DE10163677A1

DE10163677A1 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Genexpression

Info

Publication number: DE10163677A1
Application number: DE10163677A
Authority: DE
Inventors: Klaus-Rudolf Schroeder; Dirk Petersohn; Guenter Schmitt
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2003-07-10
Also published as: AU2002361399A1; AU2002361399A8; WO2003054227A3; WO2003054227A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Genexpression sowie diagnostische Kits und deren Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Genexpression sowie diagnostische Kits und deren Verwendung
Für die Entwicklung neuer pharmazeutischer oder kosmetischer Wirkstoffe ist es von zunehmender Bedeutung, nicht nur Kenntnis darüber zu erlangen, für welche Genprodukte ein Genom insgesamt kodiert, sondern auch darüber, welche Gene exprimiert werden. Gene, deren Expression mit bestimmten erwünschten oder unerwünschten Zuständen eines Organismus korreliert, können als Markergene eingesetzt werden, indem man beispielsweise eine Probe aus dem Körper eines Patienten daraufhin untersucht, ob in den Zellen der Probe ein bestimmtes Gen exprimiert wird.
Von besonderem diagnostischem Interesse ist die quantitative Bestimmung der Genexpression, da sie die Identifizierung aussagekräftiger Expressionsmuster ermöglicht, d. h. Informationen darüber liefert, welche Gene unter welchen Bedingungen in welchem Ausmaß exprimiert werden.
Die quantitative Bestimmung der Genexpression kann mittels verschiedener bekannter Methoden erfolgen, beispielsweise mit Hilfe der "Seriellen Analyse der Genexpression" (SAGET™), die unter anderem bei Velculescu, V. E. et al., 1995 Science 270, 484-487, beschrieben wird.
Die Genexpression kann auf Proteinebene oder auf mRNA-Ebene bestimmt werden. Beispiele für Verfahren, die die Quantifizierung der Genexpression auf Proteinebene ermöglichen sind: Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie, Protein-Protein-Komplexierung in Lösung, Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und der Einsatz von Proteinchips, oder geeignete Kombinationen dieser Methoden.
Diese Methoden sind in dem Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben.
Die 2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L. D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L. D. Adams & S. R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F. M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1-10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die massenspektrometrische Charakterisierung von Proteinen oder Proteinfragmenten wird beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben: Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512. Carr, S.A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.
Beispiele für Verfahren, die die Quantifizierung der Genexpression auf mRNA- Ebene ermöglichen sind: Northern Blots, Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), Dot-Blots, cDNA-Sequenzierung, Klon- Hybridisierung, Differential Display, Subtraktive Hybridisierung, cDNA- Fragment-Fingerprinting, Total Gene Expression Analysis (TOGA), und der Einsatz von Nukleinsäurechips oder geeignete Kombinationen dieser Methoden.
Diese Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000), und "Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827-836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben. Das TOGA-Verfahren ist in "J. Gregor Sutcliffe et al. TOGA: An automated parsing technology for analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol. 97, No. 5, pp. 1976-1981 (2000)" beschrieben.
Ein besonders etabliertes Verfahren zur Quantifizierung der Genexpression auf mRNA-Ebene ist der RNase Protection Assay (RPA), der beispielsweise in Sambrook/Maniatis et al. Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 7.71 bis 7.78 sowie in Current Protocols in Molecular Biology, 1997, Eds. F. M. Ausubel et al., Unit 4.7.1-4.7.8, beschrieben wird.
In einem RPA werden nach vorliegenden spezifischen DNA-Sequenzen (Matrizen) mit Hilfe von RNA-Polymerasen radioaktiv markierte anti-sense RNA-Sonden definierter Länge hergestellt. Diese können dann durch eine Hybridisierungsreaktion mit entsprechenden Sequenzen aus einer gegebenen RNA-Population doppelsträngige RNA-Segmente bilden.
Eine anschließende Behandlung des Reaktionsgemisches mit Ribonukleasen eliminiert dann überschüssige freie Sonden, sowie andere einzelsträngige RNA. Die verbleibenden RNA-Stränge sind durch die Hybridisierung mit der spezifischen Sonden-RNA doppelsträngig und radioaktiv markiert. Sie sind durch ihre Doppelsträngigkeit vor der Zerstörung durch die Ribonukleasen geschützt und können mithilfe eines denaturierenden Polyacrylamidgels unter Verwendung von RNA-Fragmente definierter Größe als Marker analysiert werden.
Die Sondenpolymere können aber auch so konstruiert werden, daß sie etwas länger sind als die zu detektierende RNA-Sequenz und bei der Hybridisierung kurze einzelsträngige Überhänge bilden. Diese werden dann durch die Ribonukleasen eliminiert. Die geschützten Sequenzen sind daher nach der Ribonuklease-Behandlung etwas kürzer als die freie Sonde und können dadurch auf dem Gel von dieser unterschieden und identifiziert werden, wenn man die Sonde als Marker parallel laufen läßt.
RPAs werden seit mehr als 10 Jahren in der oben beschriebenen Weise durchgeführt, wobei wegen seiner Genauigkeit die erheblichen Nachteile dieses Verfahrens in Kauf genommen werden:
Die Durchführung eines RPA ist zeitaufwendig. Sie dauert aufgrund der notwendigen denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese, der sich anschließenden Trocknung des Gels und schließlich der Auswertung über Autoradiografie mehrere Tage.
Die Radiomarkierung mit [32P] bedingt ebenso wie der Umgang mit Acrylamid/Bisacrylamidmonomeren ein gesundheitliches Risiko für das Personal. Die Mitarbeiter müssen als strahlenexponierte Personen medizinisch überwacht werden. Der Umgang mit Isotopen bedarf behördlicher Genehmigungen und die Arbeit erfordert spezielle Räume (Kontrollbereiche), in denen mit offener Radioaktivität gearbeitet werden darf. Der Umgang mit Acrylamiden bedarf einer besonderen Vorsicht der Experimentatoren.
Die RNA Sonden sind nur beschränkt lagerfähig, da sie einer (Auto)-Radiolyse unterliegen.
Die Anzahl der Proben, die getestet werden können, ist bedingt durch die Technik der Gelelektrophorese limitiert.
Aufgrund der Vielzahl der einzelnen Arbeitsschritte und Arbeitsinhalte, des damit verbundenen Zeitbedarfs, sowie der benötigten Materialien ist der RPA ein teurer Test.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, den RPA unter Erhalt seiner Vorteile so zu verbessern, daß die bekannten Nachteile vermieden werden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Genexpression, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) nach vorliegenden spezifischen DNA-Sequenzen (Matrizen) mit Hilfe von RNA-Polymerasen anti-sense RNA-Sonden definierter Länge herstellt, wobei man auf chemische oder radioaktive Markierung der Sonden verzichtet,
b) doppelsträngige RNA-Segmente durch eine Hybridisierungsreaktion der RNA-Sonden mit entsprechenden Sequenzen aus einer gegebenen RNA-Population bildet,
c) das Reaktionsgemisch mit Ribonukleasen behandelt, um überschüssige freie Sonden sowie andere einzelsträngige RNA zu eliminieren und
d) die doppelsträngige RNA durch Kapillarelektrophorese analysiert und quantifiziert.

Unter Elektrophorese versteht man die Trennung von geladenen Molekülen im Elektrischen Feld. Die Kapillarelektrophorese ist ein elektrophoretisches Trennverfahren, bei dem die Trennung in mit Puffer gefüllten Kapillaren erfolgt. Durch Anlegen von Hochspannung (2-35 kV) werden geladene Moleküle auf Grund unterschiedlicher Ladungszahl und Mobilität getrennt.
Die Pionierarbeiten zur Entwicklung der Kapillarelektrophorese wurden bereits in den 50er und 60er Jahren durchgeführt, als Hjertén elektrophoretische Trennungen in offenen Glasröhren demonstrierte (Hjertén, S., 1967, Free zone electrophoresis, Chromatog. Rev., 9, 122219).
Unter dem Überbegriff Kapillarelektrophorese (CE) faßt man heute verschiedene Trenntechniken zusammen, dabei zählt neben der Kapillargelelektrophorese, der micellaren elektrokinetischen Chromatographie, Isotachophorese und isoelektrischer Fokussierung, die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) zu den am häufigsten verwendeten Verfahren.
Bei der CZE ist die Kapillare auschließlich mit Elektrolyt gefüllt und die Trennung beruht auf den Mobilitätsdifferenzen der Probenbestandteile.
Über dünne Kapillaren (Innendurchmesser 25-100 µm) aus amorphem Siliziumdioxid (Quarzglas, fused silica) werden bei der CE zwei Puffergefäße überbrückt, zwischen denen eine Spannung von bis zu 35 kV angelegt werden kann. Die Injektion von einigen nL der Probe am anodischen Ende der Kapillare kann hydrodynamisch über Druck oder elektrokinetisch erfolgen. Das Anlegen einer Spannung und das sich daraufhin ausbildende elektrische Feld in der Kapillare führt zur Mobilisierung der Ionen, die sich mit konstanter Geschwindigkeit bewegen.
Während der Trennung wird die eingesetzte Elektrische Leistung in Joulesche Wärme umgesetzt (übliche Stromstärken: 1-200 mA, umgesetzte Elektrische Leistung: bis zu 7 W). Dadurch werden die Pufferflüssigkeit und die Kapillare aufgeheizt. Die Joulesche Wärme muß möglichst effizient abgeleitet werden. Deshalb werden Kapillaren mit kleinem Innendurchmesser und daher hohem Oberflächen-VolumenVerhältnis verwendet. Durch den Einsatz englumiger Kapillaren werden gleichzeitig Radialdiffusion und Konvektion vermindert.
Die photometrische Detektion, meist im UV-Bereich, ist das am häufigsten angewandte Prinzip in der Kapillarelektrophorese. Dazu wird die Quarzglaskapillare im Strahlengang justiert und dient selbst als Küvette.
Zur Durchführung einer Trennung wird zunächst die Kapillare mit Puffer gefüllt. Anschließend wird eines der Puffergefäße gegen ein Probengefäß ausgetauscht. Die Probe wird hydrodynamisch durch Druckunterschiede oder elektrokinetisch durch kurzzeitiges Anlegen von Hochspannung in das Kapillarende gebracht. Die Probenzone ist üblicherweise wenige Millimeter lang. Zu Beginn der Trennung taucht das Kapillarende wieder in Puffer, so daß die elektrophoretische Trennung aus der injizierten Probenzone erfolgen kann. Die kapillarelektrophoretische Trennung wird beispielsweise für DNA ausführlich beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, 1999, Eds. F. M. Ausubel et al., Unit 2.8.1-2.8.17, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Da die Silanol-Gruppen von unbeschichtetem Quarzglas bei höheren pH- Werten teilweise deprotoniert werden und dann negativ geladen sind, empfiehlt es sich, beschichtete Kapillaren zu verwenden, die gegenüber Nukleinsäuren, insbesondere gegenüber RNA inert sind.
Die Kapillarelektrophorese wird häufig mit der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) verglichen. Durch den gerichteten Fluß und die photometrische Detektion sehen Chromatogramme und Elektropherogramme ähnlich aus, obwohl die Trennprinzipien verschieden sind.
Die Trennleistung ist generell in der CE höher, da in der HPLC zusätzliche Peakverbreiterung durch das parabole Strömungsprofil und die Verteilungsvorgänge beobachtet wird.
Außerdem kann in der CE durch Probenfokussierung (engl.: stacking) in vielen Fällen die Trennleistung erhöht werden. Die Elektrische Feldstärke ist umgekehrt proportional zur Leitfähigkeit. Häufig ist die Leitfähigkeit der Probenzone geringer als die des Puffers, besonders wenn wäßrige Lösungen der Analysensubstanzen injiziert werden. In diesen Fällen ist die Elektrische Feldstärke zu Beginn der Trennung in der Probenzone höher als im Puffer. Durch die hohe Feldstärke werden die Probenmoleküle in Richtung der Grenzschicht Probenzone/Puffer beschleunigt. Sobald sie diese Grenzschicht erreicht haben, wandern sie im geringeren Elektrischen Feld der Pufferlösung wesentlich langsamer weiter, so daß die Probenmoleküle an dieser Grenzschicht angereichert oder fokussiert werden.
Bei der elektrophoretischen Trennung einer Probe in einer Kapillare zählt die Höhe der angelegten Separations-Spannung zu einem der wichtigsten Parameter. Eine Erhöhung der Spannung kann viele Effekte nach sich ziehen; so wird beispielsweise die Wanderungsgeschwindigkeit der Probe und die elektroosmotische Fließgeschwindigkeit gesteigert und die Gesamtanalysendauer verkürzt. Darüber hinaus kann der Peak steiler werden und sich dadurch die Auflösung verbessern. Jedoch ist eine Potentialerhöhung auch mit einigen Nachteilen verbunden, z. B. einer größeren Produktion an Joulescher Wärme, die zur Aufrechterhaltung der Trennqualität effektiv abgeführt werden muß, wie bereits oben beschrieben.
Kann dies nicht gewährleistet werden, erwärmt sich die Kapillare, was zu einer verminderten Viskosität der Lösung führt. Diese wiederum bewirkt eine Erhöhung der elektroosmotischen Fließgeschwindigkeit, eine größere Ionen-Mobilität und Analyt-Diffusion, was schließlich in einer Bandenverbreiterung enden kann. Daher muß die Separations-Spannung durch den Fachmann sorgfältig ausgewählt werden, um solche die Trennung negativ beeinflussende Effekte zu vermeiden.
In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Kapillarelektrophorese eine Mikro-Kapillarelektrophorese (µCE).
Die Miniaturisierung der CE ist technisch möglich, nicht zuletzt da der Durchmesser der in kommerziellen CE-Instrumenten verwendeten Kapillaren im allgemeinen zwischen 20 und 100 µm liegt und damit in Größen, die mit konventionellen Mikrotechniken aufgelöst werden können.
Geeignete Trägermaterialien für erfindungsgemäß einsetzbare µCE-Systeme sind beispielsweise Silizium oder photostrukturierbares Glas, das aufgrund der besseren optischen, elektrischen und chemischen Eigenschaften bevorzugt ist. So können zum Transport von Flüssigkeiten und zur Trennung der Probe höhere Spannungen angelegt werden und eine optische Detektion wird durch die Transparenz des Materials erleichtert.
Durch die Oberflächenbeschaffenheit des Glases wird darüber hinaus gewährleistet, daß sich Reaktionen zur Beschichtung der Kapillaren häufig von konventionellen Systemen auf einen Chip übertragen lassen.
Von weiterem besonderem Interesse sind auch preiswerte Substrate wie organische Polymere, in die über Heißprägen oder Laser-Ablation ein mikrofluides Kapillarnetzwerk abgebildet werden kann. Außerdem geeignet sind viskose Polymere wie Polydimethylsiloxan (PDMS), in die das Netzwerk zunächst mit einem in Silizium gefertigten Positivmaster geprägt wird, die Aushärtung der Substrate erfolgt anschließend thermisch.
Die Detektion kann bei der erfindungsgemäß einsetzbaren CE, bzw. der bevorzugten Mikro-Kapillarelektrophorese (µCE) durch jede dem Fachmann bekannte Methode erfolgen. Geeignet sind beispielsweise die Laser-induzierte Fluoreszenz (LIF), die Absorption-Detektion über optische Fasern, Elektrochemie und Elektrospray-Massenspektrometrie.
Wegen ihres hohen Integrationspotentials bevorzugt ist die elektrochemische Detektion, da es mit Hilfe von Mikrotechniken gelingt, Mikroelektrodensysteme sowie weitere benötigte elektronische Bauteile zu fertigen.
Die Detektion in der CE wird in den meisten Fällen allerdings optisch direkt in der Kapillare durchgeführt werden.
Im Gegensatz zu chromatographischen Verfahren wandern die Probenbestandteile mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durch das Detektionsfenster, daher müssen bei einer quantitativen Auswertung über die Peakflächen die unterschiedlichen Verweilzeiten der Substanzen im Detektionsbereich berücksichtigt werden.
Kommerzielle CE-Systeme sind sowohl mit UV- als auch mit Fluoreszenz-Detektoren verfügbar.
Ein erfindungsgemäß einsetzbares Mikro-Kapillarelektrophorese (µCE) System kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden:
Ein gereinigter Glaschip wird zunächst mit einer Chrom/Gold-Maske beschichtet, auf die mittels Spin-Coating ein Photolack aufgebracht wird. Über eine Photomaske erfolgte die Belichtung nur einzelner Regionen, in denen sich der Lack bis zur Metallschicht hinunter ablöst, während die Flächen, die der Belichtung nicht ausgesetzt sind, gegen die hierfür verwendete Lösung inert bleiben und so feine (z. B. etwa 10 µm breite) Linien entstehen.
Im nächsten Schritt wird die in diesen Linien frei liegende Metallfläche bis zum Glaschip geätzt, der anschließend durch eine konzentrierte Mischung aus Fluß- und Salpetersäure strukturiert wird.
Der Glaschip wurde hierbei vorzugsweise isotrop geätzt, so daß ein Teil des Glases auch seitlich unter der Metallmaske entfernt wird.
Aus diesem Verfahren resultieren abgerundete Kapillarseitenwände, wohingegen der Boden eben bleibt. Das Ausmaß der horizontalen Ausdehnung des Kanals unter dem Metall wird durch die vertikale Ätztiefe bestimmt. Im allgemeinen werden die in vertikaler und horizontaler Richtung geätzten Distanzen identisch sein, so daß mit einer Maskenlinienbreite von 10 µm und einer Tiefe von 10 µm an der Oberfläche 30 µm breite Kanäle erhalten werden.
Der Fachmann wird gegebenenfalls die Einhaltung von Reinraumbedingungen zu beachten haben.
Zur Formung von geschlossenen Kanälen werden durch einen zweiten photolithographisch unbehandelten Chip zunächst Öffnungen im Durchmesser von etwa 3 mm gebohrt, anschließend werden beide Glasplatten so übereinander angeordnet, daß die Enden der geätzten Kanäle jeweils unter dem Mittelpunkt einer der Öffnungen im Cover-Chip liegen. Durch thermisches Bonden kann diese Positionierung abschließend fixiert werden.
Die Steuerung der Relais der Hochspannungsquellen sowie die Aquisition der Daten erfolgt über spezielle Software.
Zu den on-Chip günstig einsetzbaren Detektionsmethoden zählt die Laserinduzierte Fluoreszenz (LIF). Der Laserstrahl wird zunächst über eine Linse fokussiert und anschließend über einen Spiegel als (z. B. etwa 40 µm großer) Spot auf den Trennkanal gelenkt. Die an diesem Punkt von der Probe emittierte Fluoreszenz wird über ein Mikroskop-Objektiv gesammelt, durch eine Lochblende (z. B. etwa 800 µm) und optischen Bandpaßfilter (z. B. etwa 530 nm) auf einen Photomultiplier (PMT) gerichtet.
Die Datenaufnahme erfolgt mit einer geeigneten Frequenz, beispielsweise von 50 Hz.
Kommerziell ist das Konzept der Mikrochip-CE bisher lediglich im Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) umgesetzt worden. Dieser wird im Internet mit zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten unter der Adresse (URL)
http:/ / www.chem.agilent.com/scripts/LiteratureResults.asp?iprodinfotype=4&imo del=1153
beschrieben. Dort kann auch auf die Firmenschriften mit den Publikationsnummern 5988-3119EN, 5988-3001EN, 5988-2281EN, 5980-2206E, 5980-0472E, 5980-0321E, 5968-7495E und 5968-7493E zugegriffen werden, auf die hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird.
Mit diesem Gerät ist die parallele Bestimmung von 12 DNA/RNA-Proben in weniger als 30 min möglich, wobei jeweils nur 1 µl Probe zur Verfügung stehen muß (Müller, O.; Hahnenberger, K.; Dittmann, M.; Yee, H.; Dubrow, R.; Nagle, R.; Ilsley, D., 2000, A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation, Electrophoresis, 21, 128-134).
Bedingt durch den geringen Probenbedarf und die kurze Analysendauer ist dieses System der Fa. Agilent erfindungsgemäß besonders bevorzugt einsetzbar.
Die Kapillarelektrophorese ist eine hochauflösende Technik zur Separation einer Vielzahl von Molekülen, insbesondere von solchen, die von biologischem Interesse sind, wie Proteine, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, etc.
Die Qualität von RNA ist für deren molekularbiologische Analyse essentiell. Um einen Verdau durch RNAsen auszuschließen, wird die Integrität der RNA heute in Echtzeit über die Auftrennung mittels Kapillarelektrophorese überprüft. Geringste Probenvolumina sind ausreichend für diese Analysen.
Für diese Qualitätskontrollen werden idealerweise miniaturisierte Kapillarelektrophoreseeinheiten (µCE) verwendet, die mit Probenmengen von 5 ng RNA oder 0,1 ng DNA auskommen. RNA-Fragmente definierter Größe dienen der genauen Auswertung der zu überprüfenden Nukleinsäurepolymere.
RNA Kapillarelektrophoreseeinheiten, wie z. B. der erfindungsgemäß bevorzugt einsetzbare LabChip der Fa. Agilent, bedienen sich Markersysteme zwischen 200-6000 Nukleotiden. DNA Kapillarelektrophoreseeinheiten differenzieren zwischen Fragmenten, die Größenunterschiede von 10 Nukleotiden aufweisen.
Die Schritte a) bis c) des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen der Vorgehensweise in einem üblichen RPA, mit dem entscheidenden Unterschied, daß explizit auf eine Markierung der RNA verzichtet wird.
Der Ribonuclease Protection Assay (RPA) ist eine hochsensible und spezifische Methode zur Detektion und Quantifizierung von mRNA-Spezies. DNA- abhängige RNA Polymerasen in Kombination mit ihren Promotorsequenzen sind geeignet, hochspezifische RNA-Proben von DNA-Vorlagen zu synthetisieren. Die Polymerasen zeichnen sich durch eine hohe Spezifität für ihre Promotoren aus, können in einem hohen Maße auch lange RNA polymerisieren, und benötigen nur geringe Konzentrationen an Ribonucleinsäure-Triphosposphaten (rNTP).
Für den RPA gemäß der Schritte a) bis c) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vorzugsweise cDNA Fragmente von Interesse, also Fragmente, die Teilbereichen von Genen entsprechen, deren Expression man bestimmen möchte, in ein Plasmid mit den Promotoren der DNA abhängigen RNA- Polymerasen kloniert, und dienen so als Vorlage für die Synthese von antisense RNA-Sonden.
Die klonierten cDNA-Fragmente unterschiedlicher Länge können zu Sets zusammengesetzt werden, sodaß ihre Transkription in Gegenwart nicht markierter rNTP zu unterschiedlich langen, nicht markierten anti-sense RNA-Sonden führt.
Diese werden bevorzugt im Überschuss zur Zell-RNA in Lösung gegeben und bilden nach Hybridisierung mit ihren Komplementen doppelsträngige RNA (ds RNA). Nach einem Verdau der verbleibenden einzelsträngigen RNA mit RNase werden die vor RNasen geschützten dsRNA-Moleküle gereinigt und mittels CE quantifiziert.
Hinsichtlich der Durchführung der in den Schritten a) bis c) genannten Verfahrensmaßnahmen wird auf die Publikationen Sambrook/Maniatis et al. Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 7.71 bis 7.78 sowie auf Current Protocols in Molecular Biology, 1997, Eds. F. M. Ausubel et al., Unit 4.7.1-4.7.8, verwiesen. Es wird außerdem ausdrücklich Bezug genommen auf die im Internet unter der Adresse (URL):
http:/ / www.uni-ulm.de/~mwalter/HTML-versionen/RNAseProtection.htm
auffindbaren Protokolle.
Erfindungsgemäß können auch kommerziell erhältliche Kits zur Erleichterung der Durchführung der Schritte a) bis c) verwendet werden, beispielsweise das "RiboQuant® Multi-Probe RNase Protection Assay System" der Firma Pharmingen. Es handelt sich dabei um ein Kit, das alle notwendigen Reagenzien für die Durchführung von Sondensynthese, Hybridisierung und Ribonuklease-Behandlung enthält und zusammen mit verschiedenen "Sonden-Sets" ("Multi-Probe Template Sets") desselben Herstellers verwendet werden kann. Diese dienen zur gleichzeitigen Identifizierung mehrere mRNA Species aus einer einzigen Probe von Gesamt-RNA und enthalten außerdem Sonden zur Erkennung von Haushaltsgenen als interne Standards.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) Sonden mit einer Länge von etwa 50 bis etwa 2000 Nukleotiden, insbesondere etwa 60 bis etwa 1800 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 70 bis etwa 1600 Nukleotiden, bevorzugt etwa 80 bis etwa 1400 Nukleotiden, besonders bevorzugt etwa 90 bis etwa 1200 Nukleotiden und ganz besonders bevorzugt etwa 100 bis etwa 1000 Nukleotiden herstellt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) 1 bis etwa 100, insbesondere 1 bis etwa 80, vorzugsweise 1 bis etwa 60, bevorzugt 1 bis etwa 40, besonders bevorzugt 1 bis etwa 30 und ganz besonders bevorzugt 1 bis etwa 20 Sonden parallel herstellt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) Sonden mit einer Größendifferenz von 1 bis etwa 500 Nukleotiden, insbesondere 1 bis etwa 300 Nukleotiden, vorzugsweise 1 bis etwa 100 Nukleotiden bevorzugt 1 bis etwa 50 Nukleotiden besonders bevorzugt etwa 5 bis etwa 30 Nukleotiden und ganz besonders bevozugt etwa 10 bis etwa 20 Nukleotiden herstellt.
Die dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrundeliegende neue Kombination der beiden bekannten Methoden RPA und Kapillargelelektrophorese weist beachtliche Vorteile gegenüber dem zuvor geschilderten Stand der Technik auf:

a) Eine Produktion von Gelen und eine Autoradiografie mit anschließender densitometrischer Auswertung ist nicht mehr notwendig, da die RNA über die (vorzugsweise miniaturisierte) Kapillarelektrophorese mittels geeigneter Software innerhalb weniger Stunden analysiert werden kann.
b) Da die Proben erst zur Analyse mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert werden, erübrigt sich das Arbeiten mit Radioisotopen in speziell eingerichteten Räumen. Eine Gesundheitsgefährdung des Personals durch ionisierende Strahlung wird ausgeschlossen. Ebenso entfällt der Umgang mit Acrylamiden zur Herstellung denaturierender Polyacrylamidgele, da die Separation der Reaktionsprodukte mittels Kapillargelelektrophorese erfolgt.
c) Die in vitro synthetisierten RNA-Sonden haben keine Halbwertszeit und unterliegen keiner Autoradiolyse. Sie können daher nahezu unbegrenzt gelagert werden.
d) Die unter Punkt iii. genannte Tatsache verdeutlicht, dass ein Kit zur sensitiven Quantifizierung der Transkription bestimmter Gene in zwei Versionen bereitgestellt und gewerblich verwertet werden kann:
- a) Das Kit enthält die Plasmide zur in vitro-Synthese der RNA-Sonden. D. h. der Anwender stellt die Sonden in Eigenverantwortung her und benötigt dementsprechende Expertise und mehr Zeit zur Durchführung der Analysen.
- b) Das Kit enthält bereits die in vitro synthetisierten RNA-Sonden. Dies ist nunmehr möglich, da diese Moleküle lagerstabil hergestellt werden können. Der Anwender muss somit nicht in Eigenregie RNA- Sonden synthetisieren und kann direkt mit der Hybridisierungsreaktion starten.
e) Die Schnelligkeit, mit der die einzelnen Proben vermessen werden können, vorzugsweise mittels µCE bzw. des obengenannten Agilent-Chips ermöglicht einen hohen Durchsatz an Proben.

Das unter iv. genannte Kit ist zu Forschungszwecken ebenso wie für den medizinisch diagnostischen Bereich hervorragend geeignet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Kit zur Herstellung von Sonden zur Quantifizierung der Expression bestimmter Gene enthaltend Plasmide, ihrerseits enthaltend cDNA-Fragmente, die Teilbereiche von Genen repräsentieren, deren Expression bestimmt werden soll.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Quantifizierung der Expression bestimmter Gene enthaltend unmarkierte RNA-Sonden, die Teilbereichen von mRNA-Molekülen entsprechen, die ihrerseits Gene repräsentieren, deren Expression bestimmt werden soll.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kits bei der Quantifizierung der Expression bestimmter Gene in einem kombinierten RPA/CE-Verfahren, insbesondere in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Vorzugsweise verwendet man ein erfindungsgemäßes Plasmide enthaltendes Kit in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. ein unmarkierte RNA- Sonden enthaltendes Kit in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. eines erfindungsgemäßen Kits zur diagnostischen Quantifizierung der Genexpression auf dem Gebiet des Mutagenitätsmappings, der Single-Nucleotide-Polymorphismen, des generellen Nachweises von Polymorphismen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. eines erfindungsgemäßen Kits zur diagnostischen Quantifizierung der Genexpression von medizinisch oder kosmetisch bedeutsamen Genen, insbesondere von Tumormarkern, Alterungsmarkern, bevorzugt Hautalterungsmarkern oder Irritationsmarkern und Sensibilisierungsmarkern.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
Die Verfahrensschritte, die in dem erfindungsgemäßen Beispiel 2 gegenüber dem Beispiel 1 entfallen, sind kursiv gedruckt.

Beispiel 1

Durchführung eines Versuches gemäß Stand der Technik

Synthese der cDNA

Zur Synthese der cDNA wird nach folgendem Protokoll vorgegangen: Es wird folgender Versuchsansatz erstellt:
2,0 µl 5 × Transkriptionspuffer (z. B. Promega # P1181)
1,0 µl DTT (100 mM)
0,6 µl rATP (10 mM)
0,6 µl rGTP (10 mM)
0,6 µl rCTP (10 mM)
0,6 RNase Inhibitor (z. B. Boehringer # 799 025)
1,5 µl linearisiertes Plasmid (1-2 µg)
2,0 µl [32P]rUTP (z. B. 40 µCl, 110 TBq/mmol)
1,5 µl SP6-Polymerase (z. B. Promega # P1085)

1. Die Proben werden für 60 min bei 40°C inkubiert, dann mit 1,0 µl RQI DNAse (z. B. Promega # M6101) versetzt und für 10 min bei 37°C inkubiert.
2. 0,5 µl 10%(w/v) SDS und 11 µl Formamid-"dye" werden zu den Proben gegeben und diese dann in einem 4% denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt.
3. Nach der Elektrophorese wird ein Autoradiogramm des Gels erstellt und die Transkripte aus dem Gel durch "Crush & Soak" Elution isoliert. Die Ansätze werden über Nacht bei -20°C inkubiert und dann für 30 min bei 4°C in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert.
4. Das getrocknete RNA Präzipitat wird in 30 µl RPA-Hybridisierungspuffer resuspendiert.
5. Die eingebaute Radioaktivität in 1,0 µl der RNA-Lösung wird im Flüssigkeitsszintillationszähler quantifiziert.

Hybridisierung

Für den Hybridisierungsansatz wird nach folgendem Protokoll vorgegangen:

1. 5-30 µg Gesamt-RNA werden mit DEPC-Wasser auf ein Volumen von 175 µl eingestellt und durch die Zugabe von 25 µl Na-Acetat (3 M) und 500 µl EtOH präzipitiert.
2. Das getrocknete Präziptitat wird in 27-29 µl RPA-Hybridisierungspuffer resuspendiert. Dazu werden die Proben für 30 min bei 37°C inkubiert.
3. 1,5 µl der radioaktiven cRNA (~2.5-5 × 105 cpm) werden zugegeben, 10 min bei 95°C denaturiert und zur Hybridisierung über Nacht bei 46°C inkubiert.

RNAse Behandlung

Für den Abbau der nicht geschützten RNA durch RNasen wird folgende RNAse Lösung vorbereitet:
300 mM NaCl
10 mM Tris pH 7,5 bei 37°C
5 mM EDTA
4 µg/ml RNAse A (z. B. Sigma # R-9009)
8 U/ml RNAse T1 (z. B. Boehringer # 109 193)
Die Abbaureaktion wird nach folgendem Protokoll durchgeführt:

1. 300 µl der RNAse Lösung werden zu den Hybridisierungsansätzen gegeben und die Proben für 60 min bei 37°C inkubiert.
2. Die Reaktionsansätze werden in ein Eppendorfreaktionsgefäß mit 7 µl SDS 10% (w/v) und 2,5 µl Protease K (20 mg/ml) überführt und für 15 min inkubiert.
3. Die Proben werden anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit 60 µg Glycogen und 800 µl EtOH versetzt.
4. Zur Präzipitation werden die Ansätze für 60 min bei -20°C inkubiert und anschließend für 20 min bei 4°C in einer Eppendorftischzentrifuge zentrifugiert.
5. Das Präzipitat wird in 5-10 µl Formamid-"Dye" resuspendiert.

Elektrophorese

Zur Vorbereitung der Elektrophorese wird ein denaturierendes Polyacrylamidgel (5%) gegossen. Die zu analysierenden Proben und die nicht mit RNasen behandelten cRNA werden für 3 min bei 95°C denaturiert und dann bis zur Elektrophorese auf Eis gelagert.
3-5 µl der zu analysierenden cRNA werden auf das Gel aufgetragen. Als Längenstandards werden geeignete Molekulargewichtsmarker mit [32P]dATP phosphoryliert und im Gel mit aufgetrennt. Die Elektrophorese wird für ca. 2 h bei 70 W durchgeführt, das Gel anschließend getrocknet und ein Autoradiogramm erstellt.
Mit einer normalen Laborausstattung (1 Power Supply, 1 Gelkammer) ist man in der Lage, 30 Proben aufzutrennen. Dies beinhaltet die Produktion, die Auftrennung und die Trocknung des Gels. Anschließend wird das Gel für die Autoradiografie vorbereitet.

Beispiel 2

Erfindungsgemäß

Synthese der cDNA

Zur Synthese der cDNA wird nach folgendem Protokoll vorgegangen:
Es wird folgender Versuchsansatz erstellt:
2,0 µl 5 × Transkriptionspuffer (z. B. Promega # P1181)
1,0 µl DTT (100 mM)
0,6 µl rATP (10 mM)
0,6 µl rGTP (10 mM)
0,6 µl rCTP (10 mM)
0,6 RNase Inhibitor (z. B. Boehringer # 799 025)
1,5 µl linearisiertes Plasmid (1-2 µg)
1,5 µl SP6-Polymerase (z. B. Promega # P1085)

1. Die Proben werden für 60 min bei 40°C inkubiert, dann mit 1,0 µl RQI DNAse (. B. Promega # M6101) versetzt und für 10 min bei 37°C inkubiert.
2. 0,5 µl 10%(w/v) SDS und 11 µl Formamid-"dye" werden zu den Proben gegeben und diese dann in einem 4% denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt.
3. Nach der Elektrophorese wird ein Autoradiogramm des Gels erstellt und die Transkripte aus dem Gel durch "Crush & Soak" Elution isoliert. Die Ansätze werden über Nacht bei -20°C inkubiert und dann für 30 min bei 4°C in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert.
4. Das getrocknete RNA Präzipitat wird in 30 µl RPA-Hybridisierungspuffer resuspendiert.

Hybridisierung

Für den Hybridisierungsansatz wird nach folgendem Protokoll vorgegangen:

1. 5-30 µg Gesamt-RNA werden mit DEPC-Wasser auf ein Volumen von 175 µl eingestellt und durch die Zugabe von 25 µl Na-Acetat (3 M) und 500 µl EtOH präzipitiert.
2. Das getrocknete Präziptitat wird in 27-29 µl RPA-Hybridisierungspuffer resuspendiert. Dazu werden die Proben für 30 min bei 37°C inkubiert.

RNAse Behandlung

Mit einer normalen Laborausstattung (1 Power Supply, 1 Gelkammer) ist man in der Lage, 30 Proben aufzutrennen. Dies beinhaltet die Produktion, die Auftrennung und die Trocknung des Gels. Anschließend wird das Gel für die Autoradiografie vorbereitet.
Durch die Nutzung des Agilent Caliper LabChips erübrigen sich die Arbeitsschritte mit radioaktivem Material und die Auswertung über die gelelektrophoretische Auftrennung.
Die Proben werden der Anleitung von Agilent entsprechend im Caliper LabChip vermessen. Die Messung und die Auswertung für einen Chip dauert ca. 30 min. In dieser Zeit werden 12 Proben und die notwendigen Größenmarker ausgewertet. An einem Arbeitstag mit 8 h können auf diese Weise 180 Proben untersucht und ausgewertet werden.
Gegenüber der konventionellen Auswertung des RPA über die Gelelektrophorese bedeutet dies, daß über den Caliper LabChip ca. sechs mal mehr Proben in einem vergleichbaren Untersuchungszeitraum untersucht werden können. Eine densitometrische Auswertung des Gels ist bei dieser Abschätzung noch nicht mit berücksichtigt.
Bislang wird die Methode des RPA dazu eingesetzt, bis zu sechs Transkripte einer Zelle parallel zu untersuchen. Die Transkripte sind vielfach thematisch zusammengestellt, z. B. Irritationsmarker, Transkriptionsmarker, Sensibilisierungsmarker etc. Sie werden hauptsächlich in universitären Einrichtungen genutzt.
Mit der Vereinfachung der Auswertung durch die Kombination mit dem Agilent Caliper LabChip o. ä. ist eine Auswertung der RPA-Methode auf den medizinisch-diagnostischen Sektor möglich. Die Einsatzgebiete sind zahlreich: Mutagenitätsmapping, SNPs, Nachweis von Polymorphismen etc.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Genexpression, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) nach vorliegenden spezifischen DNA-Sequenzen (Matrizen) mit Hilfe von RNA-Polymerasen anti-sense RNA-Sonden definierter Länge herstellt, wobei man auf chemische oder radioaktive Markierung der Sonden verzichtet,

b) doppelsträngige RNA-Segmente durch eine Hybridisierungsreaktion der RNA-Sonden mit entsprechenden Sequenzen aus einer gegebenen RNA-Population bildet,

c) das Reaktionsgemisch mit Ribonukleasen behandelt, um überschüssige freie Sonden sowie andere einzelsträngige RNA zu eliminieren und

d) die doppelsträngige RNA durch Kapillarelektrophorese analysiert und quantifiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt d) eine beschichtete Kapillare einsetzt, die inert gegenüber Nukleinsäuren ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Kapillarelektrophorese in Schritt d) die Detektion mittels einer Methode vornimmt, die ausgewählt ist unter Laser-induzierter Fluoreszenz (LIF), Absorption-Detektion über optische Fasern, Elektrochemie und Elektrospray-Massenspektrometrie; insbesondere Elektrochemie oder Photometrie, vorzugsweise im UV-Bereich.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt d) die doppelsträngige RNA durch Mikro-Kapillarelektrophorese analysiert und quantifiziert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikro-Kapillarelektrophorese mit einem µCE-System vornimmt, dessen Trägermaterial ausgewählt ist unter Silizium, photostrukturierbarem Glas, organischen Polymeren und thermisch härtbaren viskosen Polymeren wie Polydimethylsiloxan

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das µCE-System ein Agilent 2100 Bioanalyzer der Fa. Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA, ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) Sonden mit einer Länge von etwa 50 bis etwa 2000 Nukleotiden, insbesondere etwa 60 bis etwa 1800 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 70 bis etwa 1600 Nukleotiden, bevorzugt etwa 80 bis etwa 1400 Nukleotiden, besonders bevorzugt etwa 90 bis etwa 1200 Nukleotiden und ganz besonders bevorzugt etwa 100 bis etwa 1000 Nukleotiden herstellt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) 1 bis etwa 100, insbesondere 1 bis etwa 80, vorzugsweise 1 bis etwa 60, bevorzugt 1 bis etwa 40, besonders bevorzugt 1 bis etwa 30 und ganz besonders bevorzugt 1 bis etwa 20 Sonden parallel herstellt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) Sonden mit einer Größendifferenz von 1 bis etwa 500 Nukleotiden, insbesondere 1 bis etwa 300 Nukleotiden, vorzugsweise 1 bis etwa 100 Nukleotiden bevorzugt 1 bis etwa 50 Nukleotiden besonders bevorzugt etwa 5 bis etwa 30 Nukleotiden und ganz besonders bevozugt etwa 10 bis etwa 20 Nukleotiden herstellt.

10. Kit zur Herstellung von Sonden zur Quantifizierung der Expression bestimmter Gene enthaltend Plasmide, ihrerseits enthaltend cDNA-Fragmente, die Teilbereiche von Genen repräsentieren, deren Expression bestimmt werden soll.

11. Kit zur Quantifizierung der Expression bestimmter Gene enthaltend unmarkierte RNA-Sonden, die Teilbereichen von mRNA-Molekülen entsprechen, die ihrerseits Gene repräsentieren, deren Expression bestimmt werden soll.

12. Verwendung eines Kits nach Anspruch 10 in Schritt a) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

13. Verwendung eines Kits nach Anspruch 11 in Schritt b) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

14. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bzw. eines Kits nach einem der Ansprüche 10 bis 13, zur diagnostischen Quantifizierung der Genexpression auf dem Gebiet des Mutagenitätsmappings, der Single-Nucleotide-Polymorphismen, des generellen Nachweises von Polymorphismen.

15. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bzw. eines Kits nach einem der Ansprüche 10 bis 13, zur diagnostischen Quantifizierung der Genexpression von medizinisch oder kosmetisch bedeutsamen Genen, insbesondere von Tumormarkern, Alterungsmarkern, bevorzugt Hautalterungsmarkern oder Irritationsmarkern und Sensibilisierungsmarkern.