JPS5823795A - ポリヌクレオチドの検定方法およびこの方法に用いる反応剤 - Google Patents
ポリヌクレオチドの検定方法およびこの方法に用いる反応剤Info
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- JPS5823795A JPS5823795A JP57124293A JP12429382A JPS5823795A JP S5823795 A JPS5823795 A JP S5823795A JP 57124293 A JP57124293 A JP 57124293A JP 12429382 A JP12429382 A JP 12429382A JP S5823795 A JPS5823795 A JP S5823795A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
現在、核酸ハイブリッド形成恢定法は主として分子生物
学の領域に於て、亢奮ＤＮＡ−ＤＮＡ混合物、ある（゛
はＤＮＡフラグメントの混合物＋１］σ）ユニーク チ
オキシリポ核（１（ＤＮＡ’）配列または特定遺伝子の
検出及び同定に対する研究道具として使用されている。 多数の変形技術が存在し、組換えＤＮＡ研究に於て使用
されて（・る。［ｆ（、Ｗ＋、＋（＠集）のＭｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第６計１３７９−
４６９頁（１９７９年）；及びＤｕ、ｒｌｎ。 Ａ＋Ｈ＋とＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、のＭｅｔｂｏｄｓ
ｉｎ ｋｎｚｙｒｒ＋ｏ−１ｏｇｙ、 第６５巻、第
１部、４６８−４７８負（’１９８０年）を参照された
い。〕最もひろく使われている方法の一つは「サウザー
ン プロットフィルター ・・イブリッド形成法」とよ
ばれ−と（・る（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ、のＪ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、９８．５０３゜１９７５’）。この方法は
通常はＤＮＡフラグメントの混合物から電気泳動によっ
て分離される特定ＤＮＡフラグメントを同定するのに使
用される。 この方法は一般的にはある生体からＤＮＡの試料を単離
することによって実施される。単離されたＤＮＡは制限
子ント９ヌクレアーゼ消化作用にかけられ、そしてゲル
（アガロース、アクリルアマイド、など）上で電気泳動
される。分離されたＤＮＡフラグメントを含むゲルをニ
トロセルローズのフィルターシート（あるいは感光紙、
など）と接触させる（プロット）ときには、フラグメン
トは移されてニトロセルローズシートへ結合するに至る
。 ＤＮＡフラグメントを含む、ケルから転移されたニトロ
セルローズシートを次に加熱（〜９５’（１してＤＮＡ
を変性させる。この時点に於てシートを、変性した放射
性ラベル（：４２ｐ ）のある１特定ＤＮ’Ａプローブ
」を含むｈａで以て処理し、ノ゛イブリットゞ形成かお
こされる。ノ・イブリットゞ形成は与えられた条件に応
じて、６−４８８時間かる。 ハイブリッド形成をおこさなかった［特定Ｄ Ｎ Ａプ
ローブ」は次に抗い去られる。ニトロセルローズシート
をχ−線フイルムのシート上に置し・て露光させる。こ
れは通常は一７０℃で敬日間を要する。フィルム上の露
光領域はどのＤＮＡフラグメントがハイブリッド形成し
従って「特定ＤＮＡプローブ」の配列と同じ配列をもつ
かを検証する。 この方法レエ、大ていの池の変形法とともに、放射性同
位元素の使用を必要とし、明らかにきわめて複雑であり
５時間のかかるものである。このような各種の問題点の
ために、ＤＮＡハイブリッド形成検定法は基礎研究用の
一つの道具としてのみ残っており、臨床診断法としての
ような応用的または開業的分野に於ては一般的に使用さ
れていなかった。 背景とじてにさらに、非放射エネルギー伝達の現象もま
た一つの分析道具として利用されてきた。 それは、一つの光放出棟かそれの放出スにクトル内の光
工坏ルギーを吸収する別の棟にきわめて近接するときに
おこる。このエネルギー伝達はフォスターの式によって
最も近似される。ＣＰ、Ａ。 ＬｅｅｍａｋｅｒｓとＡ 、Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒの
ｒＥｎｅｒｇｙＴｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ
ｉｃ Ｐｈｏｔｏｃｂｅｍｔｓｔｒｙｊ第Ｘ■巻、１７
−１３２頁、（１９６９年）にューヨークのインターサ
イエンス発行）を参照されたい。〕非放射性エネルギー
概念の使用は免疫螢光性分析に関して多数の特許に述べ
られている（すべてＥ 、 Ｆ 、Ｌｌｌｌｍａｎまた
はＵｌｌｍａｎ と Ｍ。 Ｓｒｈｗａｒｚｂｅｒｇの出願した。米国性ｎ ｍ ３
．９９６．３４５号；第３．９９８．９．４３号；第４
．１６０，０１６号；第４．１７４．３８４号；及び第
４，１９９，５５９号；の各明細書を見られたい。）。 これらの特許は、放射線を受けていない試料から放出さ
れる螢光がある光エネルキーを吸収する棟（クエンチャ
−）の存在下で減少する分析法に密接に関連しかつ一般
的に属している。類似の論１猿については、力巨Ｊｏｕ
ｒｎａｌ Ｏｆ ＢｉｏｌｏｇｉＣａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ｙ２５１巻、 ＡＩ ４． ４１７２−４１７
８頁（１９７６年７月２５日）の”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔ ｔ！：ｘｃｉｔａｔｉｏｎＴｒａｎｓｆｅｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａ７ｒ″ を児られた１１）。またＡ
ｎａ ｌｙｓ を第１０５巻、９１−９２貞（１９８０
年１月）の”Ｅ’ｌｕｏｒｅｓｃａｍ１ｎｅ ａｎｄ
Ｆｌｏｕｒｒｅｓｃｅｉｎａｓ Ｌａｂｅｌｓ ｉｎ
Ｅｎｅｒｇｙ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ”を見られたい。さらに、工坏ルキー伝達技法は転
移）ＩＮＡの三次構造を決定するのに使用されてきり（
Ｑ−ＨＹａｎｇとり、Ｓ′６１ｎａｓの第７１巻、Ａ７
゜２８２ろ一３８４２負、１９７４年）。 独特のヌクレオチド（ゲノム）配列を検出及び同定する
ための簡単で迅速な方法については臨床的診断法の分野
に於て明確なニーズが存在する。 例えば、ｆｉＥ挨が感染過程かはしまったのち長（たっ
てから現われる人聞及び動物の多くの（・わゆるＩ遅速
（ＳＩＯＷ）ｙ染」病はビールスまたはビールス状作用
物によっておこされる。これらの病気のあるものはタル
、クロイツーヤコブ病、亜急性の５Ｃ１ｅｒＯ逼１ｎｇ
ｐａｎｅｎｅｅｐｌ’１ａｌｌｊｌｅｓ及び進行性の
多果性白實脳症を包括する。多発性硬化Ｑ５（ＭＳ）の
ようなより普通の人聞の病気ははしかビールスによって
おこされる遅速感染であるかもしれないと（・う証拠も
ある。多くの場合に於て、これらの遅速感染病をひきお
こすと侶じもれるビールス作用物質は免役診断学技術に
よってはビールス抗原が存在しないために検出すること
ができな（・−それゆえ、ハイブリッド形成分析法がビ
ールスゲノムを直接的に検出するのに使用される（Ａ、
Ｔ−Ｈａａｓｅらの５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１２． ６
７２ ６７４頁、１９８１年）。ハイブリッド形成検定
法はまた耐性因子ゲノムの検出を通じて多（の病原性−
生物の抗性物質抵抗性を決定するσ）にイ４ ）１４で
ある。 かくて、ノ・イブリッド形成診断法（工、抗ｊ京反応力
）ないかおそいことが免役診断１文術σ）使用を妨げる
場合に重要な役割を果たし得る。し力・し、臨床α・ノ
診断伝に於て商業的使用かひろくひろ力・るたｙ）には
、このよ５なノ・イブリッド形ｈ’ｊ、 ｒＥ ｈ工′
実施するσ〕に比較的に迅速で、開単で、経度に特電的
でありとわめて高感度であるべきであり、そして、でき
るならば放射性同位元素の便用を含むべきて・Ｇ工な−
・。 一改的Ω工、本発明レエ、二本鎖（ｄｓ）ボ１ｊヌクレ
オチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ｋ（ＮＡ 及び合１
Ｊｌｊポリヌクレオチド）に於げる龜基認。ｉ＆内程θ
〕諺１有高感度に基づく、均質ノ・イブ）ノット形ｂ’
を瑛定法に１列するものである。本発明レエまた、放射
性１百１位元素の使用を含まな（・か、その代りに化学
発光月男媒と吸収体／発光体部分とを含み、こ、＋Ｌも
カー適当な条件の下では放射性同位元素と等しし・感度
を提供しｍｌ一つの）・イブリッド形成系に関する４、
σ）である。最も重要なのは１本発明＆エノ・イブ１ノ
ット形成検定法が均質方式で実施されるよへなツノ法で
２つのポリヌクレオチド反応剤ストランド゛をイ史Ｊ−
１」スることを含んでいる。このこと（工、標１」′・
ｊ４二′Ｉｊヌクレオチド配列がある固定化手順を実施
１−る・ゼ・装なしに溶液中で検出及び同定できること
を意味して（・る。また、完全〕・イブリッド形成ば過
当なエネルギー伝達手発生する光信号を検出用につ＜
ｉ）出ずために必要であるので、この方法げ現在利用Ｊ
４゜きるし・がなる方法よりもはるかに選択的″Ｑあり
＋Ｓる。 一面に於ては１本発明は、ビールス、・・クチ１１ア、
及び他の微生物の存在、並びにある種θ）ノに伝的衣現
の存在を５検定されるべきその標的倣生＋勿または遺伝
的表現の特徴である特電の一本題（コ・δ）ポリヌクレ
オチド配列について検定することりこよって決定する１
診断方法にある。特に、こσ）ツノ法は；試料を、ノ・
イブリッド形成条ｆ＋１゛で標的ＳＳ−ポリヌクレオチ
ドの実質上相互に排析的であるハじ分に対して相補性で
ある第−及び第二のｓｓ−ボ１ｊヌクレオチビ反応剤（
ｒｅａｇｅｎｔ）セグメントと接触させることを゛含み
、この第一反応４１１セＩメントは化学発光触媒をもち
、第二の反Ｌｒ、ｉ ６１１部分が標的ＳＳ−ポリヌク
レオチドとのバイブ１１ソド形成に際して、化学発光触
媒及び：吸光体／発光体部分が非放射性のエネルギー伝
達を＝ｒ能とするのに十分に近接する（一般には相互の
約１００Ａ以内）ように位置した吸光体／発光体部分を
４）つものであり；かつまた１本発明はさらに、試料を
［ヒ学発光触媒から光放出を誘起させるのに有効な作用
する物質と接触させること；並びにハイブリッド形成量
を決定するために吸光体／発九体ｇｌｊ分により放出さ
れた光量を測定すること；を含む。 さらに−面に於ては、本発明（・工、第一のＳＳ−ポリ
ヌクレオチド反応剤セグメントもまた。第二反応剤セグ
メント上の吸光体／発光体ｇｌ１分より短かい波長の光
を吸収するかしがし第二反応剤セグメント上の吸光体／
発光体部分の吸収順戦と重複スる仮長域に於て光を放出
する、前記方法にある。 ハイブリッド化される試料（・１次に第−反応剤部分上
の吸光体／発光体部分を励起するために適切な波長の光
で以て照射し７、ハイブリッド形成量を第二反応剤部分
上の吸光体／発光体から放出される光量を測定すること
によって決定する。 さらにもへ一つの面に於ては、本発明は記載の方法を実
施するのに有用な反応剤にある。 ここに使用する”吸光体／発光体部分“とい５言葉は一
つの波長の光エネルギーを吸収しかつ別の波長の光エネ
ルギーを放出し得る棟のことをいう。この言葉は燐光株
と螢光棟との両方を含む。 一つの与えられた反応剤系に対して特定の吸光体／発光
体を選択するにあたっては、その化学発光触媒（あるい
は場合によっては第一の吸光体／発光体）によってつく
り出される光のスペクトル領域に於ける吸収性をもつこ
とである。ｌ＆元（４７発光体の発光がその反応剤系て
よって発せられる化学発光と実際上区別され得る十分に
長い波長のものであることか好ましい、 例えば、主に関係のある化学発光反応く１過酸化水素に
よるルミノール酸化とアルデヒド酸化（例えば、インブ
チルアルデヒド９とプロパツール）でル）る。これらの
反応は両方とも、ペルオキシダーゼによって触媒される
。ルミノール化学発光反応に適当な吸光体／発光体は、
ウロボルフイ１１ン及びテトラカルボキシフェニルポル
フィリンのような遊ｉｍ増基ポルフィリン、マグネシウ
ムまたは亜鉛のような金属を含む金属ポルフィリン、テ
トラフェニルカルボキシポルフィリン、ヘリレン、アン
スラセン、７−メチルジベンソ（α、ｈ）ピレン。 並びにルミノール化学発光の鎖酸（ボ１４０Ｏｎ＋ｎと
４５０ ｎｍＯ闇）に於て強い吸収をおこす十分な大き
さの共役環糸をもつ他の多塩状芳香族を包含する。吸光
体／発光体は容易にスルホン化されて一般的合成方伝ニ
よるスルホンｌ’７クロライトゞの形ｌＮ１Ｚこより、
結合へ活性化されてよし・。また、必要ならば、カルボ
キシル化を行′）でもよい。アルデヒド醪化から生ずる
化学発光に適した吸光体／発光体は上述のポルフィリン
と多核芳香族を宮む。 しかし、多核芳香族のハロゲノ化は化学発光放出体から
有効なエネルギー伝達を提供するために必要である。二
車励起状態から発光するからである。 適切なノ・ロゲン化多核芳香族の例は、９．１０−ジブ
ロモアンスラセン、９．１０−ジブロモ−２，６−アン
スラセンジスルホン酸、ろ、１０−ジブロモ−４、ｑ−
−＜リレンジ力ルポ゛キシレート、及ヒ３．９−または
ろ、１０−ジブロモにリレンである。必要ならば、記載
したよ５なスルホン化またはカルホキシル化もまた一服
的合成手段によってこれらの化合物へ容易に実施される
。 第−及び第二の両ＳＳ−ポリヌクレオチド反応削セグメ
ントが吸光体／発光体部分で以てラベル化されるべき場
合には、エテノ−ヌクレオチドのような螢光化合物とテ
トラカルボキシペリレン訪導体との組合せ、または螢光
誘導体とローダ誘導体導体との組合せを便用することか
できるＯ吸光体／発光体対の選択基準は：（１）一つの
反応★リストランド上の吸光体／発光体部分ハ紀二スト
ランド上の吸光体／発光体部分の発光領域に於ける光の
艮好な吸収をもつべきであり： ｆ２１ｊｔｉ的発光
（螢光）が強くてかつ最初の発光の最大よりも十分に長
い最大をもつべきであり；そして（３）肉部分か谷易に
官能化されて反応剤ストランドへ結合せしめられる性質
をもつべきである。 用語１−化学光尤触媒Ｊは圓−ポリヌクレオチド反応剤
セグメントへ共役結合的に結合できる各線の光放出４の
すべてを含む。このような標識は化学発光タイプと生物
発光タイプの両者を宮人、そしてここで用いられる遡り
、川１；Ｂ「化学発光」は密接に関連のある用語「生物
発光」を宮むにずである。本発明の饋威内の有用な化学
発光触媒はにルオキターゼ、細菌ルシフェラーゼ、はた
るルシフェラーゼ、１能化された鉄−ポルフィリン誘導
体、その他を含む。この化学発光標線または触媒の選択
はい（つかの要素に１ぺ存する。それら（′１（１）便
用されるべきハイブリッド形成条件、特に温度： （
２１ｓｓ−ポリヌクレオチド反応剤セグメントへの共役
結合に使用される方法： （Ｊｊ Ｓ Ｓ−ポリヌク
レオチド反応剤セグメントの大きさ；である。 化学発光触媒から光放出をび起するのに有効な化学発光
反応剤は使用されている特定の化学発光触媒に依存する
ものであり、文献［Ｍ 、 Ａ 、 Ｄｅｌｕｃａ（編
集）のＭＣＬＩＩ□ｄＳ ＩＩ］ ＥｌＩＺｙ川ｏ １
用 ｏ １＜ ｙ第し〜用を。 （１９７８年）〕によく記載されている−例えは次の反
応ははルオキシダーゼ触媒の存仔下で九かいかに放出さ
れるかを解説するものである：はルオキシダーゼ （１）Ｈ２０２＋ルミノール−□−−−−−−−→オキ
ジルミノール＋８２０＋Ｎ２−１−＋ルこの場合に於て
光放出を誘起するのに有効な化学発九剤は過酸化水素と
ルミノールから成る。使用可能である他の薬剤はインブ
チルアルデヒドとグロパノールとをよむ。 同様な反応剤糸は他の化学発光触媒を用し・る欠の反応
によって提示される： 細菌ルシフェラーゼ （２１ＦＭＮＨ２＋０２＋Ｒｅ）（Ｏ ＦＭＮ ＋ ＭＣ０ＯＨ十Ｈ２十ｂｌｙこの式に於て、
ＦＭＮＨ２は逮元されたフラビンモノヌクレオチドであ
り、Ｒは８個から１２瞳の尿素を有する直線炭素鎖であ
り、Ｆ Ｍ Ｎはフラビンモノヌクレオチドである。 ホタルルシフェラーゼ。 （３） ルシフェリン十ＡＴＰ ＋０２−−−−−−
−−＝−−−−−−＝オキシルシフェリｙ 十ＡＭＰ
十ＣＯ２＋ＰＰ １＋ｂνこの式に於て、ＡＴＰはアブ
ノノントリホスフエートで、ｉ、、ｔｌ、 ＡＭＰｖエ
アテノンンモノホスフエートであり＋ ＰＰｉ ば無
機燐酸塩である。 ［標的Ｊ ｓｓ−ポリヌクレオシードは、検定がなされ
つつある生体からの二本鎖核酸の二つの相補性スト−ｙ
７ ト’のいずれか一つのセグメントである、それは
生体自体またはある煉の遺伝的特徴か同定できるユニー
ク ポリヌクレオチド配列を含んでいる。 第−及び第二の８８−ポリヌクレオチド反応斉１１セグ
メントは標的ＳＳ−ポリヌクレオチドの塩基配列に相補
的である１基から本負的には成り立っていなげればなら
ない。第−及び第二のセグメントハ標的ＳＳ−ポリヌク
レオチドの′央實上相互に排析的な部分に対して相補性
であることか心安である。 換言すれは、標的ポリヌクレオチドとの）・イブリッド
形成に際して、第−及び第二の反応剤セグメントはハイ
ブリッド形成を妨げる程度に同一塩基配列に対して競合
してはならない。すなわち、第−及びボニのセグ゛メン
トに重複することなしにかつそれらのＩＵｌに塩基対合
空隙かほとんどｈ・／１）（なしに１頭対尾（７）′端
対５′端）で整列する。舘−及び第二のＳＳ−ポリヌク
レオチド反応剤セグメン、トは問題とする生体からの適
切な制限エンドヌクレアーゼ処理核酸からり（ることか
でき、あるいは、独特な（ユニーク）部分の塩基配列カ
ー既知である場合には、有機合成技術によって合成する
ことかできる［Ｓｔａ−ｗｉｎｓｋｉ、Ｊ 、らのＮｕ
ｃ 、Ａ、ｃｉｄｓＦｔｅｓ、４．３５ろ、 １９７
７ ； Ｇｏｕｇｈ、 Ｇ、Ｒ，らのｔＪｕｃ、Ａｃ１
ｄｓ Ｒ＋、”ｓ、ｔ５．１５５７．１９７９ ：Ｇｏ
ｕｇ、ｈ＋Ｇ 、Ｒ、らのＮｕｃ、Ａｃ１’ｄｓ Ｒｅ
ｓ、７． １９！：）５゜１９７９ ； Ｎａｒａｎｇ
、Ｓ 、Ａ 、のＭｅｔｈｏｄｓ ｌｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙｍ ｍ６５巻、第１部、 ６１０−６２０負（
１９８０年）〕。また、適当な条注下で＋ｉ（１１ヌク
レオチドゞ ホスホリナーゼ（Ｅ、 Ｇａ１ｔ ） ｖ
用いて規定された配列をもつオリコ゛テオキ／ＩＪ ；
Ｈヌクレオチドをつ（ること力呵能である［Ｇｘｌｍａ
ｏ。 Ｓ、とＳｍ１ｔｈ、Ｍ、のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ。 第６５巻、凧１部＋ ６８７−７［Ｊ１貞、（１ソ８０
年）〕。 櫨−及び第二のｓｓ−ポリヌクレオチドゞ反応剤セグメ
ントは一般にはそれぞれ６′端末位及び５′端末位に於
けるそれらの通切な−１５１３分で以て標識がつけられ
、すなわち、一方のストランドの５′端末位と連続的１
（なる（カＪ４１尾で韮ふ）６′端末位で以て標識がつ
げられる、化学発光触媒または与えられた吸光体／発光
体部分のいずれがてよる６′またげ５′位の標識化（ゴ
任意的である。−股には、そｎは与えられた部分と納会
反応の方法とに依存する。 反応剤セグメントの太六さげ長さで１０１１ｉ！ｊのヌ
クレオチドからｉｏｏ、ｏｏｏ １ｎのヌクレオチドで
あり得る。１０個以下のヌクレオチドでは−ハイブリッ
ド系は安定でなく、２０°０をこえると変性しはじめる
。ヌクレオチドが１［］０．０００個をこえると、ハイ
ブリッド形成（復元）はシよるかにおそくかつ不完全な
工程となることがわかる（Ｓｔｅｎｔ。 Ｇ、Ｓ、及びＣａ１ｅｎｄｅｒ ＲｏのＭｏ１．ｅｃｕ
ｌａｒ ｅｅｎｅ−一りｆ豆、 ２１３−２１９負、
１９７１年、を見られたい）。理想的には、反応剤セグ
メントはヌクレオチドか２０個から１０．０００個であ
るべきである。少ないヌクレオチド配夕ＩＪ（２０−１
００）は自己（ａｕ ｔｏｍａ ｔｅｄ ）有機合成技
術による生成に適合する。１００からｉｏ、ｏｏｏのヌ
クレオチドのΔ己列は適切な制限エンドヌクレアーゼ処
叩がら得ることができる。比較的脚高℃・ｆヒ学発光恥
分しζよる小さし・セグメントの標識化はハイフリソド
形成１句程を妨害する。これらの場合には内反１６剤セ
グメントを適切な吸光体／発光体部分とともυζ便川用
るのが有利であるがもしれない。 過当なハイブリッド形成条件シエ、反応剤ホリヌクレオ
チド配列へつげられた光標緻、反応剤ポリヌクレオチド
配列の大きさ１反応剤及び試料ポリヌクレオチド配列の
［Ｇ］＋［Ｃａ（グγニン＋ノドシン）含量、及び試料
ポリヌクレオチド配列のつくられ方、によって決定され
る。光’Ｃ＝ ＝ｉ＋ｅ ｉ１ハイブリッド形成反応の
表斤に便用する温度と地礫度に影響を及ぼし得る。化学
発光触媒は吸光体／発光体部分か許容できる温度と塩濃
度に対してｗｌ感であり得る。反応剤ポリヌクレオチド
配列の犬六さはハイフリット形成反応のｎｌｌｉ度及び
時間て影響する。同じ塩濃度と反応側濃度を仮定すると
、１０．０００ から１００．０００ ＋７）、；ｔＦ
囲の／ｘ応Ａｌヌクｖオチド配列を含むハイブリッド形
成は６７℃でおこるのに４０分から８０分を必υとし、
一方、２゜から１００のヌクレオチドを言むハイブリッ
ド形成は２５°Ｇで５分から３０分を８東とする。同様
に、反応剤と試料ポリヌクレオチド配列との〔Ｇ〕＋〔
Ｃａ含量はハイブリッド形成反応の温度と時１Ｍに影響
する。〔Ｇ〕十〔ｃ〕の重含ｉ４１をもっボ″リヌクレ
チド配列は
学の領域に於て、亢奮ＤＮＡ−ＤＮＡ混合物、ある（゛
はＤＮＡフラグメントの混合物＋１］σ）ユニーク チ
オキシリポ核（１（ＤＮＡ’）配列または特定遺伝子の
検出及び同定に対する研究道具として使用されている。 多数の変形技術が存在し、組換えＤＮＡ研究に於て使用
されて（・る。［ｆ（、Ｗ＋、＋（＠集）のＭｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第６計１３７９−
４６９頁（１９７９年）；及びＤｕ、ｒｌｎ。 Ａ＋Ｈ＋とＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、のＭｅｔｂｏｄｓ
ｉｎ ｋｎｚｙｒｒ＋ｏ−１ｏｇｙ、 第６５巻、第
１部、４６８−４７８負（’１９８０年）を参照された
い。〕最もひろく使われている方法の一つは「サウザー
ン プロットフィルター ・・イブリッド形成法」とよ
ばれ−と（・る（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ、のＪ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、９８．５０３゜１９７５’）。この方法は
通常はＤＮＡフラグメントの混合物から電気泳動によっ
て分離される特定ＤＮＡフラグメントを同定するのに使
用される。 この方法は一般的にはある生体からＤＮＡの試料を単離
することによって実施される。単離されたＤＮＡは制限
子ント９ヌクレアーゼ消化作用にかけられ、そしてゲル
（アガロース、アクリルアマイド、など）上で電気泳動
される。分離されたＤＮＡフラグメントを含むゲルをニ
トロセルローズのフィルターシート（あるいは感光紙、
など）と接触させる（プロット）ときには、フラグメン
トは移されてニトロセルローズシートへ結合するに至る
。 ＤＮＡフラグメントを含む、ケルから転移されたニトロ
セルローズシートを次に加熱（〜９５’（１してＤＮＡ
を変性させる。この時点に於てシートを、変性した放射
性ラベル（：４２ｐ ）のある１特定ＤＮ’Ａプローブ
」を含むｈａで以て処理し、ノ゛イブリットゞ形成かお
こされる。ノ・イブリットゞ形成は与えられた条件に応
じて、６−４８８時間かる。 ハイブリッド形成をおこさなかった［特定Ｄ Ｎ Ａプ
ローブ」は次に抗い去られる。ニトロセルローズシート
をχ−線フイルムのシート上に置し・て露光させる。こ
れは通常は一７０℃で敬日間を要する。フィルム上の露
光領域はどのＤＮＡフラグメントがハイブリッド形成し
従って「特定ＤＮＡプローブ」の配列と同じ配列をもつ
かを検証する。 この方法レエ、大ていの池の変形法とともに、放射性同
位元素の使用を必要とし、明らかにきわめて複雑であり
５時間のかかるものである。このような各種の問題点の
ために、ＤＮＡハイブリッド形成検定法は基礎研究用の
一つの道具としてのみ残っており、臨床診断法としての
ような応用的または開業的分野に於ては一般的に使用さ
れていなかった。 背景とじてにさらに、非放射エネルギー伝達の現象もま
た一つの分析道具として利用されてきた。 それは、一つの光放出棟かそれの放出スにクトル内の光
工坏ルギーを吸収する別の棟にきわめて近接するときに
おこる。このエネルギー伝達はフォスターの式によって
最も近似される。ＣＰ、Ａ。 ＬｅｅｍａｋｅｒｓとＡ 、Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒの
ｒＥｎｅｒｇｙＴｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ
ｉｃ Ｐｈｏｔｏｃｂｅｍｔｓｔｒｙｊ第Ｘ■巻、１７
−１３２頁、（１９６９年）にューヨークのインターサ
イエンス発行）を参照されたい。〕非放射性エネルギー
概念の使用は免疫螢光性分析に関して多数の特許に述べ
られている（すべてＥ 、 Ｆ 、Ｌｌｌｌｍａｎまた
はＵｌｌｍａｎ と Ｍ。 Ｓｒｈｗａｒｚｂｅｒｇの出願した。米国性ｎ ｍ ３
．９９６．３４５号；第３．９９８．９．４３号；第４
．１６０，０１６号；第４．１７４．３８４号；及び第
４，１９９，５５９号；の各明細書を見られたい。）。 これらの特許は、放射線を受けていない試料から放出さ
れる螢光がある光エネルキーを吸収する棟（クエンチャ
−）の存在下で減少する分析法に密接に関連しかつ一般
的に属している。類似の論１猿については、力巨Ｊｏｕ
ｒｎａｌ Ｏｆ ＢｉｏｌｏｇｉＣａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ｙ２５１巻、 ＡＩ ４． ４１７２−４１７
８頁（１９７６年７月２５日）の”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔ ｔ！：ｘｃｉｔａｔｉｏｎＴｒａｎｓｆｅｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａ７ｒ″ を児られた１１）。またＡ
ｎａ ｌｙｓ を第１０５巻、９１−９２貞（１９８０
年１月）の”Ｅ’ｌｕｏｒｅｓｃａｍ１ｎｅ ａｎｄ
Ｆｌｏｕｒｒｅｓｃｅｉｎａｓ Ｌａｂｅｌｓ ｉｎ
Ｅｎｅｒｇｙ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ”を見られたい。さらに、工坏ルキー伝達技法は転
移）ＩＮＡの三次構造を決定するのに使用されてきり（
Ｑ−ＨＹａｎｇとり、Ｓ′６１ｎａｓの第７１巻、Ａ７
゜２８２ろ一３８４２負、１９７４年）。 独特のヌクレオチド（ゲノム）配列を検出及び同定する
ための簡単で迅速な方法については臨床的診断法の分野
に於て明確なニーズが存在する。 例えば、ｆｉＥ挨が感染過程かはしまったのち長（たっ
てから現われる人聞及び動物の多くの（・わゆるＩ遅速
（ＳＩＯＷ）ｙ染」病はビールスまたはビールス状作用
物によっておこされる。これらの病気のあるものはタル
、クロイツーヤコブ病、亜急性の５Ｃ１ｅｒＯ逼１ｎｇ
ｐａｎｅｎｅｅｐｌ’１ａｌｌｊｌｅｓ及び進行性の
多果性白實脳症を包括する。多発性硬化Ｑ５（ＭＳ）の
ようなより普通の人聞の病気ははしかビールスによって
おこされる遅速感染であるかもしれないと（・う証拠も
ある。多くの場合に於て、これらの遅速感染病をひきお
こすと侶じもれるビールス作用物質は免役診断学技術に
よってはビールス抗原が存在しないために検出すること
ができな（・−それゆえ、ハイブリッド形成分析法がビ
ールスゲノムを直接的に検出するのに使用される（Ａ、
Ｔ−Ｈａａｓｅらの５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１２． ６
７２ ６７４頁、１９８１年）。ハイブリッド形成検定
法はまた耐性因子ゲノムの検出を通じて多（の病原性−
生物の抗性物質抵抗性を決定するσ）にイ４ ）１４で
ある。 かくて、ノ・イブリッド形成診断法（工、抗ｊ京反応力
）ないかおそいことが免役診断１文術σ）使用を妨げる
場合に重要な役割を果たし得る。し力・し、臨床α・ノ
診断伝に於て商業的使用かひろくひろ力・るたｙ）には
、このよ５なノ・イブリッド形ｈ’ｊ、 ｒＥ ｈ工′
実施するσ〕に比較的に迅速で、開単で、経度に特電的
でありとわめて高感度であるべきであり、そして、でき
るならば放射性同位元素の便用を含むべきて・Ｇ工な−
・。 一改的Ω工、本発明レエ、二本鎖（ｄｓ）ボ１ｊヌクレ
オチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ｋ（ＮＡ 及び合１
Ｊｌｊポリヌクレオチド）に於げる龜基認。ｉ＆内程θ
〕諺１有高感度に基づく、均質ノ・イブ）ノット形ｂ’
を瑛定法に１列するものである。本発明レエまた、放射
性１百１位元素の使用を含まな（・か、その代りに化学
発光月男媒と吸収体／発光体部分とを含み、こ、＋Ｌも
カー適当な条件の下では放射性同位元素と等しし・感度
を提供しｍｌ一つの）・イブリッド形成系に関する４、
σ）である。最も重要なのは１本発明＆エノ・イブ１ノ
ット形成検定法が均質方式で実施されるよへなツノ法で
２つのポリヌクレオチド反応剤ストランド゛をイ史Ｊ−
１」スることを含んでいる。このこと（工、標１」′・
ｊ４二′Ｉｊヌクレオチド配列がある固定化手順を実施
１−る・ゼ・装なしに溶液中で検出及び同定できること
を意味して（・る。また、完全〕・イブリッド形成ば過
当なエネルギー伝達手発生する光信号を検出用につ＜
ｉ）出ずために必要であるので、この方法げ現在利用Ｊ
４゜きるし・がなる方法よりもはるかに選択的″Ｑあり
＋Ｓる。 一面に於ては１本発明は、ビールス、・・クチ１１ア、
及び他の微生物の存在、並びにある種θ）ノに伝的衣現
の存在を５検定されるべきその標的倣生＋勿または遺伝
的表現の特徴である特電の一本題（コ・δ）ポリヌクレ
オチド配列について検定することりこよって決定する１
診断方法にある。特に、こσ）ツノ法は；試料を、ノ・
イブリッド形成条ｆ＋１゛で標的ＳＳ−ポリヌクレオチ
ドの実質上相互に排析的であるハじ分に対して相補性で
ある第−及び第二のｓｓ−ボ１ｊヌクレオチビ反応剤（
ｒｅａｇｅｎｔ）セグメントと接触させることを゛含み
、この第一反応４１１セＩメントは化学発光触媒をもち
、第二の反Ｌｒ、ｉ ６１１部分が標的ＳＳ−ポリヌク
レオチドとのバイブ１１ソド形成に際して、化学発光触
媒及び：吸光体／発光体部分が非放射性のエネルギー伝
達を＝ｒ能とするのに十分に近接する（一般には相互の
約１００Ａ以内）ように位置した吸光体／発光体部分を
４）つものであり；かつまた１本発明はさらに、試料を
［ヒ学発光触媒から光放出を誘起させるのに有効な作用
する物質と接触させること；並びにハイブリッド形成量
を決定するために吸光体／発九体ｇｌｊ分により放出さ
れた光量を測定すること；を含む。 さらに−面に於ては、本発明（・工、第一のＳＳ−ポリ
ヌクレオチド反応剤セグメントもまた。第二反応剤セグ
メント上の吸光体／発光体ｇｌ１分より短かい波長の光
を吸収するかしがし第二反応剤セグメント上の吸光体／
発光体部分の吸収順戦と重複スる仮長域に於て光を放出
する、前記方法にある。 ハイブリッド化される試料（・１次に第−反応剤部分上
の吸光体／発光体部分を励起するために適切な波長の光
で以て照射し７、ハイブリッド形成量を第二反応剤部分
上の吸光体／発光体から放出される光量を測定すること
によって決定する。 さらにもへ一つの面に於ては、本発明は記載の方法を実
施するのに有用な反応剤にある。 ここに使用する”吸光体／発光体部分“とい５言葉は一
つの波長の光エネルギーを吸収しかつ別の波長の光エネ
ルギーを放出し得る棟のことをいう。この言葉は燐光株
と螢光棟との両方を含む。 一つの与えられた反応剤系に対して特定の吸光体／発光
体を選択するにあたっては、その化学発光触媒（あるい
は場合によっては第一の吸光体／発光体）によってつく
り出される光のスペクトル領域に於ける吸収性をもつこ
とである。ｌ＆元（４７発光体の発光がその反応剤系て
よって発せられる化学発光と実際上区別され得る十分に
長い波長のものであることか好ましい、 例えば、主に関係のある化学発光反応く１過酸化水素に
よるルミノール酸化とアルデヒド酸化（例えば、インブ
チルアルデヒド９とプロパツール）でル）る。これらの
反応は両方とも、ペルオキシダーゼによって触媒される
。ルミノール化学発光反応に適当な吸光体／発光体は、
ウロボルフイ１１ン及びテトラカルボキシフェニルポル
フィリンのような遊ｉｍ増基ポルフィリン、マグネシウ
ムまたは亜鉛のような金属を含む金属ポルフィリン、テ
トラフェニルカルボキシポルフィリン、ヘリレン、アン
スラセン、７−メチルジベンソ（α、ｈ）ピレン。 並びにルミノール化学発光の鎖酸（ボ１４０Ｏｎ＋ｎと
４５０ ｎｍＯ闇）に於て強い吸収をおこす十分な大き
さの共役環糸をもつ他の多塩状芳香族を包含する。吸光
体／発光体は容易にスルホン化されて一般的合成方伝ニ
よるスルホンｌ’７クロライトゞの形ｌＮ１Ｚこより、
結合へ活性化されてよし・。また、必要ならば、カルボ
キシル化を行′）でもよい。アルデヒド醪化から生ずる
化学発光に適した吸光体／発光体は上述のポルフィリン
と多核芳香族を宮む。 しかし、多核芳香族のハロゲノ化は化学発光放出体から
有効なエネルギー伝達を提供するために必要である。二
車励起状態から発光するからである。 適切なノ・ロゲン化多核芳香族の例は、９．１０−ジブ
ロモアンスラセン、９．１０−ジブロモ−２，６−アン
スラセンジスルホン酸、ろ、１０−ジブロモ−４、ｑ−
−＜リレンジ力ルポ゛キシレート、及ヒ３．９−または
ろ、１０−ジブロモにリレンである。必要ならば、記載
したよ５なスルホン化またはカルホキシル化もまた一服
的合成手段によってこれらの化合物へ容易に実施される
。 第−及び第二の両ＳＳ−ポリヌクレオチド反応削セグメ
ントが吸光体／発光体部分で以てラベル化されるべき場
合には、エテノ−ヌクレオチドのような螢光化合物とテ
トラカルボキシペリレン訪導体との組合せ、または螢光
誘導体とローダ誘導体導体との組合せを便用することか
できるＯ吸光体／発光体対の選択基準は：（１）一つの
反応★リストランド上の吸光体／発光体部分ハ紀二スト
ランド上の吸光体／発光体部分の発光領域に於ける光の
艮好な吸収をもつべきであり： ｆ２１ｊｔｉ的発光
（螢光）が強くてかつ最初の発光の最大よりも十分に長
い最大をもつべきであり；そして（３）肉部分か谷易に
官能化されて反応剤ストランドへ結合せしめられる性質
をもつべきである。 用語１−化学光尤触媒Ｊは圓−ポリヌクレオチド反応剤
セグメントへ共役結合的に結合できる各線の光放出４の
すべてを含む。このような標識は化学発光タイプと生物
発光タイプの両者を宮人、そしてここで用いられる遡り
、川１；Ｂ「化学発光」は密接に関連のある用語「生物
発光」を宮むにずである。本発明の饋威内の有用な化学
発光触媒はにルオキターゼ、細菌ルシフェラーゼ、はた
るルシフェラーゼ、１能化された鉄−ポルフィリン誘導
体、その他を含む。この化学発光標線または触媒の選択
はい（つかの要素に１ぺ存する。それら（′１（１）便
用されるべきハイブリッド形成条件、特に温度： （
２１ｓｓ−ポリヌクレオチド反応剤セグメントへの共役
結合に使用される方法： （Ｊｊ Ｓ Ｓ−ポリヌク
レオチド反応剤セグメントの大きさ；である。 化学発光触媒から光放出をび起するのに有効な化学発光
反応剤は使用されている特定の化学発光触媒に依存する
ものであり、文献［Ｍ 、 Ａ 、 Ｄｅｌｕｃａ（編
集）のＭＣＬＩＩ□ｄＳ ＩＩ］ ＥｌＩＺｙ川ｏ １
用 ｏ １＜ ｙ第し〜用を。 （１９７８年）〕によく記載されている−例えは次の反
応ははルオキシダーゼ触媒の存仔下で九かいかに放出さ
れるかを解説するものである：はルオキシダーゼ （１）Ｈ２０２＋ルミノール−□−−−−−−−→オキ
ジルミノール＋８２０＋Ｎ２−１−＋ルこの場合に於て
光放出を誘起するのに有効な化学発九剤は過酸化水素と
ルミノールから成る。使用可能である他の薬剤はインブ
チルアルデヒドとグロパノールとをよむ。 同様な反応剤糸は他の化学発光触媒を用し・る欠の反応
によって提示される： 細菌ルシフェラーゼ （２１ＦＭＮＨ２＋０２＋Ｒｅ）（Ｏ ＦＭＮ ＋ ＭＣ０ＯＨ十Ｈ２十ｂｌｙこの式に於て、
ＦＭＮＨ２は逮元されたフラビンモノヌクレオチドであ
り、Ｒは８個から１２瞳の尿素を有する直線炭素鎖であ
り、Ｆ Ｍ Ｎはフラビンモノヌクレオチドである。 ホタルルシフェラーゼ。 （３） ルシフェリン十ＡＴＰ ＋０２−−−−−−
−−＝−−−−−−＝オキシルシフェリｙ 十ＡＭＰ
十ＣＯ２＋ＰＰ １＋ｂνこの式に於て、ＡＴＰはアブ
ノノントリホスフエートで、ｉ、、ｔｌ、 ＡＭＰｖエ
アテノンンモノホスフエートであり＋ ＰＰｉ ば無
機燐酸塩である。 ［標的Ｊ ｓｓ−ポリヌクレオシードは、検定がなされ
つつある生体からの二本鎖核酸の二つの相補性スト−ｙ
７ ト’のいずれか一つのセグメントである、それは
生体自体またはある煉の遺伝的特徴か同定できるユニー
ク ポリヌクレオチド配列を含んでいる。 第−及び第二の８８−ポリヌクレオチド反応斉１１セグ
メントは標的ＳＳ−ポリヌクレオチドの塩基配列に相補
的である１基から本負的には成り立っていなげればなら
ない。第−及び第二のセグメントハ標的ＳＳ−ポリヌク
レオチドの′央實上相互に排析的な部分に対して相補性
であることか心安である。 換言すれは、標的ポリヌクレオチドとの）・イブリッド
形成に際して、第−及び第二の反応剤セグメントはハイ
ブリッド形成を妨げる程度に同一塩基配列に対して競合
してはならない。すなわち、第−及びボニのセグ゛メン
トに重複することなしにかつそれらのＩＵｌに塩基対合
空隙かほとんどｈ・／１）（なしに１頭対尾（７）′端
対５′端）で整列する。舘−及び第二のＳＳ−ポリヌク
レオチド反応剤セグメン、トは問題とする生体からの適
切な制限エンドヌクレアーゼ処理核酸からり（ることか
でき、あるいは、独特な（ユニーク）部分の塩基配列カ
ー既知である場合には、有機合成技術によって合成する
ことかできる［Ｓｔａ−ｗｉｎｓｋｉ、Ｊ 、らのＮｕ
ｃ 、Ａ、ｃｉｄｓＦｔｅｓ、４．３５ろ、 １９７
７ ； Ｇｏｕｇｈ、 Ｇ、Ｒ，らのｔＪｕｃ、Ａｃ１
ｄｓ Ｒ＋、”ｓ、ｔ５．１５５７．１９７９ ：Ｇｏ
ｕｇ、ｈ＋Ｇ 、Ｒ、らのＮｕｃ、Ａｃ１’ｄｓ Ｒｅ
ｓ、７． １９！：）５゜１９７９ ； Ｎａｒａｎｇ
、Ｓ 、Ａ 、のＭｅｔｈｏｄｓ ｌｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙｍ ｍ６５巻、第１部、 ６１０−６２０負（
１９８０年）〕。また、適当な条注下で＋ｉ（１１ヌク
レオチドゞ ホスホリナーゼ（Ｅ、 Ｇａ１ｔ ） ｖ
用いて規定された配列をもつオリコ゛テオキ／ＩＪ ；
Ｈヌクレオチドをつ（ること力呵能である［Ｇｘｌｍａ
ｏ。 Ｓ、とＳｍ１ｔｈ、Ｍ、のＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ。 第６５巻、凧１部＋ ６８７−７［Ｊ１貞、（１ソ８０
年）〕。 櫨−及び第二のｓｓ−ポリヌクレオチドゞ反応剤セグメ
ントは一般にはそれぞれ６′端末位及び５′端末位に於
けるそれらの通切な−１５１３分で以て標識がつけられ
、すなわち、一方のストランドの５′端末位と連続的１
（なる（カＪ４１尾で韮ふ）６′端末位で以て標識がつ
げられる、化学発光触媒または与えられた吸光体／発光
体部分のいずれがてよる６′またげ５′位の標識化（ゴ
任意的である。−股には、そｎは与えられた部分と納会
反応の方法とに依存する。 反応剤セグメントの太六さげ長さで１０１１ｉ！ｊのヌ
クレオチドからｉｏｏ、ｏｏｏ １ｎのヌクレオチドで
あり得る。１０個以下のヌクレオチドでは−ハイブリッ
ド系は安定でなく、２０°０をこえると変性しはじめる
。ヌクレオチドが１［］０．０００個をこえると、ハイ
ブリッド形成（復元）はシよるかにおそくかつ不完全な
工程となることがわかる（Ｓｔｅｎｔ。 Ｇ、Ｓ、及びＣａ１ｅｎｄｅｒ ＲｏのＭｏ１．ｅｃｕ
ｌａｒ ｅｅｎｅ−一りｆ豆、 ２１３−２１９負、
１９７１年、を見られたい）。理想的には、反応剤セグ
メントはヌクレオチドか２０個から１０．０００個であ
るべきである。少ないヌクレオチド配夕ＩＪ（２０−１
００）は自己（ａｕ ｔｏｍａ ｔｅｄ ）有機合成技
術による生成に適合する。１００からｉｏ、ｏｏｏのヌ
クレオチドのΔ己列は適切な制限エンドヌクレアーゼ処
叩がら得ることができる。比較的脚高℃・ｆヒ学発光恥
分しζよる小さし・セグメントの標識化はハイフリソド
形成１句程を妨害する。これらの場合には内反１６剤セ
グメントを適切な吸光体／発光体部分とともυζ便川用
るのが有利であるがもしれない。 過当なハイブリッド形成条件シエ、反応剤ホリヌクレオ
チド配列へつげられた光標緻、反応剤ポリヌクレオチド
配列の大きさ１反応剤及び試料ポリヌクレオチド配列の
［Ｇ］＋［Ｃａ（グγニン＋ノドシン）含量、及び試料
ポリヌクレオチド配列のつくられ方、によって決定され
る。光’Ｃ＝ ＝ｉ＋ｅ ｉ１ハイブリッド形成反応の
表斤に便用する温度と地礫度に影響を及ぼし得る。化学
発光触媒は吸光体／発光体部分か許容できる温度と塩濃
度に対してｗｌ感であり得る。反応剤ポリヌクレオチド
配列の犬六さはハイフリット形成反応のｎｌｌｉ度及び
時間て影響する。同じ塩濃度と反応側濃度を仮定すると
、１０．０００ から１００．０００ ＋７）、；ｔＦ
囲の／ｘ応Ａｌヌクｖオチド配列を含むハイブリッド形
成は６７℃でおこるのに４０分から８０分を必υとし、
一方、２゜から１００のヌクレオチドを言むハイブリッ
ド形成は２５°Ｇで５分から３０分を８東とする。同様
に、反応剤と試料ポリヌクレオチド配列との〔Ｇ〕＋〔
Ｃａ含量はハイブリッド形成反応の温度と時１Ｍに影響
する。〔Ｇ〕十〔ｃ〕の重含ｉ４１をもっボ″リヌクレ
チド配列は
〔０〕十〔Ｃａの含量が少ないポリヌクレオ
チド配列よりも短かい時間でより低温でハイブリッド化
する。最後ニ、試料ポリヌクレオチド配夕υをっ（りそ
れを−木鎖の形で維持するのに用いる条件はハイブリッ
ド形成反応（で用いる温度、＃間及び塩濃度１（影響な
及ぼ−「ことができる、試料ポリヌクレオチド配列をっ
（るための条件はポリヌクレオチドの所要長さ及び［Ｇ
］＋［Ｃ）の含量によって影響される。一般だに、配列
が長いほどあるいは〔Ｇ〕モ〔Ｃ）の含量が多いほど、
必要とする温度及び（またレエ）塩濃度が１匹い。 図面に注目しながら、本発明をさらＶこ詳利＋１ｆＣｆ
ｉ明する。第１図に於ては、抗生物質耐性遺伝子の存在
を検定するための反応ｉｆ！ｓｓ−ポリヌクレオチドの
調製が１例えは解説されている。一般的１／コいえば、
植−及び第二の反応剤セグメントヲ・つくる最も実際的
な手段は問題として（・るユニーク配列を含む特電のポ
リヌクレオチドをまず分離することである。この場合に
、例えば細菌プラスミドの中に局在する抗生物質耐性遺
伝子はノラスミド乞適切な制限酵素の作用にかけること
によって得られる。問題とする遺伝子はゲル電気体動の
ような適当な方法によって他のフラグメントから分離さ
れる。 単離した遺伝子に次に、適切な制限酵素の作用にさらに
かげることによって接触端（Ｃｏ１ｔ ｔｚｇｕｏ＋＋
５ｅｎｄ ）ｆもつ二つ以上のセグメントに切断する。 便宜上かつ簡単のためには大ざっばに寺しい大きさをも
つ二個だけのセグメントをもつことか好ましいが、しか
し、二つより多いセグメントも同じく十分に使用でとる
。この二つの遺伝子セグメントは確認の目的で図中に於
てにＸ及びＹと標識をつけた。また、各セグメントの各
々のポリヌクレオチド ストラン白まさらに確認の慧体
で（−１−１！Ｅた゛は（−）と標示する。二つのセグ
メントは変性して四つの其なるＳＳ−ポリヌクレオチド
ゝ セグメントを遊離させる。環境は特記しないかぎり
、その選択は任意である。堀１図はＸ（−］とＹ（−）
を除去してＸ（ホ）とＹ（＋）のストランドヲ残すこと
を示しておりこれらのストランドゝは第−及び輿二のＳ
Ｓ−ポリヌクレオチド セグメントを表わし、これら（
・工、標的ｓｓ−ｒｅリヌクレオチドから分離される相
互に排析的であるそのヌクレオチドの部分に対して相補
性である。［ＸＴ−］ストランドとＹ （−１ストラン
ドを含むもとの一本鎖の串基配列は″標的″δＧ−ポリ
ヌクレオチドゝとなり、一つのＢＢ−ポリヌクレオチド
試料中のその存在がはじめの生理学的試料中の抗生物質
耐性（標的・）遺伝子の存在を表ゎ丁。〕このＸ （−
１ストランドとＹ（−］ストランドゝの除去は。 不動化したＸ（＋］及びＹ（ホ）のセグメントヘハイブ
リットゞ形成条件下でそれらのストランドを一丁ことに
よって、きわめて容易に達成できる。このような条件下
でｂｓ、Ｘ（−１及びＹ ｌ−］ストランドに不動化セ
グメントへ結合して、容易に系から除くことかできる。 残留するＸ（＋ｌ及びＹ（−１−１遺伝子セグメントの
ｗ、上端（・工状に５′一端末と６′一端末に標識かつ
けられる。Ｘｆ＋−３ｉ伝子セグメントは化学発光Ｐ＆
媒（ＣＬ５１で以て５′一端末にラベルされ、ｙ（−＋
；遺伝子セグメントは吸光体／発光体部分（Ａ／Ｅ）で
以て３′一端末にラベルされる。これらのラベルされた
ストランドはそれぞれ第−及び第二のＳＳ−ポリヌクレ
オチド８反応剤セグメントとなる。ハイブリッド形成に
あたって、化学発光触媒と吸光体／発光体部分は非放射
線エネルギー伝達を効果的に行なわせるのに十分な近さ
、一般的には相互の約１００Ａ以内に位置する。実際に
は、これら接成端への４識化を制限することか必要であ
るかもしれないしあるいは必要でないかもしれない。な
ぜならば、セグメントの他の端に−於ける余分のラベル
に、それらがエネルギー伝達がおこり始め得る相互の１
００Ａ以内にあるのでないかぎり１．凸い影響を及ぼさ
ないからである。それゆえ、約３０個より少ないヌクレ
オチド（〜９Ｏ−１０ＯＡの長さ）であるＳＳ−ポリヌ
クレオチド反応剤セグメントに一つ上・ては、接触端の
みかラベルされるべとである。長さが３０１固より多い
ヌクレオチド（〜１００Ａ）であるセグメントについて
は２両端をラベルすることかできる。後者の揚台には。 全部の５′一端［Ｘ（＋ｌとＹ（利〕を１し学兄光触媒
でラベルすることかで鍍、全部の６′一端〔χ（刑とＹ
（−ＦＩ〕を吸光体／発光体てラベルすることかできる
。５′一端末位を化学発光触媒で以てラベルしかつ３′
一端末位を吸光体／発九体恥分で以てラベルすること、
またにそれらの逆の操作ケすることの決定は任意的であ
り訪専体の官能性とオリ川する結□合方法によって決定
される。 −例として、Ｘ（＋］及びＹ［＋］のセグメントの６′
−翔をｆｉ Ｎ Ａ リガーゼを用いてアミノヘキサ／
−３’ −５’−７テノシンジホスフエートで以てラベ
ルすることができ、あるいは特定条件下でポリヌクレオ
チド ホスホリラーゼを用（・て、アミノヘギサ７−５
’ −アデノシンジホスフェートで以てラベルすること
ができる。このストランドに６′ 一端に於てアミノヘ
キシル官能基を含み、これを辿じて各棟の：及′＃、体
／発光体部分か容易に結合し得る。はルオキシダーゼの
ような化学発光触媒の５′一端への結合は短かいオリゴ
ヌクレオチビの連結体セグメントの合成を含む。これら
のセグメントは５′一端でアミノヘキサンーアテノシ／
ヌクレオチドを詮み約４１１Ｍ１から６個のアブノシン
ヌクレオチドまたはチミジンヌクレオチドの短かし・配
列かつながって（・る。この連結体セグメントは今、ｘ
（−１−）セグメント及びＹ（＋３セグメントのｂ’−
ＧｆｔｆＺへ、プラスミドＳ成についての組替えＬ）Ｎ
Ａ技術に於て普通に使われる塩基性配位子結合反Ｌ６を
適切に使用することによって付層させることかできる。 第２図は、二つのＳＳ−ポリヌクレオチド反応削セグメ
ントか試料ＳＳ−ポリヌクレオチドと検定を行なう際に
いかに相互反Ｌ６するがを解説する４、のである。いく
らかの試料ｗ１′、１ｉＩ・ｌが生理学的試料中で細胞
からＬＩＮＡ４たは）ＩＮＡを解放するのに必姿である
。好ましくは、はじめの生理学的試料からのポリヌクレ
オチドを単離してより籏縮された試料を形成させる。単
離された試料ＬＩＮＡは１−木ｇ４ポリヌクレオチド試
料ｊヶ形成′するよ５笈性せねはならない。これか本発
明の検定を行なう試料である。どのストランド［（−＋
−１ｆたは（−）〕が＆ −及び第二の反応剤セグメン
トヲつくるのに川（・られたかにかかわらず、このｓｓ
−ポリヌクレオチド試料は検定する遺伝子か晋ＪＢｉｖ
ｃ存在しているならば相補性ストランドを含んでいる。 第２図はＳ Ｓ −ポリヌクレオチド試料が二つの反応
剤セグメント及び他の化学発光剤と機成１−るときにお
こるハイブリッド形成を解説するものである。このよう
なハイブリッド形成は非放射性エネルギー伝達がおこる
よう、吸光体／発光体を化学発光触媒に近接して置く。 この化学発光エネルギー伝達は吸光体／発光体？励起し
、例えば螢光が図示のように発せられる。この検定から
のすべての元はｄＩ遇し−Ｃ背景にある化学発光を除去
し光電管ＶＣより−ＣＣ出出るのが好ましい。簡単にす
るために、丁べての反応剤を一つの溶液内に入れること
か好ましく、従って本検定に含まれる唯一の物理的ｊ阪
南（・工Ｌ； Ｓ −ポリヌクレオチド試料を添加する
ことであり、そしてもし、あれは放出される光を検出す
ることである。しかしまた、ハイブリッド形成をまず夷
、飛し続いて％小−のＳＳ−ポリヌクレオチドセグメン
トから化学発光応答をおこさせるのに昼型な他の化学発
光反応剤をさらに添加することも適当である。 第−及び第二のＳＳ−ポリヌクレオチド反応椅１１セグ
メントの両者がともに吸光体／発光体標識をつけられて
いる場合には、駆−の吸光体／発光体（工適切な波長の
光で以て照射され、そして第二の吸光体／発光体の放出
波長がバイブリットル成１隻ヲ決定するために追跡され
る〇 解説の目的のためにのみ示した本実施例からの多（の変
形は本発明の領域から外れることなしになし得ることは
、画業熟練者により予想されるであろう。
チド配列よりも短かい時間でより低温でハイブリッド化
する。最後ニ、試料ポリヌクレオチド配夕υをっ（りそ
れを−木鎖の形で維持するのに用いる条件はハイブリッ
ド形成反応（で用いる温度、＃間及び塩濃度１（影響な
及ぼ−「ことができる、試料ポリヌクレオチド配列をっ
（るための条件はポリヌクレオチドの所要長さ及び［Ｇ
］＋［Ｃ）の含量によって影響される。一般だに、配列
が長いほどあるいは〔Ｇ〕モ〔Ｃ）の含量が多いほど、
必要とする温度及び（またレエ）塩濃度が１匹い。 図面に注目しながら、本発明をさらＶこ詳利＋１ｆＣｆ
ｉ明する。第１図に於ては、抗生物質耐性遺伝子の存在
を検定するための反応ｉｆ！ｓｓ−ポリヌクレオチドの
調製が１例えは解説されている。一般的１／コいえば、
植−及び第二の反応剤セグメントヲ・つくる最も実際的
な手段は問題として（・るユニーク配列を含む特電のポ
リヌクレオチドをまず分離することである。この場合に
、例えば細菌プラスミドの中に局在する抗生物質耐性遺
伝子はノラスミド乞適切な制限酵素の作用にかけること
によって得られる。問題とする遺伝子はゲル電気体動の
ような適当な方法によって他のフラグメントから分離さ
れる。 単離した遺伝子に次に、適切な制限酵素の作用にさらに
かげることによって接触端（Ｃｏ１ｔ ｔｚｇｕｏ＋＋
５ｅｎｄ ）ｆもつ二つ以上のセグメントに切断する。 便宜上かつ簡単のためには大ざっばに寺しい大きさをも
つ二個だけのセグメントをもつことか好ましいが、しか
し、二つより多いセグメントも同じく十分に使用でとる
。この二つの遺伝子セグメントは確認の目的で図中に於
てにＸ及びＹと標識をつけた。また、各セグメントの各
々のポリヌクレオチド ストラン白まさらに確認の慧体
で（−１−１！Ｅた゛は（−）と標示する。二つのセグ
メントは変性して四つの其なるＳＳ−ポリヌクレオチド
ゝ セグメントを遊離させる。環境は特記しないかぎり
、その選択は任意である。堀１図はＸ（−］とＹ（−）
を除去してＸ（ホ）とＹ（＋）のストランドヲ残すこと
を示しておりこれらのストランドゝは第−及び輿二のＳ
Ｓ−ポリヌクレオチド セグメントを表わし、これら（
・工、標的ｓｓ−ｒｅリヌクレオチドから分離される相
互に排析的であるそのヌクレオチドの部分に対して相補
性である。［ＸＴ−］ストランドとＹ （−１ストラン
ドを含むもとの一本鎖の串基配列は″標的″δＧ−ポリ
ヌクレオチドゝとなり、一つのＢＢ−ポリヌクレオチド
試料中のその存在がはじめの生理学的試料中の抗生物質
耐性（標的・）遺伝子の存在を表ゎ丁。〕このＸ （−
１ストランドとＹ（−］ストランドゝの除去は。 不動化したＸ（＋］及びＹ（ホ）のセグメントヘハイブ
リットゞ形成条件下でそれらのストランドを一丁ことに
よって、きわめて容易に達成できる。このような条件下
でｂｓ、Ｘ（−１及びＹ ｌ−］ストランドに不動化セ
グメントへ結合して、容易に系から除くことかできる。 残留するＸ（＋ｌ及びＹ（−１−１遺伝子セグメントの
ｗ、上端（・工状に５′一端末と６′一端末に標識かつ
けられる。Ｘｆ＋−３ｉ伝子セグメントは化学発光Ｐ＆
媒（ＣＬ５１で以て５′一端末にラベルされ、ｙ（−＋
；遺伝子セグメントは吸光体／発光体部分（Ａ／Ｅ）で
以て３′一端末にラベルされる。これらのラベルされた
ストランドはそれぞれ第−及び第二のＳＳ−ポリヌクレ
オチド８反応剤セグメントとなる。ハイブリッド形成に
あたって、化学発光触媒と吸光体／発光体部分は非放射
線エネルギー伝達を効果的に行なわせるのに十分な近さ
、一般的には相互の約１００Ａ以内に位置する。実際に
は、これら接成端への４識化を制限することか必要であ
るかもしれないしあるいは必要でないかもしれない。な
ぜならば、セグメントの他の端に−於ける余分のラベル
に、それらがエネルギー伝達がおこり始め得る相互の１
００Ａ以内にあるのでないかぎり１．凸い影響を及ぼさ
ないからである。それゆえ、約３０個より少ないヌクレ
オチド（〜９Ｏ−１０ＯＡの長さ）であるＳＳ−ポリヌ
クレオチド反応剤セグメントに一つ上・ては、接触端の
みかラベルされるべとである。長さが３０１固より多い
ヌクレオチド（〜１００Ａ）であるセグメントについて
は２両端をラベルすることかできる。後者の揚台には。 全部の５′一端［Ｘ（＋ｌとＹ（利〕を１し学兄光触媒
でラベルすることかで鍍、全部の６′一端〔χ（刑とＹ
（−ＦＩ〕を吸光体／発光体てラベルすることかできる
。５′一端末位を化学発光触媒で以てラベルしかつ３′
一端末位を吸光体／発九体恥分で以てラベルすること、
またにそれらの逆の操作ケすることの決定は任意的であ
り訪専体の官能性とオリ川する結□合方法によって決定
される。 −例として、Ｘ（＋］及びＹ［＋］のセグメントの６′
−翔をｆｉ Ｎ Ａ リガーゼを用いてアミノヘキサ／
−３’ −５’−７テノシンジホスフエートで以てラベ
ルすることができ、あるいは特定条件下でポリヌクレオ
チド ホスホリラーゼを用（・て、アミノヘギサ７−５
’ −アデノシンジホスフェートで以てラベルすること
ができる。このストランドに６′ 一端に於てアミノヘ
キシル官能基を含み、これを辿じて各棟の：及′＃、体
／発光体部分か容易に結合し得る。はルオキシダーゼの
ような化学発光触媒の５′一端への結合は短かいオリゴ
ヌクレオチビの連結体セグメントの合成を含む。これら
のセグメントは５′一端でアミノヘキサンーアテノシ／
ヌクレオチドを詮み約４１１Ｍ１から６個のアブノシン
ヌクレオチドまたはチミジンヌクレオチドの短かし・配
列かつながって（・る。この連結体セグメントは今、ｘ
（−１−）セグメント及びＹ（＋３セグメントのｂ’−
ＧｆｔｆＺへ、プラスミドＳ成についての組替えＬ）Ｎ
Ａ技術に於て普通に使われる塩基性配位子結合反Ｌ６を
適切に使用することによって付層させることかできる。 第２図は、二つのＳＳ−ポリヌクレオチド反応削セグメ
ントか試料ＳＳ−ポリヌクレオチドと検定を行なう際に
いかに相互反Ｌ６するがを解説する４、のである。いく
らかの試料ｗ１′、１ｉＩ・ｌが生理学的試料中で細胞
からＬＩＮＡ４たは）ＩＮＡを解放するのに必姿である
。好ましくは、はじめの生理学的試料からのポリヌクレ
オチドを単離してより籏縮された試料を形成させる。単
離された試料ＬＩＮＡは１−木ｇ４ポリヌクレオチド試
料ｊヶ形成′するよ５笈性せねはならない。これか本発
明の検定を行なう試料である。どのストランド［（−＋
−１ｆたは（−）〕が＆ −及び第二の反応剤セグメン
トヲつくるのに川（・られたかにかかわらず、このｓｓ
−ポリヌクレオチド試料は検定する遺伝子か晋ＪＢｉｖ
ｃ存在しているならば相補性ストランドを含んでいる。 第２図はＳ Ｓ −ポリヌクレオチド試料が二つの反応
剤セグメント及び他の化学発光剤と機成１−るときにお
こるハイブリッド形成を解説するものである。このよう
なハイブリッド形成は非放射性エネルギー伝達がおこる
よう、吸光体／発光体を化学発光触媒に近接して置く。 この化学発光エネルギー伝達は吸光体／発光体？励起し
、例えば螢光が図示のように発せられる。この検定から
のすべての元はｄＩ遇し−Ｃ背景にある化学発光を除去
し光電管ＶＣより−ＣＣ出出るのが好ましい。簡単にす
るために、丁べての反応剤を一つの溶液内に入れること
か好ましく、従って本検定に含まれる唯一の物理的ｊ阪
南（・工Ｌ； Ｓ −ポリヌクレオチド試料を添加する
ことであり、そしてもし、あれは放出される光を検出す
ることである。しかしまた、ハイブリッド形成をまず夷
、飛し続いて％小−のＳＳ−ポリヌクレオチドセグメン
トから化学発光応答をおこさせるのに昼型な他の化学発
光反応剤をさらに添加することも適当である。 第−及び第二のＳＳ−ポリヌクレオチド反応椅１１セグ
メントの両者がともに吸光体／発光体標識をつけられて
いる場合には、駆−の吸光体／発光体（工適切な波長の
光で以て照射され、そして第二の吸光体／発光体の放出
波長がバイブリットル成１隻ヲ決定するために追跡され
る〇 解説の目的のためにのみ示した本実施例からの多（の変
形は本発明の領域から外れることなしになし得ることは
、画業熟練者により予想されるであろう。
駆１図に抗生物質耐性の検定を実ωｉする際に反応剤と
して使用するための、化学発光触媒及び吸光体／発光体
部分で以て標識？つけた、第−及び第二のＳＳ−ポリヌ
クレオチド反応剤セグメントの′調製を解説している。 第２図は試料及びホー、第二の反応剤ｓｓ−ポリヌクレ
オチド５ セグメントの間の相互反応を解説−ｆ６もの
で、標的ＳＳ−ポリヌクレオチドの存在がいかにして訪
起発光（螢光）をひきおこすかをボしている。 特許出願人 スタンダード・オイル・カンパニー（外２
名） 第１頁の続き ０発 明 者 ウィリアム・ダツドレイ・ブリヴアット アメリカ合衆国イリノイ州６０５１ ５ダウナース・グローブ・グラ ンド・ストリート１２０５ ０発 明 者 力ヴイト・アキン アメリカ合衆国イリノイ州６０５４ ０ネイパービル・インバーラリ −・ドライブ１４６２
して使用するための、化学発光触媒及び吸光体／発光体
部分で以て標識？つけた、第−及び第二のＳＳ−ポリヌ
クレオチド反応剤セグメントの′調製を解説している。 第２図は試料及びホー、第二の反応剤ｓｓ−ポリヌクレ
オチド５ セグメントの間の相互反応を解説−ｆ６もの
で、標的ＳＳ−ポリヌクレオチドの存在がいかにして訪
起発光（螢光）をひきおこすかをボしている。 特許出願人 スタンダード・オイル・カンパニー（外２
名） 第１頁の続き ０発 明 者 ウィリアム・ダツドレイ・ブリヴアット アメリカ合衆国イリノイ州６０５１ ５ダウナース・グローブ・グラ ンド・ストリート１２０５ ０発 明 者 力ヴイト・アキン アメリカ合衆国イリノイ州６０５４ ０ネイパービル・インバーラリ −・ドライブ１４６２
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ α）一本領ボリヌクレオチド試ｆ４をハイブリッド
形成条件下で標的θ）一本領ボリヌクレオチドの夷買上
相互に排析的な部分に相補性である第−及び第二の一本
鎖ポリヌクレオチド反応削セグメントと接触させ、第一
反応剤セクメントかそれに付着した化学発光触媒をもち
かつ第二反応剤セグメントかそれに付着した吸光体／発
九体部分乞もち、標的の一本鎖ポリヌクレオチト９との
ハイブリッド形成時に化学発光触媒と吸光体／発光体部
分とが非放射性エネルギー伝達を可能とするのに十分相
互に近接しているようにし； ｂ）一本領ポリヌクレオチド試料を、化学発光触媒の存
在下で光放出をおこさせるのに効果的な化学発光反応４
１１とさらに接触させ； そして； Ｃ）吸光体／発光体部分から放出される光の量を測定す
る； ことから成る。独特のポリヌクレオチド配列または遺伝
子セグメントを検定する方法。 ２、一本領ポリヌクレオチド配列料を化学発光反応剤と
接触させる前に第−及びｒニボリヌクレオチド反応剤セ
グメントと接触させる。特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 ６、化学発光触媒が投ルオキシダーゼとルシフェラーゼ
とから成る群から選ばれる。符０諸ボの範囲第１項に記
載の方法。 ４ 吸光体／発光体部分が螢光体と燐光体とから成る群
から選ばれる、特許請求の範囲第１８Ｊに記載の方法。 ５、ａ）生理学的試料中の二本鎖標的ポリヌクレオチド
ゞを開裂してポリヌクレオチドセグメントを形成させ； ｂ）ポリヌクレオチド セグメントを変性して一木釦ボ
リヌクレオチビ セグメントを得； Ｃ）ポリヌクレオチド セグメントの６′端に化学発光
触媒または吸光体／発光体部分のいずれかで以て標識を
つげ； そして ｃＬ）ポリヌクレオチド セグメントの５′端に段階（
Ｃ）に於て使用しなカーっだ触媒または吸光体／発光体
部分で以て標識をつける； ことによって、第−及び第二の一本頚ポリヌクレオチド
反応剤セグメントが得られる。特許請求の範囲第１項に
記載の方法。 ６、化学発光触媒をポリヌクレオチド反応剤セグメント
の５′端へ付着させかつ吸光体／発光体部分をポリヌク
レオチド反応剤セグメントの３′端へ付着させる。特許
請求の範囲第５項に記載の方法。 Ｚ 化学発光触媒をポリヌクレオチド セグメントの６
′端へ付着させかつ吸光体／発光体部分をポリヌクレオ
チド セグメントの５′端へ付着させる。特許請求の範
囲第５項に記載の・方法。 ８、 α）少くとも一つの化学発光触媒を付殖させかつ
標的−木鎖ポリヌクレオチトゝの一部に対して相補性で
ある。第一の一本鎖ボ１１ヌクレオチド反応剤セグメン
ト；ｂ）少くとも一つの吸光体／発光体を付着させかつ
標的一本鎖ポリヌクレオチドの一つの異なる実質上相互
に排析的な部分に対して相補性である、第二の一本頻ホ
リヌクレオチド反応剤セグメント； 及び Ｃ）化学発光触媒の存在で光放出をおこさせるのに有効
な化学発光反応剤； を含む、一本領ボリヌクレオチド試料中の標的一本鎖ポ
リヌクレオチドの存在を検出するための反応剤。 ９ 化学発光触媒を第一の一本鎖ポリヌクレオチド反応
剤セグメントの一つの端へ付着すせる。 特許請求の範囲第８項に記載の反応剤。 １０、吸光体／発光体部分を第二の一本鎖ポリヌクレオ
チビ反応剤セグメントの一つの端へ付着きせる１％許請
求の範囲第８項に記載の反応剤。 １１、第一の一本鎖ボリヌクレオチド反応剤セグメント
が化学発光触媒と吸光体／発光体部分とを含む、特ｉｆ
ｆ請求の範囲第８項に６ピ載の反応剤。 １２、第−及び第二の一本鎖ポリヌクレオチド反応剤セ
グメントの両者か化学発光触媒と吸光体／発光体部分と
を含む、特許請求の範囲第８項に記載の反応剤。 １６、化学発光触媒と吸光体／発光体部分とを第−及び
第二のポリヌクレオチド反応剤セグメントの両者の端へ
付着させる。特許請求の範囲第１２項に記載の反応剤。 １４、化学発光触媒を牟−及び第二の一本鎖ボリヌクレ
オチド反応剤セグメントの３′端に付着させ、かつ吸光
体／発光体を第−及び第二の一本鎖ボリヌクレオチド反
応剤セグメントの５′端へ付着させる、特、ｆ−Ｔ−請
求の範囲第１６項にｄ記載の反応剤。 １５、化学発光触媒がはルオキシダーゼとルンフエラー
ゼとから成る群から選ばれる。特許請求の範囲第１４項
に記載の反応剤。 １６、吸光体／発光体部分が螢光体と燐光体とから成る
群から選ばれる、′＋ｆ許請求の範囲第１４項記載の反
応剤。 １Ｚ α）ｌ一本領ボリヌクレオチトゞ試料をノ・イブ
リッド形成条件下で、標的−Ａ鎖ポ リヌクレオチドの実質上相互に耕析的 な部分に対して相補性である匡−及び 第二の一本鎖ポリヌークレオチド セグメントを含む反
応剤溶液と接触させ、 上記の第−及び第二のセグメントの回 者が異る吸光体／発光体部分を付着さ せて持ち、標的一本鎖ポリヌクレオチ ドとのハイブリッド形成時に吸光体／ 発光体部分が非放射性エネルギー伝達 を可能とするのに十分相互に近法して いるようにし； ｂ）この試料を吸光体／発光体部分の一つを励起するの
に十分な光で以て照射 し； そして。 Ｃ）他の吸光体／発光体加分からの光応答を訓示する； ことからなる、独特のポリヌクレオチド配列また、は遺
伝子セグメントを検定する方法。 １８、標的−木鐸ポリヌクレオチドの実買上相互に排析
的な部分に対して相補性である第−及び第二の一本領ボ
リヌクレオチド セグメントヲｔみ；この第−及び第二
のセグメントの両者が異なる吸光体／発光体部分を付海
させてもち、標的−水銀ポリヌクレオチドとのハイブリ
ッド形成時に吸光体／発光体部分が非放射性エネルギー
伝達を可能とするのに十分相互に近接しているようにす
る；反応剤溶液。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28446981A | 1981-07-17 | 1981-07-17 | |
| US284469 | 1981-07-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5823795A true JPS5823795A (ja) | 1983-02-12 |
| JPH0317480B2 JPH0317480B2 (ja) | 1991-03-08 |
Family
ID=23090332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57124293A Granted JPS5823795A (ja) | 1981-07-17 | 1982-07-16 | ポリヌクレオチドの検定方法およびこの方法に用いる反応剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0070685B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5823795A (ja) |
| CA (1) | CA1190838A (ja) |
| DE (1) | DE3266934D1 (ja) |
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