JP2527340C - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
本発明は、一般的に生物学的或いは生化学的対象分子を標識化するための蛍光
性プローブ／又は化合物に関し、より詳しくはローダミン染料のＮ−ヒドロキシ
スクシニミド活性化及び５−及び６−カルボキル異性体に関する。 蛍光性標識は分子生物学、微生物学、生化学、分析化学、及びこれらの原理に
根付いた工業的及び医学的分野及び例えばバイオテクノロジー及び環境的、工業
的及び診断的医学に広範な応用を有する。 多数の有機及び無機蛍光性物質が利用可能である。しかしながら、その様な物
質から蛍光性標識を構成する試みにおいて、多くの問題に遭遇する。ここにおい
て用いられる「蛍光性標識」とは蛍光性部分及び結合部分を有し、結合部分が蛍
光性部分を目標官能基、例えば一級アミン類、二級アミン類などに共有的に結合
させるような有機分子を意味する。 蛍光性標識の構成及び使用に伴なう幾つかの重 要な考慮としては、蛍光性部分と結合部分の間の結合の安定性、結合部分が目標
官能基との結合前後に蛍光性特性に対して有する影響、蛍光性部分と目標官能基
の結合の間の安定性即ち結合後の結合部分の強度、結合官能基の精製操作に対す
る安定性、例えばアミド結合はチオウレア結合よりも加水分解に対してより安定
である、結合官能基と目標官能基との反応性などが挙げられる。各々非重複発光
バンドなどの明確な蛍光特性を有する複数の蛍光性標識が必要とされる場合には
、特別の応用に対する標識の選択は極めて困難となる可能性があり、しばしば使
用可能な蛍光性標識の所望特性の間の取換えを必要とする。 蛍光性標識が生化学的分離操作或いは生物学的過程において目標分子を追跡す
るために用いられる場合において、二つの重要な要因は、(１)蛍光性標識が目標
分子の挙動を混乱させる程度、及び(２)もしその様な混乱が実際に存在するなら
ば目標分子間におけるような混乱の均一性である。この後者の要因はゲル電気泳
動により、大きさに基づい て巨大分子を分離する方法において、特に重要である。特に、デオキシリボ核酸
(ＤＮＡｓ)を配列決定するための技術は、極めて、単一の塩基のみにより異なる
オリゴヌクレオチドを分離する能力に依存している。例えば、スミス等(Ｓmith
et al)ヌクレイック・アッシズ・リサーチ(Nucleic Acids Research) Ｖoｌ．1
3、2399ー2412頁(1985年)、シュライヤー等(Ｓchreier et al)、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ．Mol．Biol.)、Ｖｏｌ．129、169〜172頁(
1979年)、及びサンガー等(Sanger et al)、Ｊ．Mol.Biol．Ｖol．143、161〜178
頁(1980年)。 最近、その様な方法論における改良は複数の蛍光性標識を利用して単一カラム
ゲル上において自動的に配列決定を実施している。例えば、スミス等(上記)、及
びスミス等、ネイチャー(Ｎature)、Ｖol．321、674〜679頁(1986年)。蛍光性標
識の選択はその様な技術において重要であり、この技術の能力を拡張する主たる
拘束を表わしている。更に、達成される自動化の程度に拘わらず、ユー ザーはジデオキシ−基準配列決定のために自らの標識化オリゴヌクレオチドプラ
イマーを調製しなければならない。その様なプライマーはオリゴヌクレオチドの
合成に伴なう配列失敗があってはならない。オリゴヌクレオチド精製の標準的技
術はポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む（例、Ａpplied Ｂiosystems Ｕs
ers Ｂulletin、発行番号13、1984年11月９日、「合成オリゴヌクレオチド類の
評価及び精製(Ｅvaluation and Ｐurification of Ｓynthetic Ｏligonucl
eotides)」）。プライマーがそれに密接な電気泳動易動性を有する染料異性体を
結合して有するならば、プライマー精製は不可能でないにせよ困難となる。単一
異性体の使用はこの種の精製を簡便化する。 蛍光的に標識化されたオリゴヌクレオチド類の電気泳動分離において、重要な
考慮としては、相対的合成収量及び蛍光的に標識化されたオリゴヌクレオチド複
合体の安定性、並びに、結合された標識により導入された電気泳動易動性におけ
る変 動性の量である。異なった染料に特徴的なＤＮＡ易動性の相違は染料をオリゴヌ
クレオチドに連結するために用いられるリンカーの適当な選択により補正するこ
とができるが、しかし、個々の染料が１個より多く存在するならば、結合標識は
相当なバンドの広がりを引き起こすか、或いは同一の大きさのオリゴヌクレオチ
ドの複数のバンドを生じ、それらは次いで疑似的配列決定に導く。不幸にして、
この技術において重要な蛍光性標識の一群であるローダミン染料は異性体混合物
としてのみ利用可能である。例えば、ホーグランド(Ｈaugland)、「蛍光性プロ
ーブ及び研究薬品のハンドブック(Ｈandbook of Ｆluorescent Ｐrobes and
Ｒesearch Ｃhemicals)」、(Ｍolecular Ｐrobes社、ジャンクション シテ
ィ オレゴン州、1985年)、及び、これらの異性体は標識化されたオリゴヌクレ
オチド類の電気泳動易動性に異なった程度で影響を及ぼす。 前記に鑑み、蛍光性標識の純粋異性体形態での利用可能性は蛍光性標識の応用
性を増大し、又、 ゲル電気泳動によって分離されるオリゴヌクレオチド類などの巨大分子を識別す
るための蛍光基準方法の感度を増大するであろう。 ［発明の概要］ 本発明は、対称、或いは、非対称ローダミン染料の５−及び６−スクシニミジ
ルカルボキシレート異性体及びその製法及び用法を含むものである。(明細書中
、ローダミン染料の炭素原子を示すためにカラーインデックス （Ａssociation
of Ｔextile Ｃhemists 第２版 1971年）の付番方式を用いる。キサンテ
ン様構造中の炭素原子は下記に示すようにダッシュを付した番号により示し、及
び９’−置換フェニルの炭素原子は下記の如くダッシュを付さない番号により示
す)。 より詳細には、本発明の化合物は下記一般式Ｉ、その塩例えばカルボン酸塩、
ハロゲン水素塩、オキシ酸塩などにより定義される： 式中、 Ｂはアニオン基、好ましくはカルボキシレート或いはスルホネート、より好ま
しくはカルボキシレートである。 Ｒ1及びＲ8は各々水素、ハロデン、１〜８個の炭素原子を有するアルキル、１
〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、１〜８個の炭素原子を有するアル
キルチオエーテル、及びＲ1はＲ2と共に及びＲ8はＲ7と共に各々７’炭素を６’
炭素に結合した窒素に連結し、及び２’炭素を３’炭素に結合した窒素にそれぞ
れ連結する各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖である。好ましくは、Ｒ
1及びＲ8は各々水素、１〜３個の炭素原子を有するアルキル、クロロ或いは１〜
３個の炭素原子を有するアルキルエーテルであり、及びＲ1はＲ2と共に及びＲ8
はＲ7と共に７’炭素を６’炭素に結合した窒素及び２’炭素を３’炭素に結合
した窒素にそれぞれ連結する２〜３個の炭素原子を有するアルキルを各々形成す
る。最も好ましくは、Ｒ1及びＲ8は各々水素であり、Ｒ1はＲ2と共に及びＲ8は
Ｒ7と共に７’炭素を６’炭素に結合した窒素に連結し、及び２’炭素を３’炭
素に結合した窒素にそれぞれ連結するアルキル鎖を各々形成する。 Ｒ2及びＲ7は各々１〜８個の炭素原子を有する アルキルであり、及びＲ2はＲ1と共に及びＲ7はＲ8と共に上記の如く２〜５個の
炭素原子を有する各アルキル鎖である。好ましくは、Ｒ2及びＲ7は各々１〜３個
の炭素原子を有するアルキルであり、Ｒ2はＲ1と共に、及びＲ7はＲ8と共に７’
炭素を６’炭素に結合した窒素に、及び２’炭素を３’炭素に結合した窒素にそ
れぞれ連結する各々２〜３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。最も好まし
くは、Ｒ2及びＲ7は各々メチル或いはエチル、及びＲ2はＲ1と共に及びＲ7はＲ8
と共に７’炭素を６’炭素に結合した窒素に及び６’炭素を３’炭素に結合した
２’炭素にそれぞれ連結する各々３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。 Ｒ3及びＲ6は各々１〜８個の炭素を有するアルキル及びＲ3はＲ4と共に及びＲ
6はＲ5と共に５’炭素を６’炭素に結合した窒素に、及び４’炭素を３’炭素に
結合した窒素原子にそれぞれ連結する各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル
鎖である。好ましくは、Ｒ3及びＲ6は各々１〜３個の炭素を有するアルキルであ
り、及びＲ3はＲ4と共に 及びＲ6はＲ5と共に５’炭素を６’炭素に結合した窒素原子に及び４’炭素を３
’炭素に結合した窒素にそれぞれ連結する各々２〜３個の炭素原子を有するアル
キル鎖である。最も好ましくは、Ｒ3及びＲ6は各々メチル或いはエチルであり、
及びＲ3はＲ4と共に及びＲ6はＲ5と共に５’炭素原子を６’炭素に結合した窒素
原子に及び４’炭素を３’炭素に結合した窒素原子にそれぞれ連結する各々３個
の炭素原子を有するアルキル鎖である。 Ｒ4及びＲ5は各々、水素、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基、ハロゲン
、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、或いは１〜８個の炭素原子を
有するアルキルチオエーテル、及びＲ4はＲ3と共に及びＲ5はＲ6と共に上記の如
く各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖である。好ましくはＲ4及びＲ5は
各々水素、クロロ、１〜３個の炭素原子を有するアルキル、１〜３個の炭素原子
を有するアルキルエーテル、及びＲ4はＲ3と共に及びＲ5はＲ6と共に上記の如く
各々３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。最も好まし くは、Ｒ4及びＲ5は各々水素原子であり、及びＲ4はＲ3と共に及びＲ5はＲ6と共
に５’炭素を６’炭素に結合した窒素原子に及び４’炭素を３’炭素に結合した
窒素にそれぞれ連結する各々３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。 Ｗ1，Ｗ2及びＷ3は水素、或いはクロロ、好ましくは水素である。 本発明は又ローダミン染料の５−及び６−スクシニミジルカルボキシレートの
製造方法も包含する。一つの方法は、(１)６−カルボキシルローダミン異性体を
５−カルボキシルローダミン異性体から分離する工程、(２)６−(又は５−)カル
ボキシルローダミンを当量のジ−Ｎ−スクシニミジルカーボネート(ＤＳＣ)及び
４−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)と反応させて、反応混合物中にローダミ
ン−６−(又は−５−)スクシニミジルカルボキシレートを形成する工程、及び(3
)ローダミン−６−(又は−５−)スクシニミジルカルボキシレートを反応混合物
から分離する工程を含んでなるものである。本発明のもう一つの方法におい ては、５−及び６−スクシニミジルカルボキシレートの混合物を先ず形成し、次
いで異性体に分離する。本発明の重要な特徴は、化学量論量のＤＳＣ及びＤＭＡ
Ｐを用いることによりローダミンのカルボン酸からＮ−ヒドロキシスクシニミド
(ＮＨＳ)を形成する一般的方法の発見である。 本発明は更に、本発明の化合物の巨大分子のデル電気泳動分離、特に大きさに
基づくオリゴヌクレオチド類のゲル電気泳動分離における使用方法を含むもので
ある。例えば、分子生物学における重要な技術はＤＮＡ配列決定のジデオキシ鎖
停止方法、例えばサンガー等(Ｓanger et al)(上記引用)である。そこでは、
異なった大きさの分子群よりなる標識化されたオリゴヌクレオチド類の混合物が
形成される。各大きさの群の構成員は同一の標識を保有し、その結果、ゲル電気
泳動により分子が混合物から分離されるにつれて同一の大きさのオリゴヌクレオ
チド類の群からそれらの共通標識により検出される。ローダミン染料の純粋なカ
ルボキシレート異性体よりなる蛍光標識の 使用がゲル上におけるオリゴヌクレオチド類の異なった大きさの群を分解するた
めに必要とされる。 ここにおいて用いられる「ローダミン−Ｘ−５ースクシニミジルカルボキシレ
ート」及び「ローダミン−Ｘ−６−スクシニミジルカルボキシレート」（それぞ
れ「５−ＲＯＸ−ＮＨＳ」及び「６−ＲＯＸ−ＮＨＳ」と略称される）という用
語はＲ1及びＲ2、Ｒ3及びＲ4、Ｒ5及びＲ6、及びＲ7及びＲ8が共に上記の如く３
炭素アルキル鎖であり、Ｂがカルボキシレートであり、及びＷ1，Ｗ2，及びＷ3
が水素であり、及びスクシニミジルカルボキシレート部分がそれぞれ５ー及び６
ー炭素に結合している一般式Ｉの化合物を指すものである。５−ＲＯＸ及び６−
ＲＯＸはそれぞれこれらの化合物の５ー及び６ーカルボキシ前駆体を指すもので
ある。ここにおいて用いられる「テトラメチルローダミン−５−スクシニミジル
カルボキシレート」及び「テトラメチルローダミン−６−スクシニミジルカルボ
キシレート」(それぞれ「５−ＴＭＲ−ＮＨＳ」及び「ＴＭＲ−６−ＮＨＳ」と
略称さ れる)は、Ｒ1，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ8，Ｗ1，Ｗ2，及びＷ3が水素であり、Ｂがカルボキ
シレートであり、及びＲ2,Ｒ3,Ｒ6及びＲ7がメチルであり、及びスクシニミジル
カルボキシレート部分がそれぞれ５−及び６−炭素に結合している一般式Ｉの化
合物を意味する。５−ＴＭＲ及び６−ＴＭＲはそれぞれこれらの化合物の５−及
び６−カルボキシ前駆体を指す。 ローダミン染料の５−又は６−カルボキシレート、或いは５−又は６−スクシ
ニミジルカルボキシレートの異性体形態に関して用いられる「異性体的に純粋」
という用語はローダミンの精製された異性体により標識化されたオリゴヌクレオ
チドがゲル電気泳動により分離される際に両異性体の存在のために検出可能な二
重バンド形成が生じないことを意味する。 ［発明の具体的説明］ 本発明は５−及び６−カルボキシルローダミンのＮ−ヒドロキシスクシニミド
エステル類、及びその製造方法及び使用方法を含むものである。本 発明の重要な特徴は、ローダミン染料の５−又は６−形態をエステル化して室温
において高収量をもたらすために存在するＤＳＣ及びＤＭＡＰの実質的に化学量
論量を有する反応条件である。本発明の一般的反応式は下記一般式IIにより定義
される： これらの方法は５−又は６−カルボキシローダミンの酸形態（異性体の混合物
或いは純粋異性体いづれか）を当量ジ−Ｎ−スクシニミジルカーボネート(ＤＳ
Ｃ)及び４−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)を極性非プロトン性溶媒中で反
応させてカルボキシルＮ−ヒドロキシスクニミド(ＮＨＳ)エステル形成すること
よりなる。適当な極性非プロトン溶媒としてはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(
ＤＭＦ)、ピリシン、ヘキサメチルホスホルアミド(ＨＭＰＡ)などが挙げられる
。最も好ましくは、ＤＭＦが反応溶媒として用いられる。異性体的に混合された
ＮＨＳエステルはそれらの個々の異性体に分離されて更に使用される。最も好ま
しくは、試薬を保存するするためには、５−又は６−カルボキシローダミンの酸
形態を先ず標準的分離技術、例えばエドマンソン等(Ｅdmundson et al )、Ｍo
lecular Ｉmmunology，Ｖol．21，561頁(1984年)により、それらの個々の異性
体に分離し、次いで個々の５−或いは６−カルボキシル異性体を上記の如く反応
させてそれぞれ ５−又は６−カルボキシルＮＨＳエステルを形成し、それらを再び標準的技術を
用いて反応混合物から分離する。 本発明において用いられるローダミン染料のある異性体混合物は、例えばＥas
tman Ｋodak社(ロチェスター、ニューヨーク州)、Ｍolecular Ｐrobes社(ジャ
ンクション シティ、オレゴン州)などから市販されており、及びその他のもの
は米国特許第２，２４２，５７２号、同第２，１５３，０５９号、同第３，８２
２，２７０号、同第３，９３２，４１５号及び同第４，００５，０９２号などの
教示に従って合成することができる。これらの特許の全ては本発明において準用
する。 以下の実施例は本発明を例示するものである。試薬の濃度、温度及びその他の
可変パラメータの値は本発明を例示するためのもののみであり、それを限定する
ものと考えられてはならない。 実施例１ ６−ＴＭＲ−ＮＨＳ ６−ＴＭＲ酸はカラムクロマトグラフィにより５−及び６−ＴＭＲ酸異性体の
混合物から分離さ れた。8.82mgの６−ＴＲＭ酸及び10.5mgのＤＳＣを0.5mlの乾燥ＤＭＦ中におい
て、アルゴン下に溶解された。0.09mlの、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)中ＤＭＡ
Ｐの0.5モル溶液を一度に添加した。室温で２時間後混合物を50mlのクロロホル
ム中に取り、１：１の塩水対水溶液で３回洗浄した。クロロホルムを留去し、残
渣を20gシリカデルカラム上で精製した。(300:30:8 塩化メチレン：メタノール
：酢酸溶出)。約0.4のＲfの画分を蒸発乾固し、8.6mgの６−ＴＭＲ−ＮＨＳをそ
の酢酸塩として得た。 実施例２ ５−ＴＭＲ−ＮＨＳ ５−ＴＭＲ−ＮＨＳを実施例１と同様にして２mlの乾燥ＤＭＦ中、82.3mgの５
−ＴＭＲ酸、75mgのＤＳＣ、0.70mlのＴＨＦ中0.5モル濃度のＤＭＡＰから調製
した。 実施例３ ６−ＲＯＸ−ＮＨＳ ６−ＲＯＸ酸は、カラムクロマトグラフィにより、５−及び６−酸異性体の混
合物から分離した。46.2mgの６−ＲＯＸ及び58mgのＤＳＣをアルゴン 下に２mlの乾燥ＤＭＦに溶解し、0.45mlのＴＨＦ中の0.5モル濃度のＤＭＡＰ溶
液を一度に添加した。室温で1.5時間後、混合物を100mlのクロロホルムにとり、
１：１の塩水：水の溶液で３回洗浄した。クロロホルムを留去し、残渣を 40g
シリガゲルカラム上で精製した(300:30:8 塩化メチレン：メタノール:酢醗溶出
)。約 0.5のＲfの画分を蒸発乾固し、56.4mgの６−ＲＯＸ−ＮＨＳをその酢酸
塩として得た。 実施例４ ５−ＲＯＸ−ＮＨＳ ５−ＲＯＸ−ＮＨＳを実施例３と同様にして1.0mlの乾燥ＤＭＦ中27.4mgの５
−ＲＯＸ酸、30.2mgのＤＳＣ、0.24mlのＴＨＦ中 0.5モル濃度のＤＭＡＰから
調製した。 実施例５ ６−ＴＭＲ誘導化アミノエチル オリゴヌクレオチド類 0.50mgの６−ＴＭＲ−ＮＨＳを20μｌの水中1.0ミリモル濃度の５’−アミノ
エチルホスフェートオリゴヌクレオチド(18-mer)及び10μlの１モル濃度のＮaＨ
ＣＯ3／Ｎa2ＣＯ3緩衝液、pＨ9.0 よりなる溶液に添加した。暗所中、１時間後、溶液を、0.1モル濃度のトリエチ
ルアンモニウムアセテート緩衝液、pＨ7.0と共に10mlのＳephadex Ｇ−２５(媒
体)カラムを通過させた。非除容積内に溶出する着色物質のバンドを集めた。逆
相ＨＰＬＣは90％を越えるオリゴヌクレオチドの蛍光生成物への転換率を示した
。 実施例６ ５−ＴＭＲ誘導化アミノエチル オリゴヌクレオチド ５−ＴＭＲ−ＮＨＳを実施例５と同様にして５’−アミノエチルホスフェート
オリゴヌクレオチド(18-mer)と反応させた。標識化されたオリゴヌクレオチドを
実施例５と同様にして反応混合物から除去した。この実施例からの及び実施例５
からの生成物を調製ＨＰＬＣにより精製し[アルファー32Ｐ]−コルディセピン−
５’−トリホスフェートにより末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
を介して３’末端−標識化し、及び20％ポリアクリルアミドゲル上で隣接して電
気泳動させた。ゲルのＸ−線フィルムへの露光は実施例５の 生成物が本実施例の生成物よりもゲル上で約1／2ヌクレオチドの当量よりゆっく
り移動することを示した。 実施例７ ６−ＲＯＸ誘導化アミノエチル オリゴヌクレオチド 20μｌの水中1.0ミリモル濃度の５’−アミノエチルホスフェートオリゴヌク
レオチド(18-mer)及び10μｌの１モル濃度のＮaＨＣＯ3／Ｎa2ＣＯ3緩衝液、pＨ
9.0よりなる溶液に、0.42mgの６−ＲＯＸ−ＮＨＳを添加後、５μｌのＤＭＦを
添加した。暗所中１時間後、溶液を 0.1モル濃度のトリエチルアンモニウムア
セテート緩衝液pＨ7.0と共に10mlのＳephadex Ｇ−２５(媒体)カラムを通過さ
せた。排除容積内に溶出する着色物質のバンドを集めた。逆相ＨＰＬＣはオリゴ
ヌクレオチドの70％を越える蛍光生成物への転換を示した。 実施例８ ５−ＲＯＸ誘導化アミノエチル オリゴヌクレオチド類 ５−ＲＯＸ−ＮＨＳを実施例７と同様にして５’−アミノエチルホスフェート
オリゴヌクレオチド (18-mer)と反応させた。標識化オリゴヌクレオチドを実施例７と同様にして反応
混合物から除去した。本実施例からの及び実施例７からの生成物を調製ＨＰＬＣ
により精製し、実施例６と同様にして３’−末端標識化し、及び20％ポリアクリ
ルアミドゲル上で隣接して電気泳動させた。このデルのＸ−線フィルム上への露
光は実施例７からの生成物が本実施例の生成物よりも約1／2ヌクレオチドの当量
よりゆっくりと移動することを示した。 実施例９ ジデオキシ鎖停止方法によるＤＮＡ 配列決定における６−スクシニミジ ルカルボキシレート異性体の使用 ＤＮＡ配列分析は科学的に及び工業的に共に極めて有用である。ＤＮＡ断片の
配列決定のための二つの主たる技術は、化学的方法、例えばマクサム及びギルバ
ート（Ｍaxam and Ｇilbert)、ブロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミック・サイエンス（Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．）Ｖol．74、p.560(1970年
)、及びジデオキシ鎖停止方法 例、スミス(Ｓmith)、メ ソッズ・イン・エンチモロジー(Ｍethods in Ｅnzymology)、Ｖol．65、Ｇros
sman and Ｍoldave 編、560〜580頁、(Ａcademic Ｐress、ニューヨーク、1
980年)、及びサンガー等(Ｓanger et al)、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミック・サイエンス(Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．)、Ｖol．74、
5363〜5367頁(1977年)などである。本発明の方法は放射性標識の代わりに蛍光性
標識を用いるためにいづれの技術にも適用することができる。本実施例において
は、本発明がＤＮＡ配列決定のジデオキシ鎖停止方法において如何して用いられ
るかが示される。ジデオキシ鎖停止方法を説明する前に、次の用語を定義するこ
とが有用であろう。ＤＮＡポリメラーゼは一本鎖ＤＮＡの合成を触媒する大きな
多−機能酵素である。この方法において用いられる特別の種類のＤＮＡポリメラ
ーゼはエッセリシア・コリ（Ｅscherichia coli）ＤＮＡポリメラーゼＩの所謂
クレノウ断片である。この断片は酵素の合成機能を有する。合成のため に、ＤＮＡポリメラーゼは鋳型、プライマー、デオキシリボヌクレオチド源を必
要とする。 鋳型はＤＮＡポリメラーゼにより合成される一本鎖ＤＮＡ片におけるヌクレオ
チド類の配列を決定する一本鎖ＤＮＡ片である。合成に際して、ＤＮＡポリメラ
ーゼは鋳型に添って移動し、その各ヌクレオチド塩基に対してＤＮＡポリメラー
ゼは相補的ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの成長鎖に結合する。相補的ヌクレオチ
ド 塩基は二本鎖ＤＮＡを形成するための塩基−対形成則に従って所定の塩基
に伴なうものである。塩基−対形成則は一つの鎖のアデノシンが常に他の鎖のチ
ミジンと対形成すること、及び一つの鎖のシチジンが常に他の鎖のグアノシンと
対形成することを要求する。この様に、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型上でアデノシ
ンと遭遇すると、それは合成される鎖にチミジンを付加し及びシチジンと遭遇す
る場合にそれはグアノシンを付加する。ＤＮＡポリメラーゼの移動後、新たに合
成された鎖及び鋳型の相補的部分は二本鎖形態にある。 プライマーは一本鎖ＤＮＡの断片である。プライマーはＤＮＡポリメラーゼが
合成過程においてヌクレオチド類の付加を開始する出発位置を提供する。プライ
マーは二本鎖ＤＮＡの部分がＤＮＡポリメラーゼの出発点として提供されるよう
に鋳型を含有する一本鎖ＤＮＡ片にアニーリングされなければならない。 ジデオキシリボヌクレオチド類はそれらがデオキシリボヌクレオチド類につい
ての２’−ヒドロキシルの代わりにリボース部分と２’−及び３’−ヒドロキシ
ル基の両者を欠く以外はデオキシリボヌクレオチド類と同一である。ジデオキシ
リボヌクレオチド類はＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成過程において対応するデ
オキシリボヌクレオチドの代わりにジデオキシ誘導体を受入れる点のおいて、デ
オキシリボヌクレオチド類の類似体として称されることがある。この様な置換が
生ずる場合には、ＤＮＡポリメラーゼが引続くヌクレオチドを結合させる３’−
ヒドロキシル基を有さないので合成が停止する。 ジデオキシ鎖停止方法においては配列決定されるＤＮＡ鎖をエッセリシア・コ
リ(Ｅscherichia coli)ＤＮＡポリメラーゼＩのための鋳型として用いられる。
プライマーを鋳型を形成する一本鎖ＤＮＡ片にアニーリングし、次いで、それを
放射線標識化したデオキシリポヌクレオチドトリホスフェート類、例えば32Ｐ−
標識化アデノシントリホスフェート、及び四つのヌクレオチドの一つのジデオキ
シリボヌクレオチドトリホスフェート類似体の存在下において400個以上のヌク
レオチドまで酵素的に伸延される。即ち、各々異なったジデオキシ類似体を含む
四つの別々の反応が行なわれる。ＤＮＡ頷成長は３’−ヒドロキシルへのデオキ
シリボヌクレオチドの付加を要請するので、ジデオキシリボヌクレオチドの導入
は鎖成長を停止する。正常なヌクレオチドに代わるジデオキシ類似体の導入はラ
ンダムに起こり、その結果、四つの反応の各々は、同一ヌクレオチドで停止する
不均質な数の標識化頷を生成し、それらは鎖長に従って電気泳動的に分離する。
即ち、存在する末 端ジデオキシリボヌクレオチドのタイプに基づいて四つの群のオリゴヌクレオチ
ド類が確立される。一本鎖ＤＮＡファージ Ｍ１３を用いて配列決定されるべき
ＤＮＡ断片のコピーをクローニングする。十分な量のＭ１３がクローニングされ
ると、Ｍ１３ＤＮＡを精製し、四つのアリコートに分離する。各アリコートにお
いて、各々のジデオキシリボヌクレオチドの存在下において合成或いは鎖成長反
応が生ずる。 本発明に従えば、オリゴヌクレオチド類を鎖成長相に際して、放射性ヌクレオ
チド類の導入により標識化する代わりにプライマーを合成し、次いで適当な結合
官能基を付着し、及びそれを染料と反応させることにより標識化する。アミノ結
合官能基は、プライマーを同時係属出願中の米国特許Ｓerial Ｎｏ．８２７，
３４８号(1986年７月２日出願及び本発明において準用)に開示される２−メトキ
シ−３−トリフルオロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタン
と或いはスミス等(Ｓmith et al)ヌクレイック・アッシズ・ リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch)(上記引用)などに開示されるその他の
ホスホルアミダイト結合剤と反応させることにより結合される。このジデオキシ
鎖停止方法のこの変法における重要な拘束条件は、蛍光染料が分光的に分解可能
であることである。ここにおいて用いられる「分光的に分解可能」という用語は
四つの染料の蛍光発光バンドが標識的に光検出方法を用いて区別されるように十
分に非一重複的であることを意味する。もう一つの重要な拘束条件は染料が電気
泳動的に適合性であることである。ここにおいて用いられる「電気泳動的に適合
性である」とは電気泳動的に分離された染料−標識化オリゴヌクレオチド類がオ
リゴヌクレオチド類の大きさに従った序列に対応するように結合剤の選択が染料
に帰属される電気泳動易動性における相違をバランスさせるために利用可能であ
ることを意味する。 保護基を除去し、及び６−ＲＯＸ−ＮＨＳを実施例７と同様にして脱保護５’
−アミンと反応させてＲＯＸ−プライマー複合体を形成する。別の 合成において、保護基を除去し、及び６−ＴＭＲ−ＮＨＳを実施例５と同様にし
て脱保護５’−アミンと反応させてＴＭＲ−プライマー複合体を形成する。これ
らのプライマー複合体を、次いでスミス等(Ｓmith et ａl) Ｎucleic Ａcid
s Ｒesearch及びネイチャー(Ｎature)(両者共上記で引用及び共に準用する)に
より開示されるジデオキシ鎖停止方法に従って用いる。好ましくは、ヘキシル結
合を介してそれらのジデオキシオリゴヌクレオチド類の５’−アミン類に結合し
たカルボキシフルオレッセイン或いは２’,７’−ジメトキシ−４’,５’−ジク
ロロカルボキシフルオレッセインが６−ＲＯＸ及び６−ＴＭＲがエチル結合を介
して結合されている場合には常に用いられる。 延長プライマーの相対的大きさ及びそれらの末端ジデオキシリボヌクレオチド
の性質は均質な大きさの延長プライマーが電気泳動レーンを下降すると共に決定
され、照射後蛍光光度計或いは分光光度計により検出される。好ましくは、上記
染料の選択に対しては、バンドは514nm及び488nmレー ザー光の両者により逐次或いは同時に照射される。６−ＲＯＸ或いは６−ＴＭＲ
で標識化された均質な大きさの延長プライマーは狭いバンドとして電気泳動ゲル
を下降するのに対し、５−ＲＯＸ及び６−ＲＯＸ、或いは５−ＴＭＲ及び６−Ｔ
ＭＲの混合物で標識化された均質な大きさの延長プライマーは二つのバンドとし
てゲルを下降し、不正確な配列情報を与える。 前記本発明の好ましい実施態様の開示は例示及び説明を目的として示されたも
のである。それは、説明をし尽し或いは開示された正確な形態に本発明を限定す
る趣旨のものではなく、明らかに上記教示に照らして多くの修正及び変化が可能
である。これらの実施態様は本発明の原理及びその実際の応用を最良に説明して
当業者が本発明を各種実施態様において、及び意図される特別な用途に適したよ
うに各種修正により最良に利用できるように選択され及び説明されたものである
。 本発明の範囲は冒頭に掲げた特許請求の範囲によって規定されるものである。
性プローブ／又は化合物に関し、より詳しくはローダミン染料のＮ−ヒドロキシ
スクシニミド活性化及び５−及び６−カルボキル異性体に関する。 蛍光性標識は分子生物学、微生物学、生化学、分析化学、及びこれらの原理に
根付いた工業的及び医学的分野及び例えばバイオテクノロジー及び環境的、工業
的及び診断的医学に広範な応用を有する。 多数の有機及び無機蛍光性物質が利用可能である。しかしながら、その様な物
質から蛍光性標識を構成する試みにおいて、多くの問題に遭遇する。ここにおい
て用いられる「蛍光性標識」とは蛍光性部分及び結合部分を有し、結合部分が蛍
光性部分を目標官能基、例えば一級アミン類、二級アミン類などに共有的に結合
させるような有機分子を意味する。 蛍光性標識の構成及び使用に伴なう幾つかの重 要な考慮としては、蛍光性部分と結合部分の間の結合の安定性、結合部分が目標
官能基との結合前後に蛍光性特性に対して有する影響、蛍光性部分と目標官能基
の結合の間の安定性即ち結合後の結合部分の強度、結合官能基の精製操作に対す
る安定性、例えばアミド結合はチオウレア結合よりも加水分解に対してより安定
である、結合官能基と目標官能基との反応性などが挙げられる。各々非重複発光
バンドなどの明確な蛍光特性を有する複数の蛍光性標識が必要とされる場合には
、特別の応用に対する標識の選択は極めて困難となる可能性があり、しばしば使
用可能な蛍光性標識の所望特性の間の取換えを必要とする。 蛍光性標識が生化学的分離操作或いは生物学的過程において目標分子を追跡す
るために用いられる場合において、二つの重要な要因は、(１)蛍光性標識が目標
分子の挙動を混乱させる程度、及び(２)もしその様な混乱が実際に存在するなら
ば目標分子間におけるような混乱の均一性である。この後者の要因はゲル電気泳
動により、大きさに基づい て巨大分子を分離する方法において、特に重要である。特に、デオキシリボ核酸
(ＤＮＡｓ)を配列決定するための技術は、極めて、単一の塩基のみにより異なる
オリゴヌクレオチドを分離する能力に依存している。例えば、スミス等(Ｓmith
et al)ヌクレイック・アッシズ・リサーチ(Nucleic Acids Research) Ｖoｌ．1
3、2399ー2412頁(1985年)、シュライヤー等(Ｓchreier et al)、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ．Mol．Biol.)、Ｖｏｌ．129、169〜172頁(
1979年)、及びサンガー等(Sanger et al)、Ｊ．Mol.Biol．Ｖol．143、161〜178
頁(1980年)。 最近、その様な方法論における改良は複数の蛍光性標識を利用して単一カラム
ゲル上において自動的に配列決定を実施している。例えば、スミス等(上記)、及
びスミス等、ネイチャー(Ｎature)、Ｖol．321、674〜679頁(1986年)。蛍光性標
識の選択はその様な技術において重要であり、この技術の能力を拡張する主たる
拘束を表わしている。更に、達成される自動化の程度に拘わらず、ユー ザーはジデオキシ−基準配列決定のために自らの標識化オリゴヌクレオチドプラ
イマーを調製しなければならない。その様なプライマーはオリゴヌクレオチドの
合成に伴なう配列失敗があってはならない。オリゴヌクレオチド精製の標準的技
術はポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む（例、Ａpplied Ｂiosystems Ｕs
ers Ｂulletin、発行番号13、1984年11月９日、「合成オリゴヌクレオチド類の
評価及び精製(Ｅvaluation and Ｐurification of Ｓynthetic Ｏligonucl
eotides)」）。プライマーがそれに密接な電気泳動易動性を有する染料異性体を
結合して有するならば、プライマー精製は不可能でないにせよ困難となる。単一
異性体の使用はこの種の精製を簡便化する。 蛍光的に標識化されたオリゴヌクレオチド類の電気泳動分離において、重要な
考慮としては、相対的合成収量及び蛍光的に標識化されたオリゴヌクレオチド複
合体の安定性、並びに、結合された標識により導入された電気泳動易動性におけ
る変 動性の量である。異なった染料に特徴的なＤＮＡ易動性の相違は染料をオリゴヌ
クレオチドに連結するために用いられるリンカーの適当な選択により補正するこ
とができるが、しかし、個々の染料が１個より多く存在するならば、結合標識は
相当なバンドの広がりを引き起こすか、或いは同一の大きさのオリゴヌクレオチ
ドの複数のバンドを生じ、それらは次いで疑似的配列決定に導く。不幸にして、
この技術において重要な蛍光性標識の一群であるローダミン染料は異性体混合物
としてのみ利用可能である。例えば、ホーグランド(Ｈaugland)、「蛍光性プロ
ーブ及び研究薬品のハンドブック(Ｈandbook of Ｆluorescent Ｐrobes and
Ｒesearch Ｃhemicals)」、(Ｍolecular Ｐrobes社、ジャンクション シテ
ィ オレゴン州、1985年)、及び、これらの異性体は標識化されたオリゴヌクレ
オチド類の電気泳動易動性に異なった程度で影響を及ぼす。 前記に鑑み、蛍光性標識の純粋異性体形態での利用可能性は蛍光性標識の応用
性を増大し、又、 ゲル電気泳動によって分離されるオリゴヌクレオチド類などの巨大分子を識別す
るための蛍光基準方法の感度を増大するであろう。 ［発明の概要］ 本発明は、対称、或いは、非対称ローダミン染料の５−及び６−スクシニミジ
ルカルボキシレート異性体及びその製法及び用法を含むものである。(明細書中
、ローダミン染料の炭素原子を示すためにカラーインデックス （Ａssociation
of Ｔextile Ｃhemists 第２版 1971年）の付番方式を用いる。キサンテ
ン様構造中の炭素原子は下記に示すようにダッシュを付した番号により示し、及
び９’−置換フェニルの炭素原子は下記の如くダッシュを付さない番号により示
す)。 より詳細には、本発明の化合物は下記一般式Ｉ、その塩例えばカルボン酸塩、
ハロゲン水素塩、オキシ酸塩などにより定義される： 式中、 Ｂはアニオン基、好ましくはカルボキシレート或いはスルホネート、より好ま
しくはカルボキシレートである。 Ｒ1及びＲ8は各々水素、ハロデン、１〜８個の炭素原子を有するアルキル、１
〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、１〜８個の炭素原子を有するアル
キルチオエーテル、及びＲ1はＲ2と共に及びＲ8はＲ7と共に各々７’炭素を６’
炭素に結合した窒素に連結し、及び２’炭素を３’炭素に結合した窒素にそれぞ
れ連結する各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖である。好ましくは、Ｒ
1及びＲ8は各々水素、１〜３個の炭素原子を有するアルキル、クロロ或いは１〜
３個の炭素原子を有するアルキルエーテルであり、及びＲ1はＲ2と共に及びＲ8
はＲ7と共に７’炭素を６’炭素に結合した窒素及び２’炭素を３’炭素に結合
した窒素にそれぞれ連結する２〜３個の炭素原子を有するアルキルを各々形成す
る。最も好ましくは、Ｒ1及びＲ8は各々水素であり、Ｒ1はＲ2と共に及びＲ8は
Ｒ7と共に７’炭素を６’炭素に結合した窒素に連結し、及び２’炭素を３’炭
素に結合した窒素にそれぞれ連結するアルキル鎖を各々形成する。 Ｒ2及びＲ7は各々１〜８個の炭素原子を有する アルキルであり、及びＲ2はＲ1と共に及びＲ7はＲ8と共に上記の如く２〜５個の
炭素原子を有する各アルキル鎖である。好ましくは、Ｒ2及びＲ7は各々１〜３個
の炭素原子を有するアルキルであり、Ｒ2はＲ1と共に、及びＲ7はＲ8と共に７’
炭素を６’炭素に結合した窒素に、及び２’炭素を３’炭素に結合した窒素にそ
れぞれ連結する各々２〜３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。最も好まし
くは、Ｒ2及びＲ7は各々メチル或いはエチル、及びＲ2はＲ1と共に及びＲ7はＲ8
と共に７’炭素を６’炭素に結合した窒素に及び６’炭素を３’炭素に結合した
２’炭素にそれぞれ連結する各々３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。 Ｒ3及びＲ6は各々１〜８個の炭素を有するアルキル及びＲ3はＲ4と共に及びＲ
6はＲ5と共に５’炭素を６’炭素に結合した窒素に、及び４’炭素を３’炭素に
結合した窒素原子にそれぞれ連結する各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル
鎖である。好ましくは、Ｒ3及びＲ6は各々１〜３個の炭素を有するアルキルであ
り、及びＲ3はＲ4と共に 及びＲ6はＲ5と共に５’炭素を６’炭素に結合した窒素原子に及び４’炭素を３
’炭素に結合した窒素にそれぞれ連結する各々２〜３個の炭素原子を有するアル
キル鎖である。最も好ましくは、Ｒ3及びＲ6は各々メチル或いはエチルであり、
及びＲ3はＲ4と共に及びＲ6はＲ5と共に５’炭素原子を６’炭素に結合した窒素
原子に及び４’炭素を３’炭素に結合した窒素原子にそれぞれ連結する各々３個
の炭素原子を有するアルキル鎖である。 Ｒ4及びＲ5は各々、水素、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基、ハロゲン
、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、或いは１〜８個の炭素原子を
有するアルキルチオエーテル、及びＲ4はＲ3と共に及びＲ5はＲ6と共に上記の如
く各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖である。好ましくはＲ4及びＲ5は
各々水素、クロロ、１〜３個の炭素原子を有するアルキル、１〜３個の炭素原子
を有するアルキルエーテル、及びＲ4はＲ3と共に及びＲ5はＲ6と共に上記の如く
各々３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。最も好まし くは、Ｒ4及びＲ5は各々水素原子であり、及びＲ4はＲ3と共に及びＲ5はＲ6と共
に５’炭素を６’炭素に結合した窒素原子に及び４’炭素を３’炭素に結合した
窒素にそれぞれ連結する各々３個の炭素原子を有するアルキル鎖である。 Ｗ1，Ｗ2及びＷ3は水素、或いはクロロ、好ましくは水素である。 本発明は又ローダミン染料の５−及び６−スクシニミジルカルボキシレートの
製造方法も包含する。一つの方法は、(１)６−カルボキシルローダミン異性体を
５−カルボキシルローダミン異性体から分離する工程、(２)６−(又は５−)カル
ボキシルローダミンを当量のジ−Ｎ−スクシニミジルカーボネート(ＤＳＣ)及び
４−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)と反応させて、反応混合物中にローダミ
ン−６−(又は−５−)スクシニミジルカルボキシレートを形成する工程、及び(3
)ローダミン−６−(又は−５−)スクシニミジルカルボキシレートを反応混合物
から分離する工程を含んでなるものである。本発明のもう一つの方法におい ては、５−及び６−スクシニミジルカルボキシレートの混合物を先ず形成し、次
いで異性体に分離する。本発明の重要な特徴は、化学量論量のＤＳＣ及びＤＭＡ
Ｐを用いることによりローダミンのカルボン酸からＮ−ヒドロキシスクシニミド
(ＮＨＳ)を形成する一般的方法の発見である。 本発明は更に、本発明の化合物の巨大分子のデル電気泳動分離、特に大きさに
基づくオリゴヌクレオチド類のゲル電気泳動分離における使用方法を含むもので
ある。例えば、分子生物学における重要な技術はＤＮＡ配列決定のジデオキシ鎖
停止方法、例えばサンガー等(Ｓanger et al)(上記引用)である。そこでは、
異なった大きさの分子群よりなる標識化されたオリゴヌクレオチド類の混合物が
形成される。各大きさの群の構成員は同一の標識を保有し、その結果、ゲル電気
泳動により分子が混合物から分離されるにつれて同一の大きさのオリゴヌクレオ
チド類の群からそれらの共通標識により検出される。ローダミン染料の純粋なカ
ルボキシレート異性体よりなる蛍光標識の 使用がゲル上におけるオリゴヌクレオチド類の異なった大きさの群を分解するた
めに必要とされる。 ここにおいて用いられる「ローダミン−Ｘ−５ースクシニミジルカルボキシレ
ート」及び「ローダミン−Ｘ−６−スクシニミジルカルボキシレート」（それぞ
れ「５−ＲＯＸ−ＮＨＳ」及び「６−ＲＯＸ−ＮＨＳ」と略称される）という用
語はＲ1及びＲ2、Ｒ3及びＲ4、Ｒ5及びＲ6、及びＲ7及びＲ8が共に上記の如く３
炭素アルキル鎖であり、Ｂがカルボキシレートであり、及びＷ1，Ｗ2，及びＷ3
が水素であり、及びスクシニミジルカルボキシレート部分がそれぞれ５ー及び６
ー炭素に結合している一般式Ｉの化合物を指すものである。５−ＲＯＸ及び６−
ＲＯＸはそれぞれこれらの化合物の５ー及び６ーカルボキシ前駆体を指すもので
ある。ここにおいて用いられる「テトラメチルローダミン−５−スクシニミジル
カルボキシレート」及び「テトラメチルローダミン−６−スクシニミジルカルボ
キシレート」(それぞれ「５−ＴＭＲ−ＮＨＳ」及び「ＴＭＲ−６−ＮＨＳ」と
略称さ れる)は、Ｒ1，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ8，Ｗ1，Ｗ2，及びＷ3が水素であり、Ｂがカルボキ
シレートであり、及びＲ2,Ｒ3,Ｒ6及びＲ7がメチルであり、及びスクシニミジル
カルボキシレート部分がそれぞれ５−及び６−炭素に結合している一般式Ｉの化
合物を意味する。５−ＴＭＲ及び６−ＴＭＲはそれぞれこれらの化合物の５−及
び６−カルボキシ前駆体を指す。 ローダミン染料の５−又は６−カルボキシレート、或いは５−又は６−スクシ
ニミジルカルボキシレートの異性体形態に関して用いられる「異性体的に純粋」
という用語はローダミンの精製された異性体により標識化されたオリゴヌクレオ
チドがゲル電気泳動により分離される際に両異性体の存在のために検出可能な二
重バンド形成が生じないことを意味する。 ［発明の具体的説明］ 本発明は５−及び６−カルボキシルローダミンのＮ−ヒドロキシスクシニミド
エステル類、及びその製造方法及び使用方法を含むものである。本 発明の重要な特徴は、ローダミン染料の５−又は６−形態をエステル化して室温
において高収量をもたらすために存在するＤＳＣ及びＤＭＡＰの実質的に化学量
論量を有する反応条件である。本発明の一般的反応式は下記一般式IIにより定義
される： これらの方法は５−又は６−カルボキシローダミンの酸形態（異性体の混合物
或いは純粋異性体いづれか）を当量ジ−Ｎ−スクシニミジルカーボネート(ＤＳ
Ｃ)及び４−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)を極性非プロトン性溶媒中で反
応させてカルボキシルＮ−ヒドロキシスクニミド(ＮＨＳ)エステル形成すること
よりなる。適当な極性非プロトン溶媒としてはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(
ＤＭＦ)、ピリシン、ヘキサメチルホスホルアミド(ＨＭＰＡ)などが挙げられる
。最も好ましくは、ＤＭＦが反応溶媒として用いられる。異性体的に混合された
ＮＨＳエステルはそれらの個々の異性体に分離されて更に使用される。最も好ま
しくは、試薬を保存するするためには、５−又は６−カルボキシローダミンの酸
形態を先ず標準的分離技術、例えばエドマンソン等(Ｅdmundson et al )、Ｍo
lecular Ｉmmunology，Ｖol．21，561頁(1984年)により、それらの個々の異性
体に分離し、次いで個々の５−或いは６−カルボキシル異性体を上記の如く反応
させてそれぞれ ５−又は６−カルボキシルＮＨＳエステルを形成し、それらを再び標準的技術を
用いて反応混合物から分離する。 本発明において用いられるローダミン染料のある異性体混合物は、例えばＥas
tman Ｋodak社(ロチェスター、ニューヨーク州)、Ｍolecular Ｐrobes社(ジャ
ンクション シティ、オレゴン州)などから市販されており、及びその他のもの
は米国特許第２，２４２，５７２号、同第２，１５３，０５９号、同第３，８２
２，２７０号、同第３，９３２，４１５号及び同第４，００５，０９２号などの
教示に従って合成することができる。これらの特許の全ては本発明において準用
する。 以下の実施例は本発明を例示するものである。試薬の濃度、温度及びその他の
可変パラメータの値は本発明を例示するためのもののみであり、それを限定する
ものと考えられてはならない。 実施例１ ６−ＴＭＲ−ＮＨＳ ６−ＴＭＲ酸はカラムクロマトグラフィにより５−及び６−ＴＭＲ酸異性体の
混合物から分離さ れた。8.82mgの６−ＴＲＭ酸及び10.5mgのＤＳＣを0.5mlの乾燥ＤＭＦ中におい
て、アルゴン下に溶解された。0.09mlの、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)中ＤＭＡ
Ｐの0.5モル溶液を一度に添加した。室温で２時間後混合物を50mlのクロロホル
ム中に取り、１：１の塩水対水溶液で３回洗浄した。クロロホルムを留去し、残
渣を20gシリカデルカラム上で精製した。(300:30:8 塩化メチレン：メタノール
：酢酸溶出)。約0.4のＲfの画分を蒸発乾固し、8.6mgの６−ＴＭＲ−ＮＨＳをそ
の酢酸塩として得た。 実施例２ ５−ＴＭＲ−ＮＨＳ ５−ＴＭＲ−ＮＨＳを実施例１と同様にして２mlの乾燥ＤＭＦ中、82.3mgの５
−ＴＭＲ酸、75mgのＤＳＣ、0.70mlのＴＨＦ中0.5モル濃度のＤＭＡＰから調製
した。 実施例３ ６−ＲＯＸ−ＮＨＳ ６−ＲＯＸ酸は、カラムクロマトグラフィにより、５−及び６−酸異性体の混
合物から分離した。46.2mgの６−ＲＯＸ及び58mgのＤＳＣをアルゴン 下に２mlの乾燥ＤＭＦに溶解し、0.45mlのＴＨＦ中の0.5モル濃度のＤＭＡＰ溶
液を一度に添加した。室温で1.5時間後、混合物を100mlのクロロホルムにとり、
１：１の塩水：水の溶液で３回洗浄した。クロロホルムを留去し、残渣を 40g
シリガゲルカラム上で精製した(300:30:8 塩化メチレン：メタノール:酢醗溶出
)。約 0.5のＲfの画分を蒸発乾固し、56.4mgの６−ＲＯＸ−ＮＨＳをその酢酸
塩として得た。 実施例４ ５−ＲＯＸ−ＮＨＳ ５−ＲＯＸ−ＮＨＳを実施例３と同様にして1.0mlの乾燥ＤＭＦ中27.4mgの５
−ＲＯＸ酸、30.2mgのＤＳＣ、0.24mlのＴＨＦ中 0.5モル濃度のＤＭＡＰから
調製した。 実施例５ ６−ＴＭＲ誘導化アミノエチル オリゴヌクレオチド類 0.50mgの６−ＴＭＲ−ＮＨＳを20μｌの水中1.0ミリモル濃度の５’−アミノ
エチルホスフェートオリゴヌクレオチド(18-mer)及び10μlの１モル濃度のＮaＨ
ＣＯ3／Ｎa2ＣＯ3緩衝液、pＨ9.0 よりなる溶液に添加した。暗所中、１時間後、溶液を、0.1モル濃度のトリエチ
ルアンモニウムアセテート緩衝液、pＨ7.0と共に10mlのＳephadex Ｇ−２５(媒
体)カラムを通過させた。非除容積内に溶出する着色物質のバンドを集めた。逆
相ＨＰＬＣは90％を越えるオリゴヌクレオチドの蛍光生成物への転換率を示した
。 実施例６ ５−ＴＭＲ誘導化アミノエチル オリゴヌクレオチド ５−ＴＭＲ−ＮＨＳを実施例５と同様にして５’−アミノエチルホスフェート
オリゴヌクレオチド(18-mer)と反応させた。標識化されたオリゴヌクレオチドを
実施例５と同様にして反応混合物から除去した。この実施例からの及び実施例５
からの生成物を調製ＨＰＬＣにより精製し[アルファー32Ｐ]−コルディセピン−
５’−トリホスフェートにより末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
を介して３’末端−標識化し、及び20％ポリアクリルアミドゲル上で隣接して電
気泳動させた。ゲルのＸ−線フィルムへの露光は実施例５の 生成物が本実施例の生成物よりもゲル上で約1／2ヌクレオチドの当量よりゆっく
り移動することを示した。 実施例７ ６−ＲＯＸ誘導化アミノエチル オリゴヌクレオチド 20μｌの水中1.0ミリモル濃度の５’−アミノエチルホスフェートオリゴヌク
レオチド(18-mer)及び10μｌの１モル濃度のＮaＨＣＯ3／Ｎa2ＣＯ3緩衝液、pＨ
9.0よりなる溶液に、0.42mgの６−ＲＯＸ−ＮＨＳを添加後、５μｌのＤＭＦを
添加した。暗所中１時間後、溶液を 0.1モル濃度のトリエチルアンモニウムア
セテート緩衝液pＨ7.0と共に10mlのＳephadex Ｇ−２５(媒体)カラムを通過さ
せた。排除容積内に溶出する着色物質のバンドを集めた。逆相ＨＰＬＣはオリゴ
ヌクレオチドの70％を越える蛍光生成物への転換を示した。 実施例８ ５−ＲＯＸ誘導化アミノエチル オリゴヌクレオチド類 ５−ＲＯＸ−ＮＨＳを実施例７と同様にして５’−アミノエチルホスフェート
オリゴヌクレオチド (18-mer)と反応させた。標識化オリゴヌクレオチドを実施例７と同様にして反応
混合物から除去した。本実施例からの及び実施例７からの生成物を調製ＨＰＬＣ
により精製し、実施例６と同様にして３’−末端標識化し、及び20％ポリアクリ
ルアミドゲル上で隣接して電気泳動させた。このデルのＸ−線フィルム上への露
光は実施例７からの生成物が本実施例の生成物よりも約1／2ヌクレオチドの当量
よりゆっくりと移動することを示した。 実施例９ ジデオキシ鎖停止方法によるＤＮＡ 配列決定における６−スクシニミジ ルカルボキシレート異性体の使用 ＤＮＡ配列分析は科学的に及び工業的に共に極めて有用である。ＤＮＡ断片の
配列決定のための二つの主たる技術は、化学的方法、例えばマクサム及びギルバ
ート（Ｍaxam and Ｇilbert)、ブロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミック・サイエンス（Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．）Ｖol．74、p.560(1970年
)、及びジデオキシ鎖停止方法 例、スミス(Ｓmith)、メ ソッズ・イン・エンチモロジー(Ｍethods in Ｅnzymology)、Ｖol．65、Ｇros
sman and Ｍoldave 編、560〜580頁、(Ａcademic Ｐress、ニューヨーク、1
980年)、及びサンガー等(Ｓanger et al)、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミック・サイエンス(Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．)、Ｖol．74、
5363〜5367頁(1977年)などである。本発明の方法は放射性標識の代わりに蛍光性
標識を用いるためにいづれの技術にも適用することができる。本実施例において
は、本発明がＤＮＡ配列決定のジデオキシ鎖停止方法において如何して用いられ
るかが示される。ジデオキシ鎖停止方法を説明する前に、次の用語を定義するこ
とが有用であろう。ＤＮＡポリメラーゼは一本鎖ＤＮＡの合成を触媒する大きな
多−機能酵素である。この方法において用いられる特別の種類のＤＮＡポリメラ
ーゼはエッセリシア・コリ（Ｅscherichia coli）ＤＮＡポリメラーゼＩの所謂
クレノウ断片である。この断片は酵素の合成機能を有する。合成のため に、ＤＮＡポリメラーゼは鋳型、プライマー、デオキシリボヌクレオチド源を必
要とする。 鋳型はＤＮＡポリメラーゼにより合成される一本鎖ＤＮＡ片におけるヌクレオ
チド類の配列を決定する一本鎖ＤＮＡ片である。合成に際して、ＤＮＡポリメラ
ーゼは鋳型に添って移動し、その各ヌクレオチド塩基に対してＤＮＡポリメラー
ゼは相補的ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの成長鎖に結合する。相補的ヌクレオチ
ド 塩基は二本鎖ＤＮＡを形成するための塩基−対形成則に従って所定の塩基
に伴なうものである。塩基−対形成則は一つの鎖のアデノシンが常に他の鎖のチ
ミジンと対形成すること、及び一つの鎖のシチジンが常に他の鎖のグアノシンと
対形成することを要求する。この様に、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型上でアデノシ
ンと遭遇すると、それは合成される鎖にチミジンを付加し及びシチジンと遭遇す
る場合にそれはグアノシンを付加する。ＤＮＡポリメラーゼの移動後、新たに合
成された鎖及び鋳型の相補的部分は二本鎖形態にある。 プライマーは一本鎖ＤＮＡの断片である。プライマーはＤＮＡポリメラーゼが
合成過程においてヌクレオチド類の付加を開始する出発位置を提供する。プライ
マーは二本鎖ＤＮＡの部分がＤＮＡポリメラーゼの出発点として提供されるよう
に鋳型を含有する一本鎖ＤＮＡ片にアニーリングされなければならない。 ジデオキシリボヌクレオチド類はそれらがデオキシリボヌクレオチド類につい
ての２’−ヒドロキシルの代わりにリボース部分と２’−及び３’−ヒドロキシ
ル基の両者を欠く以外はデオキシリボヌクレオチド類と同一である。ジデオキシ
リボヌクレオチド類はＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成過程において対応するデ
オキシリボヌクレオチドの代わりにジデオキシ誘導体を受入れる点のおいて、デ
オキシリボヌクレオチド類の類似体として称されることがある。この様な置換が
生ずる場合には、ＤＮＡポリメラーゼが引続くヌクレオチドを結合させる３’−
ヒドロキシル基を有さないので合成が停止する。 ジデオキシ鎖停止方法においては配列決定されるＤＮＡ鎖をエッセリシア・コ
リ(Ｅscherichia coli)ＤＮＡポリメラーゼＩのための鋳型として用いられる。
プライマーを鋳型を形成する一本鎖ＤＮＡ片にアニーリングし、次いで、それを
放射線標識化したデオキシリポヌクレオチドトリホスフェート類、例えば32Ｐ−
標識化アデノシントリホスフェート、及び四つのヌクレオチドの一つのジデオキ
シリボヌクレオチドトリホスフェート類似体の存在下において400個以上のヌク
レオチドまで酵素的に伸延される。即ち、各々異なったジデオキシ類似体を含む
四つの別々の反応が行なわれる。ＤＮＡ頷成長は３’−ヒドロキシルへのデオキ
シリボヌクレオチドの付加を要請するので、ジデオキシリボヌクレオチドの導入
は鎖成長を停止する。正常なヌクレオチドに代わるジデオキシ類似体の導入はラ
ンダムに起こり、その結果、四つの反応の各々は、同一ヌクレオチドで停止する
不均質な数の標識化頷を生成し、それらは鎖長に従って電気泳動的に分離する。
即ち、存在する末 端ジデオキシリボヌクレオチドのタイプに基づいて四つの群のオリゴヌクレオチ
ド類が確立される。一本鎖ＤＮＡファージ Ｍ１３を用いて配列決定されるべき
ＤＮＡ断片のコピーをクローニングする。十分な量のＭ１３がクローニングされ
ると、Ｍ１３ＤＮＡを精製し、四つのアリコートに分離する。各アリコートにお
いて、各々のジデオキシリボヌクレオチドの存在下において合成或いは鎖成長反
応が生ずる。 本発明に従えば、オリゴヌクレオチド類を鎖成長相に際して、放射性ヌクレオ
チド類の導入により標識化する代わりにプライマーを合成し、次いで適当な結合
官能基を付着し、及びそれを染料と反応させることにより標識化する。アミノ結
合官能基は、プライマーを同時係属出願中の米国特許Ｓerial Ｎｏ．８２７，
３４８号(1986年７月２日出願及び本発明において準用)に開示される２−メトキ
シ−３−トリフルオロアセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペンタン
と或いはスミス等(Ｓmith et al)ヌクレイック・アッシズ・ リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch)(上記引用)などに開示されるその他の
ホスホルアミダイト結合剤と反応させることにより結合される。このジデオキシ
鎖停止方法のこの変法における重要な拘束条件は、蛍光染料が分光的に分解可能
であることである。ここにおいて用いられる「分光的に分解可能」という用語は
四つの染料の蛍光発光バンドが標識的に光検出方法を用いて区別されるように十
分に非一重複的であることを意味する。もう一つの重要な拘束条件は染料が電気
泳動的に適合性であることである。ここにおいて用いられる「電気泳動的に適合
性である」とは電気泳動的に分離された染料−標識化オリゴヌクレオチド類がオ
リゴヌクレオチド類の大きさに従った序列に対応するように結合剤の選択が染料
に帰属される電気泳動易動性における相違をバランスさせるために利用可能であ
ることを意味する。 保護基を除去し、及び６−ＲＯＸ−ＮＨＳを実施例７と同様にして脱保護５’
−アミンと反応させてＲＯＸ−プライマー複合体を形成する。別の 合成において、保護基を除去し、及び６−ＴＭＲ−ＮＨＳを実施例５と同様にし
て脱保護５’−アミンと反応させてＴＭＲ−プライマー複合体を形成する。これ
らのプライマー複合体を、次いでスミス等(Ｓmith et ａl) Ｎucleic Ａcid
s Ｒesearch及びネイチャー(Ｎature)(両者共上記で引用及び共に準用する)に
より開示されるジデオキシ鎖停止方法に従って用いる。好ましくは、ヘキシル結
合を介してそれらのジデオキシオリゴヌクレオチド類の５’−アミン類に結合し
たカルボキシフルオレッセイン或いは２’,７’−ジメトキシ−４’,５’−ジク
ロロカルボキシフルオレッセインが６−ＲＯＸ及び６−ＴＭＲがエチル結合を介
して結合されている場合には常に用いられる。 延長プライマーの相対的大きさ及びそれらの末端ジデオキシリボヌクレオチド
の性質は均質な大きさの延長プライマーが電気泳動レーンを下降すると共に決定
され、照射後蛍光光度計或いは分光光度計により検出される。好ましくは、上記
染料の選択に対しては、バンドは514nm及び488nmレー ザー光の両者により逐次或いは同時に照射される。６−ＲＯＸ或いは６−ＴＭＲ
で標識化された均質な大きさの延長プライマーは狭いバンドとして電気泳動ゲル
を下降するのに対し、５−ＲＯＸ及び６−ＲＯＸ、或いは５−ＴＭＲ及び６−Ｔ
ＭＲの混合物で標識化された均質な大きさの延長プライマーは二つのバンドとし
てゲルを下降し、不正確な配列情報を与える。 前記本発明の好ましい実施態様の開示は例示及び説明を目的として示されたも
のである。それは、説明をし尽し或いは開示された正確な形態に本発明を限定す
る趣旨のものではなく、明らかに上記教示に照らして多くの修正及び変化が可能
である。これらの実施態様は本発明の原理及びその実際の応用を最良に説明して
当業者が本発明を各種実施態様において、及び意図される特別な用途に適したよ
うに各種修正により最良に利用できるように選択され及び説明されたものである
。 本発明の範囲は冒頭に掲げた特許請求の範囲によって規定されるものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）異性体的に純粋な式Ｉ’で表される５−スクシニミジルカルボキシルロ−
ダミンよりなる化合物或いはその塩類。式中： Ｂはアニオン基であり； Ｒ1及びＲ8は単独では各々水素、ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有するアル
キル、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、または１〜８価の炭素原
子を有するアルキルチオエーテルであり、またはそれぞれ、Ｒ1はＲ2と共に及び
Ｒ8はＲ7と共に各々７’炭素を６’炭素に結合した窒素に連結し、及び２’炭素
を３’炭素に結合した窒素に連結する各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル
鎖であり； Ｒ2及びＲ7は単独では各々１〜８個の炭素原子を有するアルキルであり、また はＲ2はＲ1と共に及びＲ7はＲ8と共に上記の如く２〜５個の炭素原子を有するア
ルキル鎖であり； Ｒ3およびＲ6は単独では各々１〜８個の炭素原子を有するアルキルであり、ま
たはそれぞれ、Ｒ3はＲ4と共に及びＲ6はＲ5と共に５’炭素を６’炭素に結合し
た窒素に連結し、及び４’炭素を３’炭素に結合した窒素に連結する各々２〜５
個の炭素原子を有するアルキル鎖であり； Ｒ4およびＲ5は単独では各々水素、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基、
ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、成いは１〜８個の炭
素原子を有するアルキルチオエーテルであり、またはＲ4はＲ3と共に及びＲ5は
Ｒ6と共に上記の如く各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖であり；およ
び Ｗ1、Ｗ2およびＷ3は水素またはクロロである。 （２）該５−スクシニミジルカルボキシルローダミンがローダミン−Ｘ−５−ス
クシニミジルカルボキシレート（式Ｉ’中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ
7およびＲ8は３炭素アルキル鎖を示し、Ｂはカルボキシレートであり、およびＷ
1、Ｗ2およびＷ3は水素である）或いはテトラメチルローダミン−５−スクシニ
ミジルカルボキシレート（式Ｉ’中、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5およびＲ8は水素であり、Ｒ
2、Ｒ3、Ｒ6およびＲ7はメチル基であり、Ｂはカルボキシレートであり、および
Ｗ1、Ｗ2およびＷ3は水素である）である特許請求の範囲第１項記載の化合物。 （３）異性体的に純粋な式Ｉ''で表される６−スクシニミジルカルボキシルロー
ダミンよりなる化合物或いはその塩類。 式中： Ｂはアニオン基であり； Ｒ1及びＲ8は単独では各々水素、ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有するアル
キル、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、または１〜８個の炭素原
子を有するアルキルチオエーテルであり、またはそれぞれ、Ｒ1はＲ2と共に及び
Ｒ8はＲ7と共に各々７’炭素を６’炭素に結合した窒素に連結し、及び２’炭素
を３’炭素に結合した窒素に連結する条々２〜５個の炭素原子を有するアルキル
鎖であり； Ｒ2及びＲ7は単独では各々１〜８個の炭素原子を有するアルキルであり、また
はＲ2はＲ1と共に及びＲ7はＲ8と共に上記の如く２〜５個の炭素原子を有するア
ルキル鎖であり； Ｒ3およびＲ6は単独では各々１〜８個の炭素原子を有するアルキルであり、ま
たはそれぞれ、Ｒ3はＲ4と共に及びＲ6はＲ5と共に５’炭素を６’炭素に結合し た窒素に連結し、及び４’炭素を３’炭素に結合した窒素に連結する各々２〜５
個の炭素原子を有するアルキル鎖であり； Ｒ4およびＲ5は単独では各々水素、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基、
ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、或いは１〜８個の炭
素原子を有するアルキルチオエーテルであり、またはＲ4はＲ3と共に及びＲ5は
Ｒ6と共に上記の如く各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖であり；およ
び Ｗ1、Ｗ2およびＷ3は水素またはクロロである。 （４）該６−スクシニミジルカルボキシルローダミンがローダミン−Ｘ−６−ス
クシニミジルカルボキシレート（式Ｉ''中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ
7およびＲ8は３炭素アルキル鎖を示し、Ｂはカルボキシレートであり、およびＷ
1、Ｗ2およびＷ3は水素である）或いはテトラメチルローダミン−６−スクシニ
ミジルカルボキシレート（式Ｉ''中、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5およびＲ8は水素であり、Ｒ
2、Ｒ3、Ｒ6、およびＲ7はメチル基であり、Ｂはカルボキシレートであり、およ
びＷ1、Ｗ2およびＷ3は水素である）である特許請求の範囲第３項記載の化合物
。 （５）次式IIIで表されるローダミンカルボン酸を当量のジ−Ｎ−スクシニミジ
ルカルボネート及び４−ジメチルアミノピリジンと反応させて、次式Ｉで表され
るスクシニミジルカルボキシレートを形成する工程を含んでなることを特徴とす
るローダミンカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形成方法。 式中： Ｂはアニオン基であり； Ｒ1及びＲ8は単独では各々水素、ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有するアル
キル、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、または１〜８個の炭素原
子を有するアルキルチオエーテルであり、またはそれぞれ、Ｒ1はＲ2と共に及び
Ｒ8はＲ7と共に各々７’炭素を６’炭素に結合した窒素に連結し、及び２’炭素
を３’炭素に結合した窒素に連結する各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル
鎖であり； Ｒ2及びＲ7は単独では各々１〜８個の炭素原子を有するアルキルであり、また
はＲ2はＲ1と共に及びＲ7はＲ8と共に上記の如く２〜５個の炭素原子を有するア
ルキル鎖であり； Ｒ3およびＲ6は単独では各々１〜８個の炭素原子を有するアルキルであり、ま
たはそれぞれ、Ｒ3はＲ4と共に及びＲ6はＲ5と共に５’炭素を６’炭素に結合し た窒素に連結し、及び４’炭素を３’炭素に結合した窒素に連結する各々２〜５
個の炭素原子を有するアルキル鎖であり； Ｒ4およびＲ5は単独では各々水素、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基、
ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、或いは１〜８個の炭
素原子を有するアルキルチオエーテルであり、またはＲ4はＲ3と共に及びＲ5は
Ｒ6と共に上記の如く各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖であり；およ
び Ｗ1、Ｗ2およびＷ3は水素またはクロロである。 式中、 Ｂ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＷ1、Ｗ2、Ｗ3は上記の
ものと同一である。 （６）該反応工程が更に非プロトン極性溶媒中で反応させることを含む特許請求
の範囲第５項記載の方法。 （７）該反応工程が更に室温で反応させることを含む特許請求の範囲第６項記載
の方法。 （８）該ローダミンカルボン酸が異性体的に純粋な５−カルボキシレートローダ
ミン、異性体的に純粋な６−カルボキシレートローダミン、及び５−及び６−カ
ルボキシレートローダミンの混合物よりなる群から選ばれる特許請求の範囲第７
項記載の方法。 （９）一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、下記工程を含
んでなることを特徴とする方法： 第１、第２、第３及び第４の蛍光的に標識化された塩基配列を有するプライマ
ーを、（１）第１、第２、第３及び第４の蛍光的に標識化された塩基配列を有す
るプライマーが各々異なった蛍光染料で標識化され、（２）異なった蛍光染料の
少なくとも一つが式IIIで表される異性体的に純粋な６−カルボキシルローダミ
ン或いは異性体的に純粋な５−カルボキシルローダミンであり、 式中： Ｂはアニオン基であり； Ｒ1及びＲ8は単独では各々水素、ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有するアル
キル、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、または１〜８個の炭素原 子を有するアルキルチオエーテルであり、またはそれぞれ、Ｒ1はＲ2と共に及び
Ｒ8はＲ7と共に各々７’炭素を６’炭素に結合した窒素に連結し、及び２’炭素
を３’炭素に結合した窒素に連結する各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル
鎮であり； Ｒ2及びＲ7は単独では各々１〜８個の炭素原子を有するアルキルであり、また
はＲ2はＲ1と共に及びＲ7はＲ8と共に上記の如く２〜５個の炭素原子を有するア
ルキル鎖であり； Ｒ3およぴＲ6は単独では各々１〜８個の炭素原子を有するアルキルであり、ま
たはそれぞれ、Ｒ3はＲ4と共に及びＲ6はＲ5と共に５’炭素を６’炭素に結合し
た窒素に連結し、及び４’炭素を３’炭素に結合した窒素に述結する各々２〜５
個の炭素原子を有するアルキル鎖であり； Ｒ4およびＲ5は単独では各々水素、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基、
ハロゲン、１〜８個の炭素原子を有するアルキルエーテル、或いは１〜８個の炭
素原子を有するアルキルチオエーテルであり、またはＲ4はＲ3と共に及びＲ5は
Ｒ6と共に上記の如く各々２〜５個の炭素原子を有するアルキル鎖であり；およ
び Ｗ1、Ｗ2およびＷ3は水素またはクロロである、 及び（３）異なった蛍光染料がスペクトル的に分解可能であり且つ電気泳動的に
適合性であるように合成する工程、 一本鎖ＤＮＡを該プライマーの塩基配列に対する相補的領域に隣接した一本鎖
プラスミド中に、該プライマーがＤＮＡポリメラーゼにより挿入一本鎖ＤＮＡに
相補的オリゴヌクレオチドの合成を開始できるように挿入する工程、 この一本鎖ＤＮＡを含有する一本鎖プラスミドを複製する工程、 複製一本鎖プラスミドを第１部分、第２部分、第３部分、及び第４部分に分離
する工程、 第１の蛍光的に標識化したプライマーを第１部分の一本鎖プラスミドの相補的
領域にアニーリングし、及び第１の蛍光的に標識化したプライマー及び一本鎖プ
ラスミドをＤＮＡポリメラーゼとアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン
、及びジデオキシアデノシンのトリホスフェートの存在下において反応させて、
第 １の組の二本鎖ＤＮＡを形成する工程、 第２の蛍光的に標識化したプライマーを第２部分の一本鎖プラスミドの相補的
領域にアニーリングし、及び第２の蛍光的に標識化したプライマー及び一本鎖プ
ラスミドをＤＮＡポリメラーゼとアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン
、及びジデオキシグアノシンのトリホスフェートの存在下において反応させて、
第２の組の二本鎖ＤＮＡを形成する工程、 第３の蛍光的に標識化したプライマーを第３部分の一本鎖プラスミドの相補的
領域にアニーリングし、及び第３の蛍光的に標識化したプライマー及び一本鎖プ
ラスミドをＤＮＡポリメラーゼとアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン
、及びジデオキシ シチジン のトリホスフェートの存在下において反応させて、
第３の組の二本鎖ＤＮＡを形成する工程、 第４の蛍光的に標識化したプライマーを第４部分の一本鎖プラスミドの相補的
領域にアニーリングし、及び第４の蛍光的に標識化したプライマー及び一本鎖プ
ラスミドをＤＮＡポリメラーゼとアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン
、及びジデオキシ チミジン のトリホスフェートの存在下において反応させて、
第４の組の二本鎖ＤＮＡを形成する工程、 第１、第２、第３及び第４の組の二本鎖ＤＮＡからの二本鎖オリゴヌクレオチ
ドの混合物を形成する工程、 第１、第２、第３及び第４の組の二本鎖ＤＮＡ混合物の二本鎖ＤＮＡを溶融し
て一本鎖オリゴヌクレオチド類を形成する工程、及び 大きさに従って混合物中の一本鎖オリゴヌクレオチド類をゲル電気泳動により
分離する工程。
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