CN109776679A - 一种丝氨酸蛋白酶抑制因子spink1的抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体，所述抗体包含有SEQ ID NO.1‑3的顺序所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和/或SEQ ID NO.4‑6的顺序所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。本发明提供的特异性结合丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体灵敏度和效价高、特异性强，可用于制备检测样品中丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的存在或水平的产品以及开发相关试剂盒。

Description

一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体、其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体、其制备方法和应用。

背景技术

肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，全世界每年新增肝癌病例超过100万。我国是全球肝癌发病率最高的国家，在常见肿瘤中肝癌发病率仅次于肺癌，居第2位。肝癌包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，其中由肝脏内的细胞癌变所引发的癌病，称之为“原发性肝癌”；由身体其他器官的癌症转移到肝脏而形成的肝脏恶性肿瘤，称为继发性肝癌，也称“转移性肝癌”。原发性肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。目前我国发病人数约占全球肝癌病人的55％，原发性肝癌中有85.5％属于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。

由于血清肿瘤标志物的检测具有特异性高、敏感性高、痛苦少以及费用相对较低等优点，一直成为人们用于肝细胞癌检测研究的热点。而其中甲胎蛋白AFP作为肝癌标志物，已被广泛用于肝癌的普查、诊断、判断治疗效果及预测复发。

但是在许多研究中却发现甲胎蛋白AFP的检测，它诊断肝癌的特异性和敏感性却并不理想，分别为76％-91％和39％-64％，事实上，在临床工作中，AFP阴性肝癌患者占肝癌患者总数的比例竟高达30％，其中我国肝癌患者有10％-30％属于AFP阴性。另外，除了在肝癌患者血清中AFP的含量会升高外，在一些急、慢性肝炎和肝硬化患者中，AFP的含量也会出现暂时性的升高，这就导致了AFP在诊断肝癌时候假阳性的出现。

丝氨酸蛋白酶抑制剂SPINK1(Serine Peptide Inhibitor SPINK1)，是一类丝氨酸蛋白酶活性调节因子，参与血凝、纤维蛋白溶解、炎症和免疫反应、胚胎发生及个体发育过程，是一个体内潜在的肿癌生物标志物，它在多种类型的肿癌中均有表达，可用来识别患者的患病风险及肿瘤的不良预后。SPINK1型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族成员多为小分子多肽，其中某些成员能够抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，影响细胞因子和信号转导途径分子的表达，从而成为肿瘤治疗的新靶点。

但在现有技术中，针对丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1(Serine PeptideInhibitor SPINK1type 1)的抗体存在效价和灵敏度低且特异性差的缺点，不利于对SPINK1的研究以及对其水平的检测。因此急需寻找一种新的丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体来解决上述问题。

发明内容

本发明的一个方面，是针对现有技术中丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体效价和灵敏度低且特异性差的缺点，提供了一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体。

本发明提供的技术方案为：

一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体，所述抗体包含有SEQ ID NO.1-3的顺序所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和/或SEQ ID NO.4-6的顺序所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。

本发明的另一个方面，是提供了一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体，所述抗体包含有如SEQ ID NO.7所示的重链可变区氨基酸序列和/或如SEQ ID NO.8所示的轻链可变区氨基酸序列。

本发明的另一个方面，是提供了一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗原结合部分，所述抗原结合部分包含有SEQ ID NO.1-3的顺序所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和/或SEQ ID NO.4-6的顺序所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；

其中，所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、dAb、互补决定区片段、单链抗体，人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。

本发明中所述丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗原结合部分可使用本领域技术人员公知的方法获得，如利用化学试剂处理的方法，或利用蛋白酶消化的方法，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等。

在本发明中，与上述CDR氨基酸序列具有90％以上同源性(优选为95％以上)的序列，也视为包含在本发明的保护范围之内。同样的，上述CDR氨基酸序列的其他变异形式，例如，一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或取代，在C末端和/或N末端增加一个或多个氨基酸等，只要其不改变上述CDR氨基酸序列的生物学功能，都视为包含在本发明的保护范围之内。

本发明所述抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。但作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明所述抗体为单克隆抗体。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体是由保藏编号为CGMCCNO.15800的细胞产生的单克隆抗体。所述细胞是由免疫后的宿主脾细胞和骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，其被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.15800，保藏日期为2018年07月10日。

在本发明中，所述丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1抗原可通过任意合适的方法获得，例如，原核细胞表达、真核细胞表达(例如，通过CHO细胞系、293T细胞系、Hud7细胞系或HCC细胞系进行表达)以及蛋白质合成。作为优选，在本发明的一个实施方式中，通过Hud7细胞系对抗原进行表达。在本发明的一个实施方式中，发明人选择丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的第10-19个氨基酸片段作为抗原，其氨基酸序列具体为SALALLSLSG，如SEQ IDNo.11所示。

本发明中，所得到的抗体可以为IgG，也可以为IgM，也可以为二者的混合。同样，所述抗体可以为一价或二价抗体，也可以为多价抗体。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体为IgMκ型。

在本发明中，可以采用Kohler等在Nature 256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备所述单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。

免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。佐剂可以利用弗氏佐剂(弗氏完全性佐剂或者弗氏不完全性佐剂)或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内会产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂(如PEG4000)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)。

将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21和MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)，以及SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(American Type Cμlture Collection，Rockville，Md.USA)。另外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor，J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。

杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。

在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。

利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来，进而得到所述单克隆抗体。

本发明的另一个方面，是提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码：

(i)上述抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或

(ii)上述抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或

(iii)上述抗体的重链可变区氨基酸序列或轻链可变区氨基酸序列；或

(iv)上述抗原结合部分的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或

(v)上述抗原结合部分的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，编码(iii)所述重链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码(iii)所述轻链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明的另一个方面是提供一种载体，所述载体包含上述多核苷酸。

本发明的另一个方面是提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述多核苷酸，或上述载体。

本发明的另一个方面是提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述抗体或上述抗原结合部分。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述试剂盒采用双夹心法对目标蛋白进行检测。因此，作为优选，所述试剂盒还包含与丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1特异性结合的第二抗体。

在上述试剂盒中，所述第二抗体可以为有技术中已知的与丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1特异性结合的第二抗体，从而利用双夹心法对样品进行检测。

上述试剂盒还可以包含SPINK1蛋白标准品(可商业化购买到，如灏灵赛奥(天津)生物科技有限公司生产的由肝癌细胞系Hud7中表达纯化得来的SPINK1全蛋白，该蛋白标准品的纯度大于98％)、空白対照液、酶标板、覆膜、单克隆抗体-1、辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体-2、辅助试剂等。

本发明的另一个方面，是提供上述抗体在纯化SPINK1蛋白中的用途，优选为利用免疫共沉淀法纯化SPINK1蛋白。

本发明的另一个方面，是提供上述抗体、抗原结合部分、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备检测样品中丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的存在或水平的产品中的应用。

该产品可以为选自试剂盒、基因扩增引物、蛋白质芯片、基因芯片或探针中的任意一种。所述试剂盒可包含ELISA试剂盒、胶体金试剂盒或磁珠法试剂盒。

上述检测样品中丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的存在或水平可用于检测发现如，肝癌，卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌或肾癌。但作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述抗体、抗原结合部分、多核苷酸、载体或宿主细胞用于制备检测肝癌的产品。

同时，作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述抗体、抗原结合部分、多核苷酸、载体或宿主细胞还可用于制备检测乙肝慢性大三阳肝炎标本和原发性肝癌标本的区别的产品，从而来判断患者是否患有乙肝慢性大三阳肝炎或原发性肝癌。

本发明的另一个方面，是提供上述试剂盒在检测样品中丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的存在或水平中的应用。

上述检测样品中丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的存在或水平可用于检测发现如，肝癌，卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌或肾癌。但作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述试剂盒用于制备检测肝癌的产品。

同时，作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述试剂盒还可用于制备检测乙肝慢性大三阳肝炎标本和原发性肝癌标本的区别的产品，从而来判断患者是否患有乙肝慢性大三阳肝炎或原发性肝癌。

本发明的另一个方面，是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述抗体或上述抗原结合部分；以及药学上可接受的载体。

本发明的另一个方面，是提供上述药物组合物在治疗肝癌，卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌或肾癌中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供的特异性结合丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体灵敏度和效价高、特异性强，可用于制备检测样品中丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的存在或水平的产品以及开发相关试剂盒。

生物保藏信息：

保藏编号：CGMCC NO.15800

保藏日期：2018年07月10日

保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

附图说明

图1为纯化后抗体的SDS-PAGE鉴定结果图，其中，1为Marker，2为实施例中纯化后的抗体；

图2为本发明单克隆抗体特异性识别肝癌细胞的蛋白质免疫印迹结果图，其中，1-79为肝癌细胞表达的spink1全蛋白条带，24-79为人肾上皮细胞系表达的spink1全蛋白条带，M为蛋白分子量标记条带，N为Normal缩写正常人血样条带，P为Patient缩写肝癌患者血样条带。

序列说明

SEQ ID NO.1-3为本发明抗体或抗原结合部分的重链可变区CDR1-3的氨基酸序列；

SEQ ID NO.4-6为本发明抗体或抗原结合部分的轻链可变区CDR1-3的氨基酸序列；

SEQ ID NO.7为本发明抗体的重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO.8为本发明抗体的轻链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO.9为本发明抗体的重链可变区核苷酸序列；

SEQ ID NO.10为本发明抗体的轻链可变区核苷酸序列；

SEQ ID NO.11为抗原丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体、其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本发明中使用的术语“抗体”，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

本发明中使用的术语“抗原结合部分”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合片段”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fd、Fv等。

其中，术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab′)₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

本发明中使用的术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。

本发明中使用的术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。

本发明中使用的术语“表位”是指，抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位，可以是线性的表位，也可以是构象的表位。

本发明中使用的“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用。

本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示，例如：丙氨酸可用A或Ala表示。

本发明中，术语“佐剂”是指，非特异性免疫增强剂，与抗原混合后可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型，包括但不限于铝佐剂如氢氧化铝，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂等。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：免疫原的获得

利用常规方法合成丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的第10-19个氨基酸片段，其氨基酸序列具体为SALALLSLSG，如SEQ ID No.11所示。

实施例2：动物免疫

选用5只6-8周的雄性BALB/c小鼠进行免疫

1、初次免疫：将实施例1中制备的免疫原与等体积福氏完全佐剂混合，乳化后进行皮下免疫，每只小鼠皮下注射400ul乳化液。

2、第二次免疫：1mg/ml免疫原与等体积福氏不完全佐剂1:1混合，乳化，腹腔注射200ul乳化液/小鼠。

3、第三次免疫：利用与第二次免疫相同的方法进行。

4、眼静脉取血，室温放置2h后4000rpm，5min离心，取血清。

5、包被免疫原到96孔板，用ELISA检测免疫小鼠血清效价。

1)、多肽包被量为100ng/孔，每孔100ul，PBS稀释，4度过夜。

2)、倒掉，加封闭液(10％脱脂奶粉，PBS溶解)300ul/孔，37度,2h。

3)、倒掉，拍干液体，—20度冻存备用。

4)、在冰箱中取出包被好的板子放至室温，加血清稀释液100ul/孔，37度，1h。

5)、PBST(0.1％Tween)洗板3次。

6)、加二抗(辣根酶标记山羊抗小鼠)1ul，10ml PBS稀释。100ul/孔。37度孵浴45min。

7)、PBST洗板3次。

8)、加TMB 100ul/孔，37度，15min左右。

9)、加2M盐酸终止液50ul/孔终止反应。

10)、450nm波长测OD值。

ELISA结果表明：KZN2-KLH免疫的小鼠血清效价可以终免。

6、终免：选择1#，2#小鼠，每只腹腔注射200ug抗原，200ul抗原与200ulPBS混合。

实施例3：细胞融合

1、复苏和培养小鼠骨髓瘤细胞(常规市场来源，10％FBS+DMEM培养基)。

2、取实施例2中得到的终免小鼠脾脏，用培养基制备成单个细胞悬液，计数。

3、按1：5混合骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞，加PEG进行细胞融合。

4、将100ul/孔2×HAT完全培养基铺入96孔板，加入100ul融合细胞液/孔。

5、融合细胞培养过程中用1×HAT半量换液。

实施例4：ELISA筛选细胞孔上清

1、抗原包被量为100ng/孔，每孔100ul，PBS稀释，4度过夜。

2、倒掉悬液，加封闭液(10％脱脂奶粉，PBS溶解)300ul/孔，37度,2h。

3、倒掉悬液，拍干液体，-20度冻存备用。

4、在冰箱中取出包被好的板子放至室温，加细胞上清液100ul/孔，37度，1h。

5、PBST(0.1％Tween)洗板3次。

6、加二抗(辣根酶标记山羊抗小鼠)1ul，10ml PBS稀释。100ul/孔。37度孵浴45min。

7、PBST洗板3次。

8、加TMB 100ul/孔，37度反应15min左右。

9、加2M盐酸终止液50ul/孔终止反应。

10、450nm波长测OD值。

ELISA结果显示有多个高阳性克隆孔。选择OD值高，克隆少，细胞状态好的融合孔细胞5株，进行下一步的有限稀释孔筛选单克隆杂交瘤细胞。

实施例5：筛选单克隆杂交瘤细胞株及杂交瘤细胞株保藏

1、从Balb/c或昆明种健康小鼠(雌雄均可)制备饲养细胞。

2、有限稀释选好的融合孔细胞：用1×HT培养液稀释细胞，将每孔的细胞悬液加入含饲养细胞的96孔中，浓度分别为100ul/孔含0.75，1.5，和3个细胞，5％CO₂，37℃培养.

3、10天后显微镜下观察克隆生长情况，ELISA检测有细胞克隆孔，选择阳性值高且单克隆的孔(如果需要再做有限稀释，直至全部克隆孔呈阳性)。

4、培养扩增所选择的单克隆杂交瘤细胞并冻存细胞。

5、将选择出的杂交瘤细胞于2018年07月10日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册编号为：CGMCC No.15800。

实施例6：抗体的生产及纯化

1、BALB/c小鼠的预处理：用灭菌的液体石蜡处理小鼠，腹腔注射0.5mL/只，7-10天后即可注射杂交瘤细胞。

2、杂交瘤细胞用DMEM基础培养液稀释成1～2×10⁶个/毫升，腹腔注射小鼠0.5mL/只。

3、腹水采集：间隔7天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水，每隔一到两天采集一次。这样多次反复采集直到老鼠自然死亡。腹水离心(2000rpm离心5min)，吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物。

4、腹水纯化：预处理后的腹水使用Protein G柱子进行孵育，洗脱。最终得到纯化的单克隆抗体。

实施例7：抗体的鉴定

1.CDR测序

从实施例5得到的杂交瘤细胞中扩增鼠源VH&VL，并将目的基因连入T载体并测序得到抗体CDR序列如下：

重链抗原结合区：

CDR-1：GFTFSDAW

CDR-2：IRNKAYNHAT

CDR-3：TTYDY

轻链抗原结合区：

CDR-1：QSLVHGDGNTY

CDR-2：KIS

CDR-3：SQNTHVPRT

2.抗体亚型及效价的测定

利用常规方法测得实施例6得到的抗体的亚型为IgM，kappa。

将纯化后的抗体加载SDS-PAGE胶两个重复进行纯度测定，如图1所示，经Image J分析纯度大于90％。

经NanoDrop测定抗体浓度为0.33mg/ml，效价为1：4000，即抗体最低作用浓度为0.0825ug/ml。结果如表1所示。

表1抗体效价测定结果

实施例8：抗体的特异性

利用Western Blot方法实施例5中的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对肝癌细胞的特异性识别。方法如下：

1.SDS-PAGE

5％浓缩胶+15％分离胶(含10％甘油)，80V 100min，110V 60min。上样体积10μL。

样品处理：肝癌患者血样、正常血样，以等体积乙腈沉淀大分子蛋白后取上清，100℃开盖煮样3-5min。

Spink1蛋白100℃煮样3-5min。上样量4μg。

2.转膜

100V湿转40min。

3.封闭

5％脱脂牛奶(PBST)室温摇床封闭2h。

4.一抗孵育

以5％脱脂牛奶(PBST)稀释一抗为1μg/mL，4℃过夜。

5.洗涤三次，5min每次。

6.二抗孵育

以PBST稀释羊抗鼠-HRP为1:5000，室温摇床1h。

7.洗涤三次，5min每次。

8.曝光

ECL曝光，观察条带。

结果如图2所示，结果表明，以肝癌特异性抗原制备的抗体KZN2可特异性识别肝癌细胞表达的spink1蛋白以及肝癌患者血液中的spink1蛋白，因为肝癌细胞系表达的spink1蛋白发生了非正常切割，aa10-23未被切除，同时该抗体不识别正常细胞表达的spink1蛋白以及正常人血液中的spink1蛋白，因为正常人N端aa1-23被切除，不再存在该段抗原序列。

实施例9：试剂盒

本实施例中的试剂盒包含：实施例6中得到的抗体、SPINK1蛋白标准品(可商业化购买到，如灏灵赛奥(天津)生物科技有限公司生产的由肝癌细胞系Hud7中表达纯化得来的SPINK1全蛋白，该蛋白标准品的纯度大于98％)、空白対照液、酶标板、覆膜、单克隆抗体-1、辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体-2(第二抗体)以及辅助试剂。其制作方法如下：

1.单克隆抗体包被板的制作

将实施例6中得到的抗体用0.05M碳酸缓冲液稀释后，按每孔100μl的量加入酶标板各孔，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液(PBST)洗板，再用含有牛血清白蛋白的封闭液(Blocking Buffer)封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。

2.酶标记单抗

试剂盒中的酶标单克隆抗体是用辣根过氧化酶(HRP)标记单克隆抗体-2(第二抗体)而制备的。酶标单克隆抗体的制备如下：用NaIO₄-乙二醇法进行HRP的氧化，最终浓度为10mg/ml；单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，在对PBS透析过夜；用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标单克隆抗体-2(第二抗体)。

本实施例试剂盒中的辅助试剂包括包被液(Coating Buffer)、PBST、封闭液(Blocking Buffer)、稀释液(Diluent)、底物缓冲液(Substrate Buffer)、反应终止液(Stop Solution)

1)包被液(Coating Buffer，1xPBS)：137mM NaCl，8.1mM Na₂HPO₄,1.5mMKH₂PO₄,2.7mMKCl,pH7.4

2)PBST:

PBST(0.2％):用1xPBS配制0.2％吐温-20

PBST(0.05％):用1xPBS配制0.05％吐温-20

3)封闭液：

封闭液A:用PBST(0.2％)配制5％无脂奶粉

封闭液B:用1xPBS配制3％的牛血清白蛋白

4)稀释液：用PBST(0.05％)配制2％无脂奶粉

5)底物缓冲液：将2.6g柠檬酸和6.9gNa₂HPO₄溶解于500ml去离子水中(ddH₂O)，调节pH值为5.0

6)底物溶液：用底物缓冲液配制3％过氧化氢溶液

7)显色液：四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml

8)反应终止液：2M硫酸

实施例10：丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1蛋白质含量的测定

1)抗原-抗体反应：在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入100μlSPINK1蛋白标准品(可商业化购买到，如灏灵赛奥(天津)生物科技有限公司生产的由肝癌细胞系Hud7中表达纯化得来的SPINK1全蛋白，该蛋白标准品的纯度大于98％)、待检测血清样品。把酶标板粘好覆膜，放置在37℃恒温箱中保温30分钟；

2)揭去覆膜，弃去液体，PBST(0.05％)洗板操作4次；

3)将HRP-单克隆抗体-2(第二抗体)抗体溶液100μl加入各孔，放置在37℃恒温箱中保温30分钟；

4)揭去覆膜，弃去液体，PBST(0.05％)洗板操作4次；

5)显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50μl，放置在37℃恒温箱中保温10分钟，每孔依次加入50μl反应终止液结束反应。

6)比色：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定0D值并记录。

7)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，做出标准曲线；计算标出曲线回归系数R2，当R2>0.95时本次测定有效。

8)计算待测血清样品浓度：根据待测样品的OD值，从标准曲线计算出待测血清样品中SPINK1蛋白的浓度。

在相同实验条件下，与已有的以甲胎蛋白为靶标的肝癌检测试剂盒相比较，本实施例中试剂盒具有以下优点：

1.采用血清中SPINK1蛋白作为肝癌血清肿瘤标志物；

2.SPINK1蛋白的敏感度和特异性分别为78％和95％，远远高于目前临床应用的甲胎蛋白(AFP)的49％和71％。

3.在早期肝细胞癌(癌细胞直径小于2cm)检测中，SPINK1蛋白的准确率达到80％，更是超过目前甲胎蛋白(AFP)的33％。

实施例11：试剂盒的质量检测

1)准确性：10份正常健康人血清参考品的检测结果，无假阳性出现。5份肝癌患者SPINK1阳性质控血清的参考品检测结果无假阴性出现。

2)精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份肝癌阳性质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV小于10％。

3)检测灵敏度：根据SPINK1标准品稀释测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为0.2ng/ml。

4)特异性：取四份待测样品混合后分为四份混合血清标本，每份1ml。分别加入50ng剂量的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶(Plasmin)、或纤粘连蛋白(FN)后制成干扰试验血清标本#1、#2、#3，未加任何干扰物的#4混合血清标本作为基础样品。按说明书操作步骤进行测定并计算结果。然后按干扰试验计算公式计算干扰率。标本#1、#2、#3的干扰误差均小于1.5％。

5)试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为-20℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)，抗体实际测定值均在正常范围之内。

SPINK1SPINK1以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 灏灵赛奥（天津）生物科技有限公司 天津缘至生物科技有限公司

<120> 一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体、其制备方法和应用

<130> None

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 2

Ile Arg Asn Lys Ala Tyr Asn His Ala Thr

1 5 10

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 3

Thr Thr Tyr Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 4

Gln Ser Leu Val His Gly Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 5

Lys Ile Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 6

Ser Gln Asn Thr His Val Pro Arg Thr

1 5

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ala Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Tyr Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Gly

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 342

<212> DNA

<213> Mouse

<400> 9

caggtccaac tgcagcagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggagc catgaaactc 60

tcttgtactg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tgtactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggtggctgaa attagaaata aagcttataa tcatgcaact 180

tattatgctg agtctgtgaa agggaggttc accatctcag gagatgattc caaaagtagt 240

gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta ctgtacaact 300

tatgactact ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct ca 342

<210> 10

<211> 203

<212> DNA

<213> Mouse

<400> 10

gacatcgtga tgacccagtc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacggtgatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaac ctcctgatct acaaaatttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cag 203

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Human

<400> 11

Ser Ala Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser Gly

1 5 10

Claims (16)

1.一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体，其特征在于，所述抗体包含有SEQ IDNO.1-3的顺序所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和/或SEQ ID NO.4-6的顺序所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。

2.一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗体，其特征在于，所述抗体包含有如SEQ IDNO.7所示的重链可变区氨基酸序列和/或如SEQ ID NO.8所示的轻链可变区氨基酸序列。

3.一种丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分包含有SEQ ID NO.1-3的顺序所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和/或SEQ IDNO.4-6的顺序所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；

其中，所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、dAb、互补决定区片段、单链抗体，人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。

4.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体是由保藏编号为CGMCCNO.15800的细胞产生的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述抗体是IgM型。

6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码：

(i)如权利要求1所述的抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或

(ii)如权利要求1所述的抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或

(iii)如权利要求2所述的抗体的重链可变区氨基酸序列或轻链可变区氨基酸序列；或

(iv)如权利要求3所述的抗原结合部分的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；或

(v)如权利要求3所述的抗原结合部分的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。

7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，编码(iii)所述重链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码(iii)所述轻链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

8.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求6或7所述的多核苷酸。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求6或7所述的多核苷酸，或如权利要求8所述的载体。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1、2、4-5中任意一项所述的抗体或如权利要求3所述的抗原结合部分。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含与丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1特异性结合的第二抗体。

12.如权利要求1、2、4-5任意一项所述的抗体在纯化SPINK1蛋白中的用途。

13.如权利要求1、2、4-5任意一项所述的抗体、如权利要求3所述的抗原结合部分、如权利要求6或7所述的多核苷酸、如权利要求8所述的载体；或如权利要求9所述的宿主细胞在制备检测样品中丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的存在或水平的产品中的应用，优选为在制备检测肝癌的产品中的应用。

14.如权利要求10或11所述的试剂盒在制备检测样品中丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK1的存在或水平的产品中的应用，优选为在制备检测肝癌的产品中的应用。

15.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1、2、4-5任意一项所述的抗体；或如权利要求3所述的抗原结合部分；以及药学上可接受的载体。

16.如权利要求15所述的药物组合物在治疗肝癌，卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌或肾癌中的应用。