抗ERCC1 单克隆抗体4F9 及其用途
技术领域
本发明涉及免疫学领域。具体地,本发明主要涉及可特异性识别和结合由切除修复交叉互补基因1(excision repaircross-complement-action group 1,ERCC1)编码的蛋白的单克隆抗体4F9,产生所述单克隆抗体的杂交瘤,包含所述单克隆抗体的组合物,以及所述单克隆抗体的使用方法和用途。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一,铂类药物参与的化疗是其重要的治疗手段。以顺铂为代表的铂类药物是20世纪60年代开发的高效广谱的无机抗肿瘤药,其属于破坏DNA结构和功能的细胞毒药物。经过长期研究和发展,已相继成功开发了顺铂(Cisplatin)、卡铂(Carboplatin)、奈达铂(Nedaplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、舒铂(Sunpla)和洛铂(Lobaplatin)等铂类药物,这些铂类药物常与其他抗肿瘤药物联合使用,用于卵巢癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、头颈部癌、恶性淋巴瘤等多种癌症的临床治疗。然而,肿瘤对铂类药物的耐药性严重影响了这些药物的治疗疗效。产生耐药性的原因很多,其中DNA损伤修复能力的增强是导致对铂类药物的耐药性的主要原因。
人体DNA受各种因素损伤后.其修复主要是通过核苷酸切除修复(Nueleotide excision repair,NER)途径来完成。在该途径中起重要作用的核苷酸ERCC基因家族能对核苷酸进行切除和修复,以减少DNA的损伤。其中,切除修复交叉互补基因1(excision repaircross-complement-action group 1,ERCC1)所编码的蛋白参与DNA链的损伤识别和切割,在NER途径中起着至关重要的作用,是ERCC基因家族和NER途径的关键基因。ERCC1蛋白是核苷酸剪切修复复合体的5′核酸内切酶,见于所有的肿瘤细胞中,其表达水平差异很大。
顺铂主要是通过与作用靶点DNA形成铂-DNA聚合物对肿瘤细胞发挥作用。它在肿瘤细胞中水解为双氯双氨铂,然后与DNA形成聚合物,从而影响细胞的复制与转录,导致DNA损伤。研究显示,ERCC1过表达可使损伤的DNA迅速修复,导致对顺铂的耐药性。因此,NER过程增强是导致对顺铂的耐药性的一个重要机制。
2010年NCCN指南指出,ERCC1可以作为非小细胞肺癌(NSCLC)的预后判断和疗效预测的标记物。一方面,与低水平的ERCC1相比,高水平的ERCC1预示NSCLC患者的生存效果更佳(与治疗无关),同时高水平的ERCC1还预示铂类药物的化疗效果不佳。研究显示,在完全切除的、未接受过围手术期化疗或放疗的NSCLC患者中,ERCC1mRNA的水平是生存预后指标。研究还显示,高表达ERCC1的患者生存期显著长于低表达者。另一方面,已有多项转化型研究证明,ERCC1水平可用于预测铂类药物治疗NSCLC的疗效,高水平者耐药,低水平者敏感。Olaussen等发现,在国际癌辅助化疗研究(IALT)中,仅低表达ERCC1蛋白的肿瘤患者可从含顺铂的辅助化疗中获益。Bepler等报道,在前瞻性采集自一项基于社区的III期随机临床研究的肿瘤标本中,其原位ERCC1蛋白表达水平与卡铂/吉西他滨治疗或吉西他滨单药治疗后的疾病缓解成显著负相关,即低表达ERCC1的患者缓解率更高。
因此,目前临床上在进行肿瘤辅助化疗之前,通常通过免疫组织化学(IHC)病理实验确定肿瘤细胞中ERCC1的表达水平,以指导铂类化疗药物的使用。IHC实验的核心为特异性结合ERCC1的单克隆抗体,其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性,决定着指导临床用药的有效性。当前,国内外广泛用于临床病理一线的ERCC1单克隆抗体为8F1,但已有研究显示,8F1在与ERCC1特异性结合的同时,还与非特异蛋白发生交叉反应,这直接影响了免疫组化结果的特异性和可靠性。
因此,本领域迫切需要这样的单克隆抗体,其不仅可与ERCC1特异性结合,而且与细胞内的其他非特异蛋白不发生交叉反应,以显著提高IHC实验(例如,用于非小细胞肺癌、卵巢癌等肿瘤的病理诊断的IHC实验)的特异性和可靠性,从而更有效和更精确地对使用铂类化疗药物的辅助化疗进行疗效预测及预后判断。
发明内容
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“切除修复交叉互补基因1(ERCC1)”是本领域内熟知的,其是ERCC基因家族和NER途径的关键基因,参与DNA链的损伤识别和切割,在NER途径中起着至关重要的作用。ERCC1蛋白是核苷酸剪切修复复合体的5′核酸内切酶,见于所有的肿瘤细胞中,其表达水平差异很大。ERCC1蛋白的示例性编码核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immuno logicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,特别地,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分,所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如,ERCC1)的能力,与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,RavenPress,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下,抗原结合部分包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如,scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的,术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段;术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段;术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544-546(1989));术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段;术语“F(ab′)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下,抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如,scFv),其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见,例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),CancerImmunol.描述。
在一些情况下,抗体是双抗体,即,双价抗体,其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达,但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对,从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见,例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993),和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体4F9)获得抗体的抗原结合部分(例如,上述抗体片段),并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
如本文中所使用的,以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如,单克隆抗体4F9是与从杂交瘤细胞株4F9或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。
如本文中所使用的,术语“表位”是指,抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如,表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸,其可以是“线性的”或“构象的”。参见,例如,Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中,蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中,相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
可使用本领域技术人员已知的常规技术,就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如,可进行竞争和交叉竞争研究,以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原(例如,ERCC1)的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO03/48731中。因此,可使用本领域技术人员已知的常规技术,获得与单克隆抗体4F9竞争结合ERCC1蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合部分。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常,抗体以小于大约10-7M,例如小于大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合抗原表位。
如本文中所使用的,术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小,抗体-抗原结合越紧密,抗体与抗原之间的亲和力越高。通常,抗体(例如,本发明的单克隆抗体4F9)以小于大约10-7M,例如小于大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如,ERCC1蛋白),例如,如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的,术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用,并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时,其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如,当提及杂交瘤细胞株4F9时,其还指杂交瘤细胞株4F9的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的,术语“患者”是指哺乳动物,例如人。
如本文中所使用的,术语“铂类药物”是指含有铂的药物(例如化疗药物),其包括但不限于,顺铂(Cisplatin)、卡铂(Carboplatin)、奈达铂(Nedaplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、舒铂(Sunpla)和洛铂(Lobaplatin)。
如本文中所使用的,20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其通过引用合并入本文。
因此,在一个方面,本发明提供了特异性结合ERCC1蛋白的单克隆抗体4F9或其抗原结合部分,所述单克隆抗体4F9由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC),具有保藏号CGMCC5196的杂交瘤产生。
在另一个方面,本发明提供了特异性结合ERCC1蛋白的抗体或其抗原结合部分,其与单克隆抗体4F9竞争结合ERCC1蛋白上的相同表位,所述单克隆抗体4F9由保藏在CGMCC,具有保藏号CGMCC5196的杂交瘤产生。
在另一个方面,本发明提供了一种杂交瘤,其以保藏号CGMCC5196保藏在CGMCC。
在另一个方面,本发明提供了一种组合物,其包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面,本发明提供了检测ERCC1蛋白在样品中的存在或其表达水平的方法,其包括使用根据本发明的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选的实施方案中,所述样品是组织样品,例如癌组织样品(例如肺癌组织,卵巢癌组织和结肠腺癌组织)。在一个优选的实施方案中,所述样品是细胞样品,例如细胞裂解液。在一个优选的实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中,所述方法还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合部分。此类第二抗体是本领域公知的,例如但不限于可识别抗体4F9的抗小鼠IgG抗体。在一个优选的实施方案中,所述方法包括但不限于,Western印迹法、ELISA法和免疫组织化学法。在一个优选的实施方案中,所述方法不是疾病的诊断方法。
在另一个方面,还提供了根据本发明的抗体或其抗原结合部分的用途,其用于检测ERCC1蛋白在样品中的存在或其表达水平,或者用于制备试剂盒,所述试剂盒用于检测ERCC1蛋白在样品中的存在或其表达水平。
在一个优选的实施方案中,所述样品包括但不限于,组织样品,例如癌组织样品(例如肺癌组织,卵巢癌组织和结肠腺癌组织),以及细胞样品,例如细胞裂解液。在一个优选的实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中,所述试剂盒还包含第二抗体,其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分,例如但不限于可特异性识别抗体4F9的抗小鼠IgG抗体。在进一步优选的实施方案中,所述第二抗体还包括可检测的标记。
之前已报道,ERCC1蛋白可用作标志物,用于对患有癌症的患者进行预后判断,以及用于预测对患者施用铂类药物的辅助治疗的疗效(Bhagwat,et al.Immunodetection of DNA Repair EndonucleaseERCC1-XPF in Human Tissue.Cancer Res 2009;69:6831-6838;Olaussen,et al.DNA Repair by ERCC1 in Non-Small-Cell LungCancer and Cisplatin-Based Adjuvant Chemotherapy.N Engl J Med,vol.355,no.10,September 7,2006:983-991;Arbogast et al.Automated ERCC1 Immunohistochemistry in Non-small Cell LungCancer:Comparison of anti-ERCC1 Antibodies 8F1,D-10,andFL-297.Appl Immunohistochem Mol Morphol-Volume 19,Number 2,March 2011;和,李建旺.切除修复交叉互补基因1与铂类耐药的研究进展.Jian-xi Medieal Jouma]jun 2009.Vo.44,No.6:625-628)。
因此,在另一个方面,本发明提供了对患有癌症的患者进行预后判断的方法,其包括使用根据本发明的抗体或其抗原结合部分检测来自所述患者的癌组织中ERCC1的表达水平。
在一个优选的实施方案中,所述癌症包括但不限于,肺癌(例如非小细胞肺癌),卵巢癌和结肠腺癌。在一个优选的实施方案中,所述抗体是单克隆抗体4F9。在一个优选的实施方案中,与对照相比,所述癌组织中更高水平的ERCC1预示着,所述患者的预后结果更佳(与治疗无关)。此类对照可以由本领域技术人员容易地确定。
在一个优选的实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中,所述方法还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合部分。此类第二抗体是本领域公知的,例如但不限于可识别抗体4F9的抗小鼠IgG抗体。
在另一个方面,本发明提供了预测对患有癌症的患者施用铂类药物的辅助治疗的疗效的方法,其包括使用根据本发明的抗体或其抗原结合部分检测来自所述患者的癌组织中ERCC1的表达水平。
在一个优选的实施方案中,所述癌症包括但不限于,肺癌(例如非小细胞肺癌),卵巢癌和结肠腺癌。在一个优选的实施方案中,所述抗体是单克隆抗体4F9。在一个优选的实施方案中,与对照相比,所述癌组织中更低水平的ERCC1预示着,所述辅助治疗对于该患者的疗效更好。此类对照可以由本领域技术人员容易地确定。
在一个优选的实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中,所述方法还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合部分。此类第二抗体是本领域公知的,例如但不限于可识别抗体4F9的抗小鼠IgG抗体。
在另一个方面,还提供了根据本发明的抗体或其抗原结合部分在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于对患有癌症的患者进行预后判断和/或用于预测对患有癌症的患者施用铂类药物的辅助治疗的疗效。
在一个优选的实施方案中,所述癌症包括但不限于,肺癌(例如非小细胞肺癌),卵巢癌和结肠腺癌。在一个优选的实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中,所述抗体是单克隆抗体4F9。在一个优选的实施方案中,所述试剂盒还包含第二抗体,其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分,例如但不限于可特异性识别抗体4F9的抗小鼠IgG抗体。在进一步优选的实施方案中,所述第二抗体还包括可检测的标记。
在另一个方面,本发明提供了试剂盒,其包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选的实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分还包含可检测的标记。在另一个优选的实施方案中,所述抗体是单克隆抗体4F9。在一个优选的实施方案中,所述试剂盒还包含第二抗体,其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分,例如但不限于可特异性识别抗体4F9的抗小鼠IgG抗体。在进一步优选的实施方案中,所述第二抗体还包括可检测的标记。
在其他优选的实施方案中,本发明的试剂盒可用于检测ERCC1蛋白在样品中的存在或其表达水平,用于对患有癌症的患者进行预后判断和/或用于预测对患有癌症的患者施用铂类药物的辅助治疗的疗效。
发明的有益效果
目前国内外广泛用于临床病理检测及科学研究实践的ERCC1单克隆抗体是8F1。研究显示,8F1在与ERCC1特异性结合的同时,还与细胞内除ERCC1蛋白外的非特异蛋白发生交叉反应,这直接影响了免疫组化结果的特异性和可靠性。
相比之下,本发明提供了一种特异性针对ERCC1的单克隆抗体4F9,其不仅可与ERCC1特异性结合,而且与细胞内其他非特异蛋白不发生非特异反应。因此,本发明的单克隆抗体4F9特异性更好,可有效提高IHC实验的特异性、准确性和可靠性,达到真实反映肿瘤细胞内ERCC1表达水平的目的。
本发明的单克隆抗体4F9有效克服了目前广泛使用的ERCC1单抗8F1的非特异性问题,其可用于非小细胞肺癌、卵巢癌等肿瘤的病理诊断的免疫组化检测,从而有效且精确地对使用铂类化疗药物的辅助化疗进行疗效预测及预后判断。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1展示了包含ERCC1开放阅读框(open reading frame,ORF)的构建体的核苷酸序列。其中,粗体表示ERCC1 ORF;斜体+单下划线表示酶切位点;双下划线表示C末端Myc-DDK标签。
图2展示了表达ERCC1的重组质粒的构建设计。其中,在ERCC1 ORF的两侧具有多个酶切位点,并且在ORF的上游具有核糖体结合位点(RBS)和Kozac共有序列,在ORF的下游具有Myc标签和Flag标签。
图3展示了使用Western印迹法检测细胞中表达的ERCC1蛋白的结果。其中,左侧泳道:转染了空载体pCMV6-Entry的HEK293T细胞的裂解液;右侧泳道:转染了重组质粒pCMV6-ERCC1的HEK293T细胞的裂解液。Western印迹法所使用的一抗为anti-DDK(ABM公司生产),使用的二抗为Jackson公司生产的羊抗鼠抗体。结果显示,用重组质粒转染细胞后,ERCC1蛋白在HEK293T细胞中高表达。
图4展示了使用SDS-PAGE检测经纯化的ERCC1蛋白的结果。结果显示,经亲和层析纯化后,ERCC1蛋白的纯度达到90%以上。
图5展示了使用单克隆抗体4F9通过Western印迹法检测9种不同细胞系的结果。所使用的9种细胞系如下:HepG2,HeLa,HT29,A549,COS7,Jurkat,MDCK,PC12和MCF7(这9种细胞系均来源于ATCC)。Western印迹法所使用的二抗为Jackson公司生产的羊抗鼠抗体。结果显示,本发明的单克隆抗体4F9能够特异性识别并结合ERCC1蛋白,并且ERCC1蛋白在HeLa,HT29,Jurkat和MCF7中表达。
图6展示了使用抗ERCC1单克隆抗体4F9通过免疫组化方法检测结肠腺癌组织的结果。
图7展示了使用抗ERCC1单克隆抗体4F9通过免疫组化方法检测卵巢癌组织的结果。
图8展示了使用抗ERCC1单克隆抗体4F9通过免疫组化方法检测肺癌组织的结果。
图9展示了使用origene蛋白芯片分析单克隆抗体8F1的结合特异性的结果。结果显示,单克隆抗体8F1不仅特异性结合ERCC1蛋白,还非特异性结合蛋白Protein X(即,PCYT1A,登录号为NM_005017)。
图10展示了使用origene蛋白芯片分析单克隆抗体4F9的结合特异性的结果。结果显示,单克隆抗体4F9仅特异性结合ERCC1蛋白,而不与任何其他蛋白发生非特异性反应。
图11展示了使用Western印迹法分析单克隆抗体8F1和4F9的结合特异性的结果。结果显示,单克隆抗体8F1不仅特异性结合ERCC1蛋白,还非特异性结合蛋白Protein X(即,PCYT1A,登录号为NM_005017);单克隆抗体4F9仅特异性结合ERCC1蛋白,而不与其他蛋白发生非特异性反应。该结果与origene蛋白芯片的结果完全一致,其表明单克隆抗体4F9的结合特异性比单克隆抗体8F1更好。
序列信息
本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
序列1(SEQ ID NO:1):
ATGGACCCTGGGAAGGACAAAGAGGGGGTGCCCCAGCCCTCAGGGCCGCCAGCAAGGAAGA
AATTTGTGATACCCCTCGACGAGGATGAGGTCCCTCCTGGAGTGGCCAAGCCCTTATTCCG
ATCTACACAGAGCCTTCCCACTGTGGACACCTCGGCCCAGGCGGCCCCTCAGACCTACGCC
GAATATGCCATCTCACAGCCTCTGGAAGGGGCTGGGGCCACGTGCCCCACAGGGTCAGAGC
CCCTGGCAGGAGAGACGCCCAACCAGGCCCTGAAACCCGGGGCAAAATCCAACAGCATCAT
TGTGAGCCCTCGGCAGAGGGGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAACGTGCCCTGGGAA
TTTGGCGACGTAATTCCCGACTATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTGCCCTGTTCCTCAGCC
TCCGCTACCACAACCTGCACCCAGACTACATCCATGGGCGGCTGCAGAGCCTGGGGAAGAA
CTTCGCCTTGCGGGTCCTGCTTGTCCAGGTGGATGTGAAAGATCCCCAGCAGGCCCTCAAG
GAGCTGGCTAAGATGTGTATCCTGGCCGACTGCACATTGATCCTCGCCTGGAGCCCCGAGG
AAGCTGGGCGGTACCTGGAGACCTACAAGGCCTATGAGCAGAAACCAGCGGACCTCCTGAT
GGAGAAGCTAGAGCAGGACTTCGTCTCCCGGGTGACTGAATGTCTGACCACCGTGAAGTCA
GTCAACAAAACGGACAGTCAGACCCTCCTGACCACATTTGGATCTCTGGAACAGCTCATCG
CCGCATCAAGAGAAGATCTGGCCTTATGCCCAGGCCTGGGCCCTCAGAAAGCCCGGAGGCT
GTTTGATGTCCTGCACGAGCCCTTCTTGAAAGTACCCTGA
序列2(SEQ ID NO:2):
GAGAGCGATCGCCATGGACCCTGGGAAGGACAAAG
序列3(SEQ ID NO:3):
CGAGCCCTTCTTGAAAGTACCCACGCGTGAGA
序列4(SEQ ID NO:4):
ACGCGGCCGCTCGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGGCAGCAAATGATATCCTGG
ATTACAAGGATGACGACGATAAG
关于生物材料保藏的说明
本发明涉及生物材料,HB500634(抗人ERCC1单克隆抗体杂交瘤细胞株4F9),其于2011年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏号为CGMCC5196。该杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体4F9。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法(例如,分子生物学实验方法和免疫检测法)。参见,例如,Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates(1992);和Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1990),其全部通过引用合并入本文。按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术,如在本领域内通常使用的或如本文描述的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.表达ERCC1的重组质粒的构建
以从ATCC获得的质粒BC0089302(含ERCC1 ORF 894bp)为模板,以5′-GAGAGCGATCGCCATGGACCCTGGGAAGGACAAAG-3′(SEQ ID NO:2)为正向引物(其5′端引入限制性内切酶SgfI位点GCGATCGC),5′-CGAGCCCTTCTTGAAAGTACCCACGCGTGAGA-3′(SEQ ID NO:3)为反向引物(其5′端引入限制性内切酶MluI位点ACGCGT),通过PCR扩增获得ERCC1 ORF,并在其两侧分别引入限制性内切酶SgfI和MluI的识别位点。根据制造商的说明书,使用限制性内切酶SgfI和MluI(ABI公司),将PCR产物克隆入表达载体pCMV6-Entry(来源于origene公司),从而构建表达ERCC1的重组质粒pCMV6-ERCC1,该重组质粒在ERCC1 ORF的下游携带Myc-DDK标签(参见图2,其核苷酸序列如SEQID NO:4所示)。经测序验证,所获得的重组质粒中插入的ERCC1ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。图1和图2分别显示了包含ERCC1 ORF的构建体,以及pCMV6-ERCC1重组质粒的构建设计。
实施例2.ERCC1重组蛋白的表达与纯化
ERCC1重组蛋白的表达
使用本领域技术人员熟知的方法,将实施例1获得的pCMV6-ERCC1重组质粒转染入HEK293T细胞。简言之,在37℃下在5%CO2培养箱(Thermo公司)中,将HEK293T细胞(来源于ATCC)培养在补充有新生牛血清、庆大霉素的DMEM培养基(Thermo fisher公司)中直至汇合,然后以1∶3将其传代至10cm培养皿(康宁公司)中继续培养;取7.5ml DMEM培养基(不含血清及抗生素)至50ml管中,加入300ulPEI MegaTran1.0(origene生产)并混匀;然后添加75μg pCMV6-ERCC1重组质粒DNA至上述混合物中,混匀并静置30分钟;静置后,分别取515μl至各培养皿中,继续培养细胞;转染24小时后,各培养皿分别添加2M丁酸钠,直至终浓度为5mM,继续培养细胞。
转染48小时后,从各培养皿中吸去培养基,并用PBS清洗细胞1次,然后向各培养皿中分别添加含蛋白酶抑制剂PI(SIGMA公司)和100mM PMSF(Amresco公司)的1ml裂解缓冲液(20mM Tris,150mMNaCl,pH 7.6,1%NP-40,1mM EDTA),然后在冰上,在振荡下裂解细胞。收集经转染的HEK293T细胞的细胞裂解液,在4℃下以4000rpm离心15分钟,收集裂解液上清。转染空载体pCMV6-Entry的HEK293T细胞的裂解液上清用作阴性对照。
通过本领域技术人员熟知的Western印迹法(《蛋白质技术手册》,汪家政著),使用anti-DDK(ABM公司)作为一抗,使用Jackson公司生产的羊抗鼠抗体作为二抗,检测如上获得的细胞裂解液上清中ERCC1重组蛋白的存在。结果如图3所示。结果显示,转染空载体pCMV6-Entry的HEK293T细胞不表达ERCC1蛋白,而转染pCMV6-ERCC1重组质粒的HEK293T细胞以高水平表达ERCC1重组蛋白。
ERCC1重组蛋白的纯化
使用亲和层析法对如上获得的细胞裂解液上清中的ERCC1蛋白进行纯化。将细胞裂解液上清用0.45uM,33mm PVDF膜滤器过滤,然后根据制造商的说明书,使用傲锐东源公司生产的抗DDK琼脂糖胶亲和层析柱Beads纯化裂解液上清中的ERCC1蛋白(其携带Myc-DDK标签)。简言之,向50ml的裂解液上清中加入1ml Beads,并在4℃下在360度混匀器(其林贝尔公司)中结合2小时;然后将含有Beads的裂解液倒入BIO-RAD层析柱(Poly-prep-chromatography columns,产品目录号:731-1553)中,并接住穿透液;用裂解缓冲液清洗Beads 1-2次,再用TBST(TBS+0.5%Tween-20)清洗Beads 3次;然后用0.1M Glycine pH3.5进行洗脱:第一次添加200ul,滴尽不收集,第二、三次各添加500ul,收集洗脱液至一个1.5ml离心管中,并迅速加入NaH2PO4(pH=11.0)以将洗脱液的pH中和至pH7.0左右;然后向洗脱液中添加甘油至终浓度为10%,添加Tween-80至终浓度为0.1%,从而获得经纯化的ERCC1蛋白。
使用本领域技术人员熟知的SDS-PAGE法(《蛋白质技术手册》,汪家政著)来鉴定纯化后的ERCC1蛋白,结果示于图4中。结果显示,经亲和层析纯化后,ERCC1蛋白的纯度达到90%以上。
实施例3.杂交瘤的产生和单抗的制备
动物免疫
将经过纯化的ERCC1蛋白用作抗原,免疫6-8周龄BALB/c小鼠。免疫方式为皮下或腹腔注射。初次免疫时,用完全弗氏佐剂乳化抗原,免疫剂量为50μg/只。间隔两周后,以不完全弗氏佐剂乳化抗原,进行第二次免疫,免疫剂量为50μg/只。免疫两次后,取小鼠尾血以ELISA法(使用ERCC1蛋白进行包被,使用羊抗鼠抗体作为二抗进行检测)测定梯度稀释的血清的效价。根据测定结果确定是否对小鼠进行进一步的加强免疫,并且选取血清抗体效价最高的小鼠,用于进行后续的细胞融合。
细胞融合
采用的骨髓瘤细胞为处于对数生长期的BALB/c来源的sp2/0细胞(来源于ATCC)。取经免疫的小鼠的脾脏,制备脾淋巴细胞的单细胞悬液。然后将小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1∶5-1∶10混合,滴加37℃预热的50%PEG4000(PH 8.0)1ml,加入30ml DMEM培养基(Thermofisher公司),离心弃上清后加入HAT培养基(Gibco公司),悬浮混匀,分装至3.5cm培养皿中,放于湿盒中,并置于37℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养。
筛选和克隆
融合7-10天后,挑选细胞克隆,使用经纯化的ERCC1重组蛋白进行ELISA测试,以确定细胞克隆是否产生抗体。对ELISA检测呈阳性的细胞进行有限稀释,并在每次有限稀释后5-6天进行ELISA测试,测定OD280读数。挑取OD280读数较高的阳性细胞克隆进行进一步的有限稀释,直至用ELISA测定96孔板时,整个96孔板的结果均为阳性。从中挑取OD280读数较高的阳性细胞克隆,从而获得产生抗ERCC1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为4F9。
腹水单抗的制备与纯化
给10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷。一周后,用1ml注射器给每只小鼠腹腔注射用PBS洗涤和重悬的杂交瘤细胞株的细胞悬液,细胞用量为5×106/只,注射2只小鼠/杂交瘤细胞株。待小鼠腹水积聚后,收集腹水,离心收集上清,并用亲和层析法进行腹水单抗的纯化。单克隆抗体4F9为IgG1亚型,其采用Protein G(Sigma公司生产)进行纯化。测定纯化后的单克隆抗体的浓度后,将抗体进行分装,并冻存在-20℃。
实施例4.单克隆抗体4F9的效力
Western印迹检测
在本实验中,使用单克隆抗体4F9通过Western印迹法来分析ERCC1蛋白在不同细胞系中的表达情况,从而通过Western印迹法来验证单克隆抗体4F9的效力。所使用的9种细胞系如下:HepG2,HeLa,HT29,A549,COS7,Jurkat,MDCK,PC12和MCF7(来源于ATCC)。Western印迹法中所使用的一抗为如上获得的单克隆抗体4F9,所使用的二抗为Jackson公司生产的羊抗鼠抗体,样品为上述各种细胞系的裂解液。
Western印迹分析的结果示于图5中。结果显示,用单克隆抗体4F9进行检测时,仅显示单一的特异性条带,这表明单克隆抗体4F9能够特异性识别并结合在细胞系中表达的ERCC1蛋白,其具有结合特异性。
免疫组织化学(IHC)检测
在本实验中,通过免疫组织化学(IHC)检测来验证单克隆抗体4F9的效力。免疫组织化学(IHC)检测方案如下。
1、取卵巢癌、肺癌、结肠腺癌等癌变组织块(OriGene公司)进行石蜡包埋,使用Finesse组织切片机(Thermo公司)进行切片,组织切片的厚度为6μm。
2、依次使用下列试剂,对组织切片进行脱蜡与水化:分析纯二甲苯(3×10min),无水乙醇(3×10min),95%乙醇(1×5min),85%乙醇(1×5min),75%乙醇(1×5min),去离子水(3×3min)。
3、加入抗原修复液(0.01M枸橼酸钠缓冲液,pH6.0),在121℃下高压热修复2min。待温度降至约90℃时,取出组织切片,并自然冷却至室温,然后用去离子水浸泡3×3min。
4、在室温下,使用3%过氧化氢灭活组织样品中的内源性过氧化物酶,静置10min。然后用去离子水浸泡3×5min。
5、向样品中添加封闭液(PBS+5%脱脂奶粉+5%正常山羊血清),在37℃下孵育60min。
6、去除封闭液,勿冲洗,加入ERCC1单克隆抗体4F9(以1∶150稀释于封闭液中),在湿盒中在37℃下孵育60min。然后用PBS+0.1%Tween-20洗涤2次,每次洗涤5min;再用PBS+0.02%Tween-20洗涤1次,每次洗涤5min。
7、滴加Polink-试剂盒2(GBI公司)的试剂1,并在37℃下孵育10-20分钟,然后用PBS洗涤3次,每次5min。洗涤后,滴加Polink-2试剂盒的试剂2,并在37℃下孵育10-20分钟,然后用PBS洗涤3次,每次5min。
8、使用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)进行显色,显色3-10min。然后用蒸馏水洗涤。
9、用苏木精复染细胞核2min,然后用蒸馏水漂洗,用1%盐酸分化,再用蒸馏水漂洗3次,室温静置1min。
10、依次使用下列试剂,对样品进行脱水和透明:75%乙醇(1×5min),85%乙醇(1×5min),95%乙醇(1×5min),100%乙醇(3×5min),二甲苯(3×5min)。用中性树胶封片。
11、用显微镜(Olympus公司IX70)进行镜检,结果示于图6、图7和图8中。
结果显示,单克隆抗体4F9能够特异性检测癌组织(例如卵巢癌组织、肺癌组织和结肠腺癌组织)中的ERCC1蛋白的表达水平,从而可用于对使用铂类化疗药物的辅助化疗进行疗效预测及预后判断。
实施例5.单克隆抗体4F9与8F1的结合特异性的比较
在本实施例中,使用OriGene高密度蛋白芯片(OriGene,CatPA100001)来比较单克隆抗体4F9与8F1的结合特异性,并进一步通过Western印迹法来对比较结果进行验证。
OriGene高密度蛋白芯片包含10000种在HEK293T细胞中过表达的蛋白裂解液,每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素(NC)膜上,并且每一种蛋白裂解液的位置可以通过芯片的蛋白数据库信息进行准确定位。该蛋白芯片上的蛋白被分为40个亚矩阵,每个亚矩阵中存在一些参照。通过这些参照,可以定量每个芯片点上蛋白的含量,监控每次免疫反应数据的重复性,确定蛋白芯片的方向,并定位阳性信号的位点。使用OriGene蛋白芯片(OriGene,Cat PA100001)检测单克隆抗体4F9(如上制备的)与单克隆抗体8F1(Abcam公司)的结合特异性的方案如下。
1、将两张蛋白芯片分别放在50ml离心管中,用40ml去离子水浸润,并在摇床上、在室温下温育30分钟。温育后,弃掉去离子水,用10ml PBST平衡芯片,在室温下处理10分钟。
2、向50ml离心管中加入40ml 5%脱脂牛奶(用PBST进行稀释)在摇床上、在室温下封闭芯片30分钟。
3、使用封闭液(5%脱脂牛奶)分别稀释单克隆抗体4F9与8F1,稀释比例为1∶200。将经稀释的单克隆抗体用作一抗。
4、将2张洁净的封口膜分别粘贴到实验台上,并在其上分别滴加250-300μl一抗(分别为经稀释的4F9和8F1,平行进行)。
5、从封闭液中取出蛋白芯片,并将蛋白芯片NC膜的一面朝下,从芯片的一边接触一抗,慢慢滑下,依靠液体表面张力,一抗将慢慢浸润蛋白芯片NC膜,直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。在整个操作过程中避免产生气泡。将芯片连同封口膜一起转移到4℃环境下,静置并孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖,并在盖上黏附一张湿纸巾,以防止长时间孵育导致抗体蒸发。
6、孵育后,将蛋白芯片转移至50ml离心管中,用PBST漂洗两次,去除过量的抗体。然后使用40ml PBST(0.1%Tween-20)在摇床上洗涤蛋白芯片,共洗涤三次,每次洗涤5min。
7、用封闭液(5%脱脂牛奶)稀释二抗,DyLight649-缀合的AffiniPure Fragment山羊抗小鼠IgG(Jackson公司),稀释比例为1∶400。
8、按照上述的步骤4-5,在室温下用经稀释的二抗孵育蛋白芯片1小时。孵育时,在蛋白芯片上方用铝箔纸遮盖,以防止发生信号漂白。
9、按照上述的步骤6,使用PBST洗涤蛋白芯片。
10、用去离子水洗涤蛋白芯片,以去除残余的盐分和变性剂。
11、室温干燥芯片,确保芯片完全干燥。
12、按照制造商的说明书,使用芯片扫描仪读取蛋白芯片的荧光信号。
13、根据参照(BSA-Cy 3和BSA-Cy5)确定蛋白芯片的方向,并确定阳性信号的位点。
14、根据阳性信号的位点,并结合芯片的蛋白数据库信息,查找产生阳性信号的蛋白的名称,其NCBI登录号(accession number),蛋白ID,蛋白大小等信息。
使用OriGene蛋白芯片检测抗体8F1与4F9的结合特异性的结果分别示于图9和图10中。图9的检测结果显示,单克隆抗体8F1不仅特异性结合ERCC1蛋白(NM_202001和NM_001983),还非特异性结合蛋白ProteinX(即,PCYT1A,登录号为NM_005017)。相比之下,图10的检测结果显示,单克隆抗体4F9仅特异性结合ERCC1蛋白(NM_202001和NM_001983),而不与任何其他蛋白发生非特异性反应。上述结果表明,本发明的单克隆抗体4F9的结合特异性比单克隆抗体8F1显著更好。
进一步,通过Western印迹法来验证上述蛋白芯片的检测结果。特别地,以Jackson公司生产的羊抗鼠抗体为二抗,使用Western印迹法分别检测单克隆抗体4F9和单克隆抗体8F1(作为一抗)与ERCC1蛋白(NM_202001和NM_001983)、ERCC2蛋白(NM_000400)、ERCC8蛋白(NM_001007234)、ERC31蛋白(NM_000122)、ERCC5蛋白(NM_000123)和Protein X(即,PCYT1A,登录号为NM_005017)的结合能力。Western印迹法的检测结果示于图11中。结果显示,单克隆抗体8F1不仅特异性结合ERCC1蛋白(NM_202001和NM_001983),还非特异性结合蛋白Protein X(即,PCYT1A,登录号为NM_005017),但不结合其他蛋白;单克隆抗体4F9仅特异性结合ERCC1蛋白(NM_202001和NM_001983),而不与任何其他蛋白发生非特异性反应。该结果与蛋白芯片的检测结果完全一致,其进一步验证,本发明的单克隆抗体4F9的结合特异性比单克隆抗体8F1显著更好。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公开的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。