CN117110270B - 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备，其中测定目标分子的浓度的方法包括：提供微孔；密封微孔以使每个微孔之间流体隔离；获得微孔总数；按预定时间间隔，获取第一荧光图片；获得至少两张第一荧光图片的微孔亮度总和；获取第一荧光图片的微孔亮度总和之间的至少一个差值或多个差值的平均值；以所述至少一个差值或多个差值的平均值除以所述微孔总数得到亮度值平均增长量，作为特征值；获得特征值对浓度的标准曲线；根据标准曲线测定目标分子的浓度。本发明的方法不需要判断每个微球是否连接有目标分子，简化了方法的复杂度，同时维持了高检测精确度。
Description
技术领域
本发明涉及测定生物样品中目标分子的浓度的方法，特别是极低浓度的目标分子的浓度的方法。本发明还涉及存储有执行该方法的指令的计算机可读介质以及相应的分析设备。
背景技术
能够测量来自生物样品的低丰度分析物对于包括临床诊断在内的数个领域都是非常重要的。许多蛋白和核酸诊断生物标记物以极低的浓度存在，这要求其分析方法具有非常低的检测极限。
然而，对于浓度在皮摩尔（pM）、飞摩尔（fM）、阿摩尔（aM）甚至介摩尔（zM）的目标分子而言，精确的浓度测定非常具有挑战性。已知的一种解决方案利用抗体标记微球，每个样品添加数千至数百万个微球来捕获样品中的目标分子，并以酶报告分子来标记目标分子。该方案将微球分散到空间上相互隔离的小孔中，并基于泊松分布来计算单个微球上的酶平均数量，该方案假设在低浓度下绝大多数微球上并不偶联酶分子（“off”球），所以利用偶联有酶分子的微球（“on”球）占所有微球的比例表征单个微球上的酶平均数量，这种算法也被称为数字算法。但在高浓度下，大多数微球上结合有多于1个酶分子，数字算法不再适用，因此转而通过计算包含偶联有酶分子的微球的小孔的平均荧光强度与单酶荧光强度的比值来表征单个微球上的酶平均数量，这种算法也被称为模拟算法。在实际应用中，将70%的“on”球作为阈值，低于70%时使用数字算法，高于70%时使用模拟算法。
然而，数字算法和模拟算法在70%或其他阈值时的平滑衔接依赖于分子在微球上的完美的泊松分布。泊松分布假定所有分子和微球都是相同的，分子在微球上随机结合，没有偏差，结合亲和力在浓度变化时仍保持不变，并且检测出来的强度均一。然而，这在现实情况中是无法实现的，实际情况中有各种因素会导致微球和分子的结合不是随机分布或检测信号不均一，包括但不限于，酶和底物浓度的均一性、小孔体积的均一性、各仪器之间的差别、激发光的不均匀性、成像质量的不均匀性等等。实际上，最近的报道已经证实了模拟算法和数字算法之间的不连续性。
有鉴于此，有必要克服现有技术中的缺陷提供一种新的浓度测定方法，使其在所有浓度范围上具有测定连续性。
发明内容
本发明的一个方面提供一种使用检测微球测定样品中目标分子的浓度的方法，包括以下步骤：（a）提供微孔，其中在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体-目标分子-报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂；（b）密封微孔以使每个微孔之间流体隔离；（c）获得至少一部分检测微球的微球图片，并对选定区域内包含微球的微孔进行计数，以获得微孔总数；（d）按预定时间间隔，获取对应第一荧光的N张第一荧光图片，N是大于等于2的整数；（e）对齐至少两张第一荧光图片与微球图片，获取所述选定区域内每个包含微球的微孔在所述至少两张第一荧光图片的每张中的微孔亮度值，并对每张第一荧光图片的所述微孔亮度值求和，获得每张第一荧光图片的微孔亮度总和；（f）获取所述至少两张第一荧光图片的微孔亮度总和之间的至少一个差值或多个差值的平均值；（g）以所述至少一个差值或所述多个差值的平均值，除以所述微孔总数，得到亮度值平均增长量，作为特征值；（h）获得特征值对浓度的标准曲线；和（i）根据所述标准曲线以及目标分子的特征值测定所述样品中的目标分子的浓度。
在一些实施方式中，在步骤（f）中：当N为偶数时，将第N张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第N/2张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第N-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N/2-1)张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第N/2+1张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片的微孔亮度值总和的第N/2差值。
在一些实施方式中，在步骤（f）中：当N为奇数时，将第N张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N+1)/2张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第N-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N+1)/2-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第(N+1)/2+1张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第2张第一荧光图片微孔亮度值总和的第(N-1)/2差值。
在一些实施方式中，在步骤（f）中：当N为奇数时，将第N-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N-1)/2张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第N-2张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N-1)/2-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第(N-1)/2+1张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片微孔亮度值总和的第(N-1)/2差值。
在一些实施方式中，其中步骤（a）包括对底物进行加热。例如，在一些实施方式中，将底物加热至30~40°C，并维持30分钟时间。
在一些实施方式中，在步骤（c）和/或（d）中，使用LED光源照射微孔，以获得相应的图片。例如，在一些实施方式中，其中LED光源的功率为0.1W~10W。
在一些实施方式中，步骤（a）中所述的提供微孔包括提供位于微流体装置的通道中的微孔。
在一些实施方式中，步骤（b）中所述密封包括使用油进行密封。
在一些实施方式中，步骤（d）进一步包括对第一荧光图片进行预处理以排除异常光斑。例如，在一些实施方式中，所述预处理包括基于深度学习的目标检测。
在一些实施方式中，在步骤（c）中，所述检测微球包含荧光染料，激发所述荧光染料以使检测微球发出第二荧光从而获得所述微球图片，所述第二荧光不同于所述第一荧光。
在一些实施方式中，在步骤（c）中，所述选定区域是微球图片的全部区域。
在一些实施方式中，在步骤（e）中，每个微孔的微孔亮度值是以9×9个像素显示的单个微孔的亮度值总和或是以9×9个像素显示的单个微孔的亮度均值。
在一些实施方式中，在步骤（e）之前，对第一荧光图片采用校正算法。例如，所述校正算法用以校正光学系统的中央视野和边缘视野之间像差所引入的微孔图像差异，获取更接近真实样品的荧光图像。例如，在一些实施方式中，所述校正算法包括：（i）对于图片的中央区域，获取每个微孔9×9像素的光强分布矩阵Ii（i为整数，对应于微孔编号），将Ii除以该矩阵最大元素值，获得归一化光强分布矩阵IIi，将区域内所有微孔的归一化光强分布矩阵IIi的所有元素取平均，获取Ia，以此作为每个微孔光强分布的校正矩阵；并且（ii）对于图片的边缘区域，获取每个微孔9×9像素的光强分布矩阵IIIj（j为整数，对应于微孔编号），获取每个9×9像素区域内的强度最大值，使用Ia校正矩阵乘以该强度最大值，作为每个微孔的准确光强分布，以此对所述边缘区域进行校正，获取新的图片作为第一荧光图片。
在一些实施方式中，在30~37℃之间的任一恒温条件下进行步骤（a）。
在一些实施方式中，在步骤（a）中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述第二配体不同于所述第一配体，并且步骤（a）包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；（iii）加入报告分子；（iv）加入底物；（v）将检测微球导入微孔中；其中步骤执行顺序为：i/ii/iii-iv-v或i/ii/iii/v-iv，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在一些实施方式中，在步骤（a）中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，并且步骤（a）包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；（iii）加入报告分子的所述第一部分；（iv）加入报告分子的所述第二部分；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中；其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在一些实施方式中，在步骤（a）中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述检测微球的表面修饰有第一亲和元件，第一配体偶联有第二亲和元件，所述第一配体通过第二亲和元件结合第一亲和元件，步骤（a）包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球；（iii）加入偶联有第二亲和元件的第一配体；（iv）加入报告分子；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中；其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在一些实施方式中，在步骤（a）中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，所述检测微球的表面修饰有第三亲和元件，第一配体偶联有第四亲和元件，所述第一配体通过第四亲和元件结合第三亲和元件，所述第三亲和元件和第四亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，并且步骤（a）包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球、偶联有第四亲和元件的第一配体，并且在第一、第二亲和元件与第三、第四亲和元件之间存在交叉反应可能时加入封闭剂，所述封闭剂封闭第三亲和元件，在进行下一步之前去除过量封闭剂；（iii）加入报告分子的所述第一部分；（iv）加入报告分子的所述第二部分；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中；其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在一些实施方式中，步骤（i）至（vi）的任何两个、三个、四个或全部步骤之间包括一个或多个洗涤步骤。
在一些实施方式中，第一配体和第二配体是抗目标分子的不同抗体。
在一些实施方式中，（a）所述第一亲和元件是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个；或者（b）所述第一亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。
在一些实施方式中，第一亲和元件与第二亲和元件的组合，以及第三亲和元件与第四亲和元件的组合，独立地选自：（a）生物素和链霉亲和素；和（b）生物素和亲和素。
在一些实施方式中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷。
在一些实施方式中，将检测微球导入微孔中的步骤包括：驱动微球反复经过微孔，增加微球的落孔几率。在一些实施方式中，将检测微球导入微孔中的步骤进一步包括在微孔下方设置磁体，通过磁力吸引微球落孔。
在一些实施方式中，在步骤（d）中，所述预定时间间隔为10秒至5分钟。
在一些实施方式中，在步骤（c）中，使用白光照射所述至少一部分检测微球以获得所述微球图片。
在一些实施方式中，所述目标分子的浓度为0.1 zM至100 pM。
在一些实施方式中，所述目标分子是蛋白质或核酸。
在一些实施方式中，所述微球是聚合物微球或磁珠。
在一些实施方式中，所述方法不包括单独对连接有目标分子的微球进行计数。
在一些实施方式中，所述目标分子包括多种类型，所述检测微球也包括对应的多种类型，并且所述报告分子也包括对应的多种类型。
本发明的另一个方面提供一种计算机可读介质，其上存储有计算机可读指令，所述计算机可读指令被执行时进行本发明所述的任一种方法。
本发明的另一个方面提供一种分析设备，其包括计算机控制系统和微流体设备，其中所述计算机控制系统包含本发明所述的计算机可读介质。
在一些实施方式中，所述微流体设备包含通道，所述通道包括复数个微孔，每个微孔用于容纳一个或多个检测微球。
在一些实施方式中，其中每个微孔的体积为1飞升至1皮升。
本发明提供的方法不需要判断每个微球是否连接有目标分子（即“激活”或“on”），简化了方法的复杂度，同时维持了高检测精确度。此外，本发明提供的方法在所有测定浓度范围内具有极佳的连续性，绝大多数数据CV在20%以下，解决了现有技术中在高浓度和低浓度分别使用模拟算法和数字算法而带来的数据不连续问题。此外，对于不同倍数浓度的样品，该算法所得的特征值在某些区间区分度更大，对于样品浓度分辨率更高，从而进一步提高检测灵敏度。
附图说明
本发明将参考附图进行更详细的描述。需要注意的是，图示的方案仅作为本发明实施方式的代表性示例，并且为更清楚地阐释示例性实施方式的细节，附图中的元件并非按实际尺寸等比例绘制，实际元件的数量可以变化，实际元件的相对位置关系与图示基本保持一致，并且某些元件并未示出。在存在多个实施例的情况下，当在之前实施例中已描述的一个或多个特征也可以适用于另一个实施例时，为简要起见，在后的一个或多个实施例不再赘述这些可重复适用的特征，该在后的一个或多个实施例应被理解为已描述了这些可重复适用的特征，除非另有说明。本领域技术人员在阅读本发明后将意识到，在一个图中显示的一个或多个特征可以与在另一个图中的一个或多个特征组合，以构建出一个或多个未在附图中具体示出的替代性实施方式，这些替代性实施方式也构成本发明的一部分。
图1是根据本发明的一个实施方式的方法的流程示意图。
图2显示本发明的一个实施例激发荧光染料获得的微球荧光图片及其局部示意图。
图3显示了在一个实施例中获得的多张第一荧光图片及荧光相减后的图片。
图4显示了根据一个实施例获得的特征值对浓度的标准曲线。
图5显示数字算法与本发明方法获得的特征值的CV值的比较。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的示例性实施方式。需要理解的是，本发明的范围不限于所公开的实施方式，本领域技术人员在阅读本发明公开的内容后，基于本发明的启示，可对这些示例性实施方式进行修改和变化，而无需付出创造性劳动，这些修改与变化意在被包含在所附权利要求书概括的范围内。
图1显示了根据本发明的方法的一个实施方式的流程示意图。方法100是一种测定目标分子的浓度的方法，该目标分子通常被包含在样品（例如生物样品）中。该方法用于检测样品中是否存在该目标分子，以及如果存在，以何种浓度存在该目标分子。因此，方法100可用于目标分子的定性和定量测定。目标分子可以是化学或生物学分子，包括但不限于蛋白质分子，例如细胞因子（如IL-12、IL-6等）或抗体（如PD-1抗体等）；以及核酸分子，例如DNA或RNA。其他合适的目标分子例如是抗原分子（如Aβ1-42）、基因片段或融合蛋白。生物样品可以是例如来源于人体或动物体的血液、血清、血浆、尿液、唾液、组织液或其他液体，也可以是来源于实验室的培养液、细胞或组织处理液（例如组织匀浆或细胞裂解液）。这些生物样品可能包含或不包含目标分子。
方法100开始于步骤102，其提供微孔，其中在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体-目标分子-报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂。
在步骤102中，提供微孔可通过提供微流体装置来实现，该微流体装置包括入口和出口以及流体连通入口和出口的通道。该通道可在其侧方或底部设置复数个微孔，例如数百至数万个微孔，每个微孔的尺寸可容纳一个或多个微球，因而将微球在空间上相互隔离。例如每个微孔的体积可为约1飞升至约1皮升。在本发明中，在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球。因此，一些微孔不含微球，而另一些微孔包含一个或多个微球。在包含微球的微孔中，该微球可能偶联有目标分子，也可能未偶联有目标分子。本发明的方法不涉及对偶联有目标分子的微球进行单独计数，如后详述。在其他实施方式中，每个微孔的尺寸仅可容纳一个微球，因而一些微孔不含微球，而另一些微孔仅包含一个微球。检测微球可以是本领域常用的任何微球，例如聚合物微球或磁珠。聚合物微球的例子可参见CN111318238 B中的复合微球。作为一个例子，该检测微球上偶联或编码有荧光染料，例如是CY5荧光染料。
在本发明中，在微孔中，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体-目标分子-报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂。第一配体例如是特异性结合目标分子的配体，例如抗目标分子的抗体，第一配体直接或间接偶联至检测微球的表面。在本发明中报告分子能够特异性结合所述目标分子，并且直接或间接地偶联有催化剂，所述催化剂能够催化底物发出第一荧光。例如，报告分子包含第二配体，其特异性结合至目标分子，第二配体例如是抗目标分子的抗体，其与第一配体结合目标分子的不同表位。因此，在第一配体、目标分子和报告分子（第二配体）之间就形成了“三明治”结构（或称夹心结构），其中目标分子被第一配体和报告分子夹在中间。
有多种形成所述三明治结构的方式。在一些实施方式中，报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述第二配体不同于所述第一配体，步骤102可包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；（iii）加入报告分子；（iv）加入底物；（v）将检测微球导入微孔中。对于上述步骤，其执行顺序可为i/ii/iii-iv-v或i/ii/iii/v-iv，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。例如，在顺序i/ii/iii-iv-v中，步骤（i）、（ii）和（iii）的顺序可任何调换，并在这三个步骤完成之后依次进行步骤（iv）和步骤（v）。
在另一些实施方式中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，步骤102可包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；（iii）加入报告分子的所述第一部分；（iv）加入报告分子的所述第二部分；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中。对于上述步骤，其执行顺序可为i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在另一些实施方式中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述检测微球的表面修饰有第一亲和元件，第一配体偶联有第二亲和元件，所述第一配体通过第二亲和元件结合第一亲和元件，步骤102可包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球；（iii）加入偶联有第二亲和元件的第一配体；（iv）加入报告分子；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中。对于上述步骤，其执行顺序可为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在另一些实施方式中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，所述检测微球的表面修饰有第三亲和元件，第一配体偶联有第四亲和元件，所述第一配体通过第四亲和元件结合第三亲和元件，所述第三亲和元件和第四亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，步骤102可包括：（i）提供可能包含目标分子的样品；（ii）加入检测微球、偶联有第四亲和元件的第一配体，并且在第一、第二亲和元件与第三、第四亲和元件之间存在交叉反应可能时加入封闭剂，所述封闭剂封闭第三亲和元件，在进行下一步之前去除过量封闭剂；（iii）加入报告分子的所述第一部分；（iv）加入报告分子的所述第二部分；（v）加入底物；（vi）将检测微球导入微孔中。对于上述步骤，其执行顺序可为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
在上述任何一个实施方式中，步骤（i）至（v）或步骤（i）至（vi）的任何两个、三个、四个或全部步骤之间包括一个或多个洗涤步骤。在一些实施方式中，可在步骤（i）至（v）或步骤（i）至（vi）的每个步骤之间进行一个或多个洗涤步骤。在一些实施方式中，可在步骤（i）至（v）或步骤（i）至（vi）中的其中两个步骤之间进行一个或多个洗涤步骤。洗涤步骤可通过导入与样品相溶的缓冲液（例如PBS或生理盐水）来洗涤微球和/或微孔，以去除与微球所偶联的配体非特异性结合或未与其结合的成分和/或非特异性结合或未结合的报告分子，以尽可能排除非特异性结合或目标分子之外的成分对测定造成的干扰。例如，在使用磁珠的情况下，可在磁珠与样品混合后通过施加磁场以固定磁珠（因而固定了与磁珠上的第一配体特异性结合的目标分子），通过导入PBS缓冲液以清除样品中未与磁珠上的配体特异性结合的成分（例如血浆中的非目标分子蛋白）。
在上述任何一个实施方式中，第一配体和第二配体可以是抗目标分子的不同抗体。例如在目标分子是IL-15分子时，第一配体是抗IL-15的第一抗体，第二配体是抗IL-15的第二抗体，第一抗体和第二抗体结合IL-15的不同表位。
在上述任何一个实施方式中，所述第一亲和元件可以是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个。在上述任何一个实施方式中，所述第一亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。在上述任何一个实施方式中，所述第三亲和元件可以是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第四亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个。在上述任何一个实施方式中，所述第三亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第四亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。在一个实施方式中，第一亲和元件与第二亲和元件的组合，以及第三亲和元件与第四亲和元件的组合，独立地选自：（a）生物素和链霉亲和素；和（b）生物素和亲和素。
在一些实施方式中，所述封闭剂是亲和素封闭剂，例如偶联生物素的牛血清白蛋白（BSA）或聚乙二醇（PEG）。在一些实施方式中，所述封闭剂是生物素封闭剂，例如偶联亲和素或链霉亲和素的BSA或PEG。
在步骤102中，所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷（CAS号：95079-19-9）。如前文所述，其他合适的催化剂和底物对包括催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是荧光素-二-β-D-吡喃半乳糖苷（FDG，CAS号：17817-20-8）或催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷（CAS号：6160-78-7）等等。
在存在目标分子的情况下，报告分子所连接的催化剂会催化底物以发出荧光。在一定的范围内，所连接的报告分子浓度越大（亦即目标分子的浓度越大），越多底物被催化，因而荧光的强度和/或亮度更大。当报告分子达到饱和浓度时，在底物过量的情况下，微球的荧光亮度达到最大值。在一个实施例中，由于微孔尺寸存在差异，为了保证均匀的底物浓度，鉴于底物保存在2-8℃条件，可能存在聚集现象，在使用之前将底物在30~40 °C（例如35至37 °C，例如35 °C、36 °C或37 °C）加热30分钟，确保底物充分溶解。
此外，在一些实施例中，考虑到同一试验的同一批次酶中，不同微孔的单个酶催化效率不一致，确保在30°C至37°C（例如30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C或37°C）任一恒温条件下进行酶催化反应。
在另一些实施例中，本发明致力于提高微球的落孔率，保证充分的采样基数，通过平均化，减轻单个酶差异引起的偏差。在一个例子中，将检测微球导入微孔中的步骤包括，通过外力推动（例如抽吸微球），驱动微球反复经过微孔，增加微球的落孔几率。在另一个例子中，通过所述外力驱动微球反复经过微孔，并且在微孔下方设置磁体。
在步骤104中，密封微孔以使每个微孔之间流体隔离。密封可包括对上述每个单独的微孔进行密封，从而流体隔离每个微孔，因此微孔中的缓冲液以及微球之间彼此隔离，以尽可能屏蔽微孔/微球之间荧光污染。在一些实施例中，密封可包括将密封油导入微流体装置中，密封油一方面清除通道中残留的微球和/或报告分子，另一方面因与微孔中的缓冲液不互溶而密封各个微孔。合适的密封油可以是矿物油、氟化油或硅油。
在方法100中，步骤106包括获得至少一部分检测微球的微球图片，并对选定区域内的包含微球的微孔进行计数，以获得微孔总数。在一个实施方式中，检测微球编码或偶联有荧光染料，荧光染料可被激发而发射荧光，通过例如荧光照相机可采集荧光信号而形成荧光图片，用于定位荧光微球，例如使用激光光源激发荧光染料（如CY5荧光染料），以获得微球荧光图片，并基于该荧光图片定位含有微球的每个微孔。在另一个实施例中，可使用LED光源激发荧光染料（如CY5荧光染料），以获得微球荧光图片，并基于该微球荧光图片定位每个微球。例如，该LED光源的功率可为0.1至10W，例如0.1至5W或1至5W，例如1W、2W、3W、4W或5W。此外，作为选择，可采用商用大数值孔径NA 0.28、消色差物镜。
在另一个实施方式中，检测微球不编码或偶联有荧光染料，使用白光照射微球，通过常规照相机以获得微球图片，并基于该微球图片定位含有微球的每个微孔。
在一些实施方式中，可将CY5荧光图片进行高斯模糊处理分析其轮廓，并获取每个微孔的坐标位置。在一些实施例中，对于CY5荧光图片的处理可通过计算机软件实现，例如OpenCV 2.0及以上。在本文中，为方便表述，在检测微球偶联或编码荧光染料的情况下，其被激发而发出的荧光称为第二荧光，而报告分子催化底物发出的荧光被称为第一荧光，所述第二荧光和第一荧光不同。
图2的A部分显示了通过以上方法获得的CY5荧光图片，该图片覆盖了所有微孔的80%至90%。在其他实施例中，可以使图片覆盖所有微孔的100%。在其他实施例中，可以使图片覆盖少于所有微孔的80%。图2的B部分是图2的A部分中虚线部分的局部放大图，一个白色亮点表示存在微球（亦即对应的微孔，下同），未显示亮点的位置表示对应微孔不存在微球。图2的C部分是图2的B部分的进一步局部放大图。
在本发明中，利用软件对微孔进行计数，而不论该微孔中的微球是否偶联有目标分子。在一些实施方式中，对微球图片（例如微球荧光图片）的整个区域的包含微球的微孔进行计数。在另一些实施方式中，对微球图片的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的区域的包含微球的微孔进行计数。
在步骤108中，按预定时间间隔，获取对应第一荧光的N张第一荧光图片，N是大于等于2的整数，例如是2至1000的整数。该时间间隔可以根据催化剂和底物的通常反应速率来确定，较慢的反应速率通常需要较长的时间，而较快的反应速率则需要较短的时间。在一些实施方式中，优选使用催化效率较高的催化剂，因而缩短整个测试过程。在一些实施方式中，预定的时间间隔可以是例如10秒至5分钟，例如30秒至3分钟，40秒至2分钟，50秒至90秒，或60秒至90秒。在优选的实施方式中，预定的时间间隔是30秒至90秒，例如30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒或90秒。在其他实施方式中，可以使用更长或更短的时间间隔。在本发明中，第一荧光图片的张数可以根据需要合理的确定。可以进行预实验来确定最符合需求的图片张数。通常会结合所述预定时间间隔来考虑图片张数，此外也会基于对应第一荧光的荧光增长曲线来设计荧光图片的张数。在一些实施方式中，本发明获取2至1000张第一荧光图片，例如100至1000张、500至1000张、10至100张、20至50张、50至100张、2至50张、2至20张、2至10张、5至10张、或更多或更少的第一荧光图片。在本发明的实施方式中，所获取的第一图片的张数可以是奇数，也可以是偶数，但优选是偶数。在一个具体的实施例中，在10分钟内以1分钟的时间间隔获得10张第一荧光图片。在一些实施方式中，步骤108可进一步包括对第一荧光图片进行预处理以排除异常光斑，例如因气泡、杂质等引起的异常光斑。所述预处理可包括基于深度学习的目标检测。
在一些实施例中，步骤106和108的顺序可以颠倒。例如方法进行步骤104后，首先进行步骤108，并在开始步骤110之前，进行步骤106。
在步骤110中，对齐至少两张第一荧光图片与微球图片，获取所述选定区域内每个包含微球的微孔在所述至少两张第一荧光图片的每张中的微孔亮度值并对每张第一荧光图片的所述微孔亮度值求和，获得每张第一荧光图片的微孔亮度总和。本领域技术人员可以理解，从所述微孔位置获得的微孔亮度值由微球所在的单个微孔内所有被催化的底物共同发出的荧光形成。
图3的A部分是单个微孔（亮点）的最大像素放大图。在图3的A部分中，单个微孔以9×9个像素显示。可以预期的是，使用不同分辨率的相机可使得单个微孔以更高或更低像素显示。在本发明的一个实施例中，对于单个微孔，以9×9个像素的亮度均值作为其荧光亮度。例如，对于图3的A部分所示的单个微孔，以9×9个像素的亮度值总和除以81以获得该单个微孔的亮度均值。以同样的方法可以获得图片中选定区域内的所有包含微球的微孔的亮度均值。例如，对于选定区域内所有包含微球的微孔，分别按上述方法求出每个包含微球的微孔的亮度均值，再将选定区域内所有包含微球的微孔的亮度均值求和并除以选定区域内所有包含微球的微孔的个数，作为选定区域内包含微球的微孔的平均亮度值。在本发明的另一些实施例中，对于单个微孔，以9×9个像素的亮度值总和作为其荧光亮度。在本发明的优选实施例中，该选定区域覆盖图片的整个区域。在其他实施例中，该选定区域可占据图片的整个区域的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多。在其他实施例中，该选定区域可占据图片的整个区域的少于50%、少于40%、少于30%或更少。
在优选的实施方式中，在步骤110之前，对于整幅第一荧光图片采用校正算法，以校正光学系统中央视野和边缘视野之间像差所引入的微孔图像差异，获取更接近真实样品的荧光图像。例如，所述校正算法可包括：（i） 选取第一荧光图片的中央区域，获取每个微孔9×9像素的光强分布矩阵Ii（i为整数，对应于微孔编号；矩阵大小为9×9），将Ii除以该矩阵最大元素值，获得归一化光强分布矩阵IIi，将区域内所有微孔的归一化光强分布矩阵IIi的所有元素取平均（即对所有归一化光强分布矩阵IIi的所有元素一起取平均），获取Ia（矩阵大小为9×9，矩阵元素均为前面取得的平均值），以此作为每个微孔光强分布的校正矩阵；以及（ii）对于第一荧光图片的边缘区域，获取每个微孔9×9像素的光强分布矩阵IIIj（j为整数，对应于微孔编号；矩阵大小为9×9），获取每个9×9像素区域内的强度最大值，使用Ia校正矩阵乘以该强度最大值，作为每个微孔的准确光强分布，以此对所述边缘区域进行校正，获取新的图片作为第一荧光图片。在一些实施例中，所述选定的中央区域可以是以中心坐标为圆心100×100个微孔的区域；在一些实施例中，所述选定的边缘区域可以是第一荧光图片中的四个边缘向中央延伸五分之一的区域。在一些实施例中，所述选定的中央区域可以是以中心坐标为圆心100×100个微孔的区域，并且所述选定的边缘区域可以是第一荧光图片中的四个边缘向中央延伸五分之一的区域。
此外，可采用商用高浓度固体荧光切片作为校正板，通过算法校正固体荧光切片图像，进一步校正照明光路存在的不均匀性。例如，算法校正步骤如下：首先适当调节照明光路的照明光强，获得高浓度固体荧光切片在照明光路下的未过曝荧光图片，获得该未过曝荧光图片的灰度矩阵I1；寻找灰度矩阵I1的最大灰度值MAXI1，以最大灰度值MAXI1除以灰度矩阵I1的每个元素值，获得一个新的矩阵I2，I2即为校正矩阵；对于每一幅第一荧光图片，点乘校正矩阵I2之后，即为校正均匀的第一荧光图片。
在一个实施例中，在步骤110中，需要注意的是，微球图片和至少两张第一荧光图片应对齐，以使得第一荧光图片中分析区域与微球图片的分析区域相同。在步骤110之后，每个微孔位置获得对应的多个荧光亮度值，每个荧光亮度值对应一张第一荧光图片，例如每个微孔位置可具有10个荧光亮度值。对于其中一些微孔位置，每个荧光亮度值相同或基本相同，对于其他一些微孔位置，每个荧光亮度值不同并且随着时间增加。对于不同微孔位置，随时间增加的荧光亮度值的幅度相同或不同。
在步骤110中，对至少两张第一荧光图片的所有包含微球的微孔的荧光亮度值求和，获得每张第一荧光图片的微孔亮度总和。微球亮度总和可以通过将每个包含微球的微孔的荧光亮度值相加而获得。
在步骤112中，获取第一荧光图片的微球亮度总和之间的至少一个差值或在N大于2时获得第一荧光图片的微球亮度总和之间的多个差值的平均值。当N为偶数时，将第N张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第N/2张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第N-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N/2-1)张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第N/2+1张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片的微孔亮度值总和的第N/2差值。例如，当步骤108采集了10（N=10）张第一荧光图片时，在步骤110中，对于每个包含微球的微孔，将第10、9、8、7、6张图片的微孔亮度值总和分别减去第5、4、3、2、1张图片的微孔亮度值总和，以获得5个差值。上述图片按采集的时间顺序进行编号。图3的B部分显示了在一个实施例中获得的第5张图片，图3的C部分显示了在同一个实施例中获得的第10张图片，两张图片具有相同的视野，并且均显示了数百个包含微球的微孔。图3的D部分显示将图3的C部分的图片与图3的B部分的图片相减后得到的图片，图3的D部分中的微孔亮度值总和即为第10张图片的微孔亮度值总和减去第5张图片的微孔亮度值总和而获得的第一差值。
当N为奇数时，可将第N张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N+1)/2张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第N-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N+1)/2-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第(N+1)/2+1张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第2张第一荧光图片微孔亮度值总和的第(N-1)/2差值。例如，在步骤108采集了11（N=11）张第一荧光图片时，在步骤110中，将第11、10、9、8、7张图片的微孔亮度值总和分别减去第6、5、4、3、2张图片的微孔亮度值总和，以获得5个差值。上述图片按采集的时间顺序进行编号。在其他的实施方式中，可使用更多或更少数量的第一荧光图片进行步骤110。
或者当N为奇数时，可将第N-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N-1)/2张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第N-2张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N-1)/2-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第(N-1)/2+1张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片微孔亮度值总和的第(N-1)/2差值。例如，在步骤108采集了11（N=11）张第一荧光图片时，在步骤110中，将第10、9、8、7、6张图片的微孔亮度值总和分别减去第5、4、3、2、1张图片的微孔亮度值总和，以获得5个差值。
随后在步骤114中以步骤112获得的至少一个差值，或在获得多于一个差值时以多个差值的平均值，除以步骤106获得的微孔总数，得到亮度值平均增长量，作为特征值。
在其他实施例中，也可以仅对至少两张第一荧光图片中的局部区域进行每个包含微球的微孔位置的亮度值计算，例如可仅对第一荧光图片中的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的区域进行每个包含微球的微孔位置的亮度值计算。但需要注意的是，这种情况下步骤112获得的差值或差值平均值需要除以对应局部区域在微球图片中所计数的微孔总数，以获得特征值。例如，当以微球图片中的50%的区域进行每个包含微球的微孔位置的亮度值计算以获得对应图片的微孔亮度总和，并基于此在步骤112中获得差值，该差值或差值的平均值应除以微球图片中对应50%区域的计数的微孔总数以获得特征值。
在步骤116中，获得上述特征值对浓度的标准曲线。该标准曲线可以预先以已知浓度的目标分子或其他分子按照步骤102至114所述的方法建立。
在获得标准曲线后，进行步骤118，根据所述标准曲线以及目标分子的特征值测定所述样品中的目标分子的浓度。在一些实施方式中，目标分子的浓度在样品中处于极低水平，例如0.1 zM至100 pM，例如1 zM至100 fM，甚至更低。
根据方法100所述的方法，以6种不同浓度的Aβ1-42分子样品建立标准曲线，特征值和浓度如下表1所示。
表1. Aβ1-42项目测试结果（标曲6个浓度，单位pg/mL，每个复孔8个）
/>
。
表2. 该标准曲线的特征值的评价
。
标准曲线以6个逐渐递增的浓度，每个浓度设置8个复孔，以蛋白质分子（如Aβ1-42）作为目标分子来建立。在上述实施例中，标准曲线的数据变异系数（CV），除浓度为0的组（S0）外，均在15%以下。在上述实施例中，相邻的两个浓度有明显的区分度，比值在1.5以上。图4显示了根据该实施例获得的特征值对浓度的标准曲线。可见，特征值和浓度成正比，浓度越大，特征值也越大。此外，该方法建立的标准曲线中特征值的范围更大，增加了信号响应的灵敏度；并且在高浓度和低浓度下具有良好的连续性。
在另一个实施例中，使用不同浓度的样品测试了本发明提供的特征值算法。结果如表3所示。
表3. 不同浓度样品的本发明方法测试
。
从表3的结果可以看出，本发明方法特征值重复性好，本发明方法特征值CV在25%以内，其中后三个浓度样品的特征值CV均在15%以内。
图5基于一些测试数据（未列出）显示数字算法与本发明方法获得的特征值的CV之间的关系散点图。从散点图可以看出，对于血样（A部分）和校准品（B部分）测试结果，数字算法特征值CV与本发明方法特征值CV接近。两种算法特征值CV散点大部分位于<20%的区域内。对于极少数CV>20%的散点，本发明方法获得的特征值的CV优于数字算法获得的特征值的CV。
在一些实施方式中，本发明的方法可同时分析样品中可能存在的两种或两种以上不同类型的目标分子，例如IL-12和IL-10。在这样的实施方式中，该方法可使用对应于不同类型目标分子的不同类型的微球及不同类型的荧光染料，以及不同类型的报告分子和不同类型的底物与酶组合，经由不同的荧光通道识别各个微球和报道分子。制备两种不同的荧光编码微球的方法可参见CN 111218498 A。
本发明的另一个方面提供计算机可读介质，其上存储有计算机可读指令，所述计算机可读指令被执行时进行本发明以上所述的任何一种方法。该计算机可读介质可以包括作为包括磁盘（包括软盘）、光盘（包括CD-ROM（光盘只读存储器）和DVD（数字通用光盘））、磁光盘（包括MD（小型盘））或半导体存储器的封装介质的可移除介质。
本发明的另一个方面提供一种分析设备，其包括计算机控制系统和微流体设备，其中所述计算机控制系统包含本发明的计算机可读介质。
在一个实施例中，所述微流体设备包含通道，所述通道包括复数个微孔，每个微孔用于容纳至多一个微球。在一些实施方式中，每个微孔的体积为1飞升至1皮升。所述分析设备被配置以执行本发明所述的任何一种方法。
以上所述皆为本发明实施方式的代表性示例，且仅为说明性目的提供。本发明预期在一个实施方式中使用的一个或多个技术特征，在不违背实施方式的目的的情况下，可以添加至另一个实施方式中，以形成改进或替代的实施方式。同理，在一个实施方式中使用的一个或多个技术特征，在不违背实施方式的目的的情况下可以被省略或替代，以形成替代的或简化的实施方式。此外，在一个实施方式中使用的一个或多个技术特征，在不违背实施方式的目的的情况下，可与另一个实施方式中的一个或多个技术特征组合，以形成改进的或替代的实施方式。本发明意在包括所有以上改进的、替代的、简化的技术方案。
Claims (38)
1.一种使用检测微球测定样品中目标分子的浓度的方法，包括以下步骤：
（a）提供微孔，其中每个微孔的体积为1飞升至1皮升，其中在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体-目标分子-报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂；
（b）密封微孔以使每个微孔之间流体隔离；
（c）获得至少一部分检测微球的微球图片，并对选定区域内包含微球的微孔进行计数，以获得微孔总数；
（d）按预定时间间隔，获取对应第一荧光的N张第一荧光图片，N是大于等于2的整数；
（e）对齐至少两张第一荧光图片与微球图片，获取所述选定区域内每个包含微球的微孔在所述至少两张第一荧光图片的每张中的微孔亮度值，并对每张第一荧光图片的所述微孔亮度值求和，获得每张第一荧光图片的微孔亮度总和；
（f）获取所述至少两张第一荧光图片的微孔亮度总和之间的至少一个差值或多个差值的平均值；
（g）以所述至少一个差值或所述多个差值的平均值，除以所述微孔总数，得到亮度值平均增长量，作为特征值；
（h）获得特征值对浓度的标准曲线；和
（i）根据所述标准曲线以及目标分子的特征值测定所述样品中的目标分子的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（f）中：
（1）当N为偶数时，将第N张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第N/2张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第N-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N/2-1)张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第N/2+1张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片的微孔亮度值总和的第N/2差值；
（2）当N为奇数时，将第N张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N+1)/2张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第N-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N+1)/2-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第(N+1)/2+1张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第2张第一荧光图片微孔亮度值总和的第(N-1)/2差值；或
（3）当N为奇数时，将第N-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N-1)/2张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第N-2张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第(N-1)/2-1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第(N-1)/2+1张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片微孔亮度值总和的第(N-1)/2差值。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（a）包括对底物进行加热。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将底物加热至30~40°C，并维持30分钟时间。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）和/或（d）中，使用LED光源照射微孔，以获得相应的图片。
6.根据权利要求5所述的方法，其中LED光源的功率为0.1W~10W。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（a）中所述提供微孔包括提供位于微流体装置的通道中的微孔。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b）中所述密封包括使用油进行密封。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（d）进一步包括对第一荧光图片进行预处理以排除异常光斑。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述预处理包括基于深度学习的目标检测。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）中，所述检测微球包含荧光染料，激发所述荧光染料以使检测微球发出第二荧光从而获得所述微球图片，所述第二荧光不同于所述第一荧光。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）中，所述选定区域是微球图片的全部区域。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（e）中，每个微孔的微孔亮度值是以9×9个像素显示的单个微孔的亮度值总和或是以9×9个像素显示的单个微孔的亮度均值。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（e）之前，对第一荧光图片采用校正算法。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述校正算法包括：
（i）对于图片的中央区域，获取每个微孔9×9像素的光强分布矩阵Ii，其中i为整数并且对应于微孔编号，将Ii除以该矩阵最大元素值，获得归一化光强分布矩阵IIi，将区域内所有微孔的归一化光强分布矩阵IIi的所有元素取平均，获取Ia，以此作为每个微孔光强分布的校正矩阵；并且
（ii）对于图片的边缘区域，获取每个微孔9×9像素的光强分布矩阵IIIj，j为整数并且对应于微孔编号，获取每个9×9像素区域内的强度最大值，使用Ia校正矩阵乘以该强度最大值，作为每个微孔的准确光强分布，以此对所述边缘区域进行校正，获取新的图片作为第一荧光图片。
16.根据权利要求1所述的方法，其中在30~37℃之间的任一恒温条件下进行步骤（a）。
17.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（a）中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述第二配体不同于所述第一配体，并且步骤（a）包括：
（i）提供可能包含目标分子的样品；
（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；
（iii）加入报告分子；
（iv）加入底物；
（v）将检测微球导入微孔中；
其中步骤执行顺序为：i/ii/iii-iv-v或i/ii/iii/v-iv，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
18.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（a）中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，并且步骤（a）包括：
（i）提供可能包含目标分子的样品；
（ii）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；
（iii）加入报告分子的所述第一部分；
（iv）加入报告分子的所述第二部分；
（v）加入底物；
（vi）将检测微球导入微孔中；
其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
19.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（a）中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述检测微球的表面修饰有第一亲和元件，第一配体偶联有第二亲和元件，所述第一配体通过第二亲和元件结合第一亲和元件，步骤（a）包括：
（i）提供可能包含目标分子的样品；
（ii）加入检测微球；
（iii）加入偶联有第二亲和元件的第一配体；
（iv）加入报告分子；
（v）加入底物；
（vi）将检测微球导入微孔中；
其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
20.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（a）中，所述报告分子由相互独立的第一部分和第二部分组成，所述第一部分包括与目标分子特异性结合的第二配体和第一亲和元件，所述第二部分包括第二亲和元件和所述催化剂，所述第一亲和元件和第二亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，所述第二配体不同于所述第一配体，所述检测微球的表面修饰有第三亲和元件，第一配体偶联有第四亲和元件，所述第一配体通过第四亲和元件结合第三亲和元件，所述第三亲和元件和第四亲和元件之间能够通过亲和作用连接在一起，并且步骤（a）包括：
（i）提供可能包含目标分子的样品；
（ii）加入检测微球、偶联有第四亲和元件的第一配体，并且在第一、第二亲和元件与第三、第四亲和元件之间存在交叉反应可能时加入封闭剂，所述封闭剂封闭第三亲和元件，在进行下一步之前去除过量封闭剂；
（iii）加入报告分子的所述第一部分；
（iv）加入报告分子的所述第二部分；
（v）加入底物；
（vi）将检测微球导入微孔中；
其中步骤执行顺序为：i/ii/iii/iv-v-vi或i/ii/iii/iv/vi-v，其中“/”表示其前后步骤可互换，“-”表示其前后步骤按所示顺序执行。
21.根据权利要求17所述的方法，其中步骤（i）至（v）的任何两个、三个、四个或全部步骤之间包括一个或多个洗涤步骤。
22.根据权利要求18、19或20任一项所述的方法，其中步骤（i）至（vi）的任何两个、三个、四个或全部步骤之间包括一个或多个洗涤步骤。
23.根据权利要求17、18、19或20任一项所述的方法，其中第一配体和第二配体是抗目标分子的不同抗体。
24.根据权利要求17或18任一项所述的方法，其中：
（a）所述第一亲和元件是生物素和链霉亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和链霉亲和素中的另一个；或者
（b）所述第一亲和元件是生物素和亲和素中的一个，所述第二亲和元件是生物素和亲和素中的另一个。
25.根据权利要求20所述的方法，其中第一亲和元件与第二亲和元件的组合，以及第三亲和元件与第四亲和元件的组合，独立地选自：
（a）生物素和链霉亲和素；和
（b）生物素和亲和素。
26.根据权利要求1、17、18、19或20任一项所述的方法，其中所述催化剂是β-半乳糖苷酶，所述底物是试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷。
27.根据权利要求17、18、19或20任一项所述的方法，其中将检测微球导入微孔中的步骤包括：驱动微球反复经过微孔，增加微球的落孔几率。
28.根据权利要求27所述的方法，其中将检测微球导入微孔中的步骤进一步包括在微孔下方设置磁体，通过磁力吸引微球落孔。
29.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（d）中，所述预定时间间隔为10秒至5分钟。
30.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）中，使用白光照射所述至少一部分检测微球以获得所述微球图片。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子的浓度为0.1 zM至100 pM。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子是蛋白质或核酸。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述微球是聚合物微球或磁珠。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括单独对连接有目标分子的微球进行计数。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子包括多种类型，所述检测微球也包括对应的多种类型，并且所述报告分子也包括对应的多种类型。
36.一种计算机可读介质，其上存储有计算机可读指令，所述计算机可读指令被执行时进行权利要求1至35任一项所述的方法。
37.一种分析设备，其包括计算机控制系统和微流体设备，其中所述计算机控制系统包含权利要求36所述的计算机可读介质。
38.根据权利要求37所述的分析设备，其中所述微流体设备包含通道，所述通道包括复数个微孔，每个微孔用于容纳一个或多个检测微球。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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