CN108467902A - 一种快速检测牛鼻气管炎病毒的方法 - Google Patents

一种快速检测牛鼻气管炎病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测牛鼻气管炎病毒的方法。其包括，煮沸：将感染有牛鼻气管炎病毒的细胞及其培养液煮沸；检测：煮沸后，进行PCR检测定量测定牛鼻气管炎病毒含量。本发明在短时间内有效提取和检测牛鼻气管炎病毒，与传统提取检测方法比较，直接煮沸后检测，成本更低。本发明避免了常规检测柱提基因组过程中的误差，煮沸法提取模板省去了诸多繁琐的步骤，尤其适用于快速、高通量地检测牛鼻气管炎病毒。本发明检测所需样品微量(只需100uL含病毒培养液，不足100uL可用1640培养基补足至100uL)，方便科研工作中微量样品的提取与检测；更符合牛鼻气管炎病毒检测研究工作的需要。

Description

一种快速检测牛鼻气管炎病毒的方法
技术领域
本发明属于牛鼻气管炎病毒检测技术领域，具体涉及一种快速检测牛鼻气管炎病毒的方法。
背景技术
牛鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)是双链DNA病毒，疱疹病毒科成员，是牛的重要传染病病原；除能引起呼吸道疾病外,还可引起结膜炎、流产、脑炎和全身性感染。牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)已成为全球性疫病，给养牛业造成重大经济损失；因此建立一种低成本、快速、高通量检测该病毒的方法意义重大。
传统检测方法多采用试剂盒柱提法抽提样品中的牛传染性鼻气管炎病毒DNA，再设计特异性引物进行qPCR检测。用试剂盒裂解病毒获得基因组DNA操作过程繁琐、成本高、耗时较长、不适用于高通量检测；同时柱提基因组过程中由于柱子吸附效率的差异也会给后续实验带来误差；加之，在提取过程中酚氯仿等有机试剂也会对操作人员的健康产生不良影响。因此，整个牛鼻气管炎病毒检测过程急待改进。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种快速检测牛鼻气管炎病毒的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其包括，煮沸：将感染有牛鼻气管炎病毒的细胞及其培养液煮沸；检测：煮沸后，进行PCR检测定量测定牛鼻气管炎病毒含量。
作为本发明所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法的一种优选方案，其中：所述煮沸，时间为10～30min。
作为本发明所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法的一种优选方案，其中：所述煮沸，还包括，将经过煮沸的所述细胞离心、取上清液作为检测模板。
作为本发明所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法的一种优选方案，其中：所述离心，转速为10，000rpm，时间为5min。
作为本发明所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法的一种优选方案，其中：所述细胞，包括胎牛肾细胞。
作为本发明所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法的一种优选方案，其中：所述培养液，包括1640培养液。
作为本发明所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法的一种优选方案，其中：还包括，煮沸前用1640培养基稀释所述细胞，煮沸后用水稀释所述细胞。
作为本发明所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法的一种优选方案，其中：所述煮沸，体系为100uL。
作为本发明所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法的一种优选方案，其中：所述PCR检测，包括荧光定量PCR检测牛鼻气管炎病毒DNA含量。
作为本发明所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法的一种优选方案，其中：所述荧光定量PCR检测体系为10uL。
本发明的有益效果：本发明在短时间内有效提取和检测牛鼻气管炎病毒，与传统提取检测方法比较，直接煮沸后检测，成本更低。本发明用直接煮沸法提取牛鼻气管炎病毒基因组作为检测模板，操作简单，节约时间。本发明避免了传统检测方法提取过程中化学试剂对操作者的毒害，保护了科研工作者的身体健康，更加安全。本发明检测牛鼻气管炎病毒结果稳定、重复性强，能有效准确的检测细胞培养液中的牛鼻气管炎病毒。本发明避免了常规检测柱提基因组过程中的误差，煮沸法提取模板省去了诸多繁琐的步骤，尤其适用于快速、高通量地检测牛鼻气管炎病毒。本发明检测所需样品微量(只需100uL含病毒培养液，不足100uL可用1640培养基补足至100uL)，方便科研工作中微量样品的提取与检测；更符合牛鼻气管炎病毒检测研究工作的需要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明快速检测细胞培养液中牛鼻气管炎病毒的流程图。
图2为本发明方法荧光定量PCR标准曲线图。
图3为本发明方法荧光定量PCR标准曲线图。
图4为实施例4荧光实时定量PCR熔解曲线分析图。
图5为实施例1荧光实时定量PCR熔解曲线分析图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
煮沸法检测胎牛肾细胞(MDBK)细胞培养液1640中的牛鼻气管炎病毒：图1为本发明快速检测细胞培养液中牛鼻气管炎病毒的流程图。以96孔板为例演示了本发明方法检测牛鼻气管炎病毒的总体过程：先用移液器取100uL含牛鼻气管炎病毒的1640培养液于500uL离心管中，沸水浴10～30min，10，000rpm离心5min后分层，取上清作为荧光定量PCR检测的模板。
本发明煮沸法检测细胞培养液中牛鼻气管炎病毒的过程：按照常规方法培养MDBK细胞，细胞汇合度达到90％时，接种牛鼻气管炎病毒，待细胞完全脱落后取上清。上清用空白1640培养基进行3倍梯度稀释，共稀释五个梯度，编号为1-5。取各个稀释度含病毒细胞培养液100uL加入500uL离心管中，每个稀释度三个重复。沸水煮10min后，10，000rpm离心5min，直接取上清15uL置于一个新的干净的200uL离心管中，作为荧光定量PCR检测的模板。荧光定量PCR检测体系为10uL。
选用牛鼻气管炎病毒的gB基因设计特异性qPCR引物，产物长度为108bp，qPCR引物序列如下：
IBRVgE-qPCR-F：CGTGGTGGTGCCAGTTAG
IBRVgE-qPCR-R：TCATCGTCGCTGTCGTCAT
10uL的SYBR-Green荧光定量PCR反应体系为：5uLSYBR Green PCR MasterMix，上、下游引物各0.4uL，不同稀释度的模板2uL，ddH2O补足至10uL。反应条件为：95℃预变性30s，95℃10s，60℃30s，72℃20s，40个循环，溶解曲线分析条件为：95℃15s，60℃30s，95℃15s。
在荧光定量PCR仪上反应并实时检测，每个样品三个技术重复。对Ct值进行分析：在PCR体系相同时模板量越高，Ct值越低。并且Ct值与模板初始量的对数值呈线性关系，据此原理做出标准曲线(图2)，R2＝0.9927，相关性好。
将煮沸后的样品用水3倍梯度稀释，每个稀释度三个重复，每个样品取2uL进行荧光定量PCR检测，方法同上。随着起始模板浓度的降低，Ct值逐渐升高，且Ct值与模板浓度呈线性相关，R2＝0.9971(图3)，扩增效率为101.41％。说明通过煮沸法提取的牛鼻气管炎病毒基因组质量均一，满足实验需求。
将含病毒的培养液用空白1640培养基3倍稀释，共三个梯度，取各个稀释度含病毒细胞培养液100uL加入500uL离心管中；分别沸水煮10、15、20、25和30min，每个处理设置三个生物学重复；煮沸后样品与10，000rpm离心5min，取上清15uL至200uLEP管中，取2uL作为荧光定量PCR的模板。结果显示同一样品煮沸时间与为15、20、25、30min与煮沸10min检测结果比较差异均无统计学意义(P＞0.05)(表1)。该方法稳定，在煮沸时间为10～30min内，煮沸时间不影响检测结果。
表1不同浓度不同煮沸时间牛鼻气管炎病毒DNA检测结果
实施例2：
煮沸检测方法和柱提法分别提取和检测培养液中牛鼻气管炎病毒重复性比较：
以细胞培养液中牛鼻气管炎病毒为实验材料，分别通过本发明的煮沸检测法和传统的柱提法提取细胞培养液中牛鼻气管炎病毒DNA作为模板，荧光定量PCR检测。
煮沸法检测细胞培养液中牛鼻气管炎病毒的过程同上，取2种不同浓度的病毒各一管，每个浓度三个生物学重复。煮沸后离心取上清作为荧光定量PCR检测的模板。
同样两种浓度病毒，每个浓度三个生物学重复，采用天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)提取病毒基因组DNA。柱提取法提取过程参照天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)提取步骤：1)取20uLproteinK至1.5mLEP管中；2)取100uL上述含病毒培养液与100uL1640培养基混匀后(试剂盒提取样品的体积为200uL)加入到上述EP管中；3)加入200uLCarrier RNA工作液，盖上管盖，Vortex振荡15s混匀；4)56℃孵育15min，简短离心收集管壁上液体。加入250uL无水乙醇，Vortex振荡15s混匀后，室温放置5min，简短离心收集管壁上液体；5)将上述液体全部转移至吸附柱CR2中，8,000rpm离心1min，弃废液；6)打开吸附柱管盖，加入500uL溶液GD,，8,000rpm离心1min，弃废液；7)打开吸附柱管盖，加入500uL无水乙醇，8,000rpm离心1min，弃废液；8)，12,000rpm空离3min，晾干，将吸附柱放入新的RNase-Free离心管中，加入100uLRNase-Free ddH2O,室温放置5min，12,000rpm离心1min，得到基因组DNA。
10uL的SYBR-Green荧光定量PCR反应体系为：5uLSYBR Green PCR Master Mix，上、下游引物各0.4uL，不同浓度的模板2uL，ddH2O补足至10uL。反应条件为：95℃预变性30s，95℃10s，60℃30s，72℃20s，40个循环，溶解曲线分析条件为：95℃15s，60℃30s，95℃15s。
结果表明使用本发明中的方法检测牛鼻气管炎病毒变异系数更小，重复性比试剂盒重复性更好(表2、表3)。因为直接煮沸方法避免了柱提法中过柱子的步骤，减少操作过程造成的误差，结果更准确。
表2试剂盒提取不同浓度病毒PCR的Ct值
表3煮沸法检测不同浓度病毒PCR的Ct值
从上表可知，试剂盒检测两个样品的变异系数分别为2.2％和1.2％。煮沸法检测两个样品的变异系数分别为0.9％和0.71％。说明本发明中的方法检测牛鼻气管炎病毒变异系数更小，重复性比试剂盒重复性更好。
实施例3：
将实施例1中的1640培养基分别更换为常规培养基：DMEM培养基、F12培养基、L-15培养基，其余实验条件均与实施例1相同，荧光实时定量PCR熔解曲线分析图如图4所示。实验结果表明，选用DMEM培养基、F12培养基或L-15培养基，均无法得到正常的熔解曲线，熔解曲线均出现杂峰，说明扩增特异性差，即选用DMEM培养基、F12培养基或L-15培养基均无法检测出牛逼气管炎病毒DNA。而从图5可以看出，实施例1选用1640培养基荧光实时定量PCR的熔解曲线，实施例1的熔解曲线为单峰，说明扩增产物特异性好。
不同培养基营养成分配比如表4所示：
表4不同培养基营养成分配比
DMEM 1640 F12 L-15
半胱氨酸 0 0 35 120
蛋氨酸 30 15 4.5 75
色氨酸 16 5 2 20
精氨酸 84 200 211 500
胱氨酸 63 65 0 0
组氨酸 42 15 21 250
异亮氨酸 105 50 4 250
亮氨酸 105 50 13 125
赖氨酸 146 40 36.5 75
苯丙氨酸 66 15 5 125
苏氨酸 95 20 12 300
酪氨酸 104 29 7.8 300
缬氨酸 94 20 11.7 100
丙氨酸 0 0 8.9 225
天冬酰胺 0 50 15 250
天冬氨酸 0 20 13 0
谷氨酸 0 20 14.7 0
谷氨酰胺 584 300 146 300
甘氨酸 30 10 7.5 200
脯氨酸 0 20 34.5 0
丝氨酸 42 30 10.5 200
羟脯氨酸 0 20 0 0
半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸为培养基中对细胞培养影响较大的氨基酸，从上表可知，1640培养基中半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸含量的总和最低，同时，1640培养基中氨基酸总含量也最低，发明人推测，可能由于1640培养基的氨基酸含量较低，因此对于检测牛皮气管炎病毒的干扰较小，因此是使用1640培养基能够快速、准确的检测出牛皮气管炎病毒的可能的原因之一。
综上，本发明在短时间内有效提取和检测牛鼻气管炎病毒，与传统提取检测方法比较，直接煮沸后检测，成本更低。本发明用直接煮沸法提取牛鼻气管炎病毒基因组作为检测模板，操作简单，节约时间。本发明避免了传统检测方法提取过程中化学试剂对操作者的毒害，保护了科研工作者的身体健康，更加安全。本发明检测牛鼻气管炎病毒结果稳定、重复性强，能有效准确的检测细胞培养液中的牛鼻气管炎病毒。本发明避免了常规检测柱提基因组过程中的误差，煮沸法提取模板省去了诸多繁琐的步骤，尤其适用于快速、高通量地检测牛鼻气管炎病毒。本发明检测所需样品微量(只需100uL含病毒培养液，不足100uL可用1640培养基补足至100uL)，方便科研工作中微量样品的提取与检测；更符合牛鼻气管炎病毒检测研究工作的需要。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：包括，
煮沸：将感染有牛鼻气管炎病毒的细胞及其培养液煮沸；
检测：煮沸后，进行PCR检测定量测定牛鼻气管炎病毒含量。
2.如权利要求1所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述煮沸，时间为10～30min。
3.如权利要求1或2所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述煮沸，还包括，将经过煮沸的所述细胞离心、取上清液作为检测模板。
4.如权利要求3所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述离心，转速为10,000rpm，时间为5min。
5.如权利要求1、2或4任一所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述细胞，包括胎牛肾细胞。
6.如权利要求1、2或4任一所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述培养液，包括1640培养液。
7.如权利要求6所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：还包括，煮沸前用1640培养基稀释所述细胞，煮沸后用水稀释所述细胞。
8.如权利要求1、2、4或6任一所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述煮沸，体系为100uL。
9.如权利要求1、2、4或6任一所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述PCR检测，包括荧光定量PCR检测牛鼻气管炎病毒DNA含量。
10.如权利要求9所述的快速检测牛鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR检测体系为10uL。
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