JP3929057B2 - 発光強度解析方法及び装置 - Google Patents
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Description
(1) 画像データの採取。
(2) 輝度ヒストグラムの作成
採取された画像データは、図5に示すような、CCDの画素を単位として各画素の電荷量に基づく輝度ヒストグラムを作成する。輝度は、CCDの画素に蓄積された電荷をアナログ−デジタルコンバータ(以下、ADCと略す)によりデジタル変換することで得られ、8bitのADCを用いた場合は最大で256階調の輝度に分類することができる。複数の画素、例えば、2×2の4画素を1単位として輝度ヒストグラムを作成しても良い。
(3) 閾値による信号部の確定
後述の検量線を作成した際の、階調を閾値として、信号とバックグラウンドを分離し、信号部を確定する。
(4) 信号部の解析値の算定
信号部からの解析値(積分値、合計値等)を求める。
(5) 解析値と検量線とから濃度の算定
検量線と得られた信号部の解析値とから、試料の濃度を求める。
(6) 検量線の作成
6−1 標準試料の作成
定量対象発光物質標準液の一連の濃度系列を調製し、各濃度の試料を作成する。
6−2 標準試料の画像データの採取
各濃度の試料のCCDカメラ5による画像データを採取する。
6−3 輝度ヒストグラムの作成
採取した各標準試料の輝度ヒストグラムを作成する。
6−4 階調毎の信号部の確定
全ての階調を閾値として信号とバックグラウンドを分離し、階調毎の信号部を確定する。
6−5 階調毎の信号部の解析値の算定
階調毎の信号部のデータから解析値(積分値、合計値等)を求める。
6−6 濃度と解析値の相関関係の算定
得られた各階調の解析値と試料の濃度とを比較し、検量線の相関を調べ、閾値とした階調と試料の濃度との相関係数との関係を求める(図6参照)。最も濃度との相関が高い階調を閾値とする。
6−7 検量線の選定
もっとも濃度と相関の高い階調値の解析値から検量線を選定する。
(第1の実施例)
本実施例では、顕微鏡として、共焦点型の蛍光顕微鏡を用いた。また、発光物質を固定化する基材として、ポリカーボネート製の多孔性のメンブレンフィルター(例えば、Whatman社Nuclepore Membrane)を利用した。発光物質としてローダミン溶液を、フィルターホルダー(例えば、東洋濾紙株式会社KS−13)に装着した前記フィルターを通過させた。ローダミンはポリカーボネートフィルター表面に物理吸着した。ポリカーボネートフィルターは、15μm程度の膜厚を持っており、ローダミンは膜内に3次元的に吸着した。共焦点顕微鏡で観察すると、ポリカーボネートフィルターをスライスしながら、蛍光画像を取得することができる。
(第2の実施例)
測定用の基材が活性基を有する場合、定量対象物質を共有結合させて、測定を行うことができる。活性基による表面修飾メンブレン(例えば、日本ポール株式会社イムノダインABCメンブレン)を利用した場合、該メンブレン表面の活性基は、たんぱく質のアミノ基と反応し共有結合を形成する。定量対象物質として、Fluorescein−4−isothiocyanate(FITC)標識抗体をメンブレンに滴下する。濃度系列を調製し、一定時間反応させた後、ブロッキング試薬(例えば、ウシ血清アルブミン、カゼインなど)にて洗浄し、測定に用いる。該メンブレンは、光透過性ではないので、メンブレン表面からの蛍光発光を測定する。
2 試料
3 対物レンズ
4 接眼レンズ
5 CCDカメラ
6 CCD
7 CCDコントローラ
8 演算装置
9 表示装置
10 画像処理用コンピュータ
11 信号部
12 バックグラウンド部
13 垂直シフトレジスタ
14 水平シフトレジスタ
15 記憶装置
16 演算装置
17 表示装置
Claims (7)
- 多数の発光部と非発光部とが混在する試料の一部を切り出した測定画像を得る手段と、
前記測定画像の2次元の位置に対応する輝度を記録する輝度記録手段と、
該輝度記録手段に記憶した輝度をn階調にデジタル処理化するデジタル化手段と、
前記デジタル処理化された輝度を2次元の位置情報とともに記憶装置に記憶する第1の記憶手段と、
前記記憶装置に記憶された輝度情報を読み出し輝度ヒストグラムを形成する第1の演算手段と、第2の記憶手段に記憶された前記輝度ヒストグラムの閾値となる階調値(Grth)により発光部と非発光部とを分割し、発光部から解析値を演算する第2の演算手段と、第3の記憶手段に記憶された検量線と前記解析値とから濃度を演算する第3の演算手段とを有し、
前記閾値となる階調値(Grth)が、前記検量線を求めるための少なくとも3以上の既知の試料の濃度の各々の輝度ヒストグラムをn個のすべての階調値(Gr n=1 、 n )を用いて、第2の演算手段により階調値毎に演算した解析値と、前記既知の濃度と、の関係を第3の演算手段により相関係数として求めたもののうち、該相関係数がもっとも1に近い階調値であり、
前記閾値となる階調値(Grth)での解析値と前記既知の濃度との検量線を第3の記憶手段に記憶させたことを特徴とする発光強度解析装置。 - 前記解析値が、前記多数の発光部の積分値、合計値、であることを特徴とする請求項1に記載の発光強度解析装置。
- 前記多数の発光部と非発光部とが混在する試料の一部を切り出した測定画像を得る手段が顕微鏡であることを特徴とする請求項1に記載の発光強度解析装置。
- 前記顕微鏡が共焦点型の顕微鏡であることを特徴とする請求項3に記載の発光強度解析装置。
- 前記多数の発光部からの発光が、蛍光、燐光、化学発光または生物発光であることを特徴とする請求項1に記載の発光強度解析装置。
- 前記試料は、基材上に担持された発光物質を含む化合物質であることを特徴とする請求項1に記載の発光強度解析装置。
- 多数の発光部と非発光部とが混在する試料の一部を切り出して測定画像を得るステップと、
前記測定画像の2次元の位置に対応する輝度を記録するステップと、
前記記録された輝度をデジタル値に変換するステップと、
該デジタル値に変換された輝度を2次元の位置情報とともに記憶装置に記憶するステップと、
前記記憶装置に記憶された前記輝度情報を読み出すステップと、
前記輝度情報を輝度ヒストグラムに加工するステップと、
前記輝度ヒストグラムを予め決められた閾値となる階調値(Grth)により発光部と非発光部とに分割するステップと、
前記発光部から解析値を求めるステップと、
予め求めておいた検量線と前記解析値とから濃度を求めるステップとを有し、
前記閾値となる階調値(Grth)を、前記検量線を求めるための少なくとも3以上の既知の試料の濃度の各々の輝度ヒストグラムをn個のすべての階調値(Gr n=1 、 n )を用いて、階調値毎に演算した解析値と、前記既知の濃度と、の関係を相関係数として求めたもののうち、該相関係数がもっとも1に近い階調値とし、前記階調値(Grth)での解析値と濃度との関係を示す前記検量線を作成することを特徴とする発光強度解析方法。
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