CN110819726A - 检测分枝杆菌的方法及其套组 - Google Patents
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Abstract
提供一种检测分枝杆菌的方法，包含下列步骤：提供样本；提供引子对，其是选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约45％至约99％相似度的序列、与SEQ ID NO:2具约60％至约99％相似度的序列、SEQ ID NO:1的互补链以及SEQ ID NO:2的互补链所组成的群；提供探针，其是选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％相似度的序列及SEQ ID NO:3的互补链所组成的群；利用引子对、探针与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物；以及分析产物以检测分枝杆菌的存在。还提供一种检测分枝杆菌的套组，包含前述引子对与探针。
Description
技术领域
本发明是关于一种检测方法及其套组，特别是一种检测分枝杆菌的方法及其套组。
背景技术
分枝杆菌可分为结核分枝杆菌群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)和非结核分枝杆菌群。结核病的一些致病原是属于结核分枝杆菌群(MTBC)的细菌，例如M.africanum、M.bovis、M.caprae、M.canettii、M.microti、M.pinnipedii以及M.tuberculosis。这些致病原会造成人类或动物的结核病，其中又以M.africanum、M.bovis以及M.tuberculosis为临床上人类肺结核病的主要菌种。
结核病可发生在任何器官或组织，例如肺脏、淋巴结、脑膜、胸膜、肾脏、骨骼、皮肤、消化道及泌尿生殖道等等。若在早期给予适当的抗结核药物治疗，结核病几乎可以百分之百痊愈。但若没有在早期时予以治疗，在三年内约有一半的致死率。所以目前极需一种检测方法能够在临床上早期检测出是否受到结核分枝杆菌群的病原的感染，其对于疾病治愈率的提升非常重要。
发明内容
本发明的一实施例为一种检测分枝杆菌的方法，包含下列步骤：提供一样本；提供一引子对，引子对选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约45％至约99％相似度的序列、与SEQ ID NO:2具约60％至约99％相似度的序列、SEQ ID NO:1的互补链以及SEQ ID NO:2的互补链所组成的群；提供一探针，探针选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ IDNO:3具约70％至约99％相似度的序列及SEQ ID NO:3的互补链所组成的群。利用引子对、探针与样本进行聚合酶连锁反应(Polymerase chain reaction,PCR)以获得产物。最后，分析产物以检测分枝杆菌的存在。
根据本发明的一些实施方式，步骤「提供样本」包含：提供检体包含结核分枝杆菌群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)。
根据本发明的一些实施方式，检体为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便或其组合。
根据本发明的一些实施方式，利用引子对、探针与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物步骤，包含进行聚合酶连锁反应使得引子对增幅结核分枝杆菌群中IS6110序列的部分序列以获得产物，其中此部分序列为SEQ ID NO:4。
根据本发明的一些实施方式，利用引子对、探针与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物步骤，聚合酶连锁反应为实时定量聚合酶连锁反应(Real-time polymerase chainreaction，real-time PCR)。
本发明的另一实施例为一种检测分枝杆菌的套组，包含引子对与探针。上述引子对选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约45％至约99％相似度的序列、与SEQ ID NO:2具约60％至约99％相似度的序列、SEQ ID NO:1的互补链以及SEQ ID NO:2的互补链所组成的群。探针选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％相似度的序列及SEQ ID NO:3的互补链所组成的群。
根据本发明的一些实施方式，引子对为SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。
根据本发明的一些实施方式，探针为SEQ ID NO:3。
根据本发明的一些实施方式，检测分枝杆菌的套组还包含检体，其中检体为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便或其组合。
根据本发明的一些实施方式，检测分枝杆菌的套组还包含目标基因，其中目标基因为结核分枝杆菌群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)的IS6110序列。
根据本发明的一些实施方式，检测分枝杆菌的套组还包含模板，具有约100个碱基对至约250个碱基对的长度。
根据本发明的一些实施方式，模板为SEQ ID NO:4。
附图说明
图1是根据本发明一些实施方式示出的IS6110序列的部分片段、引子对及探针设计的位置。
图2是根据本发明一些实施方式，测试在不同模板量的情形下，以引子对SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:2进行实时定量聚合酶连锁反应的增幅曲线图。
图3是依据图2示出的其不同模板起始量的标准曲线图。
图4是根据本发明一些实施方式，在模板量为10拷贝数时，以引子对SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2进行实时定量聚合酶连锁反应的增幅曲线图。
图5是根据本发明一些实施方式，在SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的基础上而衍生的相似引子对，其进行实时定量聚合酶连锁反应的增幅曲线图。
图6是根据本发明一些实施方式，以引子对SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2进行检测的电泳结果图。
具体实施方式
请结合附图阅读以下详细描述，将可更容易理解本公开内容的实施方式。但须注意依照本产业的标准做法，各种特征未按照比例绘制。事实上，各种特征的尺寸为了清楚的讨论而可被任意放大或缩小。
为使本公开内容的叙述更加详尽与完备，下文针对本发明的实施方式与具体实施例作出说明性的描述，但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。以下所公开的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其它的实施例，而无须进一步的记载或说明。在以下描述中，将详细叙述许多特定细节，以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，也可在无这些特定细节的情况下实践本发明的实施例。
在本文中，除非内文中对于冠词有所特别限定，否则『一』与『该』可泛指单一个或多个。将进一步理解的是，本文中所使用的『包含』、『包括』、『具有』及相似词汇，指明其所记载的特征、区域、整数、步骤、操作、组件和/或组件，但不排除其它的特征、区域、整数、步骤、操作、组件、组件、和/或其中的群。
本发明的实施例提供一种检测分枝杆菌的方法，包含下列步骤：提供样本、提供引子对及提供探针。引子对选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约45％至约99％相似度的序列、与SEQ ID NO:2具约60％至约99％相似度的序列、SEQ ID NO:1的互补链以及SEQ ID NO:2的互补链所组成的群。探针选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％相似度的序列及SEQ ID NO:3的互补链所组成的群。接着，利用前述引子对、探针与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物。最后，分析产物以检测分枝杆菌的存在。
样本可包含各种不同来源的检体，例如血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便或其组合。在一些实施方式中，检测分枝杆菌的方法中所提供的检体包含结核分枝杆菌群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)。
引子对的选择如前文所述，并不限于本文所公开的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。引子对在选择上除了可包含SEQ ID NO:1的互补链及SEQ ID NO:2的互补链之外，SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:2所示的序列也可容许某种程度的变异。也就是说，与SEQ ID NO:1具约45％至约99％相似度的序列以及与SEQ ID NO:2具约60％至约99％相似度的序列应用于本实施方式中也有相同的技术效果。举例而言，引子对的选择可包含SEQ ID NO:1的简并序列及SEQ ID NO:2的简并序列。此处所述的「简并序列」是指本文所公开的寡核苷酸序列中部分核苷酸被其它核苷酸所取代。换言之，SEQ ID NO:1的简并序列意味着在SEQ ID NO:1序列长度不变的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约55％的变异程度。而SEQ ID NO:2的简并序列意味着在SEQ ID NO:2序列长度不变的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约40％的变异程度。在另一些实施例中，引子对的选择也可包含SEQ ID NO:1的衍生序列及SEQ ID NO:2的衍生序列。此处所述「衍生序列」是指本文所公开的寡核苷酸序列中在3’端或5’端可进行修饰，并且仍保留部分或全部序列。换言之，SEQ ID NO:1的衍生序列意味着在SEQ ID NO:1序列长度可进行增减的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约55％的变异程度。而SEQ ID NO:2的衍生序列意味着在SEQ ID NO:2序列长度可进行增减的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约40％的变异程度。在另一些实施方式中，引子对选自与SEQ ID NO:1具约80％至约99％相似度的序列以及与SEQ ID NO:2具约80％至约99％相似度的序列所组成的群。
探针的选择如前文所述，并不限于本文所公开的SEQ ID NO:3。探针在选择上除了可包含SEQ ID NO:3的互补链之外，SEQ ID NO:3所示的序列也可容许某种程度的变异。也就是说，与SEQ ID NO:3具约70％至约99％相似度的序列应用于本实施方式中也有相同的技术效果。举例而言，探针的选择可包含SEQ ID NO:3的简并序列。SEQ ID NO:3的简并序列意味着在SEQ ID NO:3序列长度不变的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约30％的变异程度。在另一些实施例中，探针的选择也可包含SEQ ID NO:3的衍生序列。SEQ ID NO:3的衍生序列意味着在SEQ ID NO:3序列长度在3’端或5’端进行增减的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约30％的变异程度。在另一些实施方式中，探针选自与SEQ ID NO:3具约80％至约99％相似度的序列。
在一实施方式中，利用引子对、探针与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物，包含进行聚合酶连锁反应使得引子对增幅结核分枝杆菌群中IS6110序列的部分序列以获得产物，其中此部分序列为SEQ ID NO:4。聚合酶连锁反应为一种分子生物学技术。利用具有寡核苷酸序列的引子对扩增特定的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)片段。应理解的是，本文所公开的序列可用于各种以聚合酶连锁反应为基础的技术。在一实施例中，聚合酶连锁反应可包含但不限于实时定量聚合酶连锁反应(real-time PCR)。在一实施例中，若采用的实时聚合酶连锁反应为探针型的荧光系统，利用引子对与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物之前，还包含使用探针对样本进行杂合反应(hybridization)，使得探针黏合到目标序列上。也即，引子对、探针与样本一同进行一聚合酶连锁反应以获得一产物。
本发明的实施例也提供一种检测分枝杆菌的套组(kit)，包含一引子对与一探针。上述引子对选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约45％至约99％相似度的序列、与SEQ ID NO:2具约60％至约99％相似度的序列、SEQ ID NO:1的互补链以及SEQID NO:2的互补链所组成的群。在一些实施方式中，引子对为SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。在一些实施方式中，引子对为与SEQ ID NO:1具约45％至约99％相似度的序列及与SEQ IDNO:2具约60％至约99％相似度的序列。在一些实施方式中，引子对为SEQ ID NO:1的互补链及SEQ ID NO:2的互补链。上述探针选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％相似度的序列及SEQ ID NO:3的互补链所组成的群。在一些实施方式中，探针为SEQ IDNO:3。在一些实施方式中，探针为与SEQ ID NO:3具约70％至约99％相似度的序列。在一些实施方式中，引子对为SEQ ID NO:3的互补链。
在某些实施方式中，检测分枝杆菌的套组可进一步包含检体。检体的来源可为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便或其组合。举例来说，此检测分枝杆菌的套组可应用于各医疗单位，通过采集个体(例如：人)的体液或排泄物进行检测。
在一些实施方式中，检测分枝杆菌的套组可进一步包含目标基因，并且此目标基因是指结核分枝杆菌群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)的IS6110序列。还有一些实施方式，检测分枝杆菌的套组可进一步包含模板，具有约100个碱基对至约250个碱基对的长度。举例来说，此模板可为IS6110序列中的部分序列，例如SEQ ID NO:4所示的序列，具有141个碱基对的长度。但在另一些实施方式中，模板不包含SEQ ID NO:4所示的序列，且为具有约100个碱基对至约250个碱基对的长度的人工合成序列，其也可与本实施方式中的引子对黏合从而被增幅。在一些实施方式中，可直接将SEQ ID NO:4所示的序列构筑至不同载体中，并且，以此带有SEQ ID NO:4的载体作为模板进行扩增时，专一性高且检测效能极佳。
为进一步证实本发明的各种实施方式可用于检测分枝杆菌的存在，遂进行以下试验。应注意的是，下述实施例仅提供作为示范目的，而非限制本发明。
引子及探针设计
结核分枝杆菌群其IS6110序列具高度保留性。故本试验利用在线设计程序如primer 3及GenScript Real-time PCR Primer Design针对结核分枝杆菌群的IS6110序列(GenBank:LC005482)进行引子及探针的设计。
根据基因银行(GenBank)数据库提供关于Acession No.LC005482的信息，图1示出IS6110序列的部分正股序列。本试验中引子对为SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列是针对第929-949个碱基对的位置进行设计(如右箭号方框所示)。SEQID NO:2所示的核苷酸序列是针对第1048-1069个碱基对的位置进行设计(如左箭号方框所示)。而探针为SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列是针对位于第929个碱基对与第1069个碱基对之间的片段进行设计(如虚线方框所示)。据此，利用引子对SEQ ID NO:1-2可增幅的产物具有141碱基对的长度。
引子对的灵敏度分析
根据前述GenBank数据库编号LC005482所示的序列，将其选自于pUC57载体(Protech CO.,Ltd,GenBank:Y14837.1)，以获得带有IS6110序列的标准质体(以下简称为IS6110标准质体)。
依据市售实时定量聚合酶连锁反应套组(QuantiNova Probe PCR Kit,Qiagen)操作说明书，反应混合液包含模板(IS6110标准质体)、15μL的实时定量聚合酶连锁反应试剂(QuantiNova probe master mix)、浓度为1000nM的引子对(667nM的SEQ ID NO:1及333nM的SEQ ID NO:2)以及27nM的探针(SEQ ID NO:3)，配置成总体积为30μL的反应混合液。实时定量聚合酶连锁反应条件为95℃变性(denature)5秒，60℃黏合/扩增(annealing/amplification)10秒，并将反应混合液于实时定量聚合酶连锁反应器(CFX-96,BioRad)进行45个循环反应。
应说明的是，在此试验中是以不同的模板量进行实时定量聚合酶连锁反应，以测试引子对SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的灵敏度。依前述反应混合液的配方，制备八组不同模板量的反应混合液，分别带有101、102、103、104、105、106、107及108拷贝数(copies)的IS6110标准质体。先针对102、103、104、105、106、107及108拷贝数的组别进行如上述的实时定量聚合酶连锁反应，每组重复试验三次。参照图2至图3，其分别为实时定量聚合酶连锁反应后所得的增幅曲线图及标准曲线图。如图2所示，横轴为反应循环数(cycles)，纵轴为荧光强度(ΔRn)。由此增幅曲线图可知，102至108拷贝数的荧光值皆呈现上升的正趋势。如下表1所示，102、103、104、105、106、107及108拷贝数的Cq值(quantification cycle)分别为33.19、30.08、26.75、23.35、19.99、16.72及13.88。
表1
| 拷贝数 | 10<sup>2</sup> | 10<sup>3</sup> | 10<sup>4</sup> | 10<sup>5</sup> | 10<sup>6</sup> | 10<sup>7</sup> | 10<sup>8</sup> |
| Cq值 | 33.19 | 30.08 | 26.75 | 23.35 | 19.99 | 16.72 | 13.88 |
继续参照图3，即以图2所增幅的结果数值做成标准曲线图。横轴为模板拷贝数。纵轴为门槛循环数，即为Cq值。依据实时定量聚合酶连锁反应器(CFX-96,BioRad)所绘制的标准曲线，其具有可信度的动态范围(dynamic range)为相关系数(R2)大于0.98；增幅效率(E)介于90％至110％。前述增幅效率若低于90％，可能表示引子设计不良造成黏合效果差，故增幅效率较差。增幅效率若高于110％，可能表示引子有过多非专一性的黏合产生，造成增幅效率过高。如图3所示，根据前述102至108拷贝数的模板量在2图中的结果数值，可做出斜率为-3.265的直线，其相关系数为0.999以及增幅效率为102.414％。故引子对SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:2的灵敏度符合动态范围。
为了测试引子对与探针的组合的灵敏度检测极限，进一步选取101拷贝数以及5拷贝数的模板量进行实时定量聚合酶连锁反应，以引子对(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)与探针(SEQ ID NO:3)进行实时定量聚合酶连锁反应，分别重复20次试验。101拷贝数模板量的数据如图4所示，为实时定量聚合酶连锁反应后所得的增幅曲线图。横轴为反应循环数(cycles)，纵轴为相对荧光单位(relative fluorescence unit,RFU)。由此增幅曲线图可知，101拷贝数的荧光值皆呈现上升的正趋势。101拷贝数以及5拷贝数的增幅结果，将其数值汇总于下表2。
表2
由表2可知，当模板量为101拷贝数时，门槛阈值设定为40循环数(cut off＝40)，重复次数20次中未被检测出来，故阳性率为100％。而检测出来的20组重复组别其Cq值范围在34.85至36.99间，平均为36.23。当模板量为5拷贝数时，门槛阈值设定为40循环数(cutoff＝40)，重复次数20次中仅有一次未被检测出来(NA)，故阳性率为约95％。其余检测出来的19组重复组别其Cq值范围在34至37.7之间，平均为35.64。阳性率95％以上为信赖区间，故可知使用本试验的引子对与探针的组合，模板量的最低检测极限可达5拷贝数。
此外，为更进一步测试SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的专一性。本试验以SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:2所示的序列为基础，设计出相似的引子对。具体来说，此相似的引子对的正向引子为50％相似于SEQ ID NO:1，而反向引子为66％相似于SEQ ID NO:2。接着，以此相似的引子对进行实时定量聚合酶连锁反应。检测方式如前述所述，在此不多做赘述。参照图5，为利用相似引子对进行实时定量聚合酶连锁反应的增幅曲线图。由此增幅曲线图可知，102至108拷贝数的荧光值皆呈现上升的正趋势。根据图5的增幅结果，将其数值汇总于下表3。
表3
| 拷贝数 | 10<sup>2</sup> | 10<sup>3</sup> | 10<sup>4</sup> | 10<sup>5</sup> | 10<sup>6</sup> | 10<sup>7</sup> | 10<sup>8</sup> |
| Cq值 | 35.85 | 31.52 | 28.15 | 24.82 | 21.35 | 17.31 | 14.98 |
由表3可知，即使SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2具有某种程度的变异，当模板量低至102拷贝数时，Cq值仍保持在40循环数以下(即35.85)，仅略高于SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2检测相同模板量时所得的33.19。也就是说，在检测的灵敏度上并无太大差异。
再者，为更进一步测试探针SEQ ID NO:3的专一性。本试验以SEQ ID NO:3所示的序列为基础，设计出相似的探针。具体来说，此相似的探针为SEQ ID NO:5、且具有75％相似于SEQ ID NO:3。接着，以此相似的探针(SEQ ID NO:5)与引子对(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)、以及以探针(SEQ ID NO:3)与引子对(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)进行实时定量聚合酶连锁反应。检测方式如前述所述，在此不多做赘述。检测结果如下表4。
表4
由表4可知，当模板量为10拷贝数时，无论是探针(SEQ ID NO:3)或是相似的探针(SEQ ID NO:5)，门槛阈值设定为40循环数(cut off＝40)，重复次数8次中皆被检测出来，故阳性率为100％。因此，即使探针具有某种程度的变异，当模板量低至10拷贝数时，相似的探针识别到目标基因(SEQ ID NO:4的部分序列)的阳性率仍保持在100％。也就是说，在检测的灵敏度上并无差异。
临床测试(A)
本试验进一步用于临床上检测。临床检体为肺结核确诊病患的痰液。萃取结核病患的痰液的DNA。依据市售聚合酶连锁反应套组(Dr.Q Taq DNA polymerase,BioFuture)操作说明书，以0.2μM的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2为引子，结核病患的痰液DNA作为模板进行聚合酶连锁反应。PCR条件为95℃作用2分钟后，95℃变性5秒，60℃黏合/扩增10秒，进行25个循环反应。接着将聚合酶连锁反应后所得的产物以胶体电泳进行分析。如图6所示，栏1为分子量标示栏(marker ladder)。栏2示出前述确诊病患的痰液DNA经聚合酶连锁反应后所获得的增幅产物。栏3至栏5为对照组，示出未感染结核病的个体的痰液DNA经聚合酶连锁反应后所获得的产物。根据前述引子设计可知，增幅产物大小预期为141bp，而栏2的增幅产物为单一条带，并且大小位于200bp与100bp之间。也就是说，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2未有其它非专一的增幅产物产生，并且增幅产物大小也符合预期，可应用于临床检测上。
临床测试(B)
经前述验证SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2可应用临床检体之后，遂将SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2与市售的引子对套组进行比较。换言之，在此测试中，实施例为利用本实施方式的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2进行实时定量聚合酶连锁反应，而比较例为利用市售的引子对套组进行实时定量聚合酶连锁反应。如下表5所示，检体1、检体2以及检体3分别来自三个不同的结核病病患，而在Cq值方面，实施例为33.21至34.90，比较例为42.70至45.3。也就是说，利用实施例进行检测所需的循环数可少于比较例约7.8至12.09个循环。在相同模板量的情形下，实施例的灵敏度明显优于比较例。
表5
前文概述了数个实施例的特征以使得熟习该项技术者可更好地理解本公开的实施方式。熟悉该项技术者应了解，可容易地将本公开内容用作设计或修改用于实现相同目的和/或实现本文引入的实施例的相同优点的其它制程及结构的基础。熟悉该项技术者也应认识到，此类等效物构造不违背本公开内容的构思及范围，且可在不违背本公开内容的构思及范围的情况下由此作出各种变化、替代以及变更。
序列表
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<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 正向引子(Forward primer)
<400> 1
ctcggctagt gcattgtcat a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 反向引子(Reverse primer)
<400> 2
ctcgacctga aagacgttat cc 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 探针(Probe)
<400> 3
agtacacatc gatccggttc agcg 24
<210> 4
<211> 141
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌群(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 4
ctcggctagt gcattgtcat aggagcttcc gaccgctccg accgacggtt ggatgcctgc 60
ctcggcgagc cgctcgctga accggatcga tgtgtactga gatcccctat ccgtatggtg 120
gataacgtct ttcaggtcga g 141
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 探针(Probe)
<400> 5
tctcagtaca catcgatccg gt 22
Claims (12)
1.一种检测分枝杆菌的方法，包含下列步骤：
提供一样本；
提供一引子对，该引子对是选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约45％至约99％相似度的序列、与SEQ ID NO:2具约60％至约99％相似度的序列、SEQ ID NO:1的互补链以及SEQ ID NO:2的互补链所组成的群；
提供一探针，该探针是选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％相似度的序列及SEQ ID NO:3的互补链所组成的群；
利用该引子对、该探针与该样本进行一聚合酶连锁反应以获得一产物；以及
分析该产物以检测分枝杆菌的存在。
2.如权利要求1所述的检测分枝杆菌的方法，其中，提供该样本的步骤，包含提供一检体包含结核分枝杆菌群。
3.如权利要求2所述的检测分枝杆菌的方法，其中，该检体为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便或其组合。
4.如权利要求2所述的检测分枝杆菌的方法，其中，利用该引子对、该探针与该样本进行该聚合酶连锁反应以获得该产物的步骤，包含进行聚合酶连锁反应使得该引子对增幅该结核分枝杆菌群中IS6110序列的一部分序列以获得该产物，该部分序列为SEQ ID NO:4。
5.如权利要求1所述的检测分枝杆菌的方法，其中，利用该引子对、该探针与该样本进行该聚合酶连锁反应以获得该产物的步骤，该聚合酶连锁反应为实时定量聚合酶连锁反应。
6.一种检测分枝杆菌的套组，包含一引子对与一探针，该引子对是选自于由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约45％至约99％相似度的序列、与SEQ ID NO:2具约60％至约99％相似度的序列、SEQ ID NO:1的互补链以及SEQ ID NO:2的互补链所组成的群；该探针是选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％相似度的序列及SEQID NO:3的互补链所组成的群。
7.如权利要求6所述的检测分枝杆菌的套组，其中，该引子对为SEQ ID NO:1及SEQ IDNO:2。
8.如权利要求6所述的检测分枝杆菌的套组，其中，该探针为SEQ ID NO:3。
9.如权利要求6所述的检测分枝杆菌的套组，还包含一检体，其中，该检体为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便或其组合。
10.如权利要求6所述的检测分枝杆菌的套组，还包含一目标基因，其中，该目标基因为结核分枝杆菌群的IS6110序列。
11.如权利要求6所述的检测分枝杆菌的套组，还包含一模板，具有约100个碱基对至约250个碱基对的长度。
12.如权利要求11所述的检测分枝杆菌的套组，其中，该模板为SEQ ID NO:4。
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