JPH1017573A - ボロン酸誘導体から成る核酸処理試薬 - Google Patents
ボロン酸誘導体から成る核酸処理試薬Info
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- JPH1017573A JPH1017573A JP19561396A JP19561396A JPH1017573A JP H1017573 A JPH1017573 A JP H1017573A JP 19561396 A JP19561396 A JP 19561396A JP 19561396 A JP19561396 A JP 19561396A JP H1017573 A JPH1017573 A JP H1017573A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡなど核酸を処理するための新しいタイ
プの物質を提供する。 【解決手段】 紫外または可視領域の光エネルギーを吸
収して蛍光または紫外光として発光する発光性官能基ま
たは原子団にＢ( ＯＨ )2 が結合した構造を有し、核酸
のホスホジエステル結合に結合するボロン酸誘導体から
成る核酸処理試薬。発光性官能基（原子団）としては、
ピレン基などが好ましい。核酸への結合性を利用して核
酸の定量や標識化を行うことができる。また、紫外線な
どの照射下に核酸のホスホジエステル結合を切断するこ
とができ、これを利用して核酸の切断を行うこともでき
る。核酸の切断は糖によりコントロールされる。
プの物質を提供する。 【解決手段】 紫外または可視領域の光エネルギーを吸
収して蛍光または紫外光として発光する発光性官能基ま
たは原子団にＢ( ＯＨ )2 が結合した構造を有し、核酸
のホスホジエステル結合に結合するボロン酸誘導体から
成る核酸処理試薬。発光性官能基（原子団）としては、
ピレン基などが好ましい。核酸への結合性を利用して核
酸の定量や標識化を行うことができる。また、紫外線な
どの照射下に核酸のホスホジエステル結合を切断するこ
とができ、これを利用して核酸の切断を行うこともでき
る。核酸の切断は糖によりコントロールされる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を処理するた
めの新しいタイプの物質に関し、より詳細には、ＤＮＡ
など核酸に作用してその定量、切断、標識化などの処理
に使用されるのに好適な核酸処理試薬に関する。
めの新しいタイプの物質に関し、より詳細には、ＤＮＡ
など核酸に作用してその定量、切断、標識化などの処理
に使用されるのに好適な核酸処理試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】遺伝子操作技術の発達は、医
学、化学、農学、生物学などの分野において基礎研究お
よび実用的な応用の両面から多大の貢献を果たしてい
る。この遺伝子操作における最も基本的で且つ重要な技
術は、ＤＮＡで代表される核酸を分析したり、切断もし
くは連結したり、さらには標識化する等各種処理を施す
ことである。
学、化学、農学、生物学などの分野において基礎研究お
よび実用的な応用の両面から多大の貢献を果たしてい
る。この遺伝子操作における最も基本的で且つ重要な技
術は、ＤＮＡで代表される核酸を分析したり、切断もし
くは連結したり、さらには標識化する等各種処理を施す
ことである。
【０００３】例えば、遺伝子組換えにおける各段階にお
いてＤＮＡを定量することが必要とされている。また、
各種の酵素を用いてＤＮＡを規則的またはランダムに切
断することも遺伝子操作に不可欠なテクニックの一つで
あり、例えば、ニックトランスレーションやショットガ
ンクローニングなどの方法においてＤＮＡをランダムに
切断することが行われている。さらに、ＤＮＡの分析に
際してＤＮＡを適当な手段で標識して可視化することも
重要であり、例えば、リンやイオウの放射性同位元素を
含む標識剤が使用されている。
いてＤＮＡを定量することが必要とされている。また、
各種の酵素を用いてＤＮＡを規則的またはランダムに切
断することも遺伝子操作に不可欠なテクニックの一つで
あり、例えば、ニックトランスレーションやショットガ
ンクローニングなどの方法においてＤＮＡをランダムに
切断することが行われている。さらに、ＤＮＡの分析に
際してＤＮＡを適当な手段で標識して可視化することも
重要であり、例えば、リンやイオウの放射性同位元素を
含む標識剤が使用されている。
【０００４】これらの手法は、遺伝子操作における確立
された技術として慣用されているものであるが、さらに
改良を加えたり、新しいテクニックや試薬を開発するこ
とは、研究や産業の一層の発展のために常時所望されて
いるところである。
された技術として慣用されているものであるが、さらに
改良を加えたり、新しいテクニックや試薬を開発するこ
とは、研究や産業の一層の発展のために常時所望されて
いるところである。
【０００５】例えば、ＤＮＡの定量のために現在専ら採
用されている方法は、ＤＮＡの特性吸収（２６０ｎｍに
おいてモル吸光係数１６００〜１００００の吸収最大を
有する）を利用した吸光光度法であるが、この方法は試
料の濃度が非常に低い時や試料の液量が少ないときは使
用できず、さらに高感度の方法が見出されることが望ま
しい。また、ＤＮＡを切断する技術においては、切断の
コントロールを随意に行うようなことができれば新たな
展開が期待される。さらに、ＤＮＡの検出のために従来
より行われてきた放射性同位元素による標識法は、環境
や生体に及ぼす影響を考慮して代替法の開発が進められ
ている。
用されている方法は、ＤＮＡの特性吸収（２６０ｎｍに
おいてモル吸光係数１６００〜１００００の吸収最大を
有する）を利用した吸光光度法であるが、この方法は試
料の濃度が非常に低い時や試料の液量が少ないときは使
用できず、さらに高感度の方法が見出されることが望ま
しい。また、ＤＮＡを切断する技術においては、切断の
コントロールを随意に行うようなことができれば新たな
展開が期待される。さらに、ＤＮＡの検出のために従来
より行われてきた放射性同位元素による標識法は、環境
や生体に及ぼす影響を考慮して代替法の開発が進められ
ている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、核酸に作用
し、遺伝子操作における上述したような各種の核酸処理
に使用し得る全く新しいタイプの物質を見出したことに
基づく。すなわち、本発明は、紫外または可視領域の光
エネルギーを吸収して蛍光または紫外光として発光する
発光性官能基または原子団にＢ( ＯＨ )2 結合した構造
を有し、核酸のホスホジエステル結合に結合する性質を
有するボロン酸誘導体から成る核酸処理試薬を提供する
ものである。Ｂ( ＯＨ )2 は、一般的には、１つ結合さ
れているが、発光性官能基または原子団の構造に応じて
複数結合されていることもある。発光性の官能基または
原子団の特に好ましい例としては、ピレン基、テトラキ
ス（Ｎ−メチル）ピリジルポルフィリン基、アントラセ
ン基、メチルピリジル基、およびフェロセン基等が挙げ
られる。
し、遺伝子操作における上述したような各種の核酸処理
に使用し得る全く新しいタイプの物質を見出したことに
基づく。すなわち、本発明は、紫外または可視領域の光
エネルギーを吸収して蛍光または紫外光として発光する
発光性官能基または原子団にＢ( ＯＨ )2 結合した構造
を有し、核酸のホスホジエステル結合に結合する性質を
有するボロン酸誘導体から成る核酸処理試薬を提供する
ものである。Ｂ( ＯＨ )2 は、一般的には、１つ結合さ
れているが、発光性官能基または原子団の構造に応じて
複数結合されていることもある。発光性の官能基または
原子団の特に好ましい例としては、ピレン基、テトラキ
ス（Ｎ−メチル）ピリジルポルフィリン基、アントラセ
ン基、メチルピリジル基、およびフェロセン基等が挙げ
られる。
【０００７】本発明に従うボロン酸誘導体は、ＤＮＡな
どのホスホジエステル結合に結合することを特徴とす
る。すなわち、本発明に従うボロン酸誘導体は、ヌクレ
オチドのリン酸／糖結合部位にホウ素原子を介して結合
する性質を有し、そして、本発明のボロン酸誘導体は発
光性の官能基または原子団を含んでいるのでこの結合を
分光学的に検出することができる。
どのホスホジエステル結合に結合することを特徴とす
る。すなわち、本発明に従うボロン酸誘導体は、ヌクレ
オチドのリン酸／糖結合部位にホウ素原子を介して結合
する性質を有し、そして、本発明のボロン酸誘導体は発
光性の官能基または原子団を含んでいるのでこの結合を
分光学的に検出することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】上述のような性質を利用すること
により、本発明のボロン酸誘導体は、遺伝子操作技術に
おける新しいタイプの試薬として各種の用途が可能であ
る。例えば、本発明に従えば、上記のボロン酸誘導体を
核酸に添加して該ボロン酸化合物を核酸に結合させ、ボ
ロン酸誘導体／核酸複合体の量を分光学的に分析するこ
とから成る核酸の定量方法が提供される。したがって、
本発明は、別の視点として、上記のボロン酸誘導体から
成る核酸定量試薬を提供する。
により、本発明のボロン酸誘導体は、遺伝子操作技術に
おける新しいタイプの試薬として各種の用途が可能であ
る。例えば、本発明に従えば、上記のボロン酸誘導体を
核酸に添加して該ボロン酸化合物を核酸に結合させ、ボ
ロン酸誘導体／核酸複合体の量を分光学的に分析するこ
とから成る核酸の定量方法が提供される。したがって、
本発明は、別の視点として、上記のボロン酸誘導体から
成る核酸定量試薬を提供する。
【０００９】本発明に従うボロン酸誘導体を用いる核酸
定量法は、きわめて低濃度の核酸の分析が可能であり、
従来の方法がｍＭオーダーの分析しかできなかったのに
対し、μＭオーダーの濃度も精度よく定量することがで
きる。例えば、発光性官能基（原子団）がピレン基であ
るピレンボロン酸を用いる場合、数μＭから数百μＭの
ＤＮＡ濃度に直線的に比例してピレン基に起因する分光
データ（蛍光強度）が変化することが認められており、
これを利用して高精度のＤＮＡ定量分析が可能である。
定量法は、きわめて低濃度の核酸の分析が可能であり、
従来の方法がｍＭオーダーの分析しかできなかったのに
対し、μＭオーダーの濃度も精度よく定量することがで
きる。例えば、発光性官能基（原子団）がピレン基であ
るピレンボロン酸を用いる場合、数μＭから数百μＭの
ＤＮＡ濃度に直線的に比例してピレン基に起因する分光
データ（蛍光強度）が変化することが認められており、
これを利用して高精度のＤＮＡ定量分析が可能である。
【００１０】また、本発明のボロン酸誘導体は、光（紫
外線、可視光）の照射下に、核酸のホスホジエステル結
合を切断するという、きわめてユニークな性質を有する
ことも見出された。かくして、本発明に従えば、上記の
ようなボロン酸誘導体を核酸に添加し紫外線または可視
光を照射して該核酸のホスホジエステル結合を切断する
ことから成る核酸の切断方法が提供される。したがっ
て、本発明は、別の視点として、上記のボロン酸誘導体
から成る、ヌクレアーゼ酵素類似の人工的な核酸切断用
試薬を提供する。
外線、可視光）の照射下に、核酸のホスホジエステル結
合を切断するという、きわめてユニークな性質を有する
ことも見出された。かくして、本発明に従えば、上記の
ようなボロン酸誘導体を核酸に添加し紫外線または可視
光を照射して該核酸のホスホジエステル結合を切断する
ことから成る核酸の切断方法が提供される。したがっ
て、本発明は、別の視点として、上記のボロン酸誘導体
から成る、ヌクレアーゼ酵素類似の人工的な核酸切断用
試薬を提供する。
【００１１】そして、本発明のボロン酸誘導体を用いる
核酸切断法の特徴は、糖の添加により該切断をコントロ
ールできるということである。例えば、発光性官能基
（原子団）がピレン基であるピレンボロン酸をＤＮＡに
添加して紫外線を照射するとＤＮＡは切断されるが、こ
の系にＤ−グルコースやＤ−フラクトースのような糖を
添加すると同様に紫外線を照射してもＤＮＡは切断され
ない。
核酸切断法の特徴は、糖の添加により該切断をコントロ
ールできるということである。例えば、発光性官能基
（原子団）がピレン基であるピレンボロン酸をＤＮＡに
添加して紫外線を照射するとＤＮＡは切断されるが、こ
の系にＤ−グルコースやＤ−フラクトースのような糖を
添加すると同様に紫外線を照射してもＤＮＡは切断され
ない。
【００１２】上述したようなボロン酸誘導体を用いる本
発明のＤＮＡ切断は、当該ボロン酸誘導体に応じて異な
る様式のＤＮＡ切断を行うという特徴がある。すなわ
ち、濃度の低いときは、トポイソメラーゼのように閉じ
たプラスミドのねじれをほどいたり線状化するように作
用し、濃度が高くなると、Ｓ１ヌクレアーゼやＤＮａｓ
ｅＩのようにＤＮＡをランダムに切断する。そして、こ
の際、糖の存在によってＤＮＡ切断をコントロールでき
る。
発明のＤＮＡ切断は、当該ボロン酸誘導体に応じて異な
る様式のＤＮＡ切断を行うという特徴がある。すなわ
ち、濃度の低いときは、トポイソメラーゼのように閉じ
たプラスミドのねじれをほどいたり線状化するように作
用し、濃度が高くなると、Ｓ１ヌクレアーゼやＤＮａｓ
ｅＩのようにＤＮＡをランダムに切断する。そして、こ
の際、糖の存在によってＤＮＡ切断をコントロールでき
る。
【００１３】ＤＮＡなどの核酸が本発明に従うボロン酸
誘導体によって切断される理由は必ずしも完全には理解
されていないが、次のように理解できる：ボロン酸誘導
体はほぼ中性のｐＨ領域で正の電荷を帯びているためこ
のｐＨで負の電荷を帯びるＤＮＡと静電的に結合する。
この状態で光を照射するとボロン酸誘導体が光のエネル
ギーを吸収し、このエネルギーがホウ素原子に伝えら
れ、ホウ素と結合したＤＮＡなどの鎖の部分である糖と
リン酸のエステル結合をラジカル的に切断することにな
る。
誘導体によって切断される理由は必ずしも完全には理解
されていないが、次のように理解できる：ボロン酸誘導
体はほぼ中性のｐＨ領域で正の電荷を帯びているためこ
のｐＨで負の電荷を帯びるＤＮＡと静電的に結合する。
この状態で光を照射するとボロン酸誘導体が光のエネル
ギーを吸収し、このエネルギーがホウ素原子に伝えら
れ、ホウ素と結合したＤＮＡなどの鎖の部分である糖と
リン酸のエステル結合をラジカル的に切断することにな
る。
【００１４】さらに、本発明に従うボロン酸誘導体は、
ＤＮＡなどの核酸に結合する性質を利用してＤＮＡなど
に対する標識物質としての用途も有する。この際、本発
明のボロン酸誘導体は、発蛍光など分光学的手段によっ
て検出されるので、従来の放射性同位元素を使用するこ
とに伴う問題は解消される。
ＤＮＡなどの核酸に結合する性質を利用してＤＮＡなど
に対する標識物質としての用途も有する。この際、本発
明のボロン酸誘導体は、発蛍光など分光学的手段によっ
て検出されるので、従来の放射性同位元素を使用するこ
とに伴う問題は解消される。
【００１５】したがって、本発明は、上記のボロン酸誘
導体を核酸に添加して該ボロン酸誘導体を核酸に結合さ
せ、ボロン酸誘導体に因る蛍光を測定することにより核
酸の存在を検出することから成る核酸の標識化方法を提
供し、さらに、そのようなボロン酸誘導体から成る核酸
標識化試薬を提供する。
導体を核酸に添加して該ボロン酸誘導体を核酸に結合さ
せ、ボロン酸誘導体に因る蛍光を測定することにより核
酸の存在を検出することから成る核酸の標識化方法を提
供し、さらに、そのようなボロン酸誘導体から成る核酸
標識化試薬を提供する。
【００１６】本発明において用いる上記式（Ｉ）のボロ
ン酸誘導体は、既知の合成法を工夫することにより比較
的容易に合成することができ、その製造コストも従来よ
り使用されているヌクレアーゼ酵素の価格よりも非常に
安価である。ボロン酸誘導体の合成に用いられている最
も一般的な方法は、有機リチウム試薬、グリニアール試
薬（ RMgX ) などの有機金属化合物と、ホウ酸エステル
の金属交換（トランスメタレーション）反応によるもの
である。炭素基の導入を１つで停止させボリン酸やボラ
ンの生成を避けるため、冷却（通常−７８℃）したホウ
酸エステル（有機金属に対し正確に１当量または過剰量
を使用）の溶液に、滴下漏斗またはキャヌラを通して有
機金属の溶液を滴下することにより反応を進行させる。
得られた反応混合物を室温まで放置し、希酸で加水分解
することにより目的のボロン酸誘導体が得られる。
ン酸誘導体は、既知の合成法を工夫することにより比較
的容易に合成することができ、その製造コストも従来よ
り使用されているヌクレアーゼ酵素の価格よりも非常に
安価である。ボロン酸誘導体の合成に用いられている最
も一般的な方法は、有機リチウム試薬、グリニアール試
薬（ RMgX ) などの有機金属化合物と、ホウ酸エステル
の金属交換（トランスメタレーション）反応によるもの
である。炭素基の導入を１つで停止させボリン酸やボラ
ンの生成を避けるため、冷却（通常−７８℃）したホウ
酸エステル（有機金属に対し正確に１当量または過剰量
を使用）の溶液に、滴下漏斗またはキャヌラを通して有
機金属の溶液を滴下することにより反応を進行させる。
得られた反応混合物を室温まで放置し、希酸で加水分解
することにより目的のボロン酸誘導体が得られる。
【００１７】本発明に従い核酸の定量、切断、標識化等
の核酸の処理に使用されるのに好適な核酸試薬用ボロン
酸誘導体の好ましい例は、以下の構造式〔化１〕〜〔化
５〕で表されるものであり、それぞれ、発光性官能基
（原子団）が、ピレン基、テトラキス（Ｎ−メチルピリ
ジル）ポルフィリン基、アントラセン基、メチルピリジ
ル基、およびフェロセン基のボロン酸誘導体である。
の核酸の処理に使用されるのに好適な核酸試薬用ボロン
酸誘導体の好ましい例は、以下の構造式〔化１〕〜〔化
５〕で表されるものであり、それぞれ、発光性官能基
（原子団）が、ピレン基、テトラキス（Ｎ−メチルピリ
ジル）ポルフィリン基、アントラセン基、メチルピリジ
ル基、およびフェロセン基のボロン酸誘導体である。
【００１８】
【化１】
【００１９】
【化２】
【００２０】
【化３】
【００２１】
【化４】
【００２２】
【化５】
【００２３】なお、本発明の説明に関連して用いる核酸
とは、一般的には、ＤＮＡおよびＲＮＡを指称するが、
ＤＮＡやＲＮＡと同様のホスホジエステル結合を有する
天然または合成の類縁化合物の処理にも本発明のボロン
酸誘導体を使用することができる。
とは、一般的には、ＤＮＡおよびＲＮＡを指称するが、
ＤＮＡやＲＮＡと同様のホスホジエステル結合を有する
天然または合成の類縁化合物の処理にも本発明のボロン
酸誘導体を使用することができる。
【００２４】
【実施例】以下、本発明の特徴をさらに明らかにするた
め実施例に沿って本発明を説明するが、本発明は、これ
らの実施例によって限定されるものではない。
め実施例に沿って本発明を説明するが、本発明は、これ
らの実施例によって限定されるものではない。
【００２５】実施例１：ピレンボロン酸の調製 上記の式〔化１〕で表されるピレンボロン酸を以下のよ
うに合成した。１−ブロモピレン４．２２ｇ，１．６Ｍ
のｎ−ブチルリチウム１０．６ｍｌを無水エーテル２１
０ｍｌと０℃で混合し、これを０℃で１時間攪拌した。
内容物をトリメチルボレイト７．９ｇ、無水エーテル２
０ｍｌの入った別のフラスコに注ぎ−７８℃で３０分間
以上かけて徐々に注ぎ入れた。混合物を−７０℃〜−５
０℃で３時間攪拌し、さらに室温で６０時間攪拌した。
その後、８０ｍｌの２Ｎ塩酸を加え２時間攪拌した。エ
ーテル各分を２００ｍｌの水で２回洗浄した。有機層を
まとめて硫酸マグネシウムにて乾燥し、続いてろ過、濃
縮を行った。残さを５０℃で真空乾燥し、目的物２．２
５ｇ（収率６０．９％）を薄黄色固体として得られた化
合物について以下の分析結果を得た。 （１）融点：２９３−２９７℃ （２）ＴＬＣ：（クロロフォルム）Ｒｆ＝０．１６ （３）プロトン核磁気共鳴スペクトル ８．７３（ｄ，Ｊ＝９，１Ｈ，２位−プロトン）、８．
０１〜８．３１（ｍ，８Ｈ，３〜１０位−プロトン） （４）質量分析スペクトル（ＥＩ；ｍ／ｅ＝１９８（Ｍ
+ ）） これらの分析結果より〔化１〕のボロン酸誘導体である
ことが確認できた。
うに合成した。１−ブロモピレン４．２２ｇ，１．６Ｍ
のｎ−ブチルリチウム１０．６ｍｌを無水エーテル２１
０ｍｌと０℃で混合し、これを０℃で１時間攪拌した。
内容物をトリメチルボレイト７．９ｇ、無水エーテル２
０ｍｌの入った別のフラスコに注ぎ−７８℃で３０分間
以上かけて徐々に注ぎ入れた。混合物を−７０℃〜−５
０℃で３時間攪拌し、さらに室温で６０時間攪拌した。
その後、８０ｍｌの２Ｎ塩酸を加え２時間攪拌した。エ
ーテル各分を２００ｍｌの水で２回洗浄した。有機層を
まとめて硫酸マグネシウムにて乾燥し、続いてろ過、濃
縮を行った。残さを５０℃で真空乾燥し、目的物２．２
５ｇ（収率６０．９％）を薄黄色固体として得られた化
合物について以下の分析結果を得た。 （１）融点：２９３−２９７℃ （２）ＴＬＣ：（クロロフォルム）Ｒｆ＝０．１６ （３）プロトン核磁気共鳴スペクトル ８．７３（ｄ，Ｊ＝９，１Ｈ，２位−プロトン）、８．
０１〜８．３１（ｍ，８Ｈ，３〜１０位−プロトン） （４）質量分析スペクトル（ＥＩ；ｍ／ｅ＝１９８（Ｍ
+ ）） これらの分析結果より〔化１〕のボロン酸誘導体である
ことが確認できた。
【００２６】実施例２：ピレンボロン酸によるＤＮＡの
定量 実施例１のように合成した式〔化１〕のピレンボロン酸
を用いてＤＮＡの定量実験を行った。ＤＮＡは牛胸腺由
来のＤＮＡ（ファルマシア社製、分子量：３．５６×１
０6ダルトン）を使用した。この乾燥ＤＮＡを、ＤＮＡ
分解酵素の活性をなくす目的でオートクレーブ処理（１
２１℃で２０分間）した純水（ｐＨは中性）に溶解させ
てＤＮＡ原液とし、これにピレンボロン酸を添加した。
ピレンボロン酸／ＤＮＡ複合体の量に応じて発光する、
ピレン由来の蛍光の強度を蛍光分光光度計で測定した。
蛍光分光光度計は−７７型（日本分光社製）を使用し
た。条件は励起波長３４６ｎｍ、測定波長３８０ｎｍで
行った。結果を図１に示した。ピレンボロン酸濃度０．
４μＭで、ＤＮＡ濃度が２０から５０μＭ濃度の範囲に
おいて直線関係（相関係数０．９９８）が得られた。こ
のようにピレンボロン酸を用いることにより高感度でＤ
ＮＡの定量が可能であることが確認された。
定量 実施例１のように合成した式〔化１〕のピレンボロン酸
を用いてＤＮＡの定量実験を行った。ＤＮＡは牛胸腺由
来のＤＮＡ（ファルマシア社製、分子量：３．５６×１
０6ダルトン）を使用した。この乾燥ＤＮＡを、ＤＮＡ
分解酵素の活性をなくす目的でオートクレーブ処理（１
２１℃で２０分間）した純水（ｐＨは中性）に溶解させ
てＤＮＡ原液とし、これにピレンボロン酸を添加した。
ピレンボロン酸／ＤＮＡ複合体の量に応じて発光する、
ピレン由来の蛍光の強度を蛍光分光光度計で測定した。
蛍光分光光度計は−７７型（日本分光社製）を使用し
た。条件は励起波長３４６ｎｍ、測定波長３８０ｎｍで
行った。結果を図１に示した。ピレンボロン酸濃度０．
４μＭで、ＤＮＡ濃度が２０から５０μＭ濃度の範囲に
おいて直線関係（相関係数０．９９８）が得られた。こ
のようにピレンボロン酸を用いることにより高感度でＤ
ＮＡの定量が可能であることが確認された。
【００２７】実施例３：ピレンボロン酸によるＤＮＡの
切断 ＤＮＡは Col EI プラスミドＤＮＡ（ニッポンジーン社
製、分子量：４．２×１０6 ダルトン、濃度：１．８×
１０-6Ｍ）を使用した。この乾燥ＤＮＡを、ＤＮＡ分解
酵素の活性をなくす目的でオートクレーブ処理した純水
（ｐＨは中性）に溶解させてＤＮＡ原液とし、これに実
施例１で調製したピレンボロン酸を添加してＤＮＡの切
断実験を行った。ＤＮＡ切断反応は温度３０℃、ｐＨ
７．５の炭酸緩衝液中で３６５ｎｍの光を３０分間照射
した。試料について電気泳動を行い、ＤＮＡの切断の有
無を確認した。電気泳動の結果を図２および図３に示
す。
切断 ＤＮＡは Col EI プラスミドＤＮＡ（ニッポンジーン社
製、分子量：４．２×１０6 ダルトン、濃度：１．８×
１０-6Ｍ）を使用した。この乾燥ＤＮＡを、ＤＮＡ分解
酵素の活性をなくす目的でオートクレーブ処理した純水
（ｐＨは中性）に溶解させてＤＮＡ原液とし、これに実
施例１で調製したピレンボロン酸を添加してＤＮＡの切
断実験を行った。ＤＮＡ切断反応は温度３０℃、ｐＨ
７．５の炭酸緩衝液中で３６５ｎｍの光を３０分間照射
した。試料について電気泳動を行い、ＤＮＡの切断の有
無を確認した。電気泳動の結果を図２および図３に示
す。
【００２８】図２の電気泳動パターンのうち、レーン１
はＤＮＡ原液のパターンであり、切れ目のないよじれの
入った Closed Circular ＤＮＡ（タイプＩ）型プラス
ミドと、１ヵ所切断されたよじれのない Open Circula
r ＤＮＡ（タイプ II ）型プラスミドを含むことが認め
られる。比較のために制限酵素（ EcoRI )を加えるとレ
ーン２に示されるように２ヵ所切断された線状の Linea
r ＤＮＡ（タイプ III）に切断されていることが理解さ
れる。これに対して、ピレンボロン酸（濃度４．０×１
０-6Ｍ）を添加すると光照射しない場合は切断されてい
ないが（レーン３）、上述のように光照射すると１ヵ所
切断されてタイプIIに変化したことが認められる（レー
ン４）。しかし、同じ濃度のピレンボロン酸を添加し光
照射してもＤ−フラクトース（濃度１ｍＭ）を存在させ
るとＤＮＡは切断されず（レーン５）、同様に、ピレン
ボロン酸を添加し光照射してもＤ−グルコース（濃度１
０ｍＭ）を存在させるとＤＮＡの切断は認められなった
（レーン６）。
はＤＮＡ原液のパターンであり、切れ目のないよじれの
入った Closed Circular ＤＮＡ（タイプＩ）型プラス
ミドと、１ヵ所切断されたよじれのない Open Circula
r ＤＮＡ（タイプ II ）型プラスミドを含むことが認め
られる。比較のために制限酵素（ EcoRI )を加えるとレ
ーン２に示されるように２ヵ所切断された線状の Linea
r ＤＮＡ（タイプ III）に切断されていることが理解さ
れる。これに対して、ピレンボロン酸（濃度４．０×１
０-6Ｍ）を添加すると光照射しない場合は切断されてい
ないが（レーン３）、上述のように光照射すると１ヵ所
切断されてタイプIIに変化したことが認められる（レー
ン４）。しかし、同じ濃度のピレンボロン酸を添加し光
照射してもＤ−フラクトース（濃度１ｍＭ）を存在させ
るとＤＮＡは切断されず（レーン５）、同様に、ピレン
ボロン酸を添加し光照射してもＤ−グルコース（濃度１
０ｍＭ）を存在させるとＤＮＡの切断は認められなった
（レーン６）。
【００２９】図３は、ピレンボロン酸の濃度を高くした
場合のＤＮＡ切断電気泳動パターンを示すものであり、
図２の場合と同様にレーン１は原液ＤＮＡ、また、レー
ン２は制限酵素（ EcoRI )を加えた場合のパターンであ
る。ピレンボロンを添加し（濃度８．０×１０-6Ｍ）、
上述のように光照射するとタイプIIの他に、２ヵ所切断
されたタイプIII の存在が認められる（レーン３）。し
かし、同じ濃度のピレンボロン酸を添加し光照射しても
Ｄ−フラクトース（濃度１ｍＭ）を存在させるとＤＮＡ
は切断されず（レーン４）、同様に、ピレンボロン酸を
添加し光照射してもＤ−グルコース（濃度１０ｍＭ）を
存在させるとＤＮＡの切断は認められなかった（レーン
５）。
場合のＤＮＡ切断電気泳動パターンを示すものであり、
図２の場合と同様にレーン１は原液ＤＮＡ、また、レー
ン２は制限酵素（ EcoRI )を加えた場合のパターンであ
る。ピレンボロンを添加し（濃度８．０×１０-6Ｍ）、
上述のように光照射するとタイプIIの他に、２ヵ所切断
されたタイプIII の存在が認められる（レーン３）。し
かし、同じ濃度のピレンボロン酸を添加し光照射しても
Ｄ−フラクトース（濃度１ｍＭ）を存在させるとＤＮＡ
は切断されず（レーン４）、同様に、ピレンボロン酸を
添加し光照射してもＤ−グルコース（濃度１０ｍＭ）を
存在させるとＤＮＡの切断は認められなかった（レーン
５）。
【００３０】実施例４：ポルフィリンボロン酸の合成 実施例１と同様の方法により上述の式〔化２〕のポルフ
ィリンボロン酸を合成した。すなわち、５，１０，１
５，２０−テトラキス（４−ピリジル）ポルフィリン２
００ｍｇと２−ブロモメチルフェニルボロン酸を脱水Ｄ
ＭＦ３０ｍｌに溶解した。その後この溶液を８０℃に加
熱し、２４時間反応を行った。溶媒を減圧除去し、残さ
をアセトンに溶かした。沈殿をろ過し、再度メタノール
に溶かした。不要物を除き、さらに溶媒を除いた。残さ
を５０℃で真空乾燥し、目的物１００ｍｇ（収率６５
％）を得た。暗紫色固体として得られた化合物について
以下の分析を行った。 （１）融点：３５０℃以上 （２）ＩＲ：３２００（ＯＨ）、１３４０（Ｂ−Ｏ） （３）プロトン核磁気共鳴スペクトル ６．３２（８Ｈ、ｓ、ＡｒＣＨ2 ）、７．５−７．９
（１６Ｈ、ｍ、ＡｒＨ）、７．５−８．９４（８Ｈ、
ｄ、ピリジンのＡｒＨ）、９．０１（８Ｈ、ｂｒ ｓ、
β−Ｈ）、９．３４（８Ｈ、ｄ、ピリジンのＡｒＨ） （４）元素分析（測定値：Ｃ、５５．０％；Ｈ、４．２
％；Ｎ、７．２％、計算値：Ｃ、５４．７２％；Ｈ、
４．０２％；Ｎ、７．１６％ これらの分析結果よりポルフィリンボロン酸であること
が確認できた。
ィリンボロン酸を合成した。すなわち、５，１０，１
５，２０−テトラキス（４−ピリジル）ポルフィリン２
００ｍｇと２−ブロモメチルフェニルボロン酸を脱水Ｄ
ＭＦ３０ｍｌに溶解した。その後この溶液を８０℃に加
熱し、２４時間反応を行った。溶媒を減圧除去し、残さ
をアセトンに溶かした。沈殿をろ過し、再度メタノール
に溶かした。不要物を除き、さらに溶媒を除いた。残さ
を５０℃で真空乾燥し、目的物１００ｍｇ（収率６５
％）を得た。暗紫色固体として得られた化合物について
以下の分析を行った。 （１）融点：３５０℃以上 （２）ＩＲ：３２００（ＯＨ）、１３４０（Ｂ−Ｏ） （３）プロトン核磁気共鳴スペクトル ６．３２（８Ｈ、ｓ、ＡｒＣＨ2 ）、７．５−７．９
（１６Ｈ、ｍ、ＡｒＨ）、７．５−８．９４（８Ｈ、
ｄ、ピリジンのＡｒＨ）、９．０１（８Ｈ、ｂｒ ｓ、
β−Ｈ）、９．３４（８Ｈ、ｄ、ピリジンのＡｒＨ） （４）元素分析（測定値：Ｃ、５５．０％；Ｈ、４．２
％；Ｎ、７．２％、計算値：Ｃ、５４．７２％；Ｈ、
４．０２％；Ｎ、７．１６％ これらの分析結果よりポルフィリンボロン酸であること
が確認できた。
【００３１】実施例５：ポルフィリンボロン酸によるＤ
ＮＡの切断 ＤＮＡは Col EI プラスミドＤＮＡ（ニッポンジーン社
製、分子量：４．２×１０6 ダルトン、濃度：１．８×
１０-6Ｍ）を使用した。このＤＮＡを、ＤＮＡ分解酵素
の活性をなくす目的でオートクレーブ処理した純水（ｐ
Ｈは中性）に溶解させてＤＮＡ原液とし、これに実施例
４で調製したポルフィリンボロン酸を添加してＤＮＡの
切断実験を行った。ＤＮＡ切断反応は温度３０℃、ｐＨ
７．５の炭酸緩衝液中で３６５ｎｍの光を３０分間照射
した。電気泳動の結果を図４に示した。図４から理解さ
れるように、切れ目のないよじれの入った Closed Cir
cularＤＮＡ（タイプＩ）型と１ヵ所切断されたよじれ
のない Open Circular ＤＮＡ（タイプ II ) 型を含む
ＤＮＡ原液（レーン１）は制限酵素（ EcoRI )を添加す
ると２ヵ所切断された線状の Linear ＤＮＡ（タイプ I
II）型に切断されている（レーン２）が、ポルフィリン
ボロン酸（濃度３．０×１０-6Ｍ）を添加して上述のよ
うに光照射を行うと切断されてタイプ II に変化してい
ることが認められる（レーン３）。しかし、同じ濃度の
ポルフィリンボロン酸を添加し光照射してもＤ−フラク
トース（濃度１ｍＭ）を存在させるとＤＮＡは切断され
ない（レーン４）。
ＮＡの切断 ＤＮＡは Col EI プラスミドＤＮＡ（ニッポンジーン社
製、分子量：４．２×１０6 ダルトン、濃度：１．８×
１０-6Ｍ）を使用した。このＤＮＡを、ＤＮＡ分解酵素
の活性をなくす目的でオートクレーブ処理した純水（ｐ
Ｈは中性）に溶解させてＤＮＡ原液とし、これに実施例
４で調製したポルフィリンボロン酸を添加してＤＮＡの
切断実験を行った。ＤＮＡ切断反応は温度３０℃、ｐＨ
７．５の炭酸緩衝液中で３６５ｎｍの光を３０分間照射
した。電気泳動の結果を図４に示した。図４から理解さ
れるように、切れ目のないよじれの入った Closed Cir
cularＤＮＡ（タイプＩ）型と１ヵ所切断されたよじれ
のない Open Circular ＤＮＡ（タイプ II ) 型を含む
ＤＮＡ原液（レーン１）は制限酵素（ EcoRI )を添加す
ると２ヵ所切断された線状の Linear ＤＮＡ（タイプ I
II）型に切断されている（レーン２）が、ポルフィリン
ボロン酸（濃度３．０×１０-6Ｍ）を添加して上述のよ
うに光照射を行うと切断されてタイプ II に変化してい
ることが認められる（レーン３）。しかし、同じ濃度の
ポルフィリンボロン酸を添加し光照射してもＤ−フラク
トース（濃度１ｍＭ）を存在させるとＤＮＡは切断され
ない（レーン４）。
【００３２】実施例６：ボロン酸誘導体によるＤＮＡの
標識化 ＤＮＡは Col EI ＤＮＡを使用した。まず Col EI ＤＮ
Ａ１μｇを制限酵素である EcoRIで切断後１００℃で２
分間加熱後、氷冷してＤＮＡ鎖を解離させた。これに
０．１モルの炭酸水素ナトリウム１０μｌ、ピレンボロ
ン酸２０ｎｇを加え滅菌水にて全量を１００μｌにし
た。３７℃で３０分間反応させた。本溶液を氷冷し、そ
のままサザンハイブリダイゼーションのプローブとして
使用した。ＤＮＡは Col EI ＤＮＡを EcoRIで切断後ア
ガロースゲルを用いて電気泳動を行い、アルカリ変性
後、ニトロセルロース膜に転写後ハイブリダイゼーショ
ンを行った。トランスイルミネーターを用いて波長３６
５ｎｍで検出したところ、蛍光発光が認められた。
標識化 ＤＮＡは Col EI ＤＮＡを使用した。まず Col EI ＤＮ
Ａ１μｇを制限酵素である EcoRIで切断後１００℃で２
分間加熱後、氷冷してＤＮＡ鎖を解離させた。これに
０．１モルの炭酸水素ナトリウム１０μｌ、ピレンボロ
ン酸２０ｎｇを加え滅菌水にて全量を１００μｌにし
た。３７℃で３０分間反応させた。本溶液を氷冷し、そ
のままサザンハイブリダイゼーションのプローブとして
使用した。ＤＮＡは Col EI ＤＮＡを EcoRIで切断後ア
ガロースゲルを用いて電気泳動を行い、アルカリ変性
後、ニトロセルロース膜に転写後ハイブリダイゼーショ
ンを行った。トランスイルミネーターを用いて波長３６
５ｎｍで検出したところ、蛍光発光が認められた。
【図１】本発明に従うピレンボロン酸を用いてＤＮＡを
定量した場合において、ＤＮＡ濃度と蛍光強度の関係を
示すグラフである。
定量した場合において、ＤＮＡ濃度と蛍光強度の関係を
示すグラフである。
【図２】本発明に従うピレンボロン酸を用いてＤＮＡを
切断した場合の電気泳動パターンを示す写真である。
切断した場合の電気泳動パターンを示す写真である。
【図３】本発明に従うピレンボロン酸を用いてＤＮＡを
切断した場合の電気泳動パターンを示す写真である。
切断した場合の電気泳動パターンを示す写真である。
【図４】本発明に従うポルフィリンボロン酸を用いてＤ
ＮＡを切断した場合の電気泳動パターンを示す写真であ
る。
ＮＡを切断した場合の電気泳動パターンを示す写真であ
る。
Claims (6)
- 【請求項１】 紫外または可視領域の光エネルギーを吸
収して蛍光または紫外光として発光する発光性官能基ま
たは原子団にＢ( ＯＨ )2 が結合した構造を有し、核酸
のホスホジエステル結合に結合するボロン酸誘導体から
成ることを特徴とする核酸処理試薬。 - 【請求項２】 発光性官能基または原子団が、ピレン
基、テトラキス（Ｎ−メチルピリジル）ポルフィリン
基、アントラセン基、メチルピリジル基、およびフェロ
セン基から選ばれることを特徴とする請求項１の核酸処
理試薬。 - 【請求項３】 請求項１のボロン酸誘導体を核酸に添加
して該ボロン酸化合物を核酸に結合させ、ボロン酸誘導
体／核酸複合体の量を分光学的に分析することを特徴と
する核酸の定量方法。 - 【請求項４】 請求項１のボロン酸誘導体を核酸に添加
し紫外線または可視光を照射して該核酸のホスホジエス
テル結合を切断することを特徴とする核酸の切断方法。 - 【請求項５】 ボロン酸誘導体とともに糖類を添加する
ことを特徴とする請求項４の核酸の切断方法。 - 【請求項６】 請求項１のボロン酸誘導体を核酸に添加
して該ボロン酸誘導体を核酸に結合させ、ボロン酸誘導
体に因る蛍光を測定することにより核酸の存在を検出す
ることを特徴とする核酸の標識化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19561396A JPH1017573A (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | ボロン酸誘導体から成る核酸処理試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19561396A JPH1017573A (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | ボロン酸誘導体から成る核酸処理試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1017573A true JPH1017573A (ja) | 1998-01-20 |
Family
ID=16344084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19561396A Pending JPH1017573A (ja) | 1996-07-05 | 1996-07-05 | ボロン酸誘導体から成る核酸処理試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1017573A (ja) |
-
1996
- 1996-07-05 JP JP19561396A patent/JPH1017573A/ja active Pending
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