９９４）
（これは、その全体において本明細書中で参考として援用される）において議論
されるように、Ｆｌｋ−１レセプターの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの
代わりに、エリトロポイエチンレセプター（ＥＰＯＲ）の膜貫通ドメインおよび
細胞内ドメインを用いる（詳細には、図１を参照のこと）。
【０５７６】 そのキメラレセプターをコードする得られたＤＮＡを、適切な哺乳動物発現ベ
クター、バキュロウイルス発現ベクター、または細菌発現ベクター（例えば、上
記で議論されるような、ｐＣ４、ｐＣＤＮＡ３またはｐＡ２のような）中にクロ
ーニングする。このキメラレセプターの発現のために使用され得る哺乳動物宿主
細胞としては、ＮＩＨ３Ｔ３（上記）、またはｐｒｅ−Ｂ細胞株ＢａＦ３（Ａｃ
ｈｅｎら、ＰＮＡＳ ９５（２）：５４８５５３（１９９８）、これは、その全
体において本明細書中で参考として援用される）が挙げられる。
【０５７７】 活性について試験するために、脈管形成タンパク質を、このキメラレセプター
を発現する細胞株、またはその抽出物と接触させ得る。次いで、このキメラレセ
プターに対する脈管形成タンパク質結合を、このキメラレセプターによって形質
導入される任意の得られたシグナルを測定することによって検出し得る。
【０５７８】 本発明の多くの改変およびバリエーションは上記の教示を考慮して可能であり
、従って、この多くの改変およびバリエーションは添付の特許請求の範囲内であ
り、本発明は、特に記載される以外に実施され得る。
【０５７９】 本明細書中で引用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術論文、研究室マ
ニュアル、本、または他の文書を含む）の開示全体は、本明細書中に参考として
援用される。
【０５８０】 さらに、米国特許出願番号０９／１０７，９９７（１９９８年６月３０日出願
）、およびＰＣＴ出願番号ＵＳ ９９／０５０２１（１９９９年３月１０日出願
）の配列表を含む明細書全体が、それらの全体において本明細書中で参考として
援用される。
【０５８１】
【表３】 （ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０５８２】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５８３】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０５８４】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０５８５】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０５８６】 （ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５８７】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５８８】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０５８９】
【表４】 （ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０５９０】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５９１】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０５９２】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０５９３】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０５９４】 （ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５９５】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５９６】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０５９７】
【表５】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９９） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０５９８】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５９９】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０６００】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０６０１】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０６０２】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９９） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６０３】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６０４】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０６０５】
【表６】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９８） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０６０６】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６０７】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０６０８】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０６０９】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０６１０】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１９８） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６１１】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６１２】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０６１３】
【表７】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４３５） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０６１４】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６１５】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０６１６】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０６１７】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０６１８】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４３５） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６１９】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６２０】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０６２１】
【表８】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２００） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０６２２】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６２３】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０６２４】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０６２５】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０６２６】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２００） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６２７】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６２８】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０６２９】
【表９】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２０１） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０６３０】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６３１】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０６３２】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０６３３】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０６３４】 （ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２０１） （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６３５】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６３６】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａ〜図１Ｅは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド配列（配列番号１）およ
び推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。このポリペプチドは、約４１９個の
アミノ酸残基を含み、その約２３個がリーダー配列を表す。アミノ酸の標準的１
文字略語が使用される。配列決定は、Ｍｏｄｅｌ ３７３ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．）を使用して行われた。配列決定の精度は、９７％より大きいと予想される
。
【図１Ｂ】 図１Ａ〜図１Ｅは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド配列（配列番号１）およ
び推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。このポリペプチドは、約４１９個の
アミノ酸残基を含み、その約２３個がリーダー配列を表す。アミノ酸の標準的１
文字略語が使用される。配列決定は、Ｍｏｄｅｌ ３７３ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．）を使用して行われた。配列決定の精度は、９７％より大きいと予想される
。
【図１Ｃ】 図１Ａ〜図１Ｅは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド配列（配列番号１）およ
び推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。このポリペプチドは、約４１９個の
アミノ酸残基を含み、その約２３個がリーダー配列を表す。アミノ酸の標準的１
文字略語が使用される。配列決定は、Ｍｏｄｅｌ ３７３ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．）を使用して行われた。配列決定の精度は、９７％より大きいと予想される
。
【図１Ｄ】 図１Ａ〜図１Ｅは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド配列（配列番号１）およ
び推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。このポリペプチドは、約４１９個の
アミノ酸残基を含み、その約２３個がリーダー配列を表す。アミノ酸の標準的１
文字略語が使用される。配列決定は、Ｍｏｄｅｌ ３７３ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．）を使用して行われた。配列決定の精度は、９７％より大きいと予想される
。
【図１Ｅ】 図１Ａ〜図１Ｅは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド配列（配列番号１）およ
び推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。このポリペプチドは、約４１９個の
アミノ酸残基を含み、その約２３個がリーダー配列を表す。アミノ酸の標準的１
文字略語が使用される。配列決定は、Ｍｏｄｅｌ ３７３ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．）を使用して行われた。配列決定の精度は、９７％より大きいと予想される
。
【図２Ａ】 図２Ａ〜図２Ｄは、短縮型の、生物学的に活性な形態のＶＥＧＦ−２のヌクレ
オチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。この
ポリペプチドは、約３５０個のアミノ酸残基を含み、その最初の約２４個のアミ
ノ酸はリーダー配列を表す。
【図２Ｂ】 図２Ａ〜図２Ｄは、短縮型の、生物学的に活性な形態のＶＥＧＦ−２のヌクレ
オチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。この
ポリペプチドは、約３５０個のアミノ酸残基を含み、その最初の約２４個のアミ
ノ酸はリーダー配列を表す。
【図２Ｃ】 図２Ａ〜図２Ｄは、短縮型の、生物学的に活性な形態のＶＥＧＦ−２のヌクレ
オチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。この
ポリペプチドは、約３５０個のアミノ酸残基を含み、その最初の約２４個のアミ
ノ酸はリーダー配列を表す。
【図２Ｄ】 図２Ａ〜図２Ｄは、短縮型の、生物学的に活性な形態のＶＥＧＦ−２のヌクレ
オチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。この
ポリペプチドは、約３５０個のアミノ酸残基を含み、その最初の約２４個のアミ
ノ酸はリーダー配列を表す。
【図３Ａ】 図３Ａ〜図３Ｂは、ＰＤＧＦａ（配列番号５）、ＰＤＧＦｂ（配列番号６）、
ＶＥＧＦ（配列番号７）、およびＶＥＧＦ−２（配列番号４）の間のアミノ酸配
列の相同性の例示である。囲まれた領域は、保存された配列および８個の保存さ
れたシステイン残基の位置を示す。
【図３Ｂ】 図３Ａ〜図３Ｂは、ＰＤＧＦａ（配列番号５）、ＰＤＧＦｂ（配列番号６）、
ＶＥＧＦ（配列番号７）、およびＶＥＧＦ−２（配列番号４）の間のアミノ酸配
列の相同性の例示である。囲まれた領域は、保存された配列および８個の保存さ
れたシステイン残基の位置を示す。
【図４】 図４は、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦ−２の間の相同
性パーセントを、表形式で示す。
【図５】 図５は、ヒト乳癌細胞株におけるＶＥＧＦ−２ ｍＲＮＡの存在を示す。
【図６】 図６は、ヒト成体組織におけるＶＥＧＦ−２の、ノーザンブロット分析の結果
を示す。
【図７】 図７は、本発明のポリペプチドの、インビトロでの転写、翻訳および電気泳動
の後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。レーン１：14Ｃおよびレインボー
Ｍ．Ｗ．マーカー；レーン２：ＦＧＦコントロール；レーン３：Ｍ１３逆方向プ
ライマーおよびＭ１３正方向プライマーから産生されたＶＥＧＦ−２；レーン４
：Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦ−Ｆ４プライマーから産生されたＶＥ
ＧＦ−２；レーン５：Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦ−Ｆ５プライマー
から産生されたＶＥＧＦ−２。
【図８Ａ】 図８Ａおよび図８Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ＶＥＧＦ−２ポ
リペプチドは、Ｓｆ９細胞からなるバキュロウイルス系で発現された。培地およ
び細胞の細胞質由来のタンパク質を、非還元（図８Ａ）条件下および還元（図８
Ｂ）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【図８Ｂ】 図８Ａおよび図８Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ＶＥＧＦ−２ポ
リペプチドは、Ｓｆ９細胞からなるバキュロウイルス系で発現された。培地およ
び細胞の細胞質由来のタンパク質を、非還元（図８Ａ）条件下および還元（図８
Ｂ）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【図９】 図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。本発明の核酸配列で感染させた
Ｓｆ９細胞由来の培地を、沈殿させた。再懸濁した沈殿物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分析し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【図１０】 図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ＶＥＧＦ−２を、培地上清か
ら精製し、そして還元剤ｂ−メルカプトエタノールの存在下または非存在下での
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色
した。
【図１１】 図１１は、ＲＰ−３００カラム（０．２１×３ｃｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用した、精製ＶＥＧＦ−２の逆相ＨＰＬＣ分析
を示す。このカラムを、０．１％トリフルオロ酢酸（溶媒Ａ）で平衡化し、そし
てこのタンパク質を、０〜６０％の溶媒Ｂ（０．０７％のＴＦＡを含むアセトニ
トリルからなる）の７．５分間の勾配で溶出した。タンパク質溶出液を、２１５
ｎｍ（「赤」線）および２８０ｎｍ（「青」線）での吸光度によってモニターし
た。溶媒Ｂのパーセンテージを、「緑」線で示す。
【図１２】 図１２は、ｐＨＥ４−５発現ベクター（配列番号９）およびサブクローニング
されたＶＥＧＦ−２ ｃＤＮＡコード配列の略図を示す。カナマイシン耐性マー
カー遺伝子、ＶＥＧＦ−２コード配列、ｏｒｉＣ配列、およびｌａｃＩｑコード
配列の位置を示す。
【図１３】 図１３は、ｐＨＥプロモーター（配列番号１０）の調節エレメントのヌクレオ
チド配列を示す。２つのｌａｃオペレーター配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎ
ｏ配列（Ｓ／Ｄ）、および末端ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位（斜体）
を示す。
【図１４Ａ】 図１４Ａ〜図１４Ｄは、ＶＥＧＦ−２処理が、ロドプシンタンパク質のレベル
および光レセプター細胞の数を増加させることを示す。解離した網膜細胞をＰ１
動物から調製し、４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレーティングし、そしてＶＥＧ
Ｆ−２（ＡおよびＢ）またはＶＥＧＦ−２（ＣおよびＤ）で処理した。２日（白
四角）、５日（黒四角）、７日（白丸）または９日（黒丸）後、培養物中の細胞
の総数を、カルセイン放出の測定によって評価した。次いで、培養物を固定し、
ロドプシンタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって定量した。
【図１４Ｂ】 図１４Ａ〜図１４Ｄは、ＶＥＧＦ−２処理が、ロドプシンタンパク質のレベル
および光レセプター細胞の数を増加させることを示す。解離した網膜細胞をＰ１
動物から調製し、４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレーティングし、そしてＶＥＧ
Ｆ−２（ＡおよびＢ）またはＶＥＧＦ−２（ＣおよびＤ）で処理した。２日（白
四角）、５日（黒四角）、７日（白丸）または９日（黒丸）後、培養物中の細胞
の総数を、カルセイン放出の測定によって評価した。次いで、培養物を固定し、
ロドプシンタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって定量した。
【図１４Ｃ】 図１４Ａ〜図１４Ｄは、ＶＥＧＦ−２処理が、ロドプシンタンパク質のレベル
および光レセプター細胞の数を増加させることを示す。解離した網膜細胞をＰ１
動物から調製し、４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレーティングし、そしてＶＥＧ
Ｆ−２（ＡおよびＢ）またはＶＥＧＦ−２（ＣおよびＤ）で処理した。２日（白
四角）、５日（黒四角）、７日（白丸）または９日（黒丸）後、培養物中の細胞
の総数を、カルセイン放出の測定によって評価した。次いで、培養物を固定し、
ロドプシンタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって定量した。
【図１４Ｄ】 図１４Ａ〜図１４Ｄは、ＶＥＧＦ−２処理が、ロドプシンタンパク質のレベル
および光レセプター細胞の数を増加させることを示す。解離した網膜細胞をＰ１
動物から調製し、４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレーティングし、そしてＶＥＧ
Ｆ−２（ＡおよびＢ）またはＶＥＧＦ−２（ＣおよびＤ）で処理した。２日（白
四角）、５日（黒四角）、７日（白丸）または９日（黒丸）後、培養物中の細胞
の総数を、カルセイン放出の測定によって評価した。次いで、培養物を固定し、
ロドプシンタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって定量した。
【図１５】 図１５は、ロドプシン免疫陽性細胞の数が、ＶＥＧＦ−２濃度の関数として増
加したことを示す。網膜細胞を、ＶＥＧＦ−１またはＶＥＧＦ−２のいずれかの
存在下で、インビトロで８時間保持した。次いで、培養物を固定し、そして免疫
組織化学的にロドプシンについて染色した。
【図１６Ａ】 図１６Ａ〜図１６Ｃは、ＶＥＧＦ−２が、網膜培養物中のＢｒｄＵおよび［３
Ｈ］チミジン取り込みを、発達的に制限された様式で増加させることを示す。こ
の細胞をＰ１動物から単離し、そして４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレーティン
グした。この培養物を、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−２のいずれかと共にプレーテ
ィングした後、最初に４時間処理した。１日、２日、または３日後に、培養物を
ＢｒｄＵで４時間標識した。次いで、細胞を固定し、ＢｒｄＵ免疫組織化学につ
いて処理した。
【図１６Ｂ】 図１６Ａ〜図１６Ｃは、ＶＥＧＦ−２が、網膜培養物中のＢｒｄＵおよび［３
Ｈ］チミジン取り込みを、発達的に制限された様式で増加させることを示す。こ
の細胞をＰ１動物から単離し、そして４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレーティン
グした。この培養物を、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−２のいずれかと共にプレーテ
ィングした後、最初に４時間処理した。１日、２日、または３日後に、培養物を
ＢｒｄＵで４時間標識した。次いで、細胞を固定し、ＢｒｄＵ免疫組織化学につ
いて処理した。
【図１６Ｃ】 図１６Ａ〜図１６Ｃは、ＶＥＧＦ−２が、網膜培養物中のＢｒｄＵおよび［３
Ｈ］チミジン取り込みを、発達的に制限された様式で増加させることを示す。こ
の細胞をＰ１動物から単離し、そして４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレーティン
グした。この培養物を、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−２のいずれかと共にプレーテ
ィングした後、最初に４時間処理した。１日、２日、または３日後に、培養物を
ＢｒｄＵで４時間標識した。次いで、細胞を固定し、ＢｒｄＵ免疫組織化学につ
いて処理した。
【図１７Ａ】 図１７Ａ〜図１７Ｂは、細胞の単離と、因子の最初の添加との間に経過した時
間の関数としてのＶＥＧＦ−２またはＶＥＧＦ−１に対する応答の減少を示す。
１セットの培養物を、プレーティングの４時間後に因子で最初に処理し（９／０
）、引き続いてさらなるセットを２４時間後または４８時間後（それぞれ、８／
１または７／２）に処理した。培養９日後、細胞を固定し、そしてロドプシンタ
ンパク質のレベルをＥＬＩＳＡアッセイによって定量した。
【図１７Ｂ】 図１７Ａ〜図１７Ｂは、細胞の単離と、因子の最初の添加との間に経過した時
間の関数としてのＶＥＧＦ−２またはＶＥＧＦ−１に対する応答の減少を示す。
１セットの培養物を、プレーティングの４時間後に因子で最初に処理し（９／０
）、引き続いてさらなるセットを２４時間後または４８時間後（それぞれ、８／
１または７／２）に処理した。培養９日後、細胞を固定し、そしてロドプシンタ
ンパク質のレベルをＥＬＩＳＡアッセイによって定量した。
【図１８Ａ】 図１８Ａ〜図１８Ｃは、ＶＥＧＦが、アマクリン細胞の数を増加させるが、ミ
ュラー細胞の数も内皮細胞の数も増加させないことを示す。網膜細胞を、指示濃
度のＶＥＧＦ−２で８日間処理した。次いで、この細胞を固定し、シンタキシン
（Ａ）について免疫組織化学的に染色し、高親和性ＧＡＢＡ取り込み（Ｂ）また
はＧＦＡＰ（Ｃ）のレベルについて分析した。
【図１８Ｂ】 図１８Ａ〜図１８Ｃは、ＶＥＧＦが、アマクリン細胞の数を増加させるが、ミ
ュラー細胞の数も内皮細胞の数も増加させないことを示す。網膜細胞を、指示濃
度のＶＥＧＦ−２で８日間処理した。次いで、この細胞を固定し、シンタキシン
（Ａ）について免疫組織化学的に染色し、高親和性ＧＡＢＡ取り込み（Ｂ）また
はＧＦＡＰ（Ｃ）のレベルについて分析した。
【図１８Ｃ】 図１８Ａ〜図１８Ｃは、ＶＥＧＦが、アマクリン細胞の数を増加させるが、ミ
ュラー細胞の数も内皮細胞の数も増加させないことを示す。網膜細胞を、指示濃
度のＶＥＧＦ−２で８日間処理した。次いで、この細胞を固定し、シンタキシン
（Ａ）について免疫組織化学的に染色し、高親和性ＧＡＢＡ取り込み（Ｂ）また
はＧＦＡＰ（Ｃ）のレベルについて分析した。
【図１９Ａ】 図１９Ａ〜図１９Ｃは、ＶＥＧＦ−２に対する応答における発達齢の効果を示
す。Ｅ１５（Ａ）、Ｅ２０（Ｂ）、またはＰ１（Ｃ）動物由来の網膜細胞を、２
１２（白四角）、３１８（黒四角）、または４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレー
ティングした。プレーティングの４時間後、培養物を、指示濃度のＶＥＧＦ−２
で処理した。２４時間後、培養物を、無血清の培地に移し、そして因子を再び添
加した。次いで、４８時間後に、培養物を［３Ｈ］チミジンで標識した。
【図１９Ｂ】 図１９Ａ〜図１９Ｃは、ＶＥＧＦ−２に対する応答における発達齢の効果を示
す。Ｅ１５（Ａ）、Ｅ２０（Ｂ）、またはＰ１（Ｃ）動物由来の網膜細胞を、２
１２（白四角）、３１８（黒四角）、または４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレー
ティングした。プレーティングの４時間後、培養物を、指示濃度のＶＥＧＦ−２
で処理した。２４時間後、培養物を、無血清の培地に移し、そして因子を再び添
加した。次いで、４８時間後に、培養物を［３Ｈ］チミジンで標識した。
【図１９Ｃ】 図１９Ａ〜図１９Ｃは、ＶＥＧＦ−２に対する応答における発達齢の効果を示
す。Ｅ１５（Ａ）、Ｅ２０（Ｂ）、またはＰ１（Ｃ）動物由来の網膜細胞を、２
１２（白四角）、３１８（黒四角）、または４２５細胞／ｍｍ2の密度でプレー
ティングした。プレーティングの４時間後、培養物を、指示濃度のＶＥＧＦ−２
で処理した。２４時間後、培養物を、無血清の培地に移し、そして因子を再び添
加した。次いで、４８時間後に、培養物を［３Ｈ］チミジンで標識した。
【図２０Ａ】 図２０Ａ〜図２０Ｂは、網膜細胞の、ＶＥＧＦ−２および他の因子に対する応
答を比較する。培養物を、４２５細胞／ｍｍ2の密度で播種し、そして９日間処
理した。パネルＡは、カルセインを使用して評価された培養物中の細胞の総数を
示し、パネルＢは、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定されたロドプシンタンパク
質のレベルを示す。
【図２０Ｂ】 図２０Ａ〜図２０Ｂは、網膜細胞の、ＶＥＧＦ−２および他の因子に対する応
答を比較する。培養物を、４２５細胞／ｍｍ2の密度で播種し、そして９日間処
理した。パネルＡは、カルセインを使用して評価された培養物中の細胞の総数を
示し、パネルＢは、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定されたロドプシンタンパク
質のレベルを示す。
【図２１Ａ】 図２１Ａ〜図２１Ｃは、ＣＮＴＦが、光レセプター細胞前駆体のＶＥＧＦ−２
に対する応答を阻害することを示す。プレーティングの２４時間後に、１５０ｎ
ｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−２の存在下または非存在下での指示濃度のＣＮＴＦで、網
膜の培養物を処理した。インビトロで８日後、ロドプシンタンパク質の量を定量
し（Ａ）、そして培養物中の細胞の総数を決定した（Ｂ）。（Ｃ）ＶＥＧＦ−１
によって誘導される初期増殖性応答に対するＣＮＴＦ処理の効果を決定するため
に、１００ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦの存在下または非存在下での指示濃度のＶＥＧ
Ｆ−２で、培養物を処理した。４８時間後、培養物を［３Ｈ］チミジンで４時間
標識した。
【図２１Ｂ】 図２１Ａ〜図２１Ｃは、ＣＮＴＦが、光レセプター細胞前駆体のＶＥＧＦ−２
に対する応答を阻害することを示す。プレーティングの２４時間後に、１５０ｎ
ｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−２の存在下または非存在下での指示濃度のＣＮＴＦで、網
膜の培養物を処理した。インビトロで８日後、ロドプシンタンパク質の量を定量
し（Ａ）、そして培養物中の細胞の総数を決定した（Ｂ）。（Ｃ）ＶＥＧＦ−１
によって誘導される初期増殖性応答に対するＣＮＴＦ処理の効果を決定するため
に、１００ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦの存在下または非存在下での指示濃度のＶＥＧ
Ｆ−２で、培養物を処理した。４８時間後、培養物を［３Ｈ］チミジンで４時間
標識した。
【図２１Ｃ】 図２１Ａ〜図２１Ｃは、ＣＮＴＦが、光レセプター細胞前駆体のＶＥＧＦ−２
に対する応答を阻害することを示す。プレーティングの２４時間後に、１５０ｎ
ｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−２の存在下または非存在下での指示濃度のＣＮＴＦで、網
膜の培養物を処理した。インビトロで８日後、ロドプシンタンパク質の量を定量
し（Ａ）、そして培養物中の細胞の総数を決定した（Ｂ）。（Ｃ）ＶＥＧＦ−１
によって誘導される初期増殖性応答に対するＣＮＴＦ処理の効果を決定するため
に、１００ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦの存在下または非存在下での指示濃度のＶＥＧ
Ｆ−２で、培養物を処理した。４８時間後、培養物を［３Ｈ］チミジンで４時間
標識した。
【図２２】 図２２は、ＶＥＧＦ−２および抗体処理に応答して増大したＬＥＣ増殖を示す
。
【図２３】 図２３は、ＶＥＧＦ−２およびＶＥＧＦ−２：抗体の組み合わせに応答したＬ
ＥＣ増殖を示す。
【図２４】 図２４は、マウス抗ＶＥＧＦ−２モノクローナル抗体についてのエピトープマ
ップを示す。
【図２５】 図２５は、マウスＶＥＧＦ−２モノクローナル抗体の状態を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年９月１２日（２００１．９．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】 例えば、ＶＥＧＦ−２のアミノ酸レベルでの部位指向性変化は、特定のアミノ
酸を保存的アミノ酸へ置換することによって作製され得る。好ましい保存的変異
は、以下を含む：図１のＭ１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した
；Ｈ２を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｓ３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｌ４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ５を
、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ６を、Ｗ、またはＹに置換
した；Ｆ７を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｓ８をＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、また
はＶに置換した；Ｖ９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ａ１
０を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ１２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ１３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｌ１４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ１
５を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ１６を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ１７を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｌ１８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ１
９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ２１を、Ａ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ２３を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｅ２４
を、Ｄに置換した；Ａ２５を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ａ２７を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ２８を、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ２９を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶに置換した；Ａ３０を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ａ３１を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ３２を、Ｗ、また
はＹに置換した；Ｅ３３を、Ｄに置換した；Ｓ３４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ
、またはＶに置換した；Ｇ３５を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｌ３６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ３７を、Ｅに
置換した；Ｌ３８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ３９を
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ４０を、Ｅに置換した；Ａ
４１を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ４２を、Ｄに置換し
た；Ｄ４４を、Ｅに置換した；Ａ４５を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｇ４６を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ４７を
、Ｄに置換した；Ａ４８を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｔ
４９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ５０を、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｙ５１を、Ｆ、またはＷに置換した；Ａ５
２を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ５３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ５４を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｄ５５
を、Ｅに置換した；Ｌ５６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ｅ５７を、Ｄに置換した；Ｅ５８を、Ｄに置換した；Ｑ５９を、Ｎに置換した；
Ｌ６０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ６１を、Ｈ、また
はＫに置換した；Ｓ６２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｖ
６３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｓ６４を、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ６５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、また
はＶに置換した；Ｖ６６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｄ
６７を、Ｅに置換した；Ｅ６８を、Ｄに置換した；Ｌ６９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｍ７０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに
置換した；Ｔ７１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｖ７２を
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｌ７３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｙ７４を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｅ７６を、
Ｄに置換した；Ｙ７７を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｗ７８を、Ｆ、またはＹに
置換した；Ｋ７９を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｍ８０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、またはＶに置換した；Ｙ８１を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｋ８２を、Ｈ
、またはＲに置換した；Ｑ８４を、Ｎに置換した；Ｌ８５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ８６を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｋ８７を、
Ｈ、またはＲに置換した；Ｇ８８を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換
した；Ｇ８９を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｗ９０を、Ｆ
、またはＹに置換した；Ｑ９１を、Ｎに置換した；Ｈ９２を、Ｋ、またはＲに置
換した；Ｎ９３を、Ｑに置換した；Ｒ９４を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｅ９５
を、Ｄに置換した；Ｑ９６を、Ｎに置換した；Ａ９７を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ９８を、Ｑに置換した；Ｌ９９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ１００を、Ｑに置換した；Ｓ１０１を、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ１０２を、Ｈ、またはＫに置換し
た；Ｔ１０３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ１０４を、
Ｄに置換した；Ｅ１０５を、Ｄに置換した；Ｔ１０６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｍ、またはＶに置換した；Ｉ１０７を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｋ１０８を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｆ１０９を、Ｗ、またはＹに置
換した；Ａ１１０を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ１１１
を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ１１２を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｈ１１３を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｙ１
１４を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｎ１１５を、Ｑに置換した；Ｔ１１６を、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ１１７を、Ｄに置換した；Ｉ１
１８を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ１１９を、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ１２０を、Ｈ、またはＲに置換した；
Ｓ１２１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｉ１２２を、Ａ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ１２３を、Ｅに置換した；Ｎ１２
４を、Ｑに置換した；Ｅ１２５を、Ｄに置換した；Ｗ１２６を、Ｆ、またはＹに
置換した；Ｒ１２７を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｋ１２８を、Ｈ、またはＲに
置換した；Ｔ１２９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ１３
０を、Ｎに置換した；Ｍ１３２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換し
た；Ｒ１３４を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｅ１３５を、Ｄに置換した；Ｖ１３
６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｉ１３８を、Ａ、Ｇ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ１３９を、Ｅに置換した；Ｖ１４０を、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｇ１４１を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ１４２を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｅ１４３
を、Ｄに置換した；Ｆ１４４を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｇ１４５を、Ａ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｖ１４６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、またはＭに置換した；Ａ１４７を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換
した；Ｔ１４８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ１４９を
、Ｑに置換した；Ｔ１５０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ｆ１５１を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｆ１５２を、Ｗ、またはＹに置換した；
Ｋ１５３を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｖ１５７を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
またはＭに置換した；Ｓ１５８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｖ１５９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｙ１６０を、
Ｆ、またはＷに置換した；Ｒ１６１を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｇ１６３を、
Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ１６４を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ１６７を、Ｑに置換した；Ｓ１６８を、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ１６９を、Ｄに置換した；Ｇ１７０
を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ１７１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ１７２を、Ｎに置換した；Ｍ１７４を、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した；Ｎ１７５を、Ｑに置換した；Ｔ１
７６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ１７７を、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｔ１７８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、
またはＶに置換した；Ｓ１７９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｙ１８０を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｌ１８１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ１８２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｋ１８３を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｔ１８４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ１８５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
に置換した；Ｆ１８６を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｅ１８７を、Ｄに置換した
；Ｉ１８８を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｔ１８９を、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｖ１９０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、またはＭに置換した；Ｌ１９２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｓ１９３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ１９
４を、Ｎに置換した；Ｇ１９５を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｋ１９７を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｖ１９９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭに置換した；Ｔ２００を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｉ２０１を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ２０２
を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ２０３を、Ｗ、またはＹ
に置換した；Ａ２０４を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ２
０５を、Ｑに置換した；Ｈ２０６を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｔ２０７を、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ２０８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ
、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ２１０を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｍ２１２を
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した；Ｓ２１３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ２１４を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｌ２１
５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ２１６を、Ｅに置換し
た；Ｖ２１７を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｙ２１８を、
Ｆ、またはＷに置換した；Ｒ２１９を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｑ２２０を、
Ｎに置換した；Ｖ２２１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｈ
２２２を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｓ２２３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶに置換した；Ｉ２２４を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した
；Ｉ２２５を、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ２２６を、Ｈ
、またはＫに置換した；Ｒ２２７を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｓ２２８を、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ２２９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ２３１を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｔ２３２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ２３
３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ２３５を、Ｎに置換し
た；Ｑ２３７を、Ｎに置換した；Ａ２３８を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ａ２３９を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ
２４０を、Ｑに置換した；Ｋ２４１を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｔ２４２を、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｔ２４５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ２４６を、Ｑに置換した；Ｙ２４７を、Ｆ、ま
たはＷに置換した；Ｍ２４８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した
；Ｗ２４９を、Ｆ、またはＹに置換した；Ｎ２５０を、Ｑに置換した；Ｎ２５１
を、Ｑに置換した；Ｈ２５２を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｉ２５３を、Ａ、Ｇ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｒ２５５を、Ｈ、またはＫに置換した
；Ｌ２５７を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ２５８を、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ２５９を、Ｎに置換した；Ｅ２
６０を、Ｄに置換した；Ｄ２６１を、Ｅに置換した；Ｆ２６２を、Ｗ、またはＹ
に置換した；Ｍ２６３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した；Ｆ２
６４を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｓ２６５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、また
はＶに置換した；Ｓ２６６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；
Ｄ２６７を、Ｅに置換した；Ａ２６８を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｇ２６９を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｄ２７
０を、Ｅに置換した；Ｄ２７１を、Ｅに置換した；Ｓ２７２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｔ２７３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、または
Ｖに置換した；Ｄ２７４を、Ｅに置換した；Ｇ２７５を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ２７６を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｈ２７７を、
Ｋ、またはＲに置換した；Ｄ２７８を、Ｅに置換した；Ｉ２７９を、Ａ、Ｇ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ２８１を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶに置換した；Ｎ２８３を、Ｑに置換した；Ｋ２８４を、Ｈ、またはＲに置
換した；Ｅ２８５を、Ｄに置換した；Ｌ２８６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶに置換した；Ｄ２８７を、Ｅに置換した；Ｅ２８８を、Ｄに置換した；Ｅ
２８９を、Ｄに置換した；Ｔ２９０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｑ２９２を、Ｎに置換した；Ｖ２９４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ま
たはＭに置換した；Ｒ２９６を、Ｈ、またはＫに置換した；Ａ２９７を、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｇ２９８を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶに置換した；Ｌ２９９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換
した；Ｒ３００を、Ｈ、またはＫに置換した；Ａ３０２を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶに置換した；Ｓ３０３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｇ３０５を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｈ３０
７を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｋ３０８を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｅ３０
９を、Ｄに置換した；Ｌ３１０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｄ３１１を、Ｅに置換した；Ｒ３１２を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｎ３１
３を、Ｑに置換した；Ｓ３１４を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｑ３１６を、Ｎに置換した；Ｖ３１８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、または
Ｍに置換した；Ｋ３２０を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｎ３２１を、Ｑに置換し
た；Ｋ３２２を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｌ３２３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ３２４を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｓ３２６を、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ３２７を、Ｎに置換した；Ｇ
３２９を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ａ３３０を、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｎ３３１を、Ｑに置換した；Ｒ３３２
を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｅ３３３を、Ｄに置換した；Ｆ３３４を、Ｗ、ま
たはＹに置換した；Ｄ３３５を、Ｅに置換した；Ｅ３３６を、Ｄに置換した；Ｎ
３３７を、Ｑに置換した；Ｔ３３８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｑ３４０を、Ｎに置換した；Ｖ３４２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ま
たはＭに置換した；Ｋ３４４を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｒ３４５を、Ｈ、ま
たはＫに置換した；Ｔ３４６を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した
；Ｒ３４９を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｎ３５０を、Ｑに置換した；Ｑ３５１
を、Ｎに置換した；Ｌ３５３を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した
；Ｎ３５４を、Ｑに置換した；Ｇ３５６を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
に置換した；Ｋ３５７を、Ｈ、またはＲに置換した；Ａ３５９を、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ３６１を、Ｄに置換した；Ｔ３６３を、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ３６４を、Ｄに置換した；Ｓ３
６５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｑ３６７を、Ｎに置換
した；Ｋ３６８を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｌ３７０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶに置換した；Ｌ３７１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに
置換した；Ｋ３７２を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｇ３７３を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｋ３７４を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｋ３７
５を、Ｈ、またはＲに置換した；Ｆ３７６を、Ｗ、またはＹに置換した；Ｈ３７
７を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｈ３７８を、Ｋ、またはＲに置換した；Ｑ３７
９を、Ｎに置換した；Ｔ３８０を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置換し
た；Ｓ３８２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｙ３８４を、
Ｆ、またはＷに置換した；Ｒ３８５を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｒ３８６を、
Ｈ、またはＫに置換した；Ｔ３８９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶに置
換した；Ｎ３９０を、Ｑに置換した；Ｒ３９１を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｑ
３９２を、Ｎに置換した；Ｋ３９３を、Ｈ、またはＲに置換した；Ａ３９４を、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｅ３９６を、Ｄに置換した；Ｇ
３９８を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｆ３９９を、Ｗ、ま
たはＹに置換した；Ｓ４００を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した
；Ｙ４０１を、Ｆ、またはＷに置換した；Ｓ４０２を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ
、またはＶに置換した；Ｅ４０３を、Ｄに置換した；Ｅ４０４を、Ｄに置換した
；Ｖ４０５を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換した；Ｒ４０７を、Ｈ
、またはＫに置換した；Ｖ４０９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭに置換
した；Ｓ４１１を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した；Ｙ４１２を
、Ｆ、またはＷに置換した；Ｗ４１３を、Ｆ、またはＹに置換した；Ｑ４１４を
、Ｎに置換した；Ｒ４１５を、Ｈ、またはＫに置換した；Ｑ４１７を、Ｎに置換
した；Ｍ４１８を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶに置換した；および／ま
たはＳ４１９を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶに置換した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】 例えば、好ましいＶＥＧＦ−２の非保存的な置換としては、以下が挙げられる
：図１の、Ｍ１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｈ２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ７（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｓ８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｖ９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ａ１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｃ１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｓ１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１３（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１５（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１
６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ａ１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｌ１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｌ１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｐ２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｇ２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ２２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換さ
れる）；Ｒ２３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ２４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２５（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ２６（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＣで置換される）；Ａ２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ３
３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｓ３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ３５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ３７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ３８（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｄ４０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ４２（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ４３（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、また
はＣで置換される）；Ｄ４４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ４５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ４７（Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ａ４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｔ４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ａ５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｙ５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ５３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ５４（Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｄ５５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ５７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ５
８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｑ５９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ６１（Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｓ６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｖ６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｓ６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｓ６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｖ６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ６７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ６８（Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｌ６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｍ７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｔ７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｖ７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ７５（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ
で置換される）；Ｅ７６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ７７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ７
８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｋ７９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｋ８２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｃ８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ８４（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｌ８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｒ８６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ８７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ８８（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ８
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｗ９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｑ９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ９２（Ｄ、Ｅ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｎ９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ９４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ９５（Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｑ９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ９７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｌ９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｎ１００（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１０２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１０
３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｅ１０４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１０５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１０６（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ１０
７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｋ１０８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｆ１０９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１１１（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１１２
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ
１１３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｙ１１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ１１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｔ１１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｅ１１７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ１１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１２０（Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｓ１２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｉ１２２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｄ１２３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ１２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｅ１２５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ１２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１２
７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｋ１２８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ１３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｃ１３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｍ１３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ１３３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置
換される）；Ｒ１３４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１３５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１
３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｃ１３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｉ１３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ１３９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｖ１４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｇ１４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｋ１４２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１４３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ１
４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｇ１４５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１４７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ１４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｔ１５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｆ１５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ１５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１５３（
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｐ１５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｐ１５５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置
換される）；Ｃ１５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｖ１５７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１５８（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１５９（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ１６０
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｒ１６１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ１６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換され
る）；Ｇ１６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｇ１６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｃ１６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｃ１６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで
置換される）；Ｎ１６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１６９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｇ１７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｌ１７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｑ１７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ１７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置
換される）；Ｍ１７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｎ１７５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１７７（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１７８（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１７
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｙ１８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｌ１８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１８３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１８４
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ
１８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｆ１８６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１８７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ１８８（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１８
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｖ１９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｐ１９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｌ１９２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ１９４（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｇ１９５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｐ１９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｋ１９７（Ｄ、Ｅ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｐ１９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｖ１９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２００（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ２０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２０２（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ２０３（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ａ２０４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｎ２０５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ２０６（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｔ２０７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｓ２０８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｃ２０９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｒ２１０（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｃ２１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｍ２１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２１４（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｌ２１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｄ２１６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ２１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｒ２１９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ２２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２２１（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ２２２
（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｓ２２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｉ２２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ２２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ２２６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ２２７（
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｓ２２８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｌ２２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ２３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ａ２３１（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２
３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｌ２３３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｐ２３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｑ２３５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｃ２３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ２３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２３８
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ
２３９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｎ２４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２４１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２４２（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ２４
３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、またはＰで置換される）；Ｐ２４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｔ２４５（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ２
４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｙ２４７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ２４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ２４９（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｎ２５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ２５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｈ２５２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｉ２５３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ２５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｒ２５
５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｃ２５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｌ２５７（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２５８（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ２５
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｅ２６０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２６１（Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｆ２６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ２６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ２６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ
２６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｓ２６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｄ２６７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ２６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２７０（Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｄ２７１（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２７４（Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｇ２７５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｆ２７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ２７７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２
７８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｉ２７９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ２８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｇ２８
１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｐ２８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｎ２８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２８４
（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｅ２８５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２８６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２８７（Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｅ２８８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ２８９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｔ２９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｃ２９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ２９２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ
２９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｖ２９４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ２９５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；
Ｒ２９６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ａ２９７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ２９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３００（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ
３０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ａ３０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３０４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換され
る）；Ｇ３０５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｐ３０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｈ３０７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｋ３０８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｅ３０９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ３１０（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ３１１（
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｒ３１２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ３１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｓ３１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｃ３１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ３１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｃ３１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｖ３１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される
）；Ｋ３２０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ３２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ３２２（Ｄ
、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｌ３２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｆ３２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ３２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換さ
れる）；Ｓ３２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｑ３２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３２８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換され
る）；Ｇ３２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ａ３３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｎ３３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３３２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｅ３３３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ３３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ３３５（Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｅ３３６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ３３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｔ３３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｃ３３９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ３４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｃ３４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｖ３４２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３４３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される
）；Ｋ３４４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３４５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ３４６（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３４７（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＰで置換される）；Ｐ３４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｒ３４９（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｎ３５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ３５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｐ３５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｌ３５３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ３５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ
３５５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｇ３５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ３５７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３５８
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、またはＰで置換される）；Ａ３５９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｅ３６
１（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｃ３６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｔ３６３（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ３６４
（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｓ３６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ３６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｑ３６７（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｋ３６８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換さ
れる）；Ｌ３７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｌ３７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｋ３７２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ３７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ３７４（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｋ３７５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ３７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ３７７（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｈ３７８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ３７９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ３
８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｃ３８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｓ３８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される
）；Ｙ３８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３８５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３８６（Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｐ３８７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｃ３８８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換され
る）；Ｔ３８９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｎ３９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３９１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ３
９２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｋ３９３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ３９４（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ３９５（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、また
はＰで置換される）；Ｅ３９６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ３９７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置
換される）；Ｇ３９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｆ３９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ４００（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ４０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｓ４０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｅ４０３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ４０４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ
４０５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｃ４０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｒ４０７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ４０８
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、またはＰで置換される）；Ｖ４０９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ４１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｓ４１
１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｙ４１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｗ４１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ４１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｒ４１５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ４１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｑ
４１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ４１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；および／またはＳ４１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】 （アミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失） さらに、ＶＥＧＦ−２は、発現の際にタンパク質分解切断されると思われ、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動する場合、以下のサイズのポリぺプチドフラグメン
トを生じる（サイズはおおよそ）（例えば、図７〜１０を参照のこと）：８０、
５９、４５、４３、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３１、２９、２１、
および１５ｋＤａ。これらのポリぺプチドフラグメントは、タンパク質のＮ末端
部分およびＣ末端部分の両方での、タンパク質分解切断の結果である。これらの
タンパク質分解生成フラグメントは、特に２１ｋＤａのフラグメントが、活性を
有すると思われる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】 さらに、タンパク質操作は、ネイティブＶＥＧＦ−２の１つ以上の特徴を、改
善するかまたは変更するために、使用され得る。カルボキシ末端アミノ酸の欠失
は、タンパク質の活性を増強し得る。１つの例は、インターフェロンγであり、
これは、このタンパク質のカルボキシ末端から１０アミノ酸残基を欠失させるこ
とにより、１０倍までのより高い活性を示す（Ｄｏｅｂｅｌｉら、Ｊ．ｏｆ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。従って、本発
明の１つの局面は、ネイティブＶＥＧＦ−２ポリぺプチドと比較して（例えば、
代表的なｐＨ、熱条件または他の保存条件にさらされた場合に）増強された安定
性を示す、ＶＥＧＦ−２のポリぺプチドアナログおよびこのようなアナログをコ
ードするヌクレオチド配列を提供することである。特に、好ましいＶＥＧＦ−２
ポリぺプチドは、以下に示される（ナンバリングは、このタンパク質における図
１の最初のアミノ酸（Ｍｅｔ）で始まる）：
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
【化１】 好ましい実施形態は、以下の欠失変異体を含む：図１の
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】 構造的または機能的ドメインによって特徴付けられるＶＥＧＦ−２ポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチドフラグメント（例えば、α−へリックスおよびα−へ
リックス形成領域、β−シートおよびβ−シート形成領域、ターンおよびターン
形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性
領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高い
抗原性指標領域を含むフラグメント）もまた、好ましい。保存性ドメインの中に
含まれる配列番号２のポリペプチドフラグメントは、本発明によって特に意図さ
れる（図３参照のこと）。さらに、これらのドメインをコードするポリヌクレオ
チドフラグメントもまた、意図される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８３】 図１２および１３に要約するように、ｐＨＥ４ａベクター（配列番号１０）の
構成要素としては、以下が挙げられる：１）選択マーカーとしてのネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファー
ジプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダル
ガーノ配列、６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）、およ
び７）多重クローニング部位リンカー領域。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＣＵ１
９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）由来である。プロモーター配列
およびオペレーター配列は、合成的に作製された。核酸配列の合成生成物は、当
該分野で周知である（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ９５／９６Ｃａｔａｌｏｇ、２１５−
２１６頁、ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ、１０２０Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌ
ｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ９４３０３）。ｐＨＥ４ａベクターは、ＡＴＣＣ
に１９９８年２月２５日に寄託され、そして受託番号２０９６４５を与えられた
。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４２】
【化６】 を有し、ＸｂａＩ制限部位（太字）、それに続く、終止コドンおよびＶＥＧＦ−
２の３’コード配列に相補的な１７ヌクレオチドを含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４６】
【化８】 を有し、これは、ＸｂａＩ制限部位（太字）、それに続く、終止コドンおよびＶ
ＥＧＦ−２の３’コード配列に相補的な２１ヌクレオチドを含む。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５７】 （７．ｐＣ４ＳｉｇＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築） ポリメラーゼ連鎖反応指向性増幅およびＶＥＧＦ−２ Ｔ１０３−Ｌ２１５（
図１または配列番号２におけるアミノ酸１０３〜２２７）のｐＣ４Ｓｉｇへのサ
ブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望の領域に相補的な２つ
のオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を用いて合成した： ５’プライマー（ＢａｍＨＩおよび２６ヌクレオチドのコード配列）： ５’−ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＣＴ Ａ
ＴＡ ＡＡＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＣ−３’（配列番号３０） ３’プライマー（ＸｂａＩ、ＳＴＯＰおよび２１ヌクレオチドのコード配列）：
５’−ＧＣＡ ＧＣＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＡＣＧ ＴＣＴ ＡＡＴ Ａ
ＡＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＡＡＣ−３’（配列番号３１）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８７ 45/00 9/10 ４Ｈ０４５ 47/48 25/02 １０１ 48/00 27/02 Ａ６１Ｐ 3/10 29/00 9/10 31/12 25/02 １０１ 37/00 27/02 Ａ６１Ｋ 35/12 29/00 Ｃ０７Ｋ 16/18 31/12 Ａ６１Ｋ 37/24 37/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ａ６１Ｋ 35/12 37/66 Ｇ Ｃ０７Ｋ 16/18 37/36 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／１３７，７９６ (32)優先日 平成11年６月３日(1999．6．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７１，５０５ (32)優先日 平成11年12月22日(1999．12．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｓ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ， ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 (72)発明者 アルダーソン， ラルフ アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザースバーグ， オーチャード ビ ュー ロード 12125 (72)発明者 メルダー， ロバート アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザースバーグ， ナンバー 254， ビーコン スクエアー コート 921 (72)発明者 ロシュク， ビクター アメリカ合衆国 メリーランド 20850， ロックビル， ランバーティナ プレイ ス 13844 (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルネイ， ヘリテイジ ヒルズ ドラ イブ 18528 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA44 GA18 HA17 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC09 BA01 CA24 CA25 CA44 4C076 AA94 BB01 BB24 CC01 CC10 CC26 CC29 EE23 FF31 FF36 4C084 AA02 AA07 AA13 AA19 BA02 BA08 BA22 BA44 CA18 CA53 DA12 DA21 DB52 DB53 DB54 MA02 MA05 MA52 MA55 NA14 ZA011 ZA211 ZA331 ZA361 ZB011 ZB111 ZB331 ZC021 ZC351 4C085 AA13 AA14 AA16 CC32 EE01 EE03 EE07 GG08 GG10 4C087 AA02 BB65 MA02 MA05 MA52 MA55 MA58 NA14 ZA01 ZA21 ZA33 ZB01 ZB11 ZB21 ZB33 ZC02 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA30 CA40 DA01 DA76 EA20 FA74

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 光受容体の損傷または変性を処置するための方法であって、
    該方法は、そのような光受容体の損傷または変性を罹患する被験体に治療的有効
    量の血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）を投与する工程を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記光受容体の前記
    損傷または変性が、網膜色素線条、網膜色素変性症、キーンズ症候群、色素模様
    ジストロフィー、網膜穿孔、網膜炎、脈絡網膜炎、サイトメガロウイルス網膜炎
    、急性網膜壊死症候群、中心肺胞脈絡膜ジストロフィー、優性結晶腔、遺伝性出
    血黄斑変性、ノースカロライナ黄斑変性、中心周囲脈絡膜ジストロフィー、成人
    小窩斑ジストロフィー（ａｄｕｌｔ ｆｏｖｅｏｍａｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏ
    ｐｈｙ）、良性同心性輪状黄斑変性、中心輪光色素上皮ジストロフィー、先天性
    黄斑部欠損症、優性遺伝性類嚢胞黄斑水腫、家族性中心窩網膜分離、有窓性シー
    ン（ｓｈｅｅｎ）黄斑変性、進行性中心窩ジストロフィー、遅進行性黄斑変性、
    ソーズビー偽炎症性ジストロフィー、円錐体−桿状体（ｃｏｎｅ−ｒｏｄ）ジス
    トロフィー、進行性錐体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、ゴールドマン
    ファーブル症候群、バルデー−ビードル症候群、バッセン−コルンツヴァイク症
    候群（無β−リポ蛋白血症）、ベスト病（卵黄様ジストロフィー）、先天性脈絡
    膜欠如（ｃｈｏｒｏｉｄｅｍｉａ）、脳回転状萎縮（ｇｙｒａｔｅ ａｔｒｏｐ
    ｈｙ）、先天性黒内障、レフスム症候群、シュタルガルト病、アッシャー症候群
    、年齢関連黄斑変性、糖尿病性網膜症、末梢性硝子体網膜症、光性網膜症、手術
    誘導網膜症、ウイルス性網膜症、虚血性網膜症、網膜剥離または外傷性網膜症に
    関連する、方法。
  3. 【請求項３】 前記ＶＥＧＦ−２が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、
    またはその改変体もしくは誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記ＶＥＧＦ−２が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を
    有する、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ＶＥＧＦ−２が、水溶性ポリマーに付着しているＶＥＧ
    Ｆ−２を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請
    求項６に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記ＶＥＧＦ−２が、短縮されたＶＥＧＦ−２を含む、請求
    項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ＶＥＧＦ−２が、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重と約５０
    ｍｇ／ｋｇ体重との間の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ＶＥＧＦ−２が、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重と約５ｍｇ
    ／ｋｇ体重との間の用量で投与される、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ＶＥＧＦ−２が、徐放性薬学的組成物として投与され
    る、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ＶＥＧＦ−２が、局所的薬学的組成物、経口薬学的組
    成物または非経口薬学的組成物として投与される、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ＶＥＧＦ−２が、細胞治療手段または遺伝子治療手段
    によって投与され、ここで細胞がＶＥＧＦ−２を産生および分泌するように改変
    されている、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記細胞が、エキソビボで改変されている、請求項１２に
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記細胞が、インビボで改変されている、請求項１２に記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 網膜疾患を処置するために、第２の治療薬剤の有効量を患
    者に投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、ここで前記第２の治療
    薬剤は、グリア細胞株誘導神経栄養因子、脳誘導神経栄養因子、ニューロトロフ
    ィン−３、ニューロトロフィン−４／５、ニューロトロフィン−６、インスリン
    様増殖因子、毛様体神経栄養因子、酸性線維芽細胞増殖因子および塩基性線維芽
    細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子−５、トランスホーミング増殖因子、および
    コカイン−アンフェタミン調節転写物、上皮増殖因子、白血病抑制因子、インタ
    ーロイキン、インターフェロン、およびコロニー刺激因子からなる群から選択さ
    れる、方法。
  17. 【請求項１７】 前記ＶＥＧＦ−２が、眼挿入、眼注入または眼移植からな
    る群から選択される送達手段によって投与される、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 移植のための光受容体細胞を提供するための方法であって
    、該方法は、ＶＥＧＦ−２の存在下において、分離した光受容体細胞を培養する
    工程を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 単離された抗体を含む組成物であって、ここで該抗体は、
    配列番号２のポリペプチドまたはＡＴＣＣ受託番号７５６９８または９７１４９
    のヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドに特に結合する、組成物。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の組成物であって、前記抗体が、以下：
    ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体
    、単鎖抗体、抗原結合フラグメント、マウス抗体フラグメント、ヒト抗体フラグ
    メント、または単鎖抗体フラグメント、 からなる群から選択される、組成物。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の組成物であって、ここで前記単鎖抗体
    フラグメントが、以下： Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）
    ２フラグメント、軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、ヒンジ領域の一部、Ｃ
    Ｈ１ドメインの一部、ＣＨ２ドメインの一部、ＣＨ３ドメインの一部、 からなる群から選択される、組成物。
  22. 【請求項２２】 請求項１９に記載の組成物であって、ここで前記抗体が、
    以下： 配列番号２のアミノ酸−２３〜＋１、配列番号２のアミノ酸残基１〜５０、配列
    番号２のアミノ酸残基５０〜１００、配列番号２のアミノ酸残基１００〜１５０
    、配列番号２のアミノ酸残基１５０〜２００、配列番号２のアミノ酸残基２００
    〜２５０、配列番号２のアミノ酸残基２５０〜３００、配列番号２のアミノ酸残
    基３００〜３５０、または配列番号２のアミノ酸残基３５０〜３９６、 からなる群から選択されるアミノ酸残基からなるポリペプチドに特に結合する、
    組成物。
  23. 【請求項２３】 請求項１９に記載の組成物であって、前記抗体が、以下：
    １×１０-10未満、１×１０-11未満、１×１０-12未満、１×１０-13未満、また
    は１×１０-14未満、 からなる群から選択されるＫｄを有する、組成物。
  24. 【請求項２４】 請求項１９に記載の組成物であって、前記抗体が、ストリ
    ンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のポリヌクレオチド
    配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
    にのみ結合する、組成物。
  25. 【請求項２５】 請求項１９に記載の組成物であって、前記抗体が、配列番
    号２の前記ポリペプチド配列の任意の他のアナログ、オーソログ、もしくはホモ
    ログまたはＡＴＣＣ寄託番号７５６９８もしくは９７１４９に含まれるヒトｃＤ
    ＮＡによってコードされる全長ポリペプチドと結合しない、組成物。
  26. 【請求項２６】 請求項１９に記載の組成物であって、前記抗体が、配列番
    号２またはＡＴＣＣ寄託番号７５６９８もしくは９７１４９に含まれるヒトｃＤ
    ＮＡによってコードされる全長ポリペプチドに対して９５％未満の同一性、配列
    番号２またはＡＴＣＣ寄託番号７５６９８もしくは９７１４９に含まれるヒトｃ
    ＤＮＡによってコードされる全長ポリペプチドに対して９０％未満の同一性、配
    列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号７５６９８もしくは９７１４９に含まれるヒト
    ｃＤＮＡによってコードされる全長ポリペプチドに対して８５％未満の同一性、
    あるいは配列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号７５６９８もしくは９７１４９に含
    まれるヒトｃＤＮＡによってコードされる全長ポリペプチドに対して８０％未満
    の同一性、 からなる群から選択されるポリペプチドと結合しない、組成物。
  27. 【請求項２７】 前記抗体が、モノクローナル抗体１２Ｅ２；１３Ａ２；１
    ５Ｃ２；１３Ｄ６；１３Ｅ６；１９Ａ３；８Ｇ１１；１１Ａ８、１５Ｅ１０、９
    Ｂ４、および１３Ｇ１１からなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物
    。
  28. 【請求項２８】 以下： （ａ）配列番号２のポリペプチドフラグメントまたはＡＴＣＣ寄託番号７５６
    ９８もしくは９７１４９に含まれるヒトｃＤＮＡによってコードされるポリペプ
    チドフラグメント；および （ｂ）単離された抗体、 を含む、組成物。
  29. 【請求項２９】 前記抗体が、配列番号２のポリペプチドまたはＡＴＣＣ寄
    託番号７５６９８もしくは９７１４９におけるヒトｃＤＮＡによってコードされ
    るポリペプチドに特に結合する、請求項２８に記載の組成物。
  30. 【請求項３０】 前記抗体が、モノクローナル抗体１２Ｅ２；１３Ａ２；１
    ５Ｃ２；１３Ｄ６；１３Ｅ６；１９Ａ３；８Ｇ１１；１１Ａ８、１５Ｅ１０、９
    Ｂ４、および１３Ｇ１１からなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物
    。
  31. 【請求項３１】 請求項２８に記載の組成物であって、ここで前記ポリペプ
    チドフラグメントが、以下： 配列番号２の一般式ｍ−３９６によって記載されるＮ末端欠失フラグメント、一
    般式−２３−ｎによって記載されるＣ末端欠失フラグメント、一般式ｍ−ｎによ
    って記載されるＮ末端およびＣ末端欠失フラグメント、一般式＋９−ｎによって
    記載されるＣ末端欠失フラグメント、配列番号２の成熟フラグメントまたはＡＴ
    ＣＣ寄託番号７５６９８もしくは９７１４９におけるヒトｃＤＮＡによりコード
    される成熟フラグメント、配列番号２のプロタンパク質フラグメントまたはＡＴ
    ＣＣ寄託番号７５６９８もしくは９７１４９におけるヒトｃＤＮＡによりコード
    されるプロタンパク質フラグメント、あるいは、配列番号２の全長フラグメント
    またはＡＴＣＣ寄託番号７５６９８もしくは９７１４９におけるヒトｃＤＮＡに
    よりコードされる全長フラグメント、 からなる群より選択されるフラグメントを含む、組成物。
  32. 【請求項３２】 上記ポリペプチドフラグメントが、配列番号２のアミノ酸
    残基Ｒ−２０４〜Ｓ−３９６または配列番号２のアミノ酸残基Ｆ−９〜Ｒ−２０
    ４を含む、請求項２８に記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 請求項２８に記載の組成物であって、前記組成物が、配列
    番号２のアミノ酸残基Ｒ−２０４〜Ｓ−３９６の第１ポリペプチドフラグメント
    および配列番号２のアミノ酸残基Ｆ−９〜Ｒ−２０３の第２ポリペプチドフラグ
    メントを含む、組成物。
  34. 【請求項３４】 以下： （ａ）配列番号２の第１ポリペプチドフラグメントまたはＡＴＣＣ寄託番号７
    ５６９８もしくは９７１４９に含まれるヒトｃＤＮＡによってコードされる第１
    ポリペプチドフラグメント；および （ｂ）配列番号２の第２ポリペプチドフラグメントまたはＡＴＣＣ寄託番号７
    ５６９８もしくは９７１４９に含まれるヒトｃＤＮＡによってコードされる第２
    ポリペプチドフラグメント、 を含む組成物であって、ここで該第１ポリペプチドフラグメントが、該第２ポリ
    ペプチドフラグメントに連結される、組成物。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の組成物であって、ここで前記連結が、
    以下： 抗体、ヒンジ、グリシンリンカー、セリンリンカー、またはプロリンリンカー、
    非共有結合性相互作用、ジスルフィド結合、または共有結合性相互作用、 からなる群から選択されるメンバーによって、実行される、組成物。
  36. 【請求項３６】 患者の内皮細胞を増殖させる方法であって、該方法が、該
    患者に請求項１９に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
  37. 【請求項３７】 患者の内皮細胞を増殖させる方法であって、該方法が、該
    患者に請求項２８に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
  38. 【請求項３８】 患者の内皮細胞を増殖させる方法であって、該方法が、該
    患者に請求項３４に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
  39. 【請求項３９】 前記方法が、新脈管形成またはリンパ管形成を刺激する、
    請求項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記方法が、新脈管形成またはリンパ管形成を刺激する、
    請求項３７に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記方法が、新脈管形成またはリンパ管形成を刺激する、
    請求項３８に記載の方法。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6824777B1 (en) 1992-10-09 2004-11-30 Licentia Ltd. Flt4 (VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy
US5932540A (en) 1994-03-08 1999-08-03 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
US6608182B1 (en) 1994-03-08 2003-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Human vascular endothelial growth factor 2
US7186688B1 (en) 1994-03-08 2007-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Methods of stimulating angiogenesis in a patient by administering vascular endothelial growth factor 2
DE69434538T2 (de) 1994-03-08 2006-08-10 Human Genome Sciences, Inc. Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor 2
US7153827B1 (en) 1994-03-08 2006-12-26 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2 and methods of use
US6040157A (en) 1994-03-08 2000-03-21 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
US7109308B1 (en) 1994-03-08 2006-09-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human vascular endothelial growth factor 2
US7423125B2 (en) 1995-08-01 2008-09-09 Vegenics Limited Antibodies to VEGF-C
US7125714B2 (en) 1997-02-05 2006-10-24 Licentia Ltd. Progenitor cell materials and methods
US7223724B1 (en) 1999-02-08 2007-05-29 Human Genome Sciences, Inc. Use of vascular endothelial growth factor to treat photoreceptor cells
WO2000058511A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Ludwig Institute For Cancer Research Screening and therapy for lymphatic disorders involving the flt4 receptor tyrosine kinase (vegfr-3)
ATE377081T1 (de) 2000-02-25 2007-11-15 Ludwig Inst Cancer Res Material und verfahren die hybridvaskularendothelwachstumfaktoren dns und proteine enthalten und screeningverfahren für modulatoren
CA2404737C (en) 2000-04-03 2010-06-29 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Drug delivering substance containing polyalkylene glycol and phospholipid covalently bonded to drug
US7273751B2 (en) 2000-08-04 2007-09-25 Human Genome Science, Inc. Vascular endothelial growth factor-2
US7611711B2 (en) 2001-01-17 2009-11-03 Vegenics Limited VEGFR-3 inhibitor materials and methods
CN1494552A (zh) 2001-01-19 2004-05-05 ·��ά��֢�о�Ժ Flt4(VEGFR-3)作为靶用于肿瘤成像和抗肿瘤治疗
DK1385864T3 (da) 2001-04-13 2010-08-16 Human Genome Sciences Inc Anti-VEGF-2-antistoffer
WO2003028765A1 (fr) * 2001-09-28 2003-04-10 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Injections pour tissu oculaire contenant un medicament lie a du polyethylene glycol
JP4838968B2 (ja) * 2001-09-28 2011-12-14 参天製薬株式会社 薬物−ポリエチレングリコール結合体を含有する眼組織内注入剤
JP4988606B2 (ja) 2005-02-28 2012-08-01 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 抗血管新生方法及び組成物
TWI428143B (zh) * 2006-01-18 2014-03-01 Gen Hospital Corp 增加淋巴功能之方法
US8821870B2 (en) * 2008-07-18 2014-09-02 Allergan, Inc. Method for treating atrophic age related macular degeneration
ES2676878T3 (es) 2011-03-03 2018-07-25 Zymeworks Inc. Diseño de armazón de heteromultímero multivalente y constructos
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
WO2014124487A1 (en) 2013-02-18 2014-08-21 Vegenics Pty Limited Ligand binding molecules and uses thereof
EP3634999A1 (en) * 2017-06-07 2020-04-15 Philogen S.p.A. Vascular endothelial growth factor/anti-fibronectin antibody fusion proteins
CN111291789B (zh) * 2020-01-19 2022-07-05 华东交通大学 基于多阶段多特征深度融合的乳腺癌图像识别方法及系统

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69434538T2 (de) * 1994-03-08 2006-08-10 Human Genome Sciences, Inc. Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor 2
US5932540A (en) * 1994-03-08 1999-08-03 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
US5641750A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6010015307, ＨＵ，Ｊ．Ｓ． ｅｔ ａｌ, "Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｃｌｅａｖｅｄ ＶＥＧＦ−２ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕ", ＦＡＳＥＢ Ｊ, 1997, Ｖｏｌ．１１， Ｎｏ．６, ｐ．４９８−５０４ *

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