JP6231925B2 - 腸内菌叢の老若判定方法及び菌群のスクリーニング方法 - Google Patents
腸内菌叢の老若判定方法及び菌群のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6231925B2 JP6231925B2 JP2014068360A JP2014068360A JP6231925B2 JP 6231925 B2 JP6231925 B2 JP 6231925B2 JP 2014068360 A JP2014068360 A JP 2014068360A JP 2014068360 A JP2014068360 A JP 2014068360A JP 6231925 B2 JP6231925 B2 JP 6231925B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- family
- age
- intestinal flora
- group
- young
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
前記判定工程では、前記菌群ごとの前記割合を独立変数とし、前記糞便検体を得た個体の年齢又は月齢に関する回帰分析によって回帰式を算出して解を求め、前記回帰式の解と予め定められた基準値とを比較して、前記解が前記基準値を超える場合には前記腸内菌叢を老齢タイプと判定し、前記解が前記基準値以下である場合には前記腸内菌叢を若齢タイプと判定する腸内菌叢の老若判定方法を提供する。
(b)Bifidobacteriaceae科
(c)Peptococcaceae科
(d)Enterococcaceae科
(e)Verrucomicrobiaceae科
(f)Catabacteriaceae科
(g)Clostridiaceae科
(h)Caulobacteraceae科
(i)Propionibacteriaceae科
(j)Enterobacteriaceae科
本開示は、また、前記判定工程では、前記回帰式として下記式(1)を算出し、下記式(1)の解yが0を超える場合には、前記腸内菌叢を老齢タイプと判定する判定方法とすることもできる。
前記腸内菌叢の老若判定方法は、前記判定工程の前に前記割合を測定する測定工程を有していてもよい。
本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法では、腸内菌叢について老齢タイプと若齢タイプのいずれであるかを判定する。図1は、本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法の一例を示すフローチャートである。腸内菌叢の老若判定方法には、少なくとも判定工程S12が含まれる。また、本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法では、判定工程S12の前に、後述する、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する特定の菌群の割合を測定する測定工程S11を有していてもよい。
以下、測定工程S11と判定工程S12について順に説明する。なお、本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法において、腸内細菌叢を構成する菌群の「菌」とは、細菌(bacteria)及び古細菌(archaea)を含み、かつ、真菌(fungi)を含まないものである。また、これは、後述する菌群のスクリーニング方法においても同様である。
糞便検体に含まれる菌のうち、上記(a)〜(j)の科に属する菌群に分類される菌の数は、公知手法を用いて求めることができ、その手法は特に限定されない。例えば、菌の分類については、リボソームを構成する小型のサブユニット(16S)に存在するRNAをコードする遺伝子(16SrRNA遺伝子)の塩基配列に基づき、各々の菌を、上記(a)〜(j)の科に属する各々の菌群又は、その他の菌群に分けることができる。また、糞便検体に含まれる各々の菌群の菌数の算出についても、例えば、糞便検体中に含まれる、各々の菌に由来する16SrRNA遺伝子のDNA量やコピー数を定量することにより行うこともできる。菌数の算出について、以下に例を挙げる。
糞便検体から得られるDNAの解析結果を、これらのデータベースに蓄積された菌群の塩基配列に対して相同性検索することにより、糞便検体に含まれる菌群を同定することができる。いずれかの菌群に同定された配列のうち、上記(a)〜(j)の科に属する菌群の16SrRNA遺伝子として同定された配列のコピー数を、上記(a)〜(j)の科に属する菌群の数とすることができる。
糞便検体に含まれる全ての菌の数の測定は、公知の手法を用いて求めることができ、その手法は特に限定されない。例えば、上述したシークエンサーを用いる方法においては、16SrRNA遺伝子の配列中、糞便検体に含まれる菌で共通の塩基配列部分に結合するプライマーを用いて16SrRNA遺伝子の配列を解読することにより、上記(a)〜(j)の科に属する菌群以外の菌の16SrRNA遺伝子のコピー数も算出することができる。このため、糞便検体に含まれる全菌数は、例えば、糞便検体で測定される全ての菌の16SrRNA遺伝子のコピー数の和としてもよい。また、顕微鏡等を用いて、糞便検体に含まれる菌を数えることによって、糞便検体に含まれる全ての菌の数を求めることもできる。本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法においては、測定工程S11に、16SrRNA遺伝子の塩基配列を解読する工程を有する方法が好ましい。なお、本工程S11に用いられる糞便検体は、採取後に培養操作が行われていない検体が望ましい。培養操作において、各々の菌の増殖率が異なることによって、採取時の糞便検体における各菌の割合が変化してしまうおそれがあるためである。
糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する上記(a)〜(j)の科に属する菌群の各々の割合とは、糞便検体に含まれる全菌数を「1」としたときの相対値である。従って、上記割合は、上記(a)〜(j)の科に属する菌群の各々に分類された菌の数と糞便検体に含まれる全菌数から求めることができる。また、上述したように、上記(a)〜(j)の科に属する菌群の16SrRNA遺伝子のコピー数と、糞便検体に含まれる全て菌の16SrRNA遺伝子のコピー数から上記割合を求めることもできる。なお、上記(a)〜(j)の科に属する菌群が検出されなかった場合には、その菌群の割合は0とする。
(b)Bifidobacteriaceae科
(c)Peptococcaceae科
(d)Enterococcaceae科
(e)Verrucomicrobiaceae科
(f)Catabacteriaceae科
(g)Clostridiaceae科
(h)Caulobacteraceae科
(i)Propionibacteriaceae科
(j)Enterobacteriaceae科
本開示に係る菌群のスクリーニング方法では、腸内菌叢に含まれる菌群のうち、腸内菌叢を老齢タイプ又は若齢タイプに判定するための老若判定マーカーとなる菌群を探索する。
図2は、本開示に係る菌群のスクリーニング方法の工程を示すフローチャートである。
このため、より効率的に老齢タイプと判定するためのマーカーを探索することができる。この点については、老齢タイプに該当した糞便検体から同定された菌群やその菌数を、若齢タイプを判定するためのマーカー検索において、リファレンスとして用いる場合も同様である。
本開示に係る物質のスクリーニング方法では、食餌や物質に含まれる腸内菌叢へ作用するものを探索する。図4は、本開示に係る物質のスクリーニング方法のフローチャートである。物質のスクリーニング方法には、少なくとも測定工程S31、相関算出工程S32及び物質同定工程S33が含まれる。なお、本開示に係る物質のスクリーニング方法において、腸内菌叢へ作用するものとは、例えば、腸内菌叢の老化を促進したり、あるいは抑制したりするなど、腸内菌叢のバランスを変化させるものである。
例えば、相関算出工程S32において相関係数r、χ2値又はUを算出するのであれば、本工程S33では、これらの数値に対応するp値に対して閾値を設定できる。例えば、閾値をp<0.05とする場合、前記p値がこれに該当すれば、閾値を満たすものとする。また、前記p値がこれに該当しなければ、閾値を満たさないものとする。
また、食餌又は物質の摂取後に、若齢タイプと判定するためのマーカーとされる菌群の上記割合が若齢タイプの範囲外へ変動し、その相関が閾値を満たす場合には、その食餌又は物質は、腸内菌叢の老齢タイプへの変化を促進するものとして同定される。
〔1〕腸内菌叢について老齢タイプと若齢タイプのいずれであるかを判定する方法であって、糞便検体に含まれる全て菌の数に対する(a)Lachnospiraceae科に属する菌群の割合に基づき前記腸内菌叢を判定する判定工程、を有する、腸内菌叢の老若判定方法。
〔2〕前記判定工程では、前記(a)Lachnospiraceae科に属する菌群の前記割合に加えて、下記(b)〜(j)の科に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の、前記糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する割合に基づき、前記腸内菌叢を判定する、上記〔1〕に記載の腸内菌叢の老若判定方法。
(b)Bifidobacteriaceae科
(c)Peptococcaceae科
(d)Enterococcaceae科
(e)Verrucomicrobiaceae科
(f)Catabacteriaceae科
(g)Clostridiaceae科
(h)Caulobacteraceae科
(i)Propionibacteriaceae科
(j)Enterobacteriaceae科
〔3〕前記判定工程では、前記菌群ごとの前記割合を独立変数とし、前記糞便検体を得た個体の年齢又は月齢に関する回帰分析によって回帰式を算出して、当該回帰式に基づき前記腸内菌叢を判定する、上記〔1〕又は〔2〕に記載の腸内菌叢の老若判定方法。
〔4〕前記判定工程では、前記回帰式の解と、予め定められた基準値と、を比較して、前記解が前記基準値を超える場合には前記腸内菌叢を老齢タイプと判定し、前記解が前記基準値以下である場合には前記腸内菌叢を若齢タイプと判定する、上記〔3〕に記載の腸内菌叢の老若判定方法。
〔5〕前記判定工程では、前記回帰式として下記式(1)を算出し、
下記式(1)の解yが0を超える場合には、前記腸内菌叢を老齢タイプと判定する、上記〔4〕に記載の腸内菌叢の老若判定方法。
〔6〕前記判定工程の前に前記割合を測定する測定工程を有する、上記〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の判定方法。
本実験例では、糞便検体に含まれる菌群について、老齢及び若齢の各々に特徴的な菌群の同定を試みた。
本実験例では、健常な174名(21〜104歳)の日本人から提供された糞便検体を用いた。この174名の内訳は、20歳代:9人、30歳代:45人、40歳代:21人、50歳代:13人、60歳代:5人、70歳代:10人、80歳代:46人、90歳代:19人、100歳以上:6人であり、平均年齢は61.7歳である。
本実験例では、先ず、糞便検体からのDNAの抽出を行った。約20mgの糞便検体に対して、450μlの抽出用溶液(100mM Tris/HCl、4mM EDTA、pH9.0)を加えて懸濁し、さらに、10%SDS溶液50μl、0.1mm径のガラスビーズ300mg、500μlのTE飽和フェノール(和光純薬)を加えて混合した。得られた懸濁液に対しては、FastPrep FP 100A(フナコシ社製)を用いてパワーレベル5で30秒の破砕処理を実施した後、14,000×gで5分間遠心して400μlの上清を得た。得られた上清に250μlのフェノール・クロロホルム溶液(和光純薬)を加えて混合し、14,000×gで5分間遠心した後、250μlの上清を回収した。回収した上清に、2−プロパノールを250μl加え、DNAを沈殿させ、200μlのTris−EDTAバッファー(pH8.0)に再度溶解させて、これをDNA溶液とした。
次に、上記DNA溶液に含まれる菌群のゲノムに対して核酸増幅反応を行った。下記表1〜表3に、本実験例で用いたプライマーの配列を示す。表1に示すプライマーセットは、16SrRNA遺伝子の第3〜4可変領域を増幅させるためのプライマーである。これらのプライマーについては、便宜的に第1プライマーセットとする。
複数の糞便検体に由来するPCR産物を同じ濃度で混合したものをMiseq v2 Reagent kit(イルミナ社製)に供し、Miseqにてシークエンス解析を実施した。
上記シークエンス解析により得られたペアエンド配列をfastq-join (version.1.1.2-301)(http://code.google.com/p/ea-utils/wiki/FastqJoin)にて、QIIMEソフトウェア(version 1.6.0)(http://qiime.org/)にて97%の相同性を有する配列ごとをOUT(Operational Taxonomy Unit)とした。各OUTの代表配列を下記データベースに対してBLAST検索することにより、腸内菌叢の構成を解析した。
データベース:Greengenes database 12_10
(http://greengenes.secondgenome.com/downloads/database/12_10)
上述した腸内菌叢の構成の解析の結果、個々の糞便検体について8295±2366の配列が得られた。本実験例では、この配列数を各糞便検体に含まれる全菌数とした。また、これらの配列のうち、個々の門又は科ごとの数を各々の門又は科に属する菌群の数とした。上記相同性検索の結果、表4及び表5に示す腸内菌叢構成が得られた。表4は、門レベルでの分類を示し、表5は、科レベルでの分類を示す。
本実験例では、上記実験例1で同定された各門又は各科に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各々の菌群の割合が、腸内菌叢を「老齢タイプ」と「若齢タイプ」のいずれかに判定する場合に有用であるか検討した。また、本実験例では、年齢が65歳以上の個体から得られた糞便検体を「老齢タイプ」とし、64歳以下の個体から得られた糞便検体を「若齢タイプ」とした。
本実験例では、糞便検体の上記2種類のタイプへの分類に際して、回帰式を用いた。本実験例では、表4及び表5に示す門又は科に属する菌群の上記割合を、各々、独立変数とし、糞便検体を得た174の個体の年齢を従属変数とし、最小二乗法により、単回帰式を算出した。即ち、本実験例における回帰分析の独立変数及び従属変数は、各々、「1」である。
表7に本実験例の結果を示す。表7は、Lachnospiraceae科、Bifidobacteriaceae科、Clostridiaceae科、Bacteroidaceae科及びEnterococcaceae科の、各々に属する菌群について、回帰式の解yと基準値に基づく「老齢タイプ」又は「若齢タイプ」への分類と、糞便検体を得た個体の実際の年齢(実年齢)と、を比較した結果を示す。また、正答率(%)とは、検体の分類結果と検体を得た個体の実年齢とが一致した検体数の、検体数全体に占める割合(%)を示す。さらに、検出率は、174の糞便検体のうち、各々の科に属する菌群が検出された検体の割合を示す。なお、各々の科に属する菌群が検出されなかった糞便検体については、「判定結果と実年齢が一致しない検体数」にカウントした。
上述した実験例2において、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対するLachnospiraceae科に属する菌群の割合に基づいて判定することにより、糞便検体を得た個体の腸内菌叢を「老齢タイプ」と「若齢タイプ」のいずれかに精度高く判定できることが明らかとなった。そこで、本実験例では、Lachnospiraceae科に属する菌群の上記割合と、他の科に属する菌群の上記割合と、を組み合わせることにより、腸内菌叢の判定の精度がより高められるか検証した。
パターンA:(a)Lachnospiraceae科、(b)Bifidobacteriaceae科
パターンB:(a)Lachnospiraceae科、(b)Bifidobacteriaceae科、(c)Peptococcaceae科
パターンC:(a)Lachnospiraceae科、(b)Bifidobacteriaceae科、(c)Peptococcaceae科、(d)Enterococcaceae科、(e)Verrucomicrobiaceae科
パターンD:(a)Lachnospiraceae科、(b)Bifidobacteriaceae科、(c)Peptococcaceae科、(d)Enterococcaceae科、(e)Verrucomicrobiaceae科、(f)Catabacteriaceae科、(g)Clostridiaceae科、(h)Caulobacteraceae科、(i)Propionibacteriaceae科、(j)Enterobacteriaceae科
本実験例では、糞便検体の分類に際して、実験例2と同様に、回帰式を用いた。回帰式については、各科に属する菌群の上記割合を独立変数とし、糞便検体を得た174の個体の年齢を従属変数として、最小二乗法により算出した。即ち、パターンAの独立変数は「2」であり、パターンBの独立変数は「3」であり、パターンCの独立変数は「5」であり、パターンDの独立変数は「10」である。
表9に本実験例の結果を示す。表9は、回帰式の解yと基準値に基づく「老齢タイプ」又は「若齢タイプ」への分類と、糞便検体を得た個体の実際の年齢(実年齢)と、を比較した結果を示す。また、正答率(%)とは、検体の分類結果と検体を得た個体の実年齢とが一致した検体数の、検体数全体に占める割合(%)を示す。
Claims (4)
- ヒトの腸内菌叢について加齢に伴い特定の菌群が増減している高齢集団に特徴的な腸内菌叢のタイプである老齢タイプと若齢集団に特徴的な腸内菌叢のタイプである若齢タイプのいずれであるかを判定する方法であって、
ヒトの糞便検体に含まれる全て菌の数に対する(a)Lachnospiraceae科に属する菌群の割合、および下記(b)〜(j)の科に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記ヒトの糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する割合に基づき前記腸内菌叢を判定する判定工程、を有し、
前記判定工程では、前記菌群ごとの前記割合を独立変数とし、前記糞便検体を得た個体の年齢又は月齢に関する回帰分析によって回帰式を算出して解を求め、前記回帰式の解と予め定められた基準値とを比較して、前記解が前記基準値を超える場合には前記腸内菌叢を老齢タイプと判定し、前記解が前記基準値以下である場合には前記腸内菌叢を若齢タイプと判定する、腸内菌叢の老若判定方法。
(b)Bifidobacteriaceae科
(c)Peptococcaceae科
(d)Enterococcaceae科
(e)Verrucomicrobiaceae科
(f)Catabacteriaceae科
(g)Clostridiaceae科
(h)Caulobacteraceae科
(i)Propionibacteriaceae科
(j)Enterobacteriaceae科 - 前記判定工程の前に前記割合を測定する測定工程を有する、請求項1または2に記載の腸内菌叢の老若判定方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の腸内菌叢の老若判定方法の結果に基づいて糞便検体を複数の群に分ける選別工程と、
選別された前記複数の群のうち少なくともいずれか一つの群の糞便検体に含まれる菌群を同定する菌群同定工程と、を有する、腸内菌叢の老若判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014068360A JP6231925B2 (ja) | 2014-03-28 | 2014-03-28 | 腸内菌叢の老若判定方法及び菌群のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014068360A JP6231925B2 (ja) | 2014-03-28 | 2014-03-28 | 腸内菌叢の老若判定方法及び菌群のスクリーニング方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015188380A JP2015188380A (ja) | 2015-11-02 |
JP6231925B2 true JP6231925B2 (ja) | 2017-11-15 |
Family
ID=54423458
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014068360A Active JP6231925B2 (ja) | 2014-03-28 | 2014-03-28 | 腸内菌叢の老若判定方法及び菌群のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6231925B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015188379A (ja) * | 2014-03-28 | 2015-11-02 | 森永乳業株式会社 | 腸内菌叢の老若判定方法及び菌群のスクリーニング方法 |
JP6751550B2 (ja) * | 2015-05-15 | 2020-09-09 | 森永乳業株式会社 | 腸内年齢の推定方法、および腸内年齢の推定装置 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050118234A1 (en) * | 2003-12-01 | 2005-06-02 | The Iams Company | Methods and kits related to administration of a fructooligosaccharide |
-
2014
- 2014-03-28 JP JP2014068360A patent/JP6231925B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2015188380A (ja) | 2015-11-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Links et al. | The chaperonin-60 universal target is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data | |
Kommadath et al. | Gene co-expression network analysis identifies porcine genes associated with variation in Salmonella shedding | |
Normann et al. | Intestinal microbial profiles in extremely preterm infants with and without necrotizing enterocolitis | |
Ong et al. | Species identification and profiling of complex microbial communities using shotgun Illumina sequencing of 16S rRNA amplicon sequences | |
Tanigawa et al. | Identification and typing of Lactococcus lactis by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry | |
JP2020513856A (ja) | 大腸癌の複合バイオマーカーを特定するための配列ベースの糞便微生物群調査データの活用 | |
US20180137243A1 (en) | Therapeutic Methods Using Metagenomic Data From Microbial Communities | |
Thorkildsen et al. | Dominant fecal microbiota in newly diagnosed untreated inflammatory bowel disease patients | |
Haddad et al. | Molecular differentiation of Mycobacterium bovis isolates. Review of main techniques and applications | |
Bender et al. | Quantification of variation and the impact of biomass in targeted 16S rRNA gene sequencing studies | |
Motiwala et al. | Current understanding of the genetic diversity of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis | |
Spies et al. | Biological cost in Mycobacterium tuberculosis with mutations in the rpsL, rrs, rpoB, and katG genes | |
CN107075446B (zh) | 用于肥胖症相关疾病的生物标记物 | |
CN112687337B (zh) | 超多重引物设计方法 | |
Grond et al. | No evidence for phylosymbiosis in western chipmunk species | |
CN110283903A (zh) | 用于诊断胰腺炎的肠道微生物菌群 | |
US20210340625A1 (en) | tRNA-DERIVED FRAGMENTS AS BIOMARKERS FOR PARKINSON'S DISEASE | |
KR20230141873A (ko) | 시퀀싱 공정 | |
LaFrentz et al. | Multiplex PCR for genotyping Flavobacterium columnare | |
Shirzad-Aski et al. | Molecular characterization of Pasteurella multocida isolates obtained from poultry, ruminant, cats and dogs using RAPD and REP-PCR analysis | |
JP6231925B2 (ja) | 腸内菌叢の老若判定方法及び菌群のスクリーニング方法 | |
Snyder et al. | Exploiting digital droplet PCR and next generation sequencing technologies to determine the relative abundance of individual Eimeria species in a DNA sample | |
del Rey et al. | Screening of virulence-associated genes as a molecular typing method for characterization of Streptococcus suis isolates recovered from wild boars and pigs | |
US20220084632A1 (en) | Clinical classfiers and genomic classifiers and uses thereof | |
Pankoke et al. | Evaluation of commercially available DNA extraction kits for the analysis of the broiler chicken cecal microbiota |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160519 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170418 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170615 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171003 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171020 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6231925 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |