KR20030041415A - 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지를 위한진단키트 및 그 키트의 제조방법 - Google Patents

마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지를 위한진단키트 및 그 키트의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성과 관련된 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium Tuberculosis) rpoB유전자 점 돌연변이(point mutation)를 올리고뉴클레오티드칩을 이용하여 신속, 정확하게 대량으로 판별할 수 있는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지를 위한 진단키트 및 그 키트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지를 위한 진단키트는, 결핵균군 프로브(Mycobacterium tuberculosiscomplex probe), 마이코박테리움 종 구별 프로브 및 마이코박테리움 튜버큘로시스rpoB유전자의 약제내성탐지 프로브로 구성되는 올리고뉴클레오티드 칩과, 바이오틴으로 표지된 검체의 증폭산물과 해당 프로브의 혼성화 반응을 검출하도록 바이오틴-바인딩 단백질이 함유된 형광물질을 포함하여 구성된다.

Description

마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지를 위한 진단키트 및 그 키트의 제조방법{Diagnosis kit for Mycobacterium species identification and drug-resistance detection and manufacturing method thereof}
본 발명은 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지를 위한 진단키트 및 그 키트의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성과 관련된 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium Tuberculosis) rpoB유전자 점 돌연변이를 올리고뉴클레오티드칩을 이용하여 신속, 정확하게 대량으로 판별할 수 있는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지를 위한 진단키트 및 그 키트의 제조방법에 관한 것이다.
해마다 전세계적으로 약 200만 명이 결핵(tuberculosis)으로 사망하고 있으며 이민 또는 약제내성 계통(strain)의 증가로 인해 해마다 결핵의 유병율이 높아지고 있다. 특히 AIDS환자에게 있어서는 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의한 결핵 감염뿐만 아니라 마이코박테리움 에비움-인트라셀룰리 컴플렉스(Mycobacterium avium-intracellularecomplex(MAC))와 같은 비결핵균에 의한 감염이 증가 추세에 있다.
신생아, AIDS 환자와 같이 면역 작용이 약화된 경우는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 외의 다른 마이코박테리아(mycobacteria other thanMycobacterium tuberculosis; MOTT) 특히, 마이코박테리움 에비움-인트라셀룰리(Mycobacterium avium-intracellulare(MAI)),마이코박테리움 첼로니(Mycobacterium chelonae),마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum),마이코박테리움 칸자시(Mycobacterium kansasaii),마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi),마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum),마이코박테리움 스크로풀라세움(Mycobacterium scrofulaceum),마이코박테리움 쥬가이(Mycobacterium szulgai)등에 의해 쉽게 감염이 된다.
이러한 결핵의 치료는 화학요법을 중심으로 한 내과적 치료가 기본인데, 수많은 종류의 박테리아가 질병을 일으키고 각각이 서로 다른 약에 대해 내성을 띄고 있다. 따라서, 효과적인 치료를 위해서 질병의 원인이 된 박테리아 종류를 밝혀내는 것이 중요하다.
한편, 종래의 진단방법으로는 엑스선 사진촬영, 객담검사 등이 있었다. 엑스선 사진촬영은 이미 치유된 비활동성 폐결핵이나 비결핵성 흉부질환이 결핵으로 오진되기 쉬운 단점이 있다.
그리고, 객담검사에는 환자의 객담을 슬라이드에 얇게 발라 결핵균만을 선택적으로 염색해서 현미경으로 보는 직접도말 검사방법과 복잡한 방법으로 결핵균을 체온과 같은 온도 아래서 균을 증식시켜 관찰하는 배양검사 방법이 있다.
상기 직접도말검사방법은 간단하고 신속하게 결과를 얻을 수 있으나, 결핵균과 비결핵성 항산균의 구별이 어려운 단점이 있다. 또한 배양검사의 경우 결핵균의 성장속도가 매우 느리기 때문에 어떤 종류의 결핵균에 감염되었는지 판독하는 기간이 수주에서 수개월이 걸린다. 따라서, 판독기간동안 여러가지 항생제를 동시에 복용하여, 충분한 치료성과를 얻을 수 없고 다른 약에 대해서도 내성을 가지게 되는 문제점이 있다.
즉, 결핵치료에 있어 사용되는 일차 항결핵 약제인 이소니아지드(isoniazid(INH)), 리팜핀(rifampin(RIF)), 스트렙토마이신(streptomycin(STR)), 에탐부톨(ethambutol(EMB)), 피라지나마이드(pyrasinamide(PZA))에 대한 항결핵제 내성 균주가 증가되고 있다.
따라서, 환자에게 올바른 항생제 투여 및 관리를 제공하기 위해 이러한 여러종의 마이코박테리아에 의한 감염을 감염 초기에 신속하게 판별할 수 있는 방법에 대한 필요성이 계속 증가되어 왔다.
한편, 근래에는 마이코박테리움 종 구별을 위해 비교적 단시간에 결과를 확인할 수 있는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하고 있다. 이러한 PCR을 이용한 진단법에서는 마이코박테리움 속-특이, 즉 결핵균군만의 특이 염기서열을 갖는 유전자인 IS6110 같은 삽입유전자를 표적으로 이용하고 있다.
그런데, 상기 IS6110 삽입유전자는 결핵균군에 속하는 균종에 서로 다른 수로 존재할 뿐만 아니라, 최근 IS6110 삽입유전자를 갖지 않는 결핵균이 존재하는 보고 및 IS6110이 결핵균군에 특이적인 것이 아니라는 보고가 있다. 따라서, IS6110을 표적유전자로 하였을 경우 위음성 또는 위양성이 나타날 수 있는 문제점이 있다.
한편, 마이코박테리움 종 구별 방법으로 16S rRNA 유전자의 고다형질성영역(highly polymorphic region)이 종 특이 다형질성(species-specific polymorphism)을 보이는 것을 이용하는 방법도 있다. 이 방법을 이용한 검체(speciemen)에 직접 적용할 수 있는 Accuprobe(Gen-probe, San Diego, CA) 또는 민감도를 높이기 위해 표적유전자 증폭 후 적용하는 AMTD(Gen-probe, San Diego, CA), Amplicor MTB(Roche Diagnostics Systems, Somerville, NJ)이 상용화되어 사용되고 있다. 그러나, 16S rRNA 유전자는 하나의 균 안에 서로 다른 카피(copy)가 존재할 가능성이 있어 정확한 종 구별이 어려운 문제점이 있었다. 또한, 약제내성탐지를 위해서는rpoB유전자를 이용하여 약제내성탐지를 별도로 실시해야 했기 때문에 번거러웠다.
이하, 약제내성과 관련된 마이코박테리움 튜버큘로시스의 점 돌연변이(pointmutation)에 대하여 상술한다. 항결핵약제인 RIF에 대한 내성은 RNA 폴리머라제 β-서브유니트를 인코딩하는rpoB유전자와 관련되어 있다. 지금까지 보고된 30여개의 돌연변이는rpoB유전자(3,534bp)의 81bp 코아리전(core region)에 집중되어 있는 것으로 보고되었다(Amalio Telenti, Paul Imboden, Francine Marchesi,Douglas Lowrie,Sterwart Cole,M.Joseph Colston,Lukas Matter,Kurt Schopfer, and Thomas Bodmer,"Detection of rifampicin-resistance mutation in Mycobacterium tuberculosis"THE LACET,Vol.341,pp.647-650,1993)
표 1은 M.튜버큘로시스rpoB유전자에서 유발되는 점 돌연변이의 종류(Mutations occurring in codons 507 through 533 of theM. tuberculosis rpoBgene)를 나타낸다. 알려진 점 돌연변이(point mutation)의 양상은 표 1에서 제시된 바와 같이 513, 516, 526, 531 코돈에서 주로 관찰되고 있다.
다른 항결핵 약제로서 리파부틴(RIB)은 리파마이신 S의 스피로-피페리딜(spiro-piperidyl) 유도체로서 AIDS 환자의 MAC 감염 예방약제로 사용되고 있다(James M.Musser,"Antimicrobial Agent Resistance in Mycobactera:Molecular Genetic Insights", Clinical Microbiology Review,Vol.8,No4,pp.496-514,1995). 이 약제 또한 RNA 폴리머라제 β-서브유니트를 인코딩하는rpoB유전자의 점 돌연변이 양상에 따라 감수성(susceptibility)이 변화하는 것으로 보고되고 있다.
여러 논문에서 제시된 바와 같이, RIF에서 내성을 나타내지만 RIB에는 감수성을 나타나는 돌연변이가 종종 보고되며 아울러 RIF와 RIB 두 약제에 대해 모두 내성을 보이는 돌연변이 또한 보고되었다(Della Bruna C., G.Schiopacassi,D.Ungheri,D.Jabes,E.Morvillo,and A.Sanfilippo,"A new spiropiperidylrifamycin: in vitro and in vivo studies",J.Antibiot.Vol.36,pp. 1502-1506,1983, Dessen A.,A.Quenmard,J.S.Blanchard,w.R.Jacobs,Jr.,and J.C.Sacchettini,"Crystal structure and function of the isoniazid target of Mycobacterium tuberculosis"Science,Vol.267,pp.1638-1641,1995). 일련의 이러한 점 돌연변이는rpoB돌연변이 위치와 변화된 아미노산으로 인해 이 약제에 대한 감수성이 변했기 때문이라고 보고되고 있다(Gillespie S.H.,A.J.Baskerville,R.N.Davidson,D.Felmingham,and A.D.M.Bryceson,"The serum rifabutin concentrations in patient sucessfully treated for muti resistant Nycobacterium tuberculosis infection",J.Antimicrobi,Chemother.Vol.33,pp.661-674,1990).
상술한 바와 같은 특징을 갖는rpoB유전자를 이용과 관련하여, 한국 특허 제0234975호에는 마이코박테리아 속 균종의rpoBDNA만을 특이적으로 증폭시키는 PCR 프라이머쌍을 이용하여 PCR한 후 RFLP(polymerase chain reaction-restrictionfragment length polymorphism)분석으로, 마이코박테리아 각 균종을 탐지 또는 동정하는 방법이 개시되어 있다.
한국특허 제285254호에는 결핵균군과 비결핵 항산성균의rpoB유전자 분절을 각기 다른 크기로 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 결핵균군과 MOTT를 감별-탐지할 수 있는 방법이 개시되어 있다.
그런데, 상기 방법들에서는 증폭전에 배양단계가 필요하고, 구별할 수 있는 종의 종류 또는 샘플의 수가 한정되고, PCR후 제한효소의 절단 또는/및 전기영동 단계를 거쳐야 하는 등의 문제점이 있다.
한편, 한국특허 제285253호에는 네스티드 PCR-SSCP와 단단계 네스티드 PCR-SSCP에 의한 리팜핀 내성 결핵균의 탐지방법에 대해 기재되어 있는데, 이 방법에 의하면 2단계의 PCR을 거쳐야 하고 리팜핀 내성여부를 판단하는 데 4일이 소요된다.
Affimetrix사의 WO97/29212 출원에는rpoB유전자의 시퀀싱 DNA칩을 이용하는 기술이 개시되어 있으나,rpoB유전자의 700bp 전체 염기서열을 비교한다.
본 발명은 종래기술의 상기 문제점들을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명의 제1목적은 마이코박테리움 종 구별 뿐만 아니라 약제내성과 관련된 특성을 신속, 정확하게 동시에 판별할 수 있는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지를 위한 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 제2목적은, 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성과 관련된 특성을신속, 정확하게 판별할 수 있는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지를 위한 진단키트의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제3목적은 배양되지 않은 검체를 중합효소연쇄반응의 주형으로 이용할 수 있고, 다수종의rpoB유전자(157bp)를 효율적으로 증폭할 수 있어 보다 신속한 마이코박테리움 종 구별을 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 제4목적은, 중합효소연쇄반응의 효율을 극대화할 수 있는 중합효소연쇄반응 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 의한 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 올리고뉴클레오티드칩을 제작하는 단계를 보인 흐름도.
도 2는 본 발명에 의해rpoB유전자를 바이오틴-TR8, TR9 프라이머를 이용하여 증폭한 후 2% 아가로스겔 상에서 전기영동한 결과를 보여주는 도면.
도 3a - 3j는 본 발명에 의해 바이오틴-dUTP를 이용하여 증폭한 임상샘플을 유전자칩상에서 혼성화한 후 얻은 형광이미지를 보여주는 도면.
도 4는 도 3의 설명도면.
도 5는 본 발명에 의한 서열번호 5-12의 프로브를 이용한 올리고뉴클레오티드칩의 배열을 나타내는 도면.
도 6a-6c는 도 5의 유전자칩을 이용한 마이코박테리움 종 구별 실험결과를 나타내는 도면.
도 7은 리팜핀 약제내성 결핵균의rpoB유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 서열번호 41 내지 46의 염기서열의 프로브가 추가된 올리고뉴클레오티드칩의 배열을 나타내는 도면.
도 8a-8d는 도 7의 올리고뉴클레오티드칩을 이용하는 임상검체의 리팜핀 및 리파부틴 내성 진단 결과를 나타내는 도면.
도 9a는 선출원의 반응조건인 50 pmol의 바이오틴-TR8, TR9 시발체를 사용하여 63℃, 35주기에서 중합효소연쇄반응을 실시한 증폭산물의 2% 아가로오즈겔 DNA밴드 이미지도면.
도 9b는 본 발명에 따른 반응조건인 100 pmol의 바이오틴-DGR8,DGR9 시발체를 사용하여 64℃, 40주기에서 중합효소연쇄반응을 실시한 증폭산물의 2% 아가로오즈겔 DAN밴드 이미지도면.
도 10은 본 발명에 따른 바이오틴-DGR8,DGR9 프라이머 및 최적화된 조건을 이용하여 11개의 객담검체로 중합효소연쇄반응을 실시한 증폭산물의 2% 아가로오즈겔 DNA밴드 이미지도면.
도 11a-11b는 도 7의 올리고뉴클레오티드칩을 이용한 객담검체 증폭물의 리팜핀 내성 진단 결과를 나타내는 도면.
상기 목적을 달성하기 위해, 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트는, 마이코박테리아rpoB유전자의 종-특이 DNA 서열로 구성되는 종 구별 프로브, 마이코박테리아rpoB유전자의 변형된 하나 이상의 코돈으로 구성되는 마이코박테리아 약제내성탐지 프로브 및 상기 약제내성탐지 프로브의 변형된 코돈에 대응하는 야생형 코돈으로 구성되는 대조군 프로브를 함유하는 올리고뉴클레오티드칩과, 상기 올리고뉴클레오티드칩과 검체의 혼성화반응(hybridization)을 탐지하는 표지수단을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기한 구성에 의하면, 마이코박테리움 종 구별 뿐만 아니라 약제내성탐지를 동시에 할 수 있는 이점이 있다. 특히, 약제내성과 관련된 마이코박테리아rpoB유전자 점 돌연변이를 약제내성탐지 프로브와 대조군 프로브의 혼성화 정도를 대비하여 판독할 수 있어, 신속, 정확하게 대량으로 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에 의한 구체적인 실시예에 의하면, 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트는, 상기 약제내성탐지 프로브가rpoB유전자의 507 - 533 코돈에서 발견되는 변형된 하나 이상의 코돈인 것을 특징으로 한다.
상기한 구성에 의하면, 점 돌연변이가 빈발하는 507 - 533 코돈에서 발견되는 변형된 하나 이상의 코돈을 프로브로 사용하기 때문에 마이코박테리아rpoB유전자 일부만으로 약제내성여부를 신속, 정확하게 판별할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에 의한 보다 구체적인 실시예에 의하면, 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트는, 상기 약제내성탐지 프로브가 리팜핀(rifampin)내성 프로브 또는/및 리파부틴(rifabutin) 감수성 프로브인 것을 특징으로 한다.
상기한 구성에 의하면, 검체가 리팜핀 내성 또는/및 리파부틴 감수성을 가지고 있는지를 신속, 정확하게 판별할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에 의한 다른 실시예에 의하면, 본 발명에 의한 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트의 제조방법은, 마이코박테리아rpoB유전자의 종-특이(Mycobacterial species specific) DNA 서열로 구성되는 종 구별 프로브, 마이코박테리아rpoB유전자의 변형된 하나 이상의 코돈으로 구성되는 마이코박테리아 약제내성탐지 프로브 및 상기 약제내성탐지 프로브의 변형된 코돈에 대응하는 야생형 코돈으로 구성되는 대조군 프로브 각각을 아민기로 변형시키는 제 1단계와; 글래스 위에 알데히드기를 유도시키는 제 2단계와; 상기 변형된 각각의 프로브를 시프염기반응(Schiff base reaction)에 의해 상기 글래스에 고정시켜 올리고뉴클레오티드칩을 만드는 제 3단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기한 구성에 의하면, 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성특성을 동시에 신속, 정확하게 대량으로 판별할 수 있는 진단키트를 용이하게 제작할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 마이코박테리움의 종 구별을 위한 PCR의 프라이머는, 마이코박테리아의rpoB유전자 분절(157bp)을 특이적으로 증폭시키는 서열번호 47 및 48의 염기서열을 갖는 바이오틴-DGR-8 및 DGR-9를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 프라이머를 이용하면, 배양되지 않은 검체를 중합효소연쇄반응의 주형으로 이용할 수 있고, 마이코박테리움 속에 속하는 44종의rpoB유전자(157bp)를 효율적으로 증폭할 수 있어 종 구별 및 약제내성 탐지를 단시간내(약 6시간내)에 할 수 있다. 이 프라이머를 이용하여 얻은 중합효소 연쇄반응 증폭산물은 157bp 크기의 DNA로서 최종적으로 유전자 칩의 표적 DNA로 적용 가능하다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지방법에서, 검체의rpoB유전자 분절을 상기 DGR-8, DGR-9 프라이머를 이용하여 반응온도 64℃, 반응주기 40, 프라이머 농도 100pmol 반응조건하에서 PCR로 증폭시킨 다음, 본원발명에 의한 진단키트를 이용하여 특정 종에 해당하는 프로브의 형광정도로 판별하는 것을 특징으로 한다 .
1980년대 초 최초로 고안된 유전자 칩(DNA chip) 기술은 한번에 많은 유전자의 정보를 확인할 수 있는 방법을 제시하고 있다. 이 방법은 이미 유전자 발현 또는 인간 유전자, 박테리아 유전자의 돌연변이, 다형질성(polymorphism)을 관찰하는데 이용되고 있다.
본 발명은, 유전자 해석을 단기간에 대량으로 해주는 도구로서 각광받고 있는 상기 DNA칩기술을 도입하여 마이코박테리움의 종 구별 및 약제내성과 관련된 마이코박테리움 튜버큘로시스의 점 돌연변이를 판별할 수 있도록 한 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트 및 그 키트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 종래기술분야에서 상술한rpoB유전자의 특성에 기초하여 마이코박테리움 튜버큘로시스의rpoB유전자에서 일어나는 돌연변이를 조사하여 항결핵제에 대한 내성 및 감수성을 판별하고자 하였다. 즉, 특정 프라이머를 사용하여 마이코박테리아 점 돌연변이 가장 많이 일어나는 81bp 코아리전을 포함한rpoB유전자 싸이트(157bp)를 PCR로 증폭하고 이를 올리고뉴클레오티드칩으로 혼성화함으로서 유전자 돌연변이를 판별하여 약제 내성을 판별하고자 하였다.
한편, 상기 DNA칩을 이용한 방법은 우선적으로 환자의 표적유전자를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 증폭하는 단계를 포함한다. 이 방법에 있어서는 원하는 환자의 표적유전자를 한번의 중합효소연쇄반응으로 얻으려면 반응에 사용되는 프라이머를 적절한 유전자 서열을 갖도록 잘 고안하여야 한다.
본 출원인의 한국특허출원 제2000-0029369호에서는, 프라이머로서 마이코박테리움 튜버쿨로시스의rpoB유전자 염기서열만을 이용하여 고안된 biotin-TR8, TR9를 사용하고 있다. 상기 프라이머들을 사용하여 증폭되는 유전자 부위는 리팜핀(rifampin) 약제 내성과 관련있는 점돌연변이(point mutation)가 가장 많이 일어나는 81bp 코아리전(core region)을 포함한rpoB유전자(157bp)이다. 이 유전자 부위는 DNA-의존 RNA 폴리머라제(DNA-dependent RNA polymerase)의 b 서브유니트(subunit)를 암호화하는 영역이다.
그런데, 상기 프라이머들은 배양된 마이코박테리움의rpoB유전자를 중합효소연쇄반응에서 주형(template)으로 사용하므로, 리팜핀 약제내성 판별을 함에 있어서 마이코박테리움을 배양하기 위한 시간 2-3개월이 소요되는 문제점이 있었다.
또한, 상기 프라이머는 마이코박테리움 튜버큘로시스rpoB유전자 염기서열만을 이용하여 고안되어 객담에서의 마이코박테리움 튜버큘로시스와 MOTT(mycobacteria other than M. tuboculosis)의 증폭가능성은 낮으며, MOTT의 경우 배양된 샘플에서도 증폭물을 생성할 확률이 낮다.
따라서, 본 출원인은 상기 프라이머의 문제점을 해결하기 위해서 마이코박테리움 튜버쿨로시스외 43종의 마이코박테리움rpoB유전자 염기서열로부터 얻어진 염기서열을 조합하여 새로운 프라이머를 고안하였다. 이 프라이머를 이용하면 배양되지 않은 검체를 중합효소연쇄반응의 주형으로 이용할 수 있고 단 한번의 중합효소연쇄반응으로 마이코박테리움 튜버쿨로시스외 43종의 마이코박테리움의 특정rpoB유전자 서열을 증폭산물을 얻을 수 있어, 이 증폭산물을 DNA칩에 적용시 마이코박테리움 종 구별 및rpoB유전자의 점돌연변이를 동시에 단시간내에 할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해한정되는 것이 아니다.
실시예 1-1. 마이코박테리아 DNA( Mycobacterial genomic DNA)
10개의 임상검체로부터 배양, 추출된 마이코박테리아 DNA는 아산재단 서울중앙병원 호흡기내과로부터 씨퀀싱된 것을 제공받고 그 외는 미국의 ATCC에서 입수하였다.
실시예 1-2. 올리고뉴클레오티드의 프로브 및 프라이머 제작
표 2에는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머 서열(sequences of oligonucleotide probes and primers)이 나타나 있다. 각각의 프라이머(biotin-TR8,TR9)와 프로브는 바이오닉스(Bionics)에서 합성주문하여 사용하였다. 그 외 시약은 특급시약을 사용하였다.
* 상기 순서대로 염기서열 번호(1-40)가 부여됨
표 2에 제시된 바와 같이,rpoB유전자의 점 돌연변이를 조사하기 위한 올리고뉴클레오티드칩은 7개의 야생형 프로브와 17개 RIP-내성 프로브, 8개의 RIB-민감성 프로브를 포함하도록 고안되었다.
17개의 RIP-내성 프로브(서열번호 20 내지 서열번호 36)는 511 코돈(Leu 〉Pro), 513 코돈(Gln 〉Pro), 516코돈(a: Asp 〉Val, b:Asp 〉Tyr, c:Asp 〉Glu), 518 코돈(Asn 〉His), 521 코돈(Leu 〉Met), 522 코돈(Ser 〉Leu), 526 코돈(a:His 〉Tyr, b:His 〉Asp, c:His 〉Arg, d:His 〉Asn, e:His 〉Ala, f:His 〉Cys, g: His 〉Gln, h:His 〉Gly), 531 코돈(Ser 〉Leu)으로 돌연변이된 것을 판별할 수 있다.
17개의 RIF-내성 프로브 중 8개의 RIB-민감성 프로브(서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 31 내지 서열번호 36)는 516 코돈(a: Asp 〉Val, b:Asp 〉Tyr, c:Asp 〉Glu), 526 코돈(d: His 〉Asn, e:His 〉Ala, f:His 〉Cys, g: His 〉Gln, h:His 〉Gly)으로 돌연변이된 것을 판별할 수 있다.
다만, 여러 논문에 의하면 mt 516a와 mt 516b는 RIF 내성 돌연변이이면서 동시에 RIB 감수성이 다양하게 보고되고 있다(James M. Musser, "Antimicrobial Agent Resistance in Mycobacteria: Molecular Genetic Insights", Clinical Microbiology Review, Vol.8, No.4,pp.496-514,1995). 따라서, 일단 RIB-민감성 프로브에 포함하여 전체 칩 포맷을 결정하였다.
결핵균군을 판별하기 위해 고안된 프로브 Mc1, Mc2, Mc5(서열번호 1 내지 서열번호 3)는 혼합하여 올리고뉴클레오티드 칩상에서 한 개의 점으로 고정한다. 이프로브의 양성반응으로부터 Mc1이 마이코박테리움 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticum), 마이코박테리움 보비스(M. bovis(2)), 마이코박테리움 가스트리(M. gastri), 마이코박테리움 아비움(M. avium(2)), 마이코박테리움 셀라티움(M celatium(2)), 마이코박테리움 제나벤스(M. genavense), 마이코박테리움 고르도나(M. gordonae), 마이코박테리움 헤모필움(M. haemophilum), 마이코박테리움 인터젝툼(M. interjectum), 마이코박테리움 인터미디움(M. intermedium), 마이코박테리움 인트라셀룰레(M. intracellulare), 마이코박테리움 칸자시(M. kansasii), 마이코박테리움 레프리(M. leprae), 마이코박테리움 말모엔스(M. malmoense), 마이코박테리움 스크로플라세움(M. scrofulaceum), 마이코박테리움 줄게이(M. szulgai), 마이코박테리움 제노피(M. xenopi), 마이코박테리움 테라(M. terrae), 마이코박테리움 트리빌레(M. triviale), 마이코박테리움 논크로모제니쿰(M. nonchromogenicum), 마이코박테리움 아우룸(M. aurum), 마이코박테리움 치티(M. chitae), 마이코박테리움 페레그리눔(M. peregrinum), 마이코박테리움 프라이(M. phlei), 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis), 마이코박테리움 털모레지스터빌레(M. thermoresistibile), 마이코박테리움 바시(M. vaccae)와, Mc2가 병원성균 또는 비병원성균이나 임상적으로 중요한 마이코박테리움 마리움(M marium), 마이코박테리움 시모이데(M. shimoidei), 마이코박테리움 울세란스(M. ulcerans), 마이코박테리움 엡세서스(M. abscessus), 마이크로박테리움 체로나(Mycobacterium chelonae)를, Mc5가 마이코박테리움포르튜이텀(Mycobactrium fortuitum)을 검출할 수 있다. 또한, 대조군으로서 마이코박테리아(Mycobactria)는 아니지만 근연 이속균인 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)를 검출할 수 있는 프로브(Mex)(서열번호 4)도 추가하여 이와 혼성화 시그널을 비교함으로써 보다 정확한 검출이 이루어질 수 있도록 하였다.
1차적으로 결핵균군을 판별할 수 있는 프로브외에도, 2차적으로 좀 더 상세하게 마이코박테리움 종 구별을 하기 위하여 마이코박테리아 종-특이rpoBDNA 일부 서열로 구성되는 종 구별 프로브(mycobacteria species identification probe) 8개(서열번호 5 내지 서열번호 12)를 첨가하였다. 마이코박테리움 종 구별 프로브에서 Ms1 프로브는 마이코박테리움 튜버큘로시스, 마이코박테리움 아프리카눔, 마이코박테리움 보비스, 마이코박테리움 가스트리를 검출할 수 있다.
그외 병원성균이거나 비병원성균으로서 임상적으로 동정할 필요가 있는 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticum(Ms2)), 마이코박테리움 시미에(M. simiae(Ms2)), 마이코박테리움 아우룸(M. aurum(Ms2)), 마이코박테리움 세네갈렌스(M. senegalence(Ms2)), 마이코박테리움 시모이데(M. shimoidei(Ms2)), 마이코박테리움 네오아룸(M. neoaurum(Ms2)), 마이코박테리움 테라(Mycobacterium terrae(Ms2)),마이코박테리움 고르도나(M.gordonae(Ms2)), 마이코박테리움 헤모필움(M.haemophilum(Ms2)), 마이코박테리움 줄게이(M.szulgai(Ms2)), 마이코박테리움 인트라셀루라(M.intracellulare(Ms2)), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii(Ms2)), 마이코박테리움 스크로풀라세움(Mycobacteriumscrofulaceum(Ms2)), 마이코박테리움 포르튜이텀(Mycobacterium fortuitum(Ms2)), 마이코박테리움 팔락스(M. fallax(Ms2)), 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens(Ms2)), 마이코박테리움 페레그리눔(M. peregrinum(Ms2)), 마이코박테리움 프라이(M. phlei(Ms2)), 마이코박테리움 바시(M. vaccae(Ms2)), 마이코박테리움 마리눔(M. marinumv(Ms2)), 마이코박테리움 울세란스(M. ulcerans(Ms2)), 마이코박테리움 치티(M. chitae(Ms2)), 마이코박테리움 제네벤스(M.genevense(Ms2)), 마이코박테리움 스메그마티스(M.smegmatis(Ms2)), 마이코박테리움 인터미디움(M.intermedium(Ms3)), 마이코박테리움 말모엔스(M.malmonense(Ms3)), 마이코박테리움 논크로모제니쿰(M.nonchromogenicum(Ms3)), 마이코박테리움 레프리(Mycobacterium leprae(Ms3)), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium(Ms4)), 마이코박테리움 트리빌레(M. triviale(Ms4)), 마이코박테리움 셀라티움(M. celatium(Ms4)), 마이코박테리움 인터젝툼(M.interjectum(Ms5)), 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi(Ms6)), 마이코박테리움 체로나(Mycobacterium chelonae(Ms7)), 마이코박테리움 엡세서스(M.abscessus(Ms7)), 마이코박테리움 털모레지스터빌레(M.thermoresistibile(Ms8))를 검출할 수 있도록 고안하였다.
상기 표 2에서 MTAB 및 MF는 상기 표 2의 프로브 Ms1 및 Ms2에 의해 구별되는 몇 개의 종을 재분류하기 위한 프로브이다. 구체적으로 MTAB로는 마이코박테리움 튜버큘로시스(M.tuberculosis), 마이코박테리움 아프리카눔(M.africanum), 마이코박테리움 보비스(M.bovis), 마이코박테리움 보비스BCG(M.bovisBCG), 마이코박테리움 인트라셀룰레(M.intracelluare), 마이코박테리움 칸사시(M.kansasii)를 구별할 수 있다. 한편, MF로는 마이코박테리움 포르튜이텀(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens)를 구별할 수 있다.
실시예 1-3. 올리고뉴클레오티드칩의 제작(Fabrication of oligonucleotide chip)
도 1에는 본 발명에 의한 마이코박테리아 유전자 판별용 올리고뉴클레오티드칩을 제작하는 단계를 보인 흐름도가 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드칩의 제조는 개략적으로, 결핵균군 프로브, 마이코박테리아rpoB유전자의 종-특이(Mycobacterial species specific) DNA 서열로 구성되는 종 구별 프로브 및 마이코박테리아rpoB유전자의 변형된 하나 이상의 코돈로 구성되는 마이코박테리아 약제내성탐지 프로브 및 상기 약제내성탐지 프로브의 변형된 코돈에 대응하는 야생형 코돈으로 구성되는 대조군 프로브 각각을 아민기로 변형시키는 제 1단계(10)와; 글래스 위에 알데히드기를 유도시키는 제 2단계(20)와; 상기 변형된 프로브를 시프염기반응(Schiff base reaction)에 의해 상기 글래스에 고정시켜 올리고뉴클레오티드칩을 만드는 제 3단계(30)를 포함하여 구성된다.
상술하면, 3 ×SSC에 200pmol/㎕이 되도록 특정 DNA 프로브(표 2 참조)를 녹인 후, 실리에티드 슬라이드 글래스(silyated slide glass,CEL Associates,Inc.,MA USA)) 위에 0.1 - 0.2㎕ 씩 스파팅하여 습한 인큐베이터에서 37℃에서 4시간동안 반응시킨다.
시프염기(Schiff base)반응이 완료된 슬라이드 글래스를 인큐베이터에서 꺼내 연속적으로 0.2% 소디움 도디실설페이트(SDS) 용액에 1분간, 증류수에서 1분간그리고 NaBH4용액(0.1g NaBH4, 30ml PBS, 10ml EtOH)에서 5분동안 처리하였다. 마지막으로 증류수에서 1분동안 세척후 건조하여, 사용할 때까지 상온의 암실에서 보관하였다.
실시예 1-4. 중합효소연쇄반응(PCR)
PCR은 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 1U 태크 폴리머라제(Taq polymerase), 50pmol 바이오틴-TR-8, TR-9 프라이머(표 2 참조)를 첨가하여 최종 부피 50㎕에서 반응하였다. 동일한 PCR 반응혼합물에 1mM dATP, dGTP, dCTP를 각각 2㎕ 씩 그리고 dTTP를 1.5㎕, 1mM 바이오틴-dUTP를 0.5㎕ 더 첨가하고 최종적으로 표적(target) DNA에 랜덤 플로레슨스 라벨링(random fluorescence labeling)을 하였다. 표 3에는 PCR 반응액 조성이 나타나 있다.
PCR 반응은 다음과 같은 조건하에서 35 싸이클 실행하였다.
- 전변성(predenaturation) : 94℃, 5분
- 변성(denaturation) : 94℃, 30초
- 프라이머 결합(primer annealing) : 63℃, 30초
- 중합(polymerization) : 72℃, 45초
- 최종 연장(last extention) : 72℃, 5분
상기 과정을 통해 생산된 PCR 산물은 81bp 코아리젼(core region)을 포함하는 157bp로서 2% 아가로스젤상에서 전기영동하여 확인하였다.
실시예 1-5. 혼성화와 스캔닝(Hybridzation and Scanning)
PCR로 증폭된 표적 DNA(157bp) 20㎕를 취하여 DNase 버퍼 20㎕, DNase Ⅰ(0.1U/㎕) 1㎕를 첨가하여 0℃에서 5분 동안 처리하였으며, 반응이 끝난 후 DNaseⅠ를 변성시키기 위해 99℃에서 10분동안 열처리하였다.
이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 변성하기 위해 4㎕의 3N NaOH로 25℃에서 5분동안 처리한 후, 2㎕의 Tris-HCl(pH 7.2), 4㎕의 3N HCl로 0℃에서 5분동안 처리하였다.
최종적으로 위의 반응혼합물에 50㎕의 12 x SSPE(saline-sodium phosphate-EDTA buffer)와 0.5㎕의 10% SDS를 첨가하여, 올리고뉴클레오티드칩상에서 40℃에서 3시간동안 혼성화시켰다.
혼성한 후 2 x SSPE, 0.03% SDS로 25℃에서 3분, 1 x SSPE로 25℃에서 5분, 0.2 x SSPE로 25℃에서 5분 동안 차례로 세척하여 올리고뉴클레오티드 칩과 반응하지 않은 표적 DNA를 제거하였다.
올리고뉴클레오티드칩을 25℃에서 건조한 후, 49㎕의 3 x SSPE에 1㎕의 스트렙타비딘-R-피코에리스린을 혼합하여 25℃에서 10분동안 처리하였다. 최종적으로 올리고뉴클레오티드칩을 1 x SSPE에서 1분동안 2회 세척한 후 스캐너(GMS 418array scanner,TaKaRa,Japan)로 올리고뉴클레오티드칩을 스캐닝하였다.
야생형(wild type, wt) 프로브는rpoB유전자 507-533 코돈에 해당하는 부위에서 고안된 7종의 17mer DNA 절편으로서 빈발 점돌연변이 사이트를 중간위치(8-12 position)에 포함하여 각각의 프로브가 서로 겹치는 부위를 최대로 하여, 리팜핀 내성 프로브와 혼성화 시그널의 비교에 의해 빈발 돌연변이를 정확하게 검출함과 동시에 507-533 코돈에서 발견되는 모든 점돌연변이를 예측할 수 있도록 고안되었다.
각각의 프로브는 야생형 프로브와 마찬가지로 돌연변이 사이트가 프로브의 중간위치(8-12 position)에 있도록 고안하여 탐지감도를 높이고 야생형 프로브와의 비교에 의해 더욱 정확한 검출이 가능하도록 하였다. 각각의 프로브는 T10을 스페이서(spacer)로 5'에 첨가하여 표적 DNA와 혼성화시 그 효율을 높였다. 표적 DNA는 T10-mt 526c 프로브, mt 526c 프로브와 혼성화시, T10스페이서가 유도된 T10-mt 526c 프로브에만 확실하게 혼성화된 것을 확인하였다. 이것은 PCR로 얻어진rpoB유전자 157 bp와 17bp 프로브의 혼성화시, T10이 스테릭힌드런스(steric hindrance)를 감소시켜 그 효율을 증가시킨 것으로 해석된다.
도 2에는 10개 임상검체(clinical isolate)의rpoB유전자(157bp)를 바이오틴-TR8,TR9 프라이머로 증폭한 후 2%의 아가로즈젤 상에서 확인한 결과가 나타나 있다.
10개의 증폭된rpoB유전자(157bp)를 DNase Ⅰ으로 다이제스천(digestion)한후 각각의 프로브가 스파팅된 실리레이티드 슬라이드 글래스상에서 혼성화시켰다. 최적의 조건에서(40℃, 3시간)에서 혼성화시킨 후, 스트렙타비딘-R-피코에리스린으로 염색하여 578nm에서 발광되는 형광을 검출하였다. 칩의 결과는 야생형(wt)과 돌연변이형 타입(mt)의 형광세기를 상대적으로 비교함으로써 해석할 수 있다. 즉, mt 프로브는 wt 프로브와 비교시, 이 두개의 프로브는 동일한 시퀀스이지만 중앙 위치에 단 한개의 상이한 시퀀스를 설정함으로서 혼성화되는 정도가 다르고 이로 인한 두 점의 형광 시그널의 차이로 해석할 수 있다. 또한 상대적인 형광세기를 수치화하여 비교함으로서 더 명확하게 확인할 수 있다.
도 3a - 3j는 본 발명에 의해 바이오틴-dUTP를 이용하여 증폭한 임상샘플을 올리고뉴클레오티드칩상에서 혼성화한 후 얻은 형광이미지이며, 도 4는 도 3에서의 프로브의 위치를 도면화한 것으로 리팜핀 및 리파부틴 내성 판단을 용이하게 하도록 각각을 별도의 블록으로 설정하고, 동일한 스파팅을 종렬로 2회씩한 것을 나타낸다.
도 3a에서 야생형 프로브인 F1, F2, F4, F5, F6 및 F7의 신호는 그들의 돌연변이타입 프로브의 신호보다 강하지만, 돌연변이타입 516c의 신호는 상응하는 야생형 프로브인 F3 및 돌연변이타입 516a,516b 보다 강하므로, 검체는 516c 돌연변이타입으로 판독된다. 도 3b 내지 도 3j도 마찬가지 방법으로 판독된다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 각각의 임상검체의 RIF 내성 돌연변이 종류는 #22(mt516c), #24(mt516b/526e), #30(mt531), #36(mt516b), #48(mt526f), #82(mt531/516c), #87(mt531/516c), #90(mt516c/526d), #91(mt531),#94(mt511/531)로 해석되었다.
그리고 그 중 RIB에 대해 감수성을 보이는 임상검체는 #22(mt516c), #24(mt526b/526e), #36(mt516b), #48(mt526f), #82(mt531/516c), #87(mt531/516c), #90(mt516c/526d) 모두 7개로 해석되었다. 단, 위의 결과를 약제 감수성테스트 결과 또는 DNA 시퀀싱한 결과와 비교할 때 #24에서 차이가 발견되었다.
#24에 대해서는 칩의 결과로부터 mt526b/526e로 나온 것으로 보아 결핵균주가 섞여 있는 것으로 판단되었다. #24의 DNA 시퀀싱 결과 mt526e로 판명되었으나 올리고뉴클레오티드칩의 결과와 비교시, 결핵균주가 섞여있을 가능성을 배제할 수 없다고 판단된다.
L. B. Heifets에 의하면 511(Leu>Pro), 516(Asp>Tyr), 516(Asp>Val), 522(Ser>Leu)의 돌연변이를 갖는 계통은 리파부틴 MIC가 ≤5 ㎍/ml로 저준위 내성(low-level resistant)로 분류되어야 한다고 보고되었다(Heifets L. B.,Antituberculosis drugs: antimicrobial activity in vitro, pp. 14-57 in L. B. Heifets (ed.), Drug susceptibility in the chemotherapy of mycobacterial infections, 1sted. CRC Press, Boca Raton, Fla, 1991).
즉, 516 코돈에 의한 RIB 감수성은 그 양상에 따라 매우 다양하기 때문에, 항상 올리고뉴클레오티드칩의 결과와 약제 감수성테스트 결과(MIC)가 함께 고려되어야 한다고 생각된다.
그러나, 526 코돈에서 유발되는 돌연변이는 His>Gln, Gly, Asn, Ala, Cys은RIB 감수성, His>Tyr, Pro, Arg, Asp는 RIB 내성으로 판별되기 때문에 올리고뉴클레오티드칩으로 그 감수성을 유추할 수 있을 것으로 판단된다.
도 5는 상기 종 구별을 위해 개발된 프로브(Ms1-Ms8)를 이용한 올리고뉴클레오티드칩의 프로브배열을 나타내는 것이고, 도 6b- 6c는 도 5 배열의 올리고뉴클레오티드칩을 이용한 마이코박테리움 종 구별 실험결과를 나타낸다. 마이코박테리움 칸사시, 마이코박테리움 포르튜이텀, 마이코박테리움 스크로풀라세움의 경우, 마이코박테리아임을 표시해주는 MCmix 프로브의 시그널이 근연이속군 프로브인 Mex의 시그널보다 강하게 나타난 것과 종구별 프로브 중 2번 프로브의 시그널이 1번 및 3 내지 8번 프로브보다 강하게 나타남을 관찰할 수 있다. 같은 방법으로 임상적 의미가 큰 33종 마이코박테리아를 구별할 수 있다. 결핵균인 경우 Mcmix 프로브와 1번 프로브의 시그널이 나타나며, 마이코박테리움 가스트리를 제외한 MOTT는 Mcmix 프로브와 2번 내지 8번 프로브에 시그널이 나타나는 것으로 확인할 수 있다.
다음의 실시예 2에서는 16종의 마이코박테리움 지노믹 DNA를 한국 제주대로부터 제공받았다. 각각의 프라이머는 바이오닉스(Bionics, Korea)에서 합성주문하여 사용하였다. 그 외 시약은 특급시약을 사용하였다.
실시예 2-1. 올리고뉴클레오티드의 프로브제작 2
상술한 약제내성 프로브에 리팜핀 약제내성 결핵균의rpoB유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 프로브를 추가할 수 있다. 추가된 야생형 3종과 상응하는 각각의 돌연변이 3종의 프로브의 염기서열은 표 4에 나타나 있다.
프로브의 형광정도를 비교함으로써, 코돈 509(Ser)→AGA(Arg), 코돈 533 CTG(Leu)→CCG(Pro), 코돈 524 TTG(Leu)→TTA(Leu)의 돌연변이를 검출할 수 있다. 상기 표 4에서 RFP는 리팜핀, RBU는 리파부틴, R은 내성, S는 감수성을 의미한다.
도 7은 리팜핀 약제내성 결핵균의rpoB유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 상기 프로브가 추가된 올리고뉴클레오티드칩의 프로브배열을 나타내는 도면이고, 도 8b-8d는 도 7의 배열의 올리고뉴클레오티드칩을 이용하는 임상검체의 리팜핀 및 리파부틴 내성 진단 결과를 나타낸다. 실험에 사용된 임상검체는 중앙병원으로부터 공급된 것이다. 실시예 1과 동일하게 야생형에 해당하는 프로브와 돌연변이에 해당하는 프로브의 형광의 밝기를 비교해서 판단한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 #1은 516a, #2는 511, #3은 516b, #4는 531 돌연변이타입으로 판독되었으며 Mcmix와 Mex 프로브의 비교로 마이코박테리아임을 확인하였다. 염기서열 검사를 통해 칩 실험의 결과를 검증한 결과 모두 일치함을 알 수 있었다.
실시예 2-2. 프라이머의 제작 2
본 출원인의 선출원에서는 프라이머로 biotin-TR8,TR9을 사용하였으나, 본 발명에서는 상술한 바와 같이 상기 프라이머의 단점을 보완하기 위해 배양되지 않은 검체를 중합효소연쇄반응의 주형으로 이용할 수 있고, 증폭효율을 높일 수 있는 biotin-DGR8,DGR9이라는 새로운 프라이머를 고안하였다.
상기 새롭게 고안된 biotin-DGR8,DGR9은 마이코박테리움 튜버쿨로시스외 43종 즉, 마이코박테리움 아프리카눔(Mycobacterium africanum),마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum),마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium),마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 보비스BCG 스트레인 French 1173P2(Mycobacterium bovisBCG strain French 1173P2), 마이코박테리움 셀라티움 스트레인 ATCC51131(Mycobacterium celatumstrain ATCC51131), 마이코박테리움 셀라티움 스트레인 ATCC51130(Mycobacterium celatiumstrain ATCC51130), 마이코박테리움 가스트리(Mycobacterium gastri),마이코박테리움 제나벤스(Mycobacterium genavense), 마이코박테리움 고르도나(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 헤모필움(Mycobacterium haemophilum),마이코박테리움 인터젝툼(Mycobacterium interjectum),마이코박테리움 인터미디움(Mycobacterium intermedium), 마이코박테리움 인트라셀룰레(Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 레프리(Mycobacterium leprae),마이코박테리움 말모엔스(Mycobacterium malmoense),마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum), 마이코박테리움 아비움 subsp. 파라튜버쿨로시스(Mycobactrium aviumsubsp. Paratuberculosis), 마이코박테리움 스크로플라세움(Mycobacterium scrofulaceum), 마이코박테리움 시모이데(Mycobacterium shimoidei), 마이코박테리움 시미에(Mycobacterium simiae), 마이코박테리움 줄게이(Mycobacterium szulgai),마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi), 마이코박테리움 테라(Mycobacterium terrae), 마이코박테리움 트리빌레(Mycobacterium triviale), 마이코박테리움 논크로모제니쿰(Mycobacterium nonchromogenicum), 마이코박테리움 엡세서스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 아우룸(Mycobacterium aurum), 마이코박테리움 첼로니(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 치티(Mycobacterium chitae), 마이코박테리움 팔락스(Mycobacterium fallax), 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 포르튜이텀 스트레인 ATCC6841(Mycobacterium fortuitumstrain ATCC6841), 마이코박테리움 포르튜이텀 스트레인 ATCC49403(Mycobacterium fortuitumstrain ATCC49403), 마이코박테리움 네오아우룸(Mycobacterium neoaurum), 마이코박테리움 페레그리눔(Mycobacterium peregrinum), 마이코박테리움 프라이(Mycobacterium phlei), 마이코박테리움 세네갈렌스(Mycobacterium senegalense), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 털모레지스터빌레(Mycobacterium thermoresistibile), 마이코박테리움 바시(Mycobacterium vaccae)의rpoB유전자의 염기서열 일부를 혼합하여 조합된 서열로 고안되었다.
상기 44종의 biotin-DGR8,DGR9 프라이머를 고안하는데 이용된 염기서열부위를 포함하는rpoB유전자 일부의 염기서열은 서열목록의 서열번호 49 내지 서열번호 92에 나타나 있다. 또한 표 5에는 biotin-DGR8, DGR9 고안시 이용된 44종의 각 마이코박테리움의rpoB염기서열이 나타나 있다.
표 6에는 상술한 바와 같이 제조된 biotin-DGR8,DGR9의 염기서열이 선출원의 프라이머 biotin-TR8,TR9과 함께 나타나 있다.
참고) B: c, t, g
N: c, t, g, a
R: g, a
S: c, g
Y: c, t
실시예 2-3. 중합효소연쇄반응(PCR) 2
새롭게 고안된 biotin-DGR8, DGR9을 사용시 중합효소연쇄반응의 조건을 최적화하기 위해 반응조건들을 다음과 같이 변화시켜 보았다.
A. 반응온도(annealing temperature) 변화
a. 94℃에서 5 분, 94℃에서 30 초, 47℃에서 30 초, 72℃에서 45 초
b. 94℃에서 5 분, 94℃에서 30 초, 63℃에서 30 초, 72℃에서 45 초
c. 94℃에서 5 분, 94℃에서 30 초, 64℃에서 30 초, 72℃에서 45 초
d. 94℃에서 5 분, 94℃에서 30 초, 65℃에서 30 초, 72℃에서 45 초
바이오틴-DGR8, DGR9프라이머를 사용하고 반응온도(annealing temperature)조건을 변화시켰을 때 2% 아가로오즈겔상에서 증폭된 DNA의 밴드가 상이하게 나타났다. 또한, 47, 63℃에서는 여러 밴드가 보였고 64, 65℃에서는 단일 밴드를 관찰할 수 있었다.
B. 반응 주기 변화
바이오틴-DGR8, DGR9 프라이머를 사용하여 단일밴드를 보이는 64℃ 반응온도에서 각각 35주기, 40주기 실행한 중합효소 연쇄반응 증폭산물을 2% 아가로오즈겔로 확인한 결과, 반응주기에 따라 증폭산물의 양적인 차이를 관찰할 수 있었다. 64℃, 40 주기로 실행한 반응에서 더 많은 증폭산물을 얻을 수 있었다.
C. 프라이머의 농도 변화
여러가지 농도의 바이오틴-DGR8, DGR9 프라이머를 사용하여 64℃ 반응온도 40주기 실행한 중합효소 연쇄반응에서 프라이머 농도를 50 pmol, 100 pmol, 500 pmol, 1000 pmol로 다양하게 사용한 경우, 50~100 pmol 농도 범위에서 증폭산물이 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 100 pmol의 농도를 초과하여 사용한 경우는 오히려 감소 또는 증폭이 안된 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 50 - 100 pmol의 바이오틴-DGR8, DGR9 프라이머 농도가 적절한 것을 알 수 있었다.
D. 마이코박테리아 16종에 대하여 중합효소연쇄반응을 실시한 경우
도 9a는 선출원의 반응조건인 50 pmol의 바이오틴-TR8, TR9 프라이머를 사용하여 63℃, 35주기에서 중합효소연쇄반응을 실시한 증폭산물의 2% 아가로오즈겔 DNA밴드 이미지를 나타내고, 도 9b는 본 발명에 따른 반응조건인 100 pmol의 바이오틴-DGR8,DGR9 프라이머를 사용하여 64℃, 40주기에서 중합효소연쇄반응을 실시한증폭산물의 2% 아가로오즈겔 DNA밴드 이미지를 나타내었다.
도 9에서 볼 수 있듯이 바이오틴-TR8, TR9 보다 바이오틴-DGR8, DGR9을 사용한 경우 16종 마이코박테리아rpoB유전자서열의 157bp영역의 증폭산물만을 높은 효율로 얻을 수 있었다. 이 157bp 증폭 산물은 유전자 칩을 사용하여 마이코박테리움 종 구별을 하고자 할 경우 분리과정(DNA purification) 표적 DNA로서 사용가능하다.
실시예 2-4. 객담검체의 내성진단
결핵 또는 결핵이 의심되는 환자의 객담검체로부터 직접 추출된 11개의 DNA샘플은 아산재단 서울중앙병원 호흡기내과로부터 제공받았다. 도 10은 실시예 2-3에서 최적화된 조건, 즉 100 pmol의 바이오틴-DGR8,DGR9 프라이머를 사용하여 64℃, 40주기로 실시한 객담검체의 중합효소연쇄반응 증폭산물의 2% 아가로오즈겔 DNA밴드 이미지를 나타낸다. 도 10에서 16번과 36번 검체는 결핵균이 검출되지 않았고, 이를 제외한 9개의 검체는 결핵균 양성으로 판단되어 도 7의 올리고뉴클레오티드칩을 이용한 내성진단을 실시하였다. 그 결과 6,20,26,27,29,38,41,49번 8개의 검체는 야생형 즉 리팜핀 감수성 결핵균이며, 57번 검체는 509,513 돌연변이를 가진 내성균으로 판단되었다. 도 11a 및 도 11b는 각각 야생형인 27번과 돌연변이타입인 57번의 올리고뉴클레오티드칩 실험 결과 이미지이다. 야생형으로 판단된 8개의 검체는 염기서열분석을 통해 확인한 결과 모두 일치함을 알 수 있었으며 57번은 리팜핀 내성균인 것으로 확인되었다.
실시예 2-5. 표지수단(Cyanine 5-dUTP) 첨가
형광염색물질을 이용하여 칩 실험 결과를 확인하기 위한 선출원 방법 대신에 새로운 표지수단을 고안하였다. 즉, 바이오틴-dUTP 대신 시아닌 5-dUTP(NEN, U.S.A)를 이용하여 연쇄중합효소반응을 시키면 그 후 별도의 형광염색물질을 결합시키는 과정(streptavidin-R-phycoerythrin 결합과정)이 필요없으므로 빠르고 간단하게 분명한 시각적 결과를 얻을 수 있다. 연쇄중합효소 반응시 시아닌 5-dUTP의 사용농도는 기존 방법의 바이오틴-dUTP와 같으며, 프라이머는 바이오틴 변형(biotin modification)이 되지 않는 DGR-8을 사용하는 것이 바람직할 것으로 생각된다. 실험방법은 형광염색물질 염색과정만 생략하면 동일하다. 레이저 스캐너를 이용하여 실험 결과를 얻으려면 633nm 파장에서 검출하면 된다.
상기 실시예 2-1 내지 2-5에서 특별히 언급되지 않은 것들은 실시예 1-1 내지 1-5에 나타난 것과 동일하므로 생략하였다.
결론적으로 본 발명에 의하면, 마이코박테리아rpoB유전자의 일부분(157bp)만으로 종 구별 및 약제내성탐지를 동시에 신속, 정확, 대량으로 할 수 있어, 임상적으로 결핵 환자에게 적절한 약물 치료를 할 수 있도록 유용한 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 마이코박테리아 감염초기에 마이코박테리아 감염환자에게 올바른 항생제 투여 및 관리를 제공할 수 있다.

Claims (30)

  1. 마이코박테리아rpoB유전자(157bp)의 종-특이 DNA 서열로 구성되는 종 구별 프로브, 마이코박테리아rpoB유전자(157bp)의 변형된 하나 이상의 코돈으로 구성되는 마이코박테리아 약제내성탐지 프로브 및 상기 약제내성탐지 프로브의 변형된 코돈에 대응하는 야생형 코돈으로 구성되는 대조군 프로브를 함유하는 올리고뉴클레오티드칩과,
    상기 올리고뉴클레오티드칩과 검체의 혼성화반응(hybridization)을 탐지하는 표지수단을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 종 구별 프로브는, 서열번호 5 내지 서열번호 12를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 마이코박테리아 약제내성탐지 프로브는,rpoB유전자의 507 - 533 코돈에서 발견되는 변형된 하나 이상의 코돈으로 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 약제내성탐지 프로브는,
    리팜핀(rifampin)내성탐지 프로브인 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리팜핀내성탐지 프로브는,
    변형된 511, 513, 516, 518, 522, 526, 531 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 리팜핀내성탐지 프로브는, 서열번호 20 내지 서열번호 36을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 리팜핀내성탐지 프로브는,
    변형된 509, 533, 524 코돈을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 리팜핀내성탐지 프로브는, 서열번호 41 내지 서열번호 46를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  9. 제3항 또한 제4항에 있어서, 상기 약제내성탐지 프로브는,
    리파부틴(rifabutin) 감수성탐지 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 리파부틴감수성탐지 프로브는,
    변형된 516, 526 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리파부틴감수성탐지 프로브는, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 31 내지 서열번호 36을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 칩은,
    아민기로 변형된rpoB유전자 일부로 구성된 각 프로브와, 글래스에 유도된 알데히드의 시프염기반응에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 검체의 DNA를 증폭시킬 수 있는 증폭수단을 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 증폭수단은,
    rpoB유전자 분절(157bp)을 특이적으로 증폭시키는 바이오틴-TR-8 및 TR-9 프라이머(서열번호 37 및 38)를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  15. 제13항에 있어서, 상기 증폭수단은,
    rpoB유전자 분절(157bp)을 특이적으로 증폭시키는 바이오틴-DGR8 및 DGR9 프라이머(서열번호 47 및 48)를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  16. 제13항에 있어서, 상기 표지수단은,
    상기 바이오틴-바인딩 프로테인을 포함하는 형광물질인 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-R-피코에리스린(streptavidin-R-phycoerythrin)인 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  18. 제13항에 있어서, 상기 표지수단은,
    연쇄중합효소반응에 첨가되는 시아닌 5-dUTP인 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 각각의 프로브는 스페이서(spacer)로 T10을 5'에 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드칩은, 결핵균여부를 탐지할 수 있는 결핵균군 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지 위한 진단키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 결핵균군 프로브는 서열번호 1 내지 서열번호 4 프로브를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트.
  22. 마이코박테리아rpoB유전자의 종-특이 DNA 서열로 구성되는 종 구별 프로브, 마이코박테리아rpoB유전자의 변형된 하나 이상의 코돈으로 구성되는 마이코박테리아 약제내성탐지 프로브 및 상기 약제내성탐지 프로브의 변형된 코돈에 대응하는 야생형 코돈으로 구성되는 대조군 프로브 각각을 아민기로 변형시키는 제1단계와;
    글래스 위에 알데히드기를 유도시키는 제2단계와;
    상기 변형된 각각의 프로브를 시프염기반응(Schiff base reaction)에 의해 상기 글래스에 고정시켜 올리고뉴클레오티드칩을 만드는 제3단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 제3단계에서 고정으로 형성되는 이민결합(imine bond)을 NaBH4로 환원하는 단계를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성탐지를 위한 진단키트의 제조방법.
  24. 마이코박테리움 속 균종의rpoB유전자 분절(157bp)을 특이적으로 증폭시키는 서열번호 47 및 서열번호 48의 염기서열을 갖는 프라이머쌍.
  25. 제24항의 프라이머쌍을 이용하여 검체의rpoB유전자 분절을 PCR로 증폭시킨 다음, 제1항에 의한 진단키트를 이용하여 특정 종에 해당하는 프로브의 형광정도로 판별하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 PCR은 반응온도(annealing temperature)를 64-65℃로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 PCR은 반응주기를 38-42로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지방법.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 PCR은 프라이머 농도를 50-100pmol로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지방법.
  29. 제25항에 있어서, 표지수단으로 상기 PCR시 시아닌 5-dUTP를 첨가하는 단계를 더 포함하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 검체는 미배양된 환자의 객담, 혈액 또는 뇌척수액인 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 종 구별 및 약제내성 탐지방법.
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