KR20050009052A - 결핵균의 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결핵균의 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)의 리팜핀, 아이소니아지드, 피라진아마이드, 스트렙토마이신, 에탐부톨, 플로퀴놀론, 카나마이신 및 아미카신에 대한 약제 내성 검출을 위해서 특이적으로 결합 반응할 수 있는 프로브를 모두 포함하고 있을 뿐만 아니라, 각 약제의 내성을 검출할 수 있는 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체 위에 다수의 세트로 부착하여 단 1회의 실험으로 다수의 검체로부터 동시에 리팜핀, 아이소니아지드, 피라진아마이드, 스트렙토마이신, 에탐부톨, 플로퀴놀론, 카나마이신 및 아미카신에 대한 약제 내성의 검출이 가능하며, 배양된 균뿐만 아니라 임상 검체를 이용하여 대량으로 신속하고 정확한 진단 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 약제 내성을 동시에 검출할 수 있는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 지지체에 부착된 리팜핀, 아이소니아지드, 피라진아마이드, 스트렙토마이신, 에탐부톨, 플로퀴놀론, 카나마이신및 아미카신에 대한 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.
결핵은 감염성 질병 중 사망률과 이환률 1위를 차지하는 심각한 보건 문제중의 하나로, 전 인류의 3분의 1이 결핵균에 감염되어 있는데, 전세계적으로 매년 8백만 명이 결핵균에 감염되며 3백만 명 이상의 사망자가 발생하고 있는 것으로 세계보건기구(WHO)는 추정하고 있다(WHO/UNHCR. An Interagency Field Manual. Tuberculosis, 15-17(1997)).
개발도상국에서는 항결핵제의 부족으로 인한 부적절한 치료 및 관리로 항생제 내성균을 가진 만성 보균자가 증가되었다. 최근 5년간 35개국에서의 항생제 내성 결핵균에 대한 조사에 의하면, 한가지 이상의 약제에 내성을 가지는 경우가 36%에 이르고, 아이소니아지드(isoniazid, INH)와 리팜핀(rifampin, RMP)을 포함한 2가지 이상의 항생제에 내성을 보이는 다제내성결핵(multidrug-resistantM. tuberculosis, MDR-TB)이 약 13%로 심각한 수준에 이르고 있다. 또한 치료경력이 없는 환자에서조차도 적어도 한가지 약제에 대한 내성을 보이는 경우도 9.9%에 달하고 있다. 이처럼 결핵, 그 중에서도 약제 내성 및 다제내성 결핵은 치료비용의 증가를 불러올 뿐만 아니라 치료 효율도 낮아져 난치성 결핵으로 발전하는 등의 큰 위협을 주고 있다(Pablos-Mendex A, et al. N Engl J Med, 338: 1641-1649(1998)).
결핵균의 항생제 감수성 검사로 현재 많은 검사실에서는 표준적인 결핵균 검출방법으로 우선 항산균(acid fast bacteria) 염색(AFB staining)을 실시한 후 균 배양을 하고 배양된 균에서 결핵임을 확인하기 위한 생화학적 검사를 시행한다. 이과정은 검체 채취로부터 결핵균 균주 감별 시까지 4∼6주가 소요된다. 또한, 배양된 결핵균의 항생제 감수성 검사는 2∼4주의 기간을 더 요하므로 항생제 내성 결핵균의 조기 진단에 어려움이 있다(Chang CH, et al. J Korean Sco Chem, 16: 187-203(1998)).
최근에는 액체배지를 사용한 새로운 약제감수성 검사법이 개발되었는데, 이는 결핵균의 대사에 의해 일어나는 화학적 조성 변화를 형광의 형태로 탐지하여 약제 내성 여부를 결정하는 MGIT(mycobacteria growth indicator tube) 방법이다. 검사결과를 얻기까지 일주일 정도가 소요되며 고가의 장비와 배지를 필요로 하고 검사에 사용할 수 있는 약제가 제한되어 있는 단점이 있다.
이런 약제 감수성 검사 시간을 단축하기 위해서, 분자생물학적 방법에 의한 항생제 내성기전에 대한 연구가 활발히 진행되어 리팜핀(rifampin, RMP), 아이소니아지드(isoniazid, INH), 피라진아마이드(pyrazinamide, PZA), 스트렙토마이신(streptomycin, SM), 에탐부톨(ethambutol, EMB), 플로퀴놀론(fluoroquinolone, FQ), 카나마이신(kanamycin, KAN), 그리고 아미카신(amikacin, AMI) 등의 항생제가 표적하는 유전자 부위의 돌연변이가 보고되었다.
분자생물학적 방법중 PCR과 다형성 분석용 전기영동법을 접목한 PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)는 유전자 구조 변화를 분석함으로써 돌연변이를 스크리닝 할 수 있으나, 감수성균과 내성균이 공존할 경우 내성균 비율이 낮을 때 이를 감수성으로 평가할 수 있는 단점이 있다(Telenti A, et al. JClin Microbiol, 35:719-723(1997)).
또 다른 방법인 혼성화 반응에 기초한 Line hybridization assay(INNO-LiPA Rif. TB kit : Innogenetics, Belgium) 방법은 프로브나 표적 DNA를 다량 필요로 하고 프로브의 수가 리팜핀 한 약제에 대한 코돈 516, 522, 526, 531과 533의 야생형 5종류와 돌연변이형 4종류 검출에만 제한되어 있는 단점이 있다(Lee MK, et al. 결핵 및 호흡기 질환, 44:251-263(1997)).
위의 방법들처럼 종래 사용된 대부분의 분자생물학적 방법들은 한 연구자가 다수의 유전자를 가지고 동시에 실험을 하는 데에는 한계가 있고 아직까지 이러한 유전적 염기서열 변화를 이용하여 한번의 실험으로 다양한 약제의 돌연변이를 검출할 수 있는 새로운 기술의 개발이 절실히 요구된다.
이상에서 보여지듯이, 전 세계적으로 마이코박테리아에 의한 많은 수의 감염 환자와 사망자가 발생하고 있으며, 항생제의 오·남용으로 인한 다제내성 결핵의 출현으로 심각성이 증가되고 있다. 따라서, 신속하면서도 정확한 항생제 내성 결핵균의 검출을 위한 방법이 절실히 요구되고 있다. 그럼에도, 현재는 대부분의 다제내성 결핵을 조사하는 실험이 각 약제별로 개별적으로 진행되고 있어 조속한 검사 결과를 요하는 실험에서 장시간이 소요된다는 큰 단점을 가지고 있다.
이에 최근에 개발된 DNA 칩을 이용한 유전자 검색 방법이 위의 기술적 한계를 극복할 수 있을 것으로 예측되어 지고 있다. DNA 칩은 수십 개부터 수십만 개의 DNA 프로브를 아주 작은 공간에 부착시켜 유전자의 발현, 다형성, 돌연변이 검출과 genotyping 등을 동시에 검사하는데 아주 유용한 기술이다. 이러한 DNA 칩으로 대체 될 수 있는 기존의 대표적인 유전공학 방법으로는 Southern과 Northern blot, PCR 등이 있다. DNA 칩은 동시에 수백개에서 수천개의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있다는 것과 Southern이나 Northern blot의 경우 유전물질을 붙이는 매체로 니트로셀룰로즈 (nitrocellulose) 막을 사용하는데 반하여 DNA 칩에서는 유리와 같은 고형체를 사용함으로써 아주 적은 양의 유전물질을 고밀도로 붙일 수 있게 되어 동시에 많은 수를 검색할 수 있다. 또한 DNA 칩은 DNA 이외의 여러 가지 다른 생체분자도 적용이 가능하다는 장점이 있다. (US 6,228,575 B1, 대한민국특허 특2001-0107413)
이상과 같은 종래의 항결핵제에 대한 결핵균의 내성 검사법의 문제점들을 고려하였을 때, 본 발명의 주된 목적은 한번의 실험으로 동시에 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 피라진아마이드, 스트렙토마이신, 에탐부톨, 플로퀴놀론, 카나마이신 및 아미카신과 관련한 항생제 내성을 배양된 균뿐만 아니라 임상 검체에서도 신속하고 정확하게 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로어레이에 사용 가능한 프로브 또는 프라이머용 올리고뉴클레오티드를 제공하는 데 있다.
도 1의 a)는 결핵균의 항생제 내성 검출을 위한 각각의 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체에 다수 세트로 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이고, b)는 a)중 한 세트의 프로브로 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이고, c)는 b)의 마이크로어레이를 프로브 기능별로 구획을 나눈 도면이고,
도 2, 3, 4, 5는 한번의 실험으로 결핵균의 리팜핀과 아이소니아지드 내성을 동시에 검출하기 위한 각 프로브들의 특이적 혼성화 반응의 결과에 대한 것이다.
도 6은 결핵균의 리팜핀에 대한 약제 내성을 검출하기 위한 각 프로브들의 특이적 혼성화 반응의 결과에 대한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지지체에 부착된 결핵균의 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에서, 지지체는 마이크로어레이의 제작에 통상적으로 사용되는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip) 또는 실리콘(silicon) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, 프로브는 결핵균의 항생제 내성에 특이적인 어떤 생물분자(bio-molecules)도 포함하나, 바람직하게는 DNA, RNA 또는 PNA 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 마이크로어레이에서, 바람직하게는 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브(probes)가 리팜핀, 아이소니아지드, 피라진아마이드, 스트렙토마이신, 에탐부톨, 플로퀴놀론, 카나마이신 및 아미카신으로 구성된 군에서 선택된 한 종류 이상의 항생제 내성을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 하나의 지지체에 상기 항생제 내성을 검출하는 프로브를 각각의 세트로 하여 다수의 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이로써, 단 1회의 실험으로 다수의 검체로부터 동시에 결핵균의 다수 약제에 대한 내성 검출을 신속하고 정확하게 할 수 있다.
본 발명에서, 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브는 항생제 내성을 유발하는 표적 유전자에 특이적으로 결합 반응할 수 있는 염기서열, 예를 들면, 리팜핀(rifampin, RMP), 아이소니아지드(isoniazid, INH), 피라진아마이드(pyrazinamide, PZA), 스트렙토마이신(streptomycin, SM), 에탐부톨(ethambutol, EMB), 플로퀴놀론(fluoroquinolone, FQ), 카나마이신(kanamycin, KAN), 또는 아미카신(amikacin, AMI) 등에 대한 내성을 유발하는 염기서열에 특이적으로 반응이 가능한 즉, 상보적인 염기서열의 어떤 올리고뉴클레오티드도 포함하나, 바람직하게는 리팜핀 내성을 유발하는 rpoB 유전자의점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 아이소니아지드 내성을 유발하는 katG 유전자와 inhA 유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 피라진아마이드 내성을 유발하는 pncA 유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 스트렙토마이신 내성을 유발하는 rpsL 유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 에탐부톨 내성을 유발하는 embB 유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 플로퀴놀론 내성을 유발하는 gyrA 유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 카나마이신과 아미카신 내성을 유발하는 rrs 유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 17 내지 37의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 38 내지 42의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 43과 44의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 45 내지 48의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 49 내지 54의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 55 내지 66의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티와 서열번호 67 내지 73의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 마이크로어레이는 위에서 제시한 현재 사용되고 있는 결핵 치료용 항생제 이외에 새로 개발되는 항생제에 대해서도 내성을 동시에 검출하기 위하여 새롭게 밝혀지는 항생제 내성과 관련된 돌연변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수도 있다.
RMP와 INH 모두에 내성을 보이는 다제내성 결핵균 중 RMP 내성 균주의 94∼98%가rpoB유전자에 의해 암호화되는 DNA 의존성 RNA 중합효소 β subunit에 포함된 69 bp 염기서열의 제한된 지역 내의 점돌연변이(point mutation)에 의해 생기므로 DNA 혼성화 반응(hybridization)과 역 혼성화 반응(reverse hybridization)을 이용하여 쉽게 확인할 수 있다(이민기, 외. 결핵 및 호흡기 질환, 44: 251-263(1997); Rossau R, et al. Antimicrob Agents Chemother, 41: 2093-2098(1997)).
또 다른 항생제인 INH는 결핵균에 내성이 나타나지 않는 한 가장 이상적인 항생제로써 주로 마이코박테리움 투베르쿨로시스 콤플렉스에 의한 감염 치료에 주로 이용된다. INH 내성 결핵균의 약 84%가katG유전자의 점돌연변이 또는inhA의 상류 뉴클레오티드(upstream nucleotide) 치환에 의한 것으로 75%가 catalase-peroxidase 효소의 유전자인katG유전자 일부의 구조 변화에 의한 기능 저하 또는 기능 상실이 주로 발견되고 있고, 그중 코돈 315 부위의 serine(AGC)이 threonine(ACC)과 asparagine(AAC)으로 치환된 돌연변이가 INH 내성에 중요한 기전으로 밝혀지고 있다. 또한 결핵균 세포벽의 주성분 중의 하나인 mycolic acid의 생합성과 관련된 enoyl acyl reductase를 암호화하는inhA유전자의 주요 돌연변이로 리보솜 단백질의 결합 부위에 C가 T로 치환된 돌연변이가 주요 기전으로 밝혀져 있다(Musser JM, et al. J Infect Dis. 173: 196-202(1996); Ramaswamy S, et al. Tuber Lung Dis, 79: 3-29(1998)).
PZA는 결핵을 치료하는 일차 약제 중의 하나로, 피라진아미데이즈(pyrazinamidase, PZase)에 의해서 활성형인 피라지노익 액시드(pyrazinoic acid, POA)로 전환되어 살균 효과를 나타내고, 결핵균이 갖고 있는 PZase의 활성이 소실되면 그 결핵균은 PZA에 내성을 갖게 된다(Konno K, et al. Am Rev Respir Dis 95: 461-469(1967)). PZA 내성에는 PZase를 만들어내는 유전자인pncA유전자 프로모터의 -11에 A가 G로 변형된 돌연변이가 중요한 PZA 내성 기전으로 보고되었다(대한민국특허 030935).
일차 항결핵 약제 중 가장 먼저 쓰여진 SM은 균의 세포막 내로 들어가 리보솜 단백질에 결합하여 비정상적인 단백을 합성하게 하여 균을 사멸시키는데 이와 관련된 16S rRNA를 암호화하는rrs유전자나 리보솜 단백질 S12의rpsL유전자의 돌연변이에 의해 약 70% 이상의 내성이 나타난다고 밝혀지고 있다(Marion F, et al. Mol Microb, 9: 1239-1246(1993); Nadine H, et al. Antimicrobial agent Chem, 38: 238-242(1994)). SM 내성 중rpsL유전자의 코돈 43과 코돈 88의 lysine(AAG)이 arginine(AGG)으로 치환된 돌연변이가 주요 SM 내성 기전으로 보고되었다.
또 다른 일차 항결핵 약제인 EMB는 INH 외의 다른 약제와 병행하여 사용하는데 RNA 합성과 안정화에 작용하는 polyamines이나 metal cations의 작용을 방해하여 마이코박테리아의 세포벽 합성을 억제함으로써 항균력을 나타낸다. 세포벽 arabinogalactan의 arabinose의 중합반응(polymerization)을 매개하는 arabinosyltransferase를 암호화하는 약 10 kb의embCAB오페론 내에서도 특히,embB유전자의 코돈 306의 점돌연변이가 출현빈도가 높은 부위로 밝혀지고 있다(Musser JM. et al. Antimicrobial agent Chem, 44: 326-336(2000); Musser JM, et al. Antimicrobial agent Chem,, 41: 1677-1681(1997); Ramaswamy S, et al. Tuber Lung Dis, 79: 3-29(1998)).EmbB유전자의 코돈 306에서 methionine(ATG)이 valine(GTG), leucine(CTG), isoleucine(ATA), isoleucine(ATT) 이나 isoleucine(ATC)으로 치환된 5가지가 주요 점돌연변이로 보고되고 있다.
선택적인 이차 약제인 FQ에는 시프로플로사신(ciprofloxacin, CIP)과 오플로사신(ofloxacin,OFX) 등이 있는데, 이 약제는 그들의 표적인 ATP-dependent type Ⅱ topoisomerase인 DNA gyrase에 결합하여 DNA의 supercoiling을 저해함으로써 DNA topology에 의존하는 세포 과정을 분열시켜서 항균력을 나타낸다. DNA gyrase는gyrA와gyrB유전자를 암호화하는 각각 두 개의 A와 B subunit으로 구성되어 있는데, 이 중에서 42-85%의 내성이 나타나는 quinolone resistance determining region (QRDR)으로써gyrA의 40개 아미노산 부위가 점돌연변이의 출현빈도가 높은 부위로 밝혀지고 있다(Ramaswamy S, et al. Tuber Lung Dis, 79: 3-29(1998); Cambau E, et al. 13th Forum in Microbiology, 26:52-59(1995)).
FQ 내성 중gyrA유전자의 코돈 88의 glycine(GGC)이 cysteine(TGC), 코돈90의 alanine(GCG)이 valine(GTG), 코돈 91의 serine(TCG)이 proline(CCG)으로 치환된 것과 코돈 94의 aspartic acid(GAC)가 glycine(GGC), histidine(CAC), asparagine(AAC), tyrosine(TAC)과 alanine(GCC)으로 치환된 돌연변이가 주요 FQ 내성 기전으로 보고되었다.
결핵 치료의 또 다른 중요한 이차 약제인 KAN과 AMI는 aminoglycoside계 항결핵제로써 결핵균의 리보솜(ribosome)에 직접적으로 결합하여 단백질 합성을 저지시켜 항결핵 작용을 나타낸다. KAN과 AMI의 내성과 관련된 유전자는 16S rRNA를 암호화하는rrs유전자로써 이의 염기서열 변화가 약 70% 이상의 내성과 관련한다고 밝혀지고 있다(Yasuhiko S, et al. JCM, 36:1220-1225(1998); George JA, et al. Antimicrobial agent Chem, 42:1295-1297(1998)).
KAN과 AMI의 내성 중rrs유전자의 염기서열 1400 bp 부위의 A가 G, 1401 bp 부위의 C가 A와 T로 치환된 것과 1483 bp 부위의 G가 T로 변형된 돌연변이가 주요 KAN과 AMI의 내성 기전으로 보고되었다.
본 발명에서의 항생제 내성 결핵균의 검출 방법은 각 항생제의 염기서열 변화에 의한 돌연변이 검출에 기초하였다. 각 항생제에서 표적 염기서열의 야생형과 돌연변이 검출을 위한 프로브를 고형지지체에 부착하여 마이크로어레이를 제작하였다. 한번의 실험으로 다양한 돌연변이 검출이 가능하며, 장시간이 소요되는 기존의 항생제 내성 결핵균 검출 방법에 비해 단 몇 시간 내에 정확한 점돌연변이를 검출함으로서 신속한 항생제 내성 여부 확인으로 효과적인 결핵치료를 가능하게 하는 검사법이다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 마이크로어레이를 이용하여 결핵균의 여러 가지 항생제의 내성 검출을 동시에 수행하는 항생제 내성 검출 방법을 제공한다. 즉, 본 발명의 마이크로어레이를 제작하고, 여기에 배양된 균 또는 임상 검체로부터 분리된 표적 DNA를 혼성화 반응시킨 후, 표적 DNA와 프로브의 결합유무를 확인함으로써 결핵균의 항생제 내성 검출을 동시에 수행할 수 있다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열 번호 1 내지 73의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함한 항생제 내성을 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브용 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 비록 한 가닥의 염기서열만을 기재하였지만, 표적 DNA 이중가닥 중 어느 가닥에 대해서도 프라이머 또는 프로브 디자인이 가능하므로 상기 서열번호들의 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) 염기서열을 모두 포함하는 것으로 해석되어진다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열 번호 1내지 16의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함한 하나이상의 프라이머용 올리고뉴클레오티드와 서열 번호 17 내지 73의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함한 하나이상의 프로브용 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항생제 내성 검출용 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 진단 키트에는 본 발명의 프로브가 부착된 마이크로어레이외에 혼성화 반응용액, 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머가 포함된 PCR 키트, 비혼성화 반응 DNA 세척용 용액, 커버슬립, 염료, 비염료 결합 세척용 용액 및사용설명서 등을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단키트는 서열 번호 1 내지 73의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 결핵균 외 비결핵마이코박테리아 치료용 항생제인 레보플로사신(levofloxacin), 스파플로사신(spafloxacin), 바이오마이신(viomycin)과 카프리오마이신(capreomycin) 내성과 관련된 돌연변이를 검출하는 프라이머 또는 프로브용 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예인 마이크로어레이의 도면으로서, a)는 결핵균의 리팜핀(rifampin, RMP), 아이소니아지드(isoniazid, INH), 피라진아마이드(pyrazinamide, PZA), 스트렙토마이신(streptomycin, SM), 에탐부톨(ethambutol, EMB), 플로퀴놀론(fluoroquinolone, FQ), 카나마이신(kanamycin, KAN), 그리고 아미카신(amikacin, AMI)의 항생제 내성 검출을 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체에 다수 세트로 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이며, b)는 a)중 한 세트의 프로브로 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이며, c)는 b)의 마이크로어레이를 프로브 기능별로 구획을 나눈 도면이다. 도 1에서, 마이크로어레이의 상단부터 각각 RMP 내성 검출, INH 내성 검출, PZA 내성 검출, SM 내성 검출, EMB 내성 검출, FQ 내성 검출, KAN-AMI 내성 검출을 위한 프로브를 부착하고 있으나, 이것은 본 발명에 따른 프로브 구획의 한 예에 불과하므로 각 프로브 구획의 위치(layout)는 변동될 수 있다.
본 발명에서 개발된 결핵균의 리팜핀(rifampin, RMP), 아이소니아지드(isoniazid, INH), 피라진아마이드(pyrazinamide, PZA), 스트렙토마이신(streptomycin, SM), 에탐부톨(ethambutol, EMB), 플로퀴놀론(fluoroquinolone, FQ), 카나마이신(kanamycin, KAN), 그리고 아미카신(amikacin, AMI)의 항생제 내성 검출을 위한 프라이머 및 프로브는 표1과 표2와 같다.
<표1> 항생제 내성 검출을 위한 프라이머
| 항생제 | 표적유전자 | 프라이머 | 염기서열 | 서열번호 |
| Rifampin(리팜핀) | rpoB | Rpo FRpo R | 5'-b- TCGCCGCGATCAAGGAGT-3'5'-b-TGCACGTCGCGGACCTCCA-3' | 12 |
| Isoniazid(아이소니아지드) | katG inhA | Kat 1FKat 4RInh FInh R | 5'-b-AAGAGCTCGTATGGCACCGG-3'5'-b-AGCGCCAGCAGGGCTCTTC-3'5'-b-ACCCCAGTGCGAAAGTTCCC-3'5'-b-GGTAACCAGG ACTGAACGGG-3 | 3456 |
| Pyrazinamide(피라진아마이드) | pncA | Pnc FPnc R | 5'-b-GCTGGTCATGTTCGCGATCG-3'5'-b-ACCGGTTACCGCCAGCGAG-3' | 78 |
| Streptomycin(스트렙토마이신) | rpsL | SM FSM R | 5'-b-GATGAGTAAGGTCAAGACCG-3'5'-b-GTTCTTGACACCCTGCGTAT-3' | 910 |
| Ethambutol(에탐부톨) | embB | EMB FEMB R | 5'-b-AATTCGTCGGACGACGGCTA-3'5'-b-TCACCTATGTGCTGATCGAG-3' | 1112 |
| Fluoroquinolone(플로퀴놀론) | gyrA | GyrFGyrR | 5'-b-ACCGCAGCCACGCCAAGTCG-3'5'-b-GCCTGGCGAGCCGAAGTTGC-3' | 1314 |
| Kanamycin-Amikacin(카나마이신-아미카신) | rrs | RrsFRrsR | 5'-b-AATCCTTAAAAGCCGGTCTC-3'5'-b-ACGGCCTACGCCCCACCAGT-3' | 1516 |
<표2> 항생제 내성 검출을 위한 프로브
| 항생제 | 표적유전자 | 프로브 | 염기서열 | 서열번호 |
| Rifampin(리팜핀) | rpoB | 511W511M513W513M516W516M1516M2516M3522W522M526W526M1526M2526M3526M4526M5531W531M1531M2533W533M | 5'- CAGCCAGCTGAGCCAATTCA-3'5'- AGCCAGCCGAGCCAA-3'5'- CTGAGCCAATTCATG-3'5'- CTGAGCCTATTCATGG-3'5'- TTCATGGACCAGAACA-3'5'- TTCATGGTCCAGAACA-3'5'- ATTCATGTACCAGAACA-3'5'- ATTCATGTTCCAGAACA-35'- CTGTCGGGGTTGAC-3'5'- CTGTTGGGGTTGAC-3'5'- GTTGACCCACAAGCGCCGA-3'5'- GGTTGACCTACAAGCGC-3'5'- GGTTGACCGACAAGCGC-3'5'- TTGACCCGCAAGCGC-3'5'- TTGACCCTCAAGCGC-3'5'- TTGACCCCCAAGCGC-3'5'- CGACTGTCGGCGCTG-3'5'- CGACTGTTGGCGCTG-3'5'- CCGACTGTGAGCGCT-3'5'- GGCGCTGGGGCCCGGC-3'5'- GTCGGCGCCGGGGCCCG-3'' | 171819202122232425262728293031323334353637 |
| Isoniazid(아이소니아지드) | katG inhA | 315W315M1315M2inhWinhM | 5'- ATCACCAGCGGCATC -3'5'- ATCACCACCGGCATC -3'5'- ATCACCAACGGCATC -3'5'- GGCGAGACGATAGGT -3'5'- GGCGAGATGATAGGT -3' | 3839404142 |
| Pyrazinamide(피라진아마이드) | pncA | 11W11M | 5'- ACGTATGGTGGACGT-3'5'- ACGTGTGGTGGACGT -3' | 4344 |
| Streptomycin(스트렙토마이신) | rpsL | 43W43M88W88M | 5'- TCGGCTTCTTCGGAGT-3'5'- TTCGGCTTCCTCGGAGTG-3'5'- GCAGGTCCTTCACCCG-3'5'- GCAGGTCCCTCACCCG-3' | 45464748 |
| Ethambutol(에탐부톨) | embB | 306W306M1306M2306M3306M4306M5 | 5'- ACTCGGGCCATGCCCAG-3'5'- TCGGGCCACGCCCAGGA-3'5'- TCGGGCCAGGCCCAGGA-3'5'- ACTCGGGCTATGCCCAG-3'5'- ACTCGGGCAATGCCCAG-3'5'- ACTCGGGCGATGCCCAG-3' | 495051525354 |
| Fluoroquinolone(플로퀴놀론) | gyrA | FQ88WFQ88MFQ90WFQ90MFQ91WFQ91MFQ94WFQ94M1FQ94M2FQ94M3FQ94M4FQ94M5 | 5'-CCCGCACGGCGACGC-3'5'-CCCGCACTGCGACGC-3'5'-GGCGACGCGTCGATC-3'5'-GGCGACGTGTCGATC-3'5'-CGACGCGTCGATCTA-3'5'-CGACGCGCCGATCTA-3'5'-ATCTACGACAGCCTG-3'5'-ATCTACGGCAGCCTG-3'5'-GATCTACCACAGCCT-3'5'-GATCTACAACAGCCT-3'5'-GATCTACTACAGCCT-3'5'-ATCTACGCCAGCCTG-3' | 555657585960616263646566 |
| Kanamycin-Amikacin(카나마이신-아미카신) | rrs | 1400W1400M1401W1401M11401M21483W1483M | 5'-GCCCGTCACGTCATG-3'5'-GCCCGTCGCGTCATG-3'5'-CCCGTCACGTCATGA-3'5'-CCCGTCAAGTCATGA-3'5'-CCCGTCATGTCATGA-3'5'-TTGGGACGAAGTCGT-3'5'-TTGGGACtAAGTCGT-3' | 67686970717273 |
이하, 실시예를 기초로 하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시 예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.
실시 예 1: 균주로부터 제놈 DNA 분리
본 실험에 사용된 결핵균은 대한결핵협회에서 분양받은 균주와 국립마산결핵병원을 통해서 검체를 확보하였다.
이들의 DNA를 추출하기 위해서는 인스타진 매트릭스(InstaGene matrix, Bio-Rad Co., USA)를 사용하였다. 균주 및 임상 검체는 1.5 ㎖ 튜브에 인스타진 매트릭스 100 ㎕를 가하였다. 그리고, 본 실험에 사용할 균주를 고체 배지(Ogawa 배지)에서 배양한 후 1 백금이를 따서 인스타진 매트릭스가 들어 있는 튜브에 넣어 부유시켰다. 이것을 항온수조의 56 ℃에서 30 분 동안 반응시킨 후 10 초 동안 잘 혼합되도록 섞어 균질화 시키고, 다시 100 ℃에서 8 분 동안 열처리한 후 10 초 동안 잘섞었다. 혼합물을 12,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 이를 PCR 반응의 주형 DNA로 사용하였다.
사용된 균주는 대한결핵협회 분양균주 40주와 국립마산결핵병원에서 제공받은 15주를 사용하였다.
실시 예 2: 결핵균의 항생제 내성 검출을 위한 프로브 제작
본 발명에 사용된 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 항생제 내성 검사를 위한 올리고뉴클레오티드 프로브는 다음과 같이 제작하였다. 5’말단에 아민(amine)을 변형시키고 15개 염기 길이의 dT 스페이서와 15-25 개의 염기서열을 갖도록 프로브를 제작하였다. 결핵균의 항생제 내성 검출을 위한 프로브는 표 2의 염기서열에 한정된 것이 아니라 이를 포함한 염기서열로 이루어진 프로브를 제작하여 이용할 수 있다.
1.항생제 내성 검출을 위한 프로브 제작
① 리팜핀 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작
리팜핀 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 검출을 위해 돌연변이 출현빈도가 높은rpoB유전자의 코돈 511에서 코돈 533의 69 bp 염기서열을 바탕으로 점돌연변이 염기서열이 프로브의 중앙부위에 오도록 디자인하였다. (Musser JM. et al. Clin Microbiol Rev 8: 496-514(1995); 이민기, 외. 결핵 및 호흡기 질환, 44: 251-263(1997); Valim AR., et al. J Clin Microbiol 38: 3119-3122(2000)). 그중 코돈 511 부위의 leucine(CTG)이 proline(CCG), 코돈 513 부위의 glutamine(CAA)이 leucine(CTA), 코돈 516 부위의 aspartic acid(GAC)이 valine(GTC), tyrosine(TAC)과 phenylalanine(TTC), 코돈 522 부위의 serine(TCG)이 leucine(TTG), 코돈 526 부위의 histidine(CAC)이 tyrosine(TAC), aspartic acid(GAC), arginine(CGC), leucine(CTC)과 proline(CCC), 코돈 531 부위의 serine(TCG)이 leucine(TTG)과 tryptophan(TGG), 코돈 533 부위의 leucine(CTG)이 proline(CCG)으로 치환된 돌연변이를 바탕으로 디자인하여 표 2의 서열번호 17에서 37의 총 21종류의 프로브를 제작하였다.
② 아이소니아지드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작
아이소니아지드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 검출을 위해 돌연변이 출현빈도가 높은katG유전자의 코돈 315의 염기서열과inhA유전자의 리보솜 단백질 바인딩 부위의 한 염기의 변형을 바탕으로 점돌연변이 염기서열이 프로브의 중앙부위에 오도록 디자인하였다(Musser JM, et al. J Infect Dis, 173: 196-202(1996); Musser JM, et al. Clin Microbiol Rev, 8: 496-514(1995); Mokrousov I, et al. Antimicrobial agent Chem, 46: 1417-1424(2002) ).KatG유전자의 코돈 315 부위의 serine(AGC)이 threonine(ACC)과 asparagine(AAC)으로 치환된 것과inhA유전자의 리보솜 단백질 바인딩 부위의 한 염기인 C 염기가 T 염기로 변형된 돌연변이를 바탕으로 디자인하여 표 2의 서열번호 38에서 42의 총 5종류의 프로브를 제작하였다.
③ 피라진아마이드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작
피라진아마이드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 경우 돌연변이가pncA유전자 전반에 걸쳐 산재되어 있는데 이중 상대적으로 출현빈도가 높은 부위인 프로모터 -11 부위의 A가 G로 변형된 돌연변이를 바탕으로 점돌연변이 염기서열이 프로브의 중앙부위에 오도록 디자인하여 표 2의 서열번호 43과 44의 총 2종류의 프로브를 제작하였다(Musser JM, et al. Antimicrobial agent Chem, 41: 636-640(1997); Lee KH, et al. J Korean Med Sci, 16: 537-543(2001); Park SK, et al. BMC Infectious Diseases, 1: 4(2001)).
④ 스트렙토마이신 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작
스트렙토마이신 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 검출을 위해 돌연변이 출현빈도가 높은rpsL유전자의 코돈 43과 코돈 88의 염기서열을 바탕으로 점돌연변이 염기서열이 프로브의 중앙부위에 오도록 디자인하였다(Marion F, et al. Mol Microb, 9: 1239-1246(1993); Nadine H, et al. Antimicrobial agent Chem, 38: 238-242(1994)). 코돈 43과 코돈 88 부위 둘 다 lysine(AAG)이 arginine(AGG)으로 치환된 돌연변이를 바탕으로 디자인하여 표 2의 서열번호 45에서 48의 총 4종류의 프로브를 제작하였다.
⑤ 에탐부톨 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작
에탐부톨 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 검출을 위해 상대적으로 높은 내성빈도를 나타내는embB유전자의 코돈 306의 염기서열을 바탕으로 점돌연변이 염기서열이 프로브의 중앙부위에 오도록 디자인하였다(Musser JM. et al. Antimicrobial agent Chem, 44: 326-336(2000); Musser JM, et al. Antimicrobialagent Chem, 41: 1677-1681(1997)). 코돈 306의 methionine(ATG)이 valine(GTG), leucine(CTG), isoleucine(ATA), isoleucine(ATT) 과 isoleucine(ATC)으로 치환된 돌연변이를 바탕으로 디자인하여 표 2의 서열번호 49에서 54의 총 6종류의 프로브를 제작하였다.
⑥ 플로퀴놀론 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작
플로퀴놀론 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 검출을 위해 돌연변이 출현빈도가 높은gyrA유전자의 40개 아미노산 부위의 염기서열 치환을 바탕으로 점돌연변이 염기서열이 프로브의 중앙부위에 오도록 디자인하였다(Ramaswamy S, et al. Tuber Lung Dis, 79: 3-29(1998); Cambau E, et al. 13th Forum in Microbiology, 26:52-59(1995)). 그중 코돈 88의 glycine(GGC)이 cysteine(TGC), 코돈 90의 alanine(GCG)이 valine(GTG), 코돈 91의 serine(TCG)이 proline(CCG)으로 치환된 것과 코돈 94의 aspartic acid(GAC)가 glycine(GGC), histidine(CAC), asparagine(AAC), tyrosine(TAC)과 alanine(GCC)으로 치환된 돌연변이를 바탕으로 디자인하여 표 2의 서열번호 55에서 66의 총 12종류의 프로브를 제작하였다.
⑦ 카나마이신-아미카신 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위한 프로브 제작
카나마이신-아미카신 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 검출을 위해 돌연변이 출현빈도가 높은rrs유전자의 1400, 1401과 1483 염기서열을 바탕으로 점돌연변이 염기서열이 프로브의 중앙부위에 오도록 디자인하였다(Yasuhiko S, et al. JCM, 36:1220-1225(1998); George JA, et al. Antimicrobial agent Chem, 42:1295-1297(1998)).Rrs유전자의 염기서열 1400 bp 부위의 A가 G, 1401 bp 부위의 C가 A와 T로 변형된 것과 1483 bp 부위의 G가 T로 변형된 돌연변이를 바탕으로 디자인하여 표 2의 서열번호 67에서 73의 총 7종류의 프로브를 제작하였다.
실시 예 3: 표적 DNA 준비
1. 항생제 내성 결핵균의 검출을 위한 표적 DNA 준비
RMP 내성 검사를 위한rpoB유전자의 표적 돌연변이 DNA 증폭을 위해 각각 바이오틴이 부착된 rpoF(서열번호1)와 rpoR(서열번호2) 프라이머를 약 160 bp 산물을 증폭하도록 제작하고, 이를 이용하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, RMP 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 RMP 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)로부터 실시예1에 따라 분리된 제놈 DNA를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다. INH 내성 검사를 위한katG유전자의 표적 돌연변이 DNA 증폭을 위해 각각 바이오틴이 부착된 kat1F(서열번호3)와 kat4R(서열번호4) 프라이머를 150 bp 산물을 증폭하도록 제작하고,inhA유전자의 돌연변이 검출을 위해 각각 바이오틴이 부착된 inhF(서열번호5)와 inhR(서열번호6) 프라이머를 160 bp의 산물을 증폭하도록 제작하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, INH 내성의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 INH 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)로부터 실시예1에 따라 분리된 제놈 DNA를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다. PZA 내성 검사를 위한pncA유전자의 표적 돌연변이 DNA 증폭을 위해 각각 바이오틴이 부착된 pncF(서열번호7)와 pncR(서열번호8) 프라이머를 약 200 bp 산물을 증폭하도록 제작하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, PZA 내성의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 PZA 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)로부터 실시예1에 따라 분리된 제놈 DNA를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다. SM 내성 검사를 위한rpsL유전자의 표적 돌연변이 DNA 증폭을 위해 각각 바이오틴이 부착된 SMF(서열번호9)와 SMR(서열번호10) 프라이머를 약 280 bp 산물을 증폭하도록 제작하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, SM 내성의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 SM 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)로부터 실시예1에 따라 분리된 제놈 DNA를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다. EMB 내성 검사를 위한embB유전자의 표적 돌연변이 DNA 증폭을 위해 각각 바이오틴이 부착된 EMBF(서열번호11)와 EMBR(서열번호12) 프라이머를 약 370 bp 산물을 증폭하도록 제작하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, EMB 내성의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 EMB 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다. FQ 내성 검사를 위한gyrA유전자의 표적 돌연변이 DNA 증폭을 위해 각각 바이오틴이 부착된 gyrF(서열번호13)와 gyrR(서열번호14) 프라이머를 약 161bp 산물을 증폭하도록 제작하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, FQ 내성의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 FQ 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)로부터 실시예1에 따라 분리된 제놈 DNA를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다. KAN-AMI 내성 검사를 위한rrs유전자의 표적 돌연변이 DNA 증폭을 위해 각각 바이오틴이 부착된 rrsF(서열번호15)와 rrsR(서열번호16) 프라이머를 약 310 bp 산물을 증폭하도록 제작하여 표준 균주인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv, KAN-AMI 내성의 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)와 KAN-AMI 감수성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 임상 검체(M. tuberculosisclinical isolates)로부터 실시예1에 따라 분리된 제놈 DNA를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다.
위의 약제 내성 검출을 위한 PCR 반응 조건은 한 튜브에서 동시에 증폭이 일어나도록 94 ℃에서 3분간 충분히 변성시킨 후 94 ℃에서 1분, 60??에서 1분, 72 ℃에서 1분씩 35회 반응시켰으며, 마지막으로 72 ℃에서 10분간 연장하였다. 반응이 끝난 후 증폭산물은 바로 마이크로어레이용 칩에 사용하였다.
실시 예 4: 지지체에 프로브 부착
실시 예 2에서 제작된 프로브는 100 pmol로 희석하여 384-well 마이크로플레이트에 옮겨서 spotting 용액을 첨가하여 50 pmol로 잘 섞었다. 슬라이드 글라스 또는 멤브레인(membrane) 등의 지지체에 프로브를 마이크로어레이어(Cartesian Technologies, PLXSYS 7500 SQXL Microarryer, USA)를 이용하여 부착시켰다.
도 1의 항생제 내성 검출용 프로브 중 RMP 내성 검출 프로브는 도 1의 1에서 30에 해당되는 것으로 차례대로 양성 대조군 프로브(도1의 번호 1번과 30번)와 서열번호 17에서 37(도1의 번호 2번에서 22번)이며, INH 내성 검출 프로브는 도 1의 31에서 42로 양성 대조군 프로브(도1의 번호 31번과 42번)와 서열번호 38에서 42(도1의 번호 32번에서 36번)이며, PZA 내성 검출 프로브는 도 1의 43에서 48로 양성 대조군 프로브(도1의 번호 43번과 48번)와 서열번호 43과 44(도1의 번호 44번와 45번)이며, SM 내성 검출 프로브는 도 1의 49에서 60으로 양성 대조군 프로브(도1의 번호 49번과 60번)와 서열번호 45에서 48(도1의 번호 50번에서 53번)이며, EMB 내성 검출 프로브는 도 1의 61에서 72로 양성 대조군 프로브(도1의 번호 61번과 72번)와 서열번호 49와 54(도1의 번호 62번에서 67번)이며, FQ 내성 검출 프로브는 도 1의 73에서 90으로 양성 대조군 프로브(도1의 번호 73번과 90번)와 서열번호 55와 66(도1의 번호 74번에서 85번)이며, KAN-AMI 내성 검출 프로브는 도 1의 91에서 102로 양성 대조군 프로브(도1의 번호 91번과 102번)와 서열번호 67과 73(도1의 번호 92번에서 98번)에 해당된다. 한 종류의 프로브 당 두 개의 점(spot)을 지지체에 부착시킨 후, 실온의 슬라이드 박스에서 24시간 정도 정치 또는 50 ℃의 건조기(dry oven)에 약 5시간 방치하여 지지체 위의 표면에 고정시켰다.
실시 예 5: 고정되지 않은 프로브의 세척
지지체 표면에 부착되지 않은 프로브를 제거하기 위해 실온에서 0.2% SDS(Sodium dodecyl sulfate) 용액에 세척한 후, 증류수로 세척하였다. Sodium borohydride 용액으로 세척하고 다시 끓는 증류수에 세척하였다. 실온에서 0.2%SDS와 증류수를 이용하여 세척한 후 원심분리기를 이용하여 지지체 표면을 완전하게 건조시켜 마이크로어레이 제작을 완료하였다.
실시 예 6: 염료 결합 및 혼성화 반응 (Hybridization)
실시 예 3에서 제조된 바이오틴으로 표지화된 표적 DNA를 단일 가닥으로 사용하기 위해 끓인 후 4 ℃로 냉각시켰다. PCR 산물과 프로브와의 결합유무를 확인하기 위해, Cy5-streptavidin 또는 Cy3-streptavidin(Amersham pharmacia biotech, USA)을 포함하는 반응용액과 1∼5 ㎕의 표적 DNA를 포함하는 혼성화 반응 용액 10 ㎕를 제조하였다. 프로브 부착과 세척을 마친 슬라이드에 혼성화 반응 용액을 분주하고 기포가 생기지 않도록 커버 글라스를 덮고 빛을 차단한 뒤 40 ℃에서 30분간 반응시켰다.
실시 예 7: 결합되지 않은 DNA의 세척
혼성화 반응을 하지 않은 잔여의 DNA를 세척하기 위해 2 X SSC(300mM NaCl, 30mM Na-Citrate, pH 7.0) 용액을 이용하여 커버 글라스를 제거한 후에 2 X SSC와 0.2 X SSC 용액 순으로 슬라이드를 세척하였다. 마지막으로 원심분리기를 이용하여 슬라이드를 완전하게 건조시켰다.
실시 예 8: 결과 분석
실험을 마친 후 결과의 분석을 위해 비공초점 레이져 스캐너(non-confocoal laser scanner)인 GenePix 4000A(Axon Instruments, USA)를 이용하여 결과를 분석하였다.
도 2는 하나의 임상검체로부터 한번의 실험으로 결핵균의 리팜핀과 아이소니아지드 내성을 동시에 검출하기 위한 각 프로브들(도1 (b)의 번호 1번에서 42번)의 특이적 혼성화 반응의 결과를 스캐너로 분석한 그림으로 본 발명의 마이크로어레이와의 혼성화 반응을 실시한 결과 RMP, INH의 각 프로브에 대해 모두 야생형 프로브(도1 (b)의 번호 1, 2, 4, 6, 9, 11, 17, 20, 30, 31, 32, 35, 42)에서만 반응이 일어났다.
도 3은 하나의 임상검체로부터 한번의 실험으로 결핵균의 리팜핀과 아이소니아지드 내성을 동시에 검출하기 위한 각 프로브들(도1 (b)의 번호 1번에서 42번)의 특이적 혼성화 반응의 결과를 스캐너로 분석한 그림으로 본 발명의 마이크로어레이와의 혼성화 반응을 실시한 결과 RMP 내성으로 516 M1 프로브(도1 (b)의 번호7)에서 특이적으로 돌연변이 반응이 일어나고 나머지 코돈에서는 야생형 프로브(도1 (b)의 번호 1, 2, 4, 9, 11, 17, 20, 30)에서만 반응이 일어났다. INH의 각 프로브에 대해서는 모두 야생형 프로브(도1 (b)의 번호 31, 32, 35, 42)에서만 반응이 일어났다.
도 4는 하나의 임상검체로부터 한번의 실험으로 결핵균의 리팜핀과 아이소니아지드 내성을 동시에 검출하기 위한 각 프로브들(도1 (b)의 번호 1번에서 42번)의 특이적 혼성화 반응의 결과를 스캐너로 분석한 그림으로 본 발명의 마이크로어레이와의 혼성화 반응을 실시한 결과 RMP 내성으로 516 M2 프로브(도1 (b)의 번호 8)에서 특이적으로 돌연변이 반응이 일어나고 나머지 코돈에서는 야생형 프로브(도1 (b)의 번호 1, 2, 4, 9, 11, 17, 20, 30)에서만 반응이 일어났다. INH의 각 프로브에 대해서는 katG 내성으로 315 M1 프로브(도1 (b)의 번호 33)에서 특이적으로 돌연변이 반응이 일어나고 inhA 프로브에서는 야생형 프로브(도1 (b)의 번호 35)에서 특이적 반응이 일어났다.
도 5는 하나의 임상검체로부터 한번의 실험으로 결핵균의 리팜핀과 아이소니아지드 내성을 동시에 검출하기 위한 각 프로브들(도1 (b)의 번호 1번에서 42번)의 특이적 혼성화 반응의 결과를 스캐너로 분석한 그림으로 본 발명의 마이크로어레이와의 혼성화 반응을 실시한 결과 RMP와 INH의 katG 프로브에서는 야생형 프로브(도1 (b)의 번호 1, 2, 4, 6, 9, 11, 17, 20, 30, 31, 32, 42)에서만 반응이 일어났다. INH의 inhA 프로브에서는 inhA-M 프로브(도1 (b)의 번호 36)에서 특이적으로 돌연변이 반응이 일어났다.
도 6은 RMP 내성 결핵균의 RMP 내성 검출용 프로브들(도1 (b)의 번호 1-30번)의 특이적 혼성화 반응 결과를 스캐너로 분석한 그림으로 531 M1 프로브(도1 (b)의 번호 18)에서 특이적으로 돌연변이 반응이 일어나고 나머지 코돈에서는 야생형 프로브(도1 (b)의 번호 1, 2, 4, 6, 9, 11, 20, 30)에서만 반응이 일어났다.
실시 예 9: 염기서열분석
ABI 377A 자동염기서열분석기(PE Biosystems, USA)를 이용하여, 주형 DNA는 ABI prism BigDye terminator sequencing kit (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 반응시킨 후, 이를 염기서열분석기에 전기영동하고 분석프로그램으로 결과를 분석하였다.
본 실험에 사용한 55균주에 대한 RMP의 염기서열을 분석한 결과 본 발명의 마이크로어레이와 염기서열분석 결과가 모두 정확하게 일치하여 11 균주에서 야생형으로 나타나고 나머지 44 균주에서 돌연변이를 나타냄을 확인하였다.
55균주에 대한 INH의 염기서열을 분석한 결과 본 발명의 마이크로어레이와 염기서열분석 결과가 모두 정확하게 일치하여 30 균주에서 야생형으로 나타나고 나머지 25 균주에서 돌연변이를 나타냄을 확인하였다.
55균주에 대한 SM의 염기서열을 분석한 결과 본 발명의 마이크로어레이와 염기서열분석 결과 중 4 균주를 제외한 결과가 모두 정확하게 일치하여 44 균주에서 야생형으로 나타나고 7 균주에서 돌연변이를 나타냄을 확인하였다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 마이크로어레이는, 하나의 지지체 위에 결핵균의 리팜핀, 아이소니아지드, 피라진아마이드, 스트렙토마이신, 에탐부톨, 플로퀴놀론, 카나마이신 및 아미카신의 약제에 대한 돌연변이 출현 빈도가 매우 높은 항생제 내성을 검사할 수 있는 프라이머 및 프로브 모두를 포함하고 있어서 단 1회의 혼성화 반응으로 주요 항결핵 약제 내성을 정확하게 검출할 수 있다. 또한 하나의 고형지지체 위에 다수의 세트로 부착하여 한번의 실험으로 다수의 검체로부터 동시에 결핵균의 항생제 내성에 대한 실험이 가능하여 검사 시간과 비용 면에서도 매우 경제적이다. 이는 기존의 배양 균주 뿐만 아니라 임상 검체를 직접 표적으로 이용하므로 진단에 필요한 시간을 기존의 상품화된 방법보다 훨씬 단축시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 마이크로어레이는 결핵균의 주요 항생제 내성 검사결과를 정확하고 최단시간에 얻을 수 있어 경제적이며 매우 효과적으로 사용될 수 있다.
<110> KIM, Cheol Min
PARK, Hee Kyung
<120> Microarray comprising probes for antibiotic-resistance detection
of M.tuberculosis
<130> Gn14827
<160> 73
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rpo F primer of the rpoB gene
<400> 1
tcgccgcgat caaggagt 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rpo R primer of the rpoB gene
<400> 2
tgcacgtcgc ggacctcca 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kat 1F primer of katG gene
<400> 3
aagagctcgt atggcaccgg 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kat 4R primer of the katG gene
<400> 4
agcgccagca gggctcttc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Inh F primer of the inhA gene
<400> 5
accccagtgc gaaagttccc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Inh R primer of the inhA gene
<400> 6
ggtaaccagg actgaacggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pnc F primer of the pncA gene
<400> 7
gctggtcatg ttcgcgatcg 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pnc R primer of the pncA gene
<400> 8
accggttacc gccagcgag 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM F primer of the rpsL gene
<400> 9
gatgagtaag gtcaagaccg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM R primer of the rpsL gene
<400> 10
gttcttgaca ccctgcgtat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EMB F primer of the embB gene
<400> 11
aattcgtcgg acgacggcta 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EMB R primer of the embB gene
<400> 12
tcacctatgt gctgatcgag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GyrF primer of the gyrA gene
<400> 13
accgcagcca cgccaagtcg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GyrR primer of the gyrA gene
<400> 14
gcctggcgag ccgaagttgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RrsF primer of the rrs gene
<400> 15
aatccttaaa agccggtctc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RrsR primer of the rrs gene
<400> 16
acggcctacg ccccaccagt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 511W probe for the rpoB gene
<400> 17
cagccagctg agccaattca 20
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 511M probe for the rpoB gene
<400> 18
agccagccga gccaa 15
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 513W probe for the rpoB gene
<400> 19
ctgagccaat tcatg 15
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 513M probe for the rpoB gene
<400> 20
ctgagcctat tcatgg 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 516W probe for the rpoB gene
<400> 21
ttcatggacc agaaca 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 516M1 probe for the rpoB gene
<400> 22
ttcatggtcc agaaca 16
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 516M2 probe for the rpoB gene
<400> 23
attcatgtac cagaaca 17
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 516M3 probe for the rpoB gene
<400> 24
attcatgttc cagaaca 17
<210> 25
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 522W probe for the rpoB gene
<400> 25
ctgtcggggt tgac 14
<210> 26
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 522M probe for the rpoB gene
<400> 26
ctgttggggt tgac 14
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 526W probe for the rpoB gene
<400> 27
gttgacccac aagcgccga 19
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 526M1 probe for the rpoB gene
<400> 28
ggttgaccta caagcgc 17
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 526M2 probe for the rpoB gene
<400> 29
ggttgaccga caagcgc 17
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 526M3 probe for the rpoB gene
<400> 30
ttgacccgca agcgc 15
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 526M4 probe for the rpoB gene
<400> 31
ttgaccctca agcgc 15
<210> 32
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 526M5 probe for the rpoB gene
<400> 32
ttgaccccca agcgc 15
<210> 33
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 531W probe for the rpoB gene
<400> 33
cgactgtcgg cgctg 15
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 531M1 probe for the rpoB gene
<400> 34
cgactgttgg cgctg 15
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 531M2 probe for the rpoB gene
<400> 35
ccgactgtga gcgct 15
<210> 36
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 533W probe for the rpoB gene
<400> 36
ggcgctgggg cccggc 16
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 533M probe for the rpoB gene
<400> 37
gtcggcgccg gggcccg 17
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 315W probe for the katG gene
<400> 38
atcaccagcg gcatc 15
<210> 39
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 315M1 probe for the katG gene
<400> 39
atcaccaccg gcatc 15
<210> 40
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 315M2 probe for the katG gene
<400> 40
atcaccaacg gcatc 15
<210> 41
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> inhW probe for the inhA gene
<400> 41
ggcgagacga taggt 15
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> inhM probe for the inhA gene
<400> 42
ggcgagatga taggt 15
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 11W probe for pncA gene
<400> 43
acgtatggtg gacgt 15
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 11M probe for the pncA gene
<400> 44
acgtgtggtg gacgt 15
<210> 45
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 43W probe for the rpsL gene
<400> 45
tcggcttctt cggagt 16
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 43M probe for the rpsL gene
<400> 46
ttcggcttcc tcggagtg 18
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 88W probe for the rpsL gene
<400> 47
gcaggtcctt cacccg 16
<210> 48
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 88M probe for the rpsL gene
<400> 48
gcaggtccct cacccg 16
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 306W probe for the embB gene
<400> 49
actcgggcca tgcccag 17
<210> 50
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 306M1 probe for the embB gene
<400> 50
tcgggccacg cccagga 17
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 306M2 probe for the embB gene
<400> 51
tcgggccagg cccagga 17
<210> 52
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 306M3 probe for the embB gene
<400> 52
actcgggcta tgcccag 17
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 306M4 probe for the embB gene
<400> 53
actcgggcaa tgcccag 17
<210> 54
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 306M5 probe for the embB gene
<400> 54
actcgggcga tgcccag 17
<210> 55
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ88W probe for the gyrA gene
<400> 55
cccgcacggc gacgc 15
<210> 56
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ88M probe for the gyrA gene
<400> 56
cccgcactgc gacgc 15
<210> 57
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ90W probe for the gyrA gene
<400> 57
ggcgacgcgt cgatc 15
<210> 58
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ90M probe for the gyrA gene
<400> 58
ggcgacgtgt cgatc 15
<210> 59
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ91W probe for the gyrA gene
<400> 59
cgacgcgtcg atcta 15
<210> 60
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ91M probe for the gyrA gene
<400> 60
cgacgcgccg atcta 15
<210> 61
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ94W probe for the gyrA gene
<400> 61
atctacgaca gcctg 15
<210> 62
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ94M1 probe for the gyrA gene
<400> 62
atctacggca gcctg 15
<210> 63
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ94M2 probe for the gyrA gene
<400> 63
gatctaccac agcct 15
<210> 64
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ94M3 probe for the gyrA gene
<400> 64
gatctacaac agcct 15
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ94M4 probe for the gyrA gene
<400> 65
gatctactac agcct 15
<210> 66
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FQ94M5 probe for the gyrA gene
<400> 66
atctacgcca gcctg 15
<210> 67
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1400W probe for the rrs gene
<400> 67
gcccgtcacg tcatg 15
<210> 68
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1400M probe for the rrs gene
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<223> 1483M probe for the rrs gene
<400> 73
ttgggactaa gtcgt 15
Claims (12)
- 지지체에 부착된 결핵균의 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브(probes)를 포함하는 마이크로어레이.
- 제1항에 있어서, 하나의 지지체에 결핵균의 항생제 내성을 검출하는 프로브(probes)를 한 세트로 하는 다수의 세트로 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘 또는 젤(gel)인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로브는 DNA, RNA 또는 PNA 인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브는 리팜핀, 아이소니아지드, 피라진아마이드, 스트렙토마이신, 에탐부톨, 플로퀴놀론, 카나마이신 및 아미카신으로 구성된 군에서 선택된 한 종류 이상의 항생제 내성을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
- 제5항에 있어서, 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브는 리팜핀 내성을 유발하는rpoB유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 아이소니아지드 내성을 유발하는katG유전자와inhA유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 피라진아마이드 내성을 유발하는pncA유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 스트렙토마이신 내성을 유발하는rpsL유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 에탐부톨 내성을 유발하는embB유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 플로퀴놀론 내성을 유발하는gyrA유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 카나마이신과 아미카신 내성을 유발하는rrs유전자의 점돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 중 한 종류 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이
- 제6항에 있어서, 항생제 내성을 검출하기 위한 증폭용 프라이머는 서열번호 1 내지 16의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
- 제6항에 있어서, 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브는 서열번호 17 내지 37의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 38 내지 42의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 43과 44의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 45 내지 48의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 49 내지 54의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 55 내지 66의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드, 서열번호 67 내지 73의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드 중 한 종류이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 마이크로어레이를 이용하여 복수의 항생제의 내성 검출을 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 항생제 내성 검출 방법.
- 서열 번호 5, 6, 9 내지 16중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 항생제 내성을 검출하기 위한 프라이머용 올리고뉴클레오티드.
- 서열 번호 24, 41, 42, 45 내지 73중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 항생제 내성을 검출하기 위한 프로브용 올리고뉴클레오티드.
- 서열 번호 1내지 16의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함한 1종 이상의 프라이머용 올리고뉴클레오티드와 서열 번호 17 내지 73의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함한 1종 이상의 프로브용 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항생제 내성 검출용 진단 키트.
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