CN102094062A - 一种细菌检测方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细菌检测方法，包括以下步骤：a、采样步骤：待测样本通过过滤器，样本中的细菌在过滤器内积累；计量通过过滤器的样本总体积；b、培养及检测步骤：将积累有细菌的过滤器放入培养液中，细菌被限制在过滤器内生长繁殖并产生代谢物，目标细菌产生的代谢物与培养液中的底物发生特异性反应；检测培养液的信息，得到被测样本中目标细菌的信息。本发明还提供了一种细菌检测装置。本发明具有采样方便、消除共存物干扰、检测结果准确等优点。

Description

一种细菌检测方法及装置

技术领域

本发明涉及样本检测，尤其是一种样本中细菌的检测方法及装置。

背景技术

地表水、地下水，甚至雨水中含有多种细菌。当水体受到人畜粪便、生活污水或某些工农业废水污染时，水体中的细菌大量增加。因此，对水的细菌学检验，特别是肠道细菌的检验，在卫生学上具有重要的意义。通过检验水体中特定种类的细菌数量，可以判断水体的卫生学质量。

在现有的水体细菌检测方法中，一般是将在现场采集的大体积水样带回实验室进行分析。该方式由于从采样到检测有一定的时间间隔，则若有效实现对水体细菌的检测，需要满足以下条件：常温条件下，水样从采样到检验不能超过2小时；若采用10摄氏度以下冷藏保存也不得超过6小时。这就需要采样以后及时将水样送至实验室进行检测，但由于水样的采样体积大，不方便运输及冷藏保存，这就给江河、湖库、泳池、景观场所的水体细菌日常监测带来很大不便。

在细菌实验室检测中，基于酶底物的培养检测法易于观察识别和实现自动化，在地表水、饮用水检测中被广泛采用。但被测水体中在含有目标细菌的同时往往还含有大量其他其他微生物，在对水体中的细菌进行培养的过程中，目标细菌和其他微生物将大量繁殖，使培养液的浊度发生显著变化。菌浊的增加将严重干扰光电检测仪器对酶底物的检测，从而影响水样细菌浓度检测结果的准确性。此外，被测水样中可能还会含有其他诸如抗生素、氧化剂等其他化学物质。在现有的方法中，不对水样进行分离处理，而直接进行培养检测，前述化学物质将抑制细菌的增殖，从而延长了细菌培养生长时间，最终影响水样细菌浓度检测结果的准确性。

发明内容

为解决现有技术中的上述不足，本发明提供了一种能够消除共存微生物干扰功能的细菌检测方法及装置。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种细菌检测方法，包括以下步骤：

a、采样步骤

待测样本通过过滤器，样本中的细菌在过滤器内积累；

计量通过过滤器的样本总体积；

b、培养及检测步骤

将积累有细菌的过滤器放入培养液中，细菌被限制在过滤器内生长繁殖并产生代谢物，目标细菌产生的代谢物与培养液中的底物发生特异性反应；

检测培养液的信息，得到被测样本中目标细菌的信息。

进一步，所述样本为水样。

作为优选，在现场进行步骤a，再将积累有细菌的过滤器带回实验室，再进行步骤b。

进一步，检测培养液中对目标细菌代谢物具有特异性的底物变化信息。

作为优选，在步骤b中，检测培养液的吸光度或透光度或荧光强度。

进一步，在步骤b中，根据检测得到的培养液的信息，判断样本中是否含有细菌；

或根据连续检测得到的培养液的信息随时间变化的关系，得出细菌的浓度。

本发明还提供了一种细菌检测装置，包括培养单元、检测单元和分析单元，其特点是：所述检测装置还包括过滤器；所述过滤器用于截留样本中的细菌；所述过滤器放置在培养单元中时，所述培养单元中的培养液和细菌代谢物能够透过所述过滤器。

进一步，所述样本为水样。

进一步，所述检测装置还包括驱动泵，以驱动样本进入过滤器。

进一步，所述检测装置还包括冷藏箱，对截留细菌后的过滤器冷藏。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、采样方便

在现场采用特殊设计的过滤器过滤水样，将大体积水样中的细菌富集在小体积的过滤器内，然后将积累有细菌的小体积过滤器在现场或带回实验室进行培养检测，从而解决了大体积水样运输及存储不便的问题；

2、消除水体基体干扰

通过特殊设计的过滤器过滤水样，将细菌与基体未知的水样分离，且截留后放入已知组分的培养液中培养，避免了原水样未知基体对细菌生长可能的干扰，从而提高了检测结果的准确性；

3、消除细菌生长形成的浊度干扰

细菌及其共存微生物被限制在过滤器内培养生长，仅培养液及细菌代谢物能够透过过滤器，避免了细菌繁殖形成的菌浊对光学法检测的干扰，从而提高了检测结果的准确性和可靠性；

4、方法分析过程简便，便于实现仪器化和自动化。

附图说明

图1为实施例1中采样时对应的装置结构示意图；

图2为实施例1中对细菌培养时对应的装置结构示意图；

图3为实施例1中对培养液进行检测时对应的装置结构示意图；

图4为实施例2中对细菌连续培养检测时对应的装置结构示意图；

图5为实施例3中采样时对应的装置结构示意图；

图6为实施例3中对细菌连续培养检测时对应的装置结构示意图。

具体实施方式

实施例1：

如图1、2、3所示，一种细菌检测装置，包括过滤器11、培养单元2、检测单元和分析单元4；

所述过滤器11包括过滤膜111和连接器112，所述过滤膜111为等效过滤孔径为0.2um的亲水性聚砜滤膜；

带有压力的样本(0.1～3bar)通过所述连接器112进入过滤器11，在压力的作用下滤液从过滤膜111的滤孔排出，而样本中的细菌被截留在过滤膜111的内壁上；所述过滤器11用于过滤积累被测样本中的细菌，本实施例中样本为水样；

所述培养单元2包括培养容器211和培养箱212，所述培养容器211用于容纳含有特异性反应底物的培养液；由于本实施例是对水体中的大肠杆菌进行检测，只要培养容器211对检测细菌光度信息时的光度信号不会产生影响即可；本实施例是检测培养液在420nm波长处的吸光度或者透光率，选用培养容器的材料为无色透明硼硅酸玻璃材料，该材料的截止波长为300nm左右，对420nm左右的光均是透明的；

所述培养箱212为可容纳所述培养容器211的用于调节和控制细菌培养条件的箱体，用于细菌培养过程的环境条件控制；

所述培养箱212也可以同时容纳检测单元，以使检测单元在培养箱内能够检测培养容器211内培养液的光度信息；

所述检测单元包括光发射模块311和光接收模块312；在测量时，光发射模块311和光接收模块312分别设置在培养容器211相对的两侧；由于本实施例是检测培养液在420nm波长处的吸光度或者透光率，则所述检测单元能够发射和检测420nm左右的光即可；

所述检测单元设置在培养单元2的外部，所述光发射模块311和光接收模块312处于光路相对的测量状态；当需要测量时，将培养容器211从培养箱212中拿出放入检测单元中光发射模块311和光接收模块312形成的测量光路中，对细菌培养过程中培养液的光度信息进行间断检测；

或将检测单元31及分析单元4放入培养箱212内，使光发射模块311和光接收模块312分别置于培养容器211相对的两侧，在细菌培养过程中，对培养液的光度信息进行间断或连续检测；

本实施例中，检测单元设置在培养单元2的外部；

分析单元4与光接收模块312相连，对光接收模块312传来的培养液的信号进行分析，并得出样本中的细菌信息。

本实施例还提供了一种细菌检测方法，采用本实施例的细菌检测装置，包括以下步骤：

a、采样步骤

在采样现场，直接将过滤器11连接至样本源上，本实施例样本源为水龙头；在水龙头自身压力(0.1～3bar)的驱动下，水样通过连接器112进入过滤器11并从过滤膜111的滤孔排出，水样中的细菌被截留在过滤膜111的内壁上并积累；

计量通过过滤器11的样本总体积；本实施例中，样本总体积为1L；

b、培养及检测步骤，具体如下：

b1、培养步骤

在现场，将积累有细菌的过滤器11放入培养容器211中的培养液中，所述培养液含有反应底物ONPG(Orthonitrophenyl β-D galactopyranoside)，目标细菌为总大肠菌群；所述反应底物ONPG对目标细菌代谢物具有特异性；

将培养箱212的温度调节至35.5℃，将内置过滤器11的培养容器211放入培养箱212内；

培养液通过过滤膜111的微孔进入到所述过滤器11内，将截流在过滤膜111内壁上的细菌浸润；细菌被限制在过滤器11内，在培养液的浸润下生长繁殖并产生代谢物，代谢物中包括分泌的特定酶：

部分细菌分泌的特定酶在过滤器11内特异性地将培养液中的反应底物分解，释放出特征指示物，该特征指示物通过过滤膜111上的微孔扩散至过滤器11外；

部分细菌分泌的特定酶也通过过滤膜111上的微孔扩散至过滤器11外，并将过滤器11外培养液中的反应底物分解，释放出特征指示物；

随着细菌的生长增殖，前述两部分特征指示物在培养液中逐步累积；

若被测水样中存在目标细菌即总大肠菌群，则在培养过程中该类细菌将分泌β-D半乳糖苷酶(β-D galactosidase)，该酶将特异性地切断ONPG分子并释放出ONP(Orhonitrophenyl)分子，导致ONP分子在培养液内累积；若被测水样中不存在总大肠菌群，则在培养过程中不释放出ONP分子；

b2、检测步骤

对细菌培养12小时后，将培养容器211从培养箱212内取出，放入检测单元的光发射模块311和光接收模块312形成的测量光路中，对细菌培养过程中培养液的光度信息进行间断检测；检测培养液在420nm波长处的吸光度或者透光率，分析单元4处理光接收模块312传来的信号，得出特征指示物ONP的浓度信息：

若最终培养液吸光度达到0.05Unit，表明被测水样中目标细菌即总大肠菌群的浓度高于1个/100mL，则可认为被测水样中存在目标细菌；若吸光度小于0.05Unit，表明被测水样中目标细菌即总大肠菌群的浓度低于1个/100mL，则可认为被测水样中不存在目标细菌。

采用本实施例的方法采样时，水体中的细菌共存微生物也被截留在过滤膜内壁上；则在进行培养步骤时，所有细菌被限制在过滤器内生长，共存微生物不会对过滤器外的培养液产生影响，而检测单元仅对过滤器外的培养液进行检测，消除了共生细菌繁殖形成的菌浊对光电检测的干扰，从而提高了检测结果的准确性。

实施例2

请参阅图4，一种细菌检测装置，与实施例1所述检测装置不同的是：本实施例检测装置还包括密封袋及冷藏箱，对采样后的过滤器12在运输过程中保存；

过滤膜121为等效过滤孔径为0.1um的亲水性特氟隆滤膜；

检测单元的光发射模块321能发射波长为365nm的光，光接收模块322能检测波长为450nm的光；培养容器221为无色透明聚碳酸酯材料，对检测单元的发射光和接收光透明；

在测量时，将培养容器221从培养箱212中取出放入设置在培养单元外的检测单元的测量光路中，对细菌培养过程中的培养液进行间断检测，或将检测单元和分析单元4放入培养箱212内，在细菌培养的过程中，对培养液的光度信息进行间断或连续检测；本实施例中，检测单元和分析单元4设置在培养箱212内。

本实施例还提供了一种细菌检测方法，与实施例1所述检测方法不同的是：

采用本实施例的细菌检测装置；

在步骤a中，在现场，样本中的细菌被截留在过滤膜121的内壁上并积累；

计量通过过滤器12的样本总体积；本实施例中，样本总体积为1.5L；

将截流细菌后的过滤器12装入密封袋内，并放入冷藏箱内(温度保持在4～10摄氏度内)保存，然后带回实验室；本实施例为水样；

在步骤b中，在实验室，将积累有细菌的过滤器12从冷藏箱内取出，并去除密封袋，放入培养容器221中的培养液中，本实施例中培养液含有反应底物MUG(4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖苷酸)，目标细菌为大肠杆菌；

将培养箱212的温度调节至35.5℃，将内置过滤器12的培养容器221放入培养箱212内；

培养液通过过滤膜121的微孔进入到所述过滤器12内，将截流在过滤膜121内壁上的细菌浸润；细菌被限制在过滤器12内，在培养液的浸润下生长繁殖并产生代谢物，代谢物中包括分泌的特定酶：

若被测样本中存在目标细菌即大肠杆菌，则在培养过程中该类细菌将分泌β-D-葡糖醛酸糖苷酶，该酶将特异性地切断MUG分子并释放出MU(4-甲基伞形酮)分子，导致MU分子在培养液内累积；若被测水样中不存在大肠杆菌，则在培养过程中不释放出MU分子；

同时，检测单元的光发射模块321和光接收模块322设置在培养箱212内培养容器221相对的两侧，实时检测培养液的荧光信息(激发波长为365nm，发射波长为450nm)，以获取特征指示物MU的浓度随时间的变化信息；

当培养液的荧光强度增大并达到设定的阈值0.01RF时培养结束，记录从开始培养至培养结束所消耗的时间，结合培养消耗时间与细菌浓度之间的关系式可推算出被测水样中目标细菌即大肠杆菌的浓度；培养消耗时间与细菌浓度之间的关系式可通过对一系列水样按前述方法与平板计数法对比获得。

采用本实施例的方法对细菌进行检测，不仅能够排除共生微生物对细菌检测的影响；且采用特殊设计的过滤器过滤样本，采集样本中的细菌，采集操作可以在检测取样点现场进行，并可将采集得到的样本中的细菌带回实验室进行培养及检测，从而解决了大体积样本运输和存储不便的问题。

实施例3

请参阅图5、图6，一种细菌检测装置，与实施例1所述的检测装置不同的是：所述检测装置还包括驱动泵5，所述驱动泵5将驱动样本进入过滤器11；

检测单元和分析单元4设置在培养箱内；光发射模块311和光接收模块312设置在培养箱212内培养容器211相对的两侧，能够发射和检测405nm波长的光。

本实施例还提供了一种细菌检测方法，与实施例1所述检测方法不同的是：

采用本实施例所述的细菌检测装置；

在步骤a中，从现场采集1.5L样本，并带回实验室对样本进行细菌截留累积操作：

采用驱动泵5驱动从现场采回的样本，使其进入过滤器11，样本中的细菌被截留在过滤膜111的内壁上并积累；本实施例中样本为水样；

在步骤b中，将培养箱212的温度调节至37℃，对细菌进行培养；本实施例中培养液含有反应底物Boc-le和u-Gly-Arp-p，目标细菌为凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌；

若样本中存在目标细菌即凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌，则在培养过程中该类细菌将分泌凝固酶，该酶将特异性地催化Boc-le和u-Gly-Arp-p反应，产生有色的对硝基苯胺(nitroa-niline，PNA)，导致PNA分子在培养液内累积；若被测水样中不存在凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌，则在培养过程中不释放出PNA分子；

检测单元的光发射模块311和光接收模块312设置在培养箱212内培养容器211相对的两侧，实时检测培养液在405nm波长处的吸光度或者透光率，分析单元4处理光接收模块传来的信号，从而获取特征指示物PNA分子的浓度信息；若最终培养液吸光度大于等于0.1Unit，则表明被测水样中存在目标细菌即凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌；若吸光度小于0.1Unit，则表明被测水样中不存在凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌。

实施例4

一种细菌检测装置，与实施例2所述检测装置不同的是：所述检测装置还包括驱动泵5，所述驱动泵5将驱动样本进入过滤器12。

本实施例还提供了一种细菌检测方法，与实施例2所述的检测方法不同的是：

采用本实施例所述的细菌检测装置；

在步骤a中，从现场采集2L样本，并带回实验室对样本进行细菌累积：

采用驱动泵5驱动从现场采回的样本，使其进入过滤器12，样本中的细菌被截留在过滤膜121的内壁上并积累；

在步骤b中，将培养箱212的温度调节至45℃，对细菌进行培养；本实施例中培养液含有反应底物MUGal(4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷酸)，目标细菌为粪大肠菌群；

若样本中存在目标细菌即粪大肠菌群，则在培养过程中该类细菌将分泌β-D-半乳糖苷酶，该酶将特异性地切断MUGal分子并释放出MU分子，导致MU分子在培养液内累积；若被测水样中不存在粪大肠菌群，则在培养过程中不释放出MU分子；

同时，检测单元的光发射模块321和光接收模块322设置在培养箱212内培养容器221相对的两侧，实时检测培养液的荧光信息(激发波长为365nm，发射波长为450nm)，以获取特征指示物MU的浓度随时间的变化信息；

当培养液的荧光强度增大并达到设定的阈值0.01RF时培养结束，记录从开始培养至培养结束所消耗的时间，结合培养消耗时间与细菌浓度之间的关系式可推算出被测水样中目标细菌即粪大肠杆菌的浓度；培养消耗时间与细菌浓度之间的关系式可通过对一系列水样按前述方法与平板计数法对比获得。

上述实施方式不应理解为对本发明保护范围的限制。本发明的关键是：在采样过程中将细菌截留在过滤器内膜上，在对细菌培养时，其共生微生物也被限制在过滤器内，而不会对培养液的信息产生影响，从而使检测得到的培养液的信息能够更准确地反应细菌存在的状况，使对细菌的检测更准确。在不脱离本发明精神的情况下，对本发明做出的任何形式的改变均应落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细菌检测方法，包括以下步骤：

a、采样步骤

待测样本通过过滤器，样本中的细菌在过滤器内积累；

计量通过过滤器的样本总体积；

b、培养及检测步骤

将积累有细菌的过滤器放入培养液中，细菌被限制在过滤器内生长繁殖并产生代谢物，目标细菌产生的代谢物与培养液中的底物发生特异性反应；

检测培养液的信息，得到被测样本中目标细菌的信息。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述样本为水样。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：在现场进行步骤a，再将积累有细菌的过滤器带回实验室，再进行步骤b。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：检测培养液中对目标细菌代谢物具有特异性的底物变化信息。

5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于：在步骤b中，检测培养液的吸光度或透光率或荧光强度。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：

在步骤b中，根据检测得到的培养液的信息，判断样本中是否含有细菌；

或根据连续检测得到的培养液的信息随时间变化的关系，得出细菌的浓度。

7.一种细菌检测装置，包括培养单元、检测单元和分析单元，其特征在于：所述检测装置还包括过滤器；所述过滤器用于截留样本中的细菌；所述过滤器放置在培养单元中时，所述培养单元中的培养液和细菌代谢物能够透过所述过滤器。

8.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于：所述样本为水样。

9.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于：所述检测装置还包括驱动泵，以驱动样本进入过滤器。

10.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于：所述检测装置还包括冷藏箱，对截留细菌后的过滤器冷藏。

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