CN115836210A - 使用光学反应表征来自感兴趣区域的化验的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于表征来自多个感兴趣区域(ROI)的化验的系统和方法。该方法包括：从所述多个ROI接收所述化验的图像数据，所述图像数据包括用于每个ROI的至少两个颜色通道；确定每个ROI跨越颜色通道的信号变化的比率；使用校准曲线将每个孔的信号变化的所述比率转换成所述化验的浓度测量，所述校准曲线由具有已知浓度的校准化验的图像数据确定；以及输出每个ROI的浓度测量值。

Description

使用光学反应表征来自感兴趣区域的化验的系统和方法
技术领域
下面一般地涉及分析仪器，更具体地涉及使用光学反应表征来自感兴趣区域的化验的系统和方法。
背景技术
获得健康护理在全球仍然具有挑战性，并且存在对快速诊断测试的显著需求。这种诊断测试通常需要用于测量和材料表征的光学仪器。在示例中，光学测量可以使用提供大规模并行测量的酶标仪来实现。成像系统也已经成为大量类似环境中的标准设备，并且在研究和临床实验室中大量使用。然而，这种系统通常具有非常高的成本和低的可移植性，这限制了对光学表征的广泛获得。
发明内容
在一方面，提供了一种用于表征来自化验外壳上的多个感兴趣区域(ROI)的化验的系统，所述系统包括：照明源，用于照明所述ROI；照相机，用于从所述多个ROI接收所述化验的图像数据，所述图像数据包括用于每个ROI的至少两个颜色通道；以及控制器，包括一个或多个处理器和存储器，所述一个或多个处理器被配置为执行：测量模块确定每个ROI的颜色通道上的信号变化的比率，并且使用校准曲线将所述信号变化的比率转换为所述化验的浓度确定，所述校准曲线由具有已知浓度的校准化验的图像数据确定；以及输出模块输出用于每个ROI的浓度确定。
在系统的特定情况下，所述照明源包括用于比色化验的具有均匀强度的宽带光源。
在该系统的另一种情况下，所述照明源包括与用于荧光化验的发射滤光器相结合的窄带激发光源。
在该系统的另一种情况下，所述浓度确定是通过比较终点读数处的校准曲线浓度或比较随时间进程反应的校准曲线浓度来确定的。
在该系统的另一种情况下，从所述多个ROI接收所述化验的图像数据包括吸光度、荧光或发光读数中的至少一个。
在该系统的另一种情况下，所述系统执行酶标仪和凝胶成像器中的至少一个的功能。
在该系统的另一种情况下，所述系统还包括用于使用热对流、传导或辐射而进行现场培养的热元件。
在该系统的另一种情况下，所述系统还包括与所述化验外壳相关联的界标，用于由所述控制器进行ROI位置识别。
在该系统的另一种情况下，所述界标包括位于所述化验壳体的板载体上或所述化验壳体的多孔板的四个角上的标记，并且其中所述控制器识别所述界标并将所述界标与多孔板的数字模板图像对准以确定所述多个ROI的位置。
在该系统的另一种情况下，所述系统还包括与所述化验外壳相关联的条形码，以通过所述控制器确定样本类型和分析协议。
在该系统的另一种情况下，所述系统还包括位于所述照相机前面的不透明膜，以阻挡不希望的光。
在该系统的另一种情况下，所述图像数据中的所述多个ROI可被动态地定义。
在另一方面，提供了一种用于表征来自多个感兴趣区域(ROI)的分析的方法，所述方法包括：在照明期间从所述多个ROI接收所述化验的图像数据，所述图像数据包括用于每个ROI的至少两个颜色通道；确定每个ROI跨越所述颜色通道的信号变化的比率；使用校准曲线将每个ROI的信号变化的比率转换为化验的浓度确定，所述校准曲线由具有已知浓度的校准化验的图像数据确定；以及输出每个ROI的所述浓度确定。
在该方法的特定情况下，所述照明包括用于比色化验的具有均匀强度的宽带光源。
在该方法的另一种情况下，所述照明源包括与用于荧光化验的发射滤光器相结合的窄带激发光源。
在该方法的另一种情况下，所述浓度确定是通过比较终点读数处的校准曲线浓度或比较随时间进程反应的校准曲线浓度来确定的。
在该方法的另一种情况下，从所述多个ROI接收所述化验的图像数据包括吸光度、荧光或发光读数中的至少一个。
在该方法的另一种情况下，所述信号变化的比率包括增加的通道值的和与减小的通道值的和的比率。
在该方法的另一种情况下，将每个ROI的信号变化的所述比率转换为所述浓度确定包括使用奇异值分解来映射从终点反应的稀释系列收集的已知浓度数据样本以确定未知样本。
在该方法的另一种情况下，确定信号变化的所述比率包括用时间序列反应数据训练人工智能模型以确定具有随时间的一致增加并在时间上为最终点提供最佳线性的函数。
这些和其它方面在本文中被考虑和描述。应当理解，前面的概述陈述了实施例的代表性方面，以帮助技术人员理解下面的详细描述。
附图说明
在以下参考附图的详细描述中，本发明的特征将变得更加明显，其中：
图1是根据实施例的使用光学反应表征来自多个感兴趣区域的化验的系统的示意图；
图2是根据实施例的使用光学反应表征来自多个感兴趣区域的化验的方法的流程图；
图3是384孔微孔板和96孔微孔板的图示；
图4示出了示例性酶标仪的示意图；
图5示出了图1的系统的示例性物理实施例的透视图；
图6示出了图1的系统的另一示例性物理实施例的透视图；
图7是图1的系统的实施例的示意图；
图8示出了根据另一方法使用图1的系统(称为PLUM)和酶标仪的蛋白质滴定的示例性化验；
图9示出了将虚拟模板与照相机捕获的微孔板对准的示例；
图10示出了将虚拟模板与使用两种不同类型的板覆盖空孔的照相机捕获的微孔板对准的示例；
图11示出了捕获的映射数据的示例和这种捕获的映射数据的坐标图；
图12示出了颜色吸收和反射原理的示意性示例；
图13示出了校准浓度化验和要确定的二辛可宁酸化验(BCA)的示例；
图14示出了用于酶标仪的图13的示例的输出浓度坐标图；
图15示出了用于图1的系统的图13的示例的输出吸光度读数坐标图；
图16示出了用于图1的系统的图13的示例的输出反射光读数坐标图；
图17示出了用于孔雀绿化验的校准浓度化验的示例；
图18示出了用于酶标仪的图17的示例的输出浓度坐标图；
图19示出用于图1的系统的图17的示例的输出反射光读数坐标图；
图20示出了用于图1的系统的图17的示例的输出吸光度读数坐标图；
图21示出了用于铵化验的校准浓度化验的示例；
图22示出了用于酶标仪的图21的示例的输出浓度坐标图；
图23示出用于图1的系统的图21的示例的输出反射光读数坐标图；
图24说明了用于布拉德福化验(Bradford assay)的校准浓度化验的示例；
图25示出了用于酶标仪的图24的示例的输出浓度坐标图；
图26示出了用于图1的系统的图24的示例的输出反射光读数坐标图：
图27示出了使用图1的系统，从在巴西，厄瓜多尔和哥伦比亚进行的示例性实验中得到的现场读数，利用蓝色通道值相对绿色通道值的反射光读数的输出；
图28示出了感兴趣区域映射的示例，其中微孔位置被圈为感兴趣区域；
图29示出了板上的颜色变化的示例，其中阳性反应变为紫色并且阴性反应保持黄色；
图30示出用于图1的系统的图29的示例的输出反射光读数坐标图；
图31示出了用于商业成像器和用于图1的系统的感兴趣条带的示例性可视化图；
图32示出了用于商业成像器和图1的系统的具有长通滤光器的感兴趣条带的示例性可视化图；
图33示出了使用商业成像器和图1的系统的成像蛋白质印迹的示例；
图34是示出图1的系统的示例性实验的灵敏度测试的坐标图；
图35是示出用于图34的示例性实验的逻辑斯蒂测试(logistictest)的结果的坐标图；
图36是示出图34的示例性实验的阈值确定结果的坐标图；
图37示出了用于酶联免疫吸附化验(ELISA)的校准浓度化验的示例；
图38示出了用于酶标仪的图37的示例的输出浓度坐标图；
图39示出用于图1的系统的图37的示例的输出反射光读数坐标图；
图40示出了用于在为图1的系统命名样本时确定样本类型的用户界面的示例；
图41示出了用于将样本放入不同组的用户界面的示例，其中将根据图1的系统的样本类型进行分析；
图42示出了使用荧光染料ATTO 520的校准浓度化验的示例；
图43示出了酶标仪中的图42的读数的示例；
图44示出了图1的系统中的图42的读数的示例；
图45示出了使用荧光染料ATTO 550的校准浓度化验的示例；
图46示出了酶标仪中的图45的读数的示例；
图47示出了图1的系统中的图45的读数的示例；
图48示出了将铝块使用到96个管进行分析的适配器的示例，其中具有四个角标记；
图49示出了图1的系统的又一示例性物理实施例的前部透视图；
图50示出了图49的实施例的底部透视图；
图51示出了图49的实施例的局部剖切的前部透视图；
图52示出了图49的实施例的进一步的局部剖切的前部透视图；以及
图53示出了图49的实施例的局部剖切的底部透视图。
具体实施方式
现在将参考附图来描述实施例。为了说明的简洁和清楚，在适当的情况下，可以在附图中重复附图标记，以表示相应的或类似的元件。此外，为了提供对这里描述的实施例的透彻理解，阐述了许多具体细节。然而，本领域的普通技术人员将会理解，在没有这些具体细节的情况下，可以实现这里描述的实施例。在其它情况下，没有详细描述公知的方法、过程和组件，以免使这里描述的实施例模糊。而且，本说明书不应被认为是限制了这里描述的实施例的范围。
除非上下文另有说明，在本说明书全文中使用的各种术语可如下解读和理解：“或”在全文中使用时是包括在内的，如同所写的“和/或”；在全文中使用的单数冠词和代词包括它们的复数形式，反之亦然；类似地，性别的代词包括它们的对应代词，使得代词不应被理解为将这里描述的任何东西限制为单一性别的使用、实现、性能等；“示例性的”应该被理解为“说明性的”或“举例性的”，而不必被理解为“优选的”。术语的进一步定义可在本文中阐述；如通过阅读本说明书将会理解的，这些可应用于那些术语的先前和后续示例。
在此示例的执行指令的任何模块、单元、组件、服务器、计算机、终端、引擎或设备可以包括或可以访问计算机可读介质，例如存储介质、计算机存储介质、或数据存储设备(可移动和/或不可移动的)，数据存储设备例如磁盘、光盘或磁带。计算机存储介质可以包括以用于存储信息的任何方法或技术实现的易失性和非易失性，可移动和不可移动的介质，例如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据。计算机存储介质的示例包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其它存储器技术、CD-ROM、数字多功能盘(DVD)或其它光存储、磁带盒、磁带、磁盘存储或其它磁存储设备，或可用于存储所需信息并可由应用、模块或两者访问的任何其它介质。任何这样的计算机存储介质可以是设备的一部分或可访问的或可连接的。此外，除非上下文另外清楚地指示，否则本文陈述的任何处理器或控制器可实施为单个处理器或实施为多个处理器。所述多个处理器可以是阵列或分布式的，并且这里所提及的任何处理功能可以由一个或多个处理器来执行，即使可以例示单个处理器。在此描述的任何方法，应用或模块可以使用计算机可读/可执行指令来实现，所述计算机可读/可执行指令可以由这样的计算机可读介质存储或以其他方式保持并由一个或多个处理器执行。
下面一般地涉及分析仪器，更具体地涉及使用光学反应表征来自感兴趣区域的化验的系统和方法。
通常，用于光学定量和表征的商业方法昂贵且麻烦(即，不够便携)。有利地，本公开的实施例提供了一种基于照相机的方法(称为“PLUM”)，其提供了用于板读取和成像的低成本和足够便携的解决方案。这种可移植性使得例如在疫情爆发期间建立弹出式诊断站，以最小化样本运输中涉及的风险。如本文所述，该方法使用反射光，而不是吸光度或其它形式，以以其它方法的成本的一小部分而提供高度精确的功能。在一些实施例中，提供了一种用于广泛应用的自包含、自动化和易于使用的系统。这样的系统可以执行车载数据收集和分析、培养、加热，以及具有电池操作的其它功能。本文所述的实施例可用于多种应用中，例如，用于工业、制造、研究、保健和教育的分布式和高容量光学测量。在此描述的实施例可以有利地在实验室设置之外使用，以便能够例如在蚊幼虫/蛹监视，群体计数、硬件识别、ID跟踪等的现场分析中使用。
在本文所述的一些实施例中，提供了一种多模式电子光学读取器系统，其可以通过终点或时间间隔测量来处理多种多孔板形式(例如，96孔的、384孔的、定制的)或电泳凝胶/印迹类型。与其它方法相反，一些实施例可以使用照相机和宽带白光来收集反射光的RGB通道值。如本文所述，这些RGB像素值可被转换成用于计算目标波长范围内的吸收当量的量化数据。在进一步的实施方案中，可以使用其它颜色通道的比率来确定浓度。
通常，酶标仪是用于量化微孔板中并行的生物、化学或物理性质的光学仪器(图3中示出了384孔和96孔微孔板的实例)。图4示出了示例性酶标仪的工作图。这种酶标仪通常由多个运动部件组成；这些包括需要校准的单色仪(棱镜)和光纤单元，以及用于波长选择的滤光立方体和狭缝。这些部件的复杂性显著增加了仪器的成本。在图4中，“M”表示运动分量。如图所示，将微孔板放入仪器中并置于光源和光检测器(光电倍增管(PMT))之间。每个孔具有允许光穿过样本的透明窗口，从而能够测量相关的性质。测量可以作为终点读数或随着时间的而被收集，并且最常见的是在吸光度(比色法)、荧光和发光模式中进行。
通常，酶标仪，例如上述的酶标仪，基于比色原理工作。在1868年，路易斯·朱尔斯·杜博斯克(Louis Jules Duboscq)发明了允许同时比较两种液体的第一种色度计。从那时起，色度计已经广泛用于通过使用比尔定律(Beer Law)测量吸光度来确定分析物的浓度，这表明颜色的强度与有色颗粒的浓度成正比。使用基于酶标仪的比色测量来定量蛋白质和核酸定量，以及pH，以用于蛋白质检测(例如ELISA)和广泛的可商购的化验。例如，二辛可宁酸(BCA)化验使用随着蛋白质浓度增加而从浅绿色变为深紫色的比色响应。通过监测反应(例如，在563nm)，蛋白质浓度的增加提供线性光学响应。
荧光强度测量是化验表征的高成本但高度精确的方式。荧光信号由特定波长的荧光团的激发产生，这导致发射较长波长的信号。捕获所发射的光依赖于滤光器将所产生的荧光与激发输入分离。基于荧光的测量在研究中的应用包括在生化、化学和基于细胞的化验中荧光信号和报告蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP))的定量。
发光测量是用于化验表征的另一种类型的方式。在这种情况下，导致光产生的化学和生化反应被认为是发光的。发光的检测比荧光简单得多，因为没有需要过滤的激发波长，因此通常只包括光传感器。像GFP一样，天然发光酶，如来自萤火虫的萤光素酶，已经被用作基于蛋白质的报道，并且可以用于基于细胞的化验。
在其它方法中，可以使用凝胶成像系统对核酸和蛋白质凝胶进行成像。在一实例中，琼脂糖凝胶可用于表征已用荧光染料标记的核酸。在一实例中，每个条带可以代表核酸片段，在凝胶的顶部具有最大的一片，而在凝胶的底部具有最小的一片。可使用电泳类似地表征蛋白质，例如，可以使用与化学发光信号结合的抗体在蛋白质印迹中标记蛋白质。
现在参考图1，示出了根据一实施例的用于利用光学反应100表征来自多个感兴趣区域(ROI)的化验的系统。图1示出了系统100的实施例的各种物理和逻辑组件。如图所示，系统100包括具有多个物理和逻辑组件的控制器102，控制器102包括中央处理单元(“CPU”)104(包括一个或多个处理器)，随机存取存储器(“RAM”)106，用户界面108，外围接口110，非易失性存储器114和使CPU 104能够与其它组件通信的本地总线116。在一些情况下，一个或多个处理器中的至少一些可以是微处理器、片上系统(SoC)、单板计算机(例如，RaspberryPiTM)等。RAM106向CPU104提供相对响应的易失性存储。用户界面108使得管理员或用户能够通过输入设备(例如键盘和鼠标或触摸屏)来提供输入。用户界面108还可以将信息输出到用户的输出设备，例如显示器、扬声器或触摸屏。网络接口118允许与其它系统进行通信，诸如远离系统100的、诸如用于云计算存储的其它计算设备和服务器。外围接口110允许控制器102与系统100的外围组件通信，或与其它计算设备通信(例如通过网络)。外围部件可以包括培养器120，照明源122，照相机124，滤光器126，托盘128和加热源129中的至少一个。非易失性存储器114存储操作系统和模块，包括用于实现操作系统和模块的计算机可执行指令，以及这些服务所使用的任何数据。附加存储数据可以存储在数据库118中。在系统100的操作期间，可以从非易失性存储器114中检索操作系统、模块和相关数据，并将其放置在RAM106中以便于执行。
系统100还包括可以在CPU104上执行的多个概念模块，在一些实施例中，包括验证模块130，捕获模块132，测量模块134和输出模块136。在一些实施例中，系统100的模块由单个计算设备存储并在单个计算设备上执行。在其它实施例中，系统100的模块可以分布在本地或远程分布的两个或多个计算设备中。在一些情况下，模块的功能和/或操作可以在其它模块上组合或执行。
与吸光度模式读取器相反，本系统100的实施例可有利地用于转换反射的RGB光以产生吸光度等效测量。在进一步的实施例中，该方法可用于将来自各种基于照相机的设备(例如，智能电话)的读数转换为吸光度等效测量。
在大多数情况下，化验可以是平板阵列或凝胶阵列。如本文所述，可以基于阵列类型来检测感兴趣区域(ROI)。
加热源129可以使用间接方法(例如，具有风扇的加热器)或直接方法(例如，铝块或电流)。利用间接方法，加热源129包括位于离化验中的样本一定距离处的多个热元件，以使加热均匀。利用直接方法，加热源129包括直接与化验的样本接触的多个热元件。在一实例中，热组件可以具有室温至120℃的温度范围。
如本文所述，为了能够实现根据系统100的基于照相机的读取器，可以使用各种类型的用于容纳感兴趣区域的化验的容器。在一些情况下，可以使用各种尺寸的改进的多孔板，其中一个或多个孔是容纳化验的感兴趣区域。在一些情况下，可以将不透明膜(例如铝PCR(聚合酶链反应)膜)施加到多孔板以增加图像对比度和质量。在一些情况下，可以将明亮的丙烯酸盘添加到多孔板中，使得系统100可以将图像与数字模板对准，以便进行数据采集。在一些情况下，电泳凝胶或印迹可用于容纳在凝胶或印迹中的一个或多个感兴趣区域处的化验。在一些情况下，可使用多个管来容纳化验，其中每个管是容纳化验的感兴趣区域。在一些情况下，紫外线(UV)透明玻璃托盘可以与用于容纳化验作为感兴趣区域的多个部分一起使用。
有利的是，与其它方法中的8-12个光传感器相比，本系统100的实施例可以使用照相机124作为用于酶标仪的单个传感器。另外，为了有利地消除由于光源类型引起的任何偏差，系统100可以使用具有模拟阳光的均匀照明的照明源122。普通的白色光源通常不具有这种特性。公共照明源具有高蓝色通道信号强度。这将读数偏向与化验本身无关的高蓝色通道读数，导致不准确的测量。在大多数情况下，由于这里描述的方法取决于颜色值的变化，所以用于分析的两个颜色通道应该具有相对相似的均匀照明水平。有利地，与其它方法相比，本系统100的实施例可以使用收集荧光信号所需的减少数量的滤光器126。在一些情况下，系统100可以使用廉价的长通滤光器与在照相机上发现的拜耳滤光器(Bayerfilters)相结合来创建带通滤光器组。在一些情况下，可以减去荧光强度以确定被带通滤光器阻挡的光。
有利的是，本发明人确定反射光可用于通过监测颜色通道的变化来表征反应。本文所述的示例性实验表明，反射光的红色、绿色和蓝色通道值可用于量化色度变化。这种方法可以显着地减少所需的组件的数量，并且可以消除对需要校准的大多数移动部件的需要。
有利地，在一些实施例中，系统100可以自动地将感兴趣区域的数据图像与相对于感兴趣区域位于预定位置的标记对准。在多孔板的示例中，标记可以安装到板上(例如，在板的四个角中的每一个上的丙烯酸标记)或承载板的托盘和适配器上，以用于处理来自每个孔的离散值。这能够显着地降低硬件成本。以此方式，系统100可经配置以识别任何类型的板，商业的或定制的。另外，系统100允许用户为样本创建组图，这使得能够进行自动数据分析和基于结果的决策(例如，诊断为阳性或阴性)。在一些情况下，用户可以：(1)通过将诸如“背景”，“对照”或“样本”的标签与检测到的感兴趣区域相关联，为每个反应设置类型(如图40的示例所示)；(2)将用于自动绘图的标记反应分组(如图41的示例所示)。如本文所述，系统100可以基于颜色变化自动生成测试结果。
图5示出了系统100的示例性物理实施例。在该示例中，系统被封装在物理外壳502中。用户界面108与例如触摸屏设备通信。控制器102位于外壳502下方的外壳506中。外围接口110与马达508相互作用，以用于控制托盘128作为电动托盘510。外围接口110与位于外壳502的底部512的照相机124、照明源122(在该示例中，具有白色LED的光盒514)，培养器120(包括温度和/或湿度传感器)和位于外壳502的顶部的加热源129相互作用。在一些情况下，外壳可以由不透明的丙烯酸片制成，以防止环境光干扰测量。
因此，系统100的上述实施例可以被认为包含三个覆盖部分：1)具有宽带或窄带光作为照明源122的光盒，2)具有特定传输参数的一组滤光器126，以及3)具有高像素分辨率的数字照相机124。这种有效的硬件结构与涉及高成本机械部件的其它酶标仪的复杂性形成鲜明的对比。
在上述示例性实施例中，可寻址光盒514包含一个宽带光源和用于荧光模式的多组激发LED。由于所需LED的数量减少(边缘照明具有8个LED，而其它方法通常是背照明并且需要54个LED)，这种边缘照明设计可以提供显著的成本节约。机动化托盘510有助于将化验壳体(例如多孔板)装载到装置中，同时热源和温度探针允许在整个实验中持续培养(＞25℃)。滤光轮可以用于选择带通滤光器，并且可以由控制器102自动控制。在该示例中，使用8兆像素照相机来收集图像数据并将入射光分成红绿蓝(RGB)通道。车载控制器102消除了对附加计算机站的需要。
图6示出了系统100的另一示例性物理实施例。在该示例中，外壳被分成两个隔室：检测室602和控制室604。在该示例中，光盒606照明源122位于顶部，而照相机和过滤器126(这里是电动滤光轮)位于检测室602中。在一些情况下，滤光轮可具有空的位置以实现吸光度等效测量。
在上述例子中，检测室604包含光盒、电动托盘、电动滤光轮和照相机。这种配置允许从底部清楚地显示板并捕获图像数据。在侧板上，检测室容纳用于加热的基于风扇的空气培养器120、用于记录的温度传感器、两个托盘导轨、用于控制托盘的连续伺服电机和用于归位托盘的微型开关。伺服电机齿轮与托盘齿啮合以打开和关闭托盘。
在一实施例中，电动托盘128可用于确保成像的正确对准。一旦板被传送到照相机的视野中，伺服电机的相互啮合的齿轮提供阻力以将板锁定在适当的位置，确保在实验运行时没有运动。为此，可以使用自动控制的齿轮盘轨道来移动托盘进出。托盘可构造成保持任何类型的化验外壳，例如微孔板或UV透明玻璃托盘，其可放置在用于DNA和蛋白质凝胶和膜成像的装置中。在一些情况下，压敏开关可以放置在托盘轨道的末端，因此当装载完成时，装置自动停止伺服电机。
在一些情况下，系统100可以具有背光照明光源122(例如，具有54个单元的高CRIYuji LED的背光照明光源122，其接近地模仿太阳光波长分布)。在其它情况下，为了允许荧光成像同时保持低成本，可以使用边缘照明光源122(例如，与丙烯酸光导面板一起)。在一个实例中，边缘照明设计可以包含12个高显色指数(CRI)宇极(Yuji)LED和4组用于激发荧光分子的8个窄波长反叛(Rebel)LED。在该示例中，可以利用由控制器102控制的定制设计的可寻址多路复用器PCB单元来控制LED。在一些情况下，为了选择发射波长，滤光器126可以是滤光轮(例如，能够容纳四个长通滤光器和空位置的滤光轮)。滤光轮可以用伺服电机驱动，该伺服电机允许滤光轮的精确轴向旋转和与照相机的对准。
在被称为荧光模式的特定实施例中，系统100借助于激发LED和发射滤光器收集数据。通过使用相应的RGB通道值来量化在长通滤光器之后到达照相机的发射光谱。
在边缘照明的另一个例子中，系统100中的光盒可以包括边缘照明框架，该边缘照明框架由3-mm丙烯酸片和具有宽光谱或窄光谱的LED组成。白色宽波长LED产生全可见光谱，其具有从380nm至740nm的波长的表示。窄带LED在特定波长范围具有高发射峰值。具体地，宝蓝光LED具有在440nm至460nm之间的波长峰值，蓝光LED具有在460nm至485nm之间的波长峰值，青光LED具有在490nm至515nm之间的波长峰值，琥珀光LED具有在585nm至595nm的峰值。边缘照明的光盒被设计成使得所有的LED在镜像的透明丙烯酸的每一侧都面向内。
图7示出了使用滤光轮作为滤光器126的系统的实施例的示意图。在该实施例中，系统100的光学组件可以是固定的，除了旋转的滤光轮之外。这可以有利地使系统100更坚固并且允许它是便携式的。组装到轮形基座中的这组滤光器可以由控制器102控制。在一实施例中，滤光轮可以包括多个开口，这些开口为滤光器提供容量，为未滤光的光收集留下一个开口，以用于吸光度等效的读数。在一例子中，四个长通滤光器可以分别具有515nm、540nm、570nm和660nm的截止波长。在照射到达样本后，光从样本反射。当反应发生时，在存在或不存在滤光器的情况下到达照相机的反射光产生照相机的颜色通道强度的偏移。
在一实施例中，照相机124可以是单片数字图像传感器，然而，可以使用任何合适的照相机。在一些情况下，照相机124传感器可以具有RGB(红色、绿色、蓝色)颜色滤光器的布置。在一些情况下，照相机124可具有经设定以聚焦在化验外壳(例如多孔板)的平面处的可调焦距。有利的是，系统100可以使用固定的照相机(例如，非电动的)，这与在其它酶标仪中使用的多个和电动的传感器相反。光盒、滤光器和照相机使得系统100能够以高灵活性执行多模式测量。利用耦合的光源和滤光器，照相机能够通过嵌入的红色、绿色和蓝色传感器阵列捕获光学信号。对于吸光度化验，使用具有全发射光谱的白光，允许照相机捕获来自样本的宽光谱反射光。对于荧光化验，使用有色LED和滤光器的组合，所选择的LED具有波长峰值，其中波长峰值落入用于通常使用的荧光样本的激发波长，而长通滤光器阻挡背景并允许发射光到达照相机(例如荧光标记ATTO 520和ATTO 550)。为了检测发光信号，照相机124具有可调的暴露时间和模拟增益以捕获来自生物发光或化学发光物质的低发射光。
系统100有利地利用分析方法，该分析方法使用反射光数据而不是用于比色应用的吸光度。这种分析方法量化红色-绿色-蓝色(RGB)通道值的偏移以产生分析物浓度的估计量。在一实施例中，这可以通过化验通道值来实现，所述通道值与终点读数中的校准曲线浓度或基于时间的化验的分析物浓度随时间的增加相关。可以生成函数，该函数将RGB通道值作为输入，并将它们映射到估计值，称为信号。然后可以用线性或S形回归拟合将估算值与分析物的浓度相联系，被称为信号计算器。
信号计算器将由照相机收集的RGB通道值转换为比率(称为估计量)。具有已知浓度的一组标准可用于产生校准曲线。不包含感兴趣的分析物的标准被称为空白。捕获包含标准和空白的板的图像。从图像中，对每个包含标准的感兴趣区域的RGB通道值分别平均给每个通道。平均RGB通道值被用作信号计算器的输入。基于空白的RGB值的平均值，以及至少一些其余的标准，系统100生成输出估计量的可能的方程。信号计算方程是增加的颜色通道值(例如，R，R^2，R+B等)的组合与减少的颜色通道值(例如，R+B，R*B等)的组合的比率。基于标准的估计值，校准曲线被用于生成映射估计量和已知浓度之间的关系的关系方程。在一些情况下，使用关系方程(R-平方值)与数据点的拟合优度来确定给出最佳匹配的信号计算方程。未知浓度的估计值可以用作校准曲线方程的输入以确定未知浓度。
利用信号计算器，系统100分析RGB值的增加或减少。具有显著变化的颜色通道被表示为增加的颜色值与减少的颜色值的比率。这种变化可以被表示为允许量化颜色转变并且将最小化孔间照明变化的比率。
在其它情况下，可以使用奇异值分解(SVD)来确定颜色变化。SVD是一种将矩阵简化为其组成部分的矩阵分解方法。在系统100中，可以使用SVD来映射已知样本浓度和RGB通道值之间的关系。这允许系统100为预测溶液浓度的标准曲线方程提供更好的估计。以这种方式，SVD可用于获取反射光数据以确定吸光度等效数据的测量。每个颜色通道可以对浓度读数有其自身的贡献。在其它情况下，SVD可用作确定估计量的替代方法。
在一些情况下，为了降低系统100的成本，滤光器126可以由长通滤光器而不是昂贵的带通滤光器组成。为了实现窄波长检测的水平，从较低波长带通滤光器值中减去较高波长带通滤光器值。可以使用减法来选择落入较窄条带的光，而不使用可能是昂贵的带通滤光器。
参见图2，示出了根据一实施例的使用光学反应200表征多个感兴趣区域(ROI)的化验的方法的流程图。在框202，微孔板通过插入到托盘128而被接收。在一示例中，用户可以使用电动托盘128将板插入到系统100中。
在框204，验证模块130可以执行验证。该验证确保板处于照相机124的视野中并且与相应的数字映射对准，该数字映射允许光学测量被归因于微孔板的每个孔。后一步骤产生板的虚拟模板，其中感兴趣区域(ROI)可以与微孔板图案对准。在一些情况下，为了确保获得高质量的图像数据，用户可以使用用户界面108来将虚拟模板(在一实例中，通过点阵列来可视化)对准所捕获的板；如图9的示例所示。在一些情况下，为了帮助识别板，可以将可重复使用的有色丙烯酸盘(可以称为“标记”)放置在板上，例如，在四个角中的每一个都放置有一个。然后，验证模块130可以通过将标记与模板的角对准来确定模板。图9和图10示出了通过使用四个角标记来确定包含96孔板和384孔板中的ROI(感兴趣区域)的虚拟模板的板验证。对于图9和图10，左边的图像是捕获的图像，右边的图像是由验证模块130确定的孔位，如圆圈标记所示。感兴趣区域是所捕获的图像的区域，该所捕获的图像的区域包含用于数据分析的样本的像素信息。为了避免可能干扰读数的气泡，可以选择某一区域用于进一步分析。感兴趣区域的确定可以由用户通过选择或定位所选择的区域来手动地确定，或者可以使用当前的验证方法自动地确定。
在一些情况下，由验证模块130执行的对准可以包括图像的基于界标的自动对准。在这种情况下，验证模块130自动地将图像与多孔板的数字模板对准。以这种方式，验证模块130识别放置在多孔板的四个角中的标记(在某些情况下，可重复使用的标记)。在一些情况下，这种识别可以基于颜色或形状。基于界标的对准可以在图像获取之前或之后执行，允许所捕获的图像被自动地分割成用于每个孔的光学数据集。验证模块130可以，例如使用计算机视觉，通过独特的图案识别(例如，识别正方形或圆形)来确定界标。
在一些情况下，多孔板可具有二维或三维条形码(例如，QR码)或其它可见数据编码。验证模块130可以通过照相机扫描该条形码，以实现样本类型和分析协议的自动输入。条形码可以编码与例如盒类型，协议参数(温度、光信息、滤光器信息等)以及与后端数据库的链接有关的信息。通过识别条形码，验证模块130将能够执行本实施例的方法。这有利地代替了手动数据输入和孔与样本类型的手动匹配。
在一实例中，验证模块130可以通过边缘检测方法识别条形码，然后对化验/盒的类型进行解码。对于每种类型的化验/盒，验证模块130将基于界标(如本文所述)将给定的映射与从照相机接收的图像进行匹配，或者验证模块130可以使用计算机视觉来识别图像中的ROI(例如，使用条带检测)。
一旦模板是可接受的，在框206，捕获模块132可以指示照明源122照明并指示照相机124接收图像。这样，捕获模块132可以从图像中捕获每个感兴趣区域的RGB信息，如图10的示例所示。
在一些情况下，捕获模块132可以允许确定每个孔位置的样本标识(例如，对照、测试等)。在捕获图像时，可以根据上述板验证期间生成的样本标识映射自动绘制数据，如图11的示例所示。这样，可以将所捕获的图像数据和映射数据集成到系统100中以提供定量分析。在一些情况下，可以输出来自映射和图像的结果数据和原始信息。
对于吸光度测量，系统100可以采用比其他酶标仪有利的光学原理，并且在一些情况下，可以提供吸光度等效结果。其它酶标仪通常跟踪波长窄范围的吸光度的变化，例如，遵循朗伯比尔(Beer-Lambert)定律，该定律说明固定波长的光的吸光度与其浓度成正比。因此，感兴趣的波长与光源分离并通过感兴趣的样本(例如，多孔板中的样本)。任何观察到的透射光的减少被监测并被转换为吸光度值。可以绘制校准曲线并用于确定未知溶液的浓度。
与上述相反，在框208，测量模块134可以通过测量由照相机124收集的红色-绿色-蓝色(RGB)通道值上的信号变化来执行浓度的测量。当反应导致颜色变化时，样本中的颜色偏移可以由撞击照相机124的反射光捕获，从而导致照相机124记录的RGB信号的变化。在荧光模式中，有色LED照明源122和长通滤光器126可用于隔离感兴趣的信号。基于在反应之前和之后(或者与对照和标准曲线值相比)收集的RGB值，测量模块134能够量化可由照相机检测到的任何颜色偏移，并且能够使用反射光分析来增加信号幅度。在发光模式中，照相机124可用于检测和量化由样本产生的光。在吸光度测量的情况下，透射的光通过另外的一组滤光器分离。然后，使用透射的光来产生校准曲线方程，而不需要任何进一步的操作。
反射光分析基于RGB颜色混合。撞击物体的光包含可以由红、绿和蓝传感器捕获的光。所识别的颜色是基于从感兴趣对象反射的光。如果单独接收红、绿和蓝光，则它们可以分别被识别为原色。如果接收到具有相同强度的绿色和红色的组合，则可以将其识别为黄色。相同的颜色混合概念导致绿色和蓝色产生青色，以及红色和蓝色产生品红色的组合。当光撞击物体，或者生物化验的情况下的溶液时，一些光在物体的吸收中损失，而其余的光被照相机的传感器反射和接收。例如，当青色物体被白光照射时，红光被吸收，其余(绿色和蓝色)被反射。如果样本颜色从青色变为品红色，则这种转换意味着照相机传感器将接收更多的红光和更少的绿光。图12示出了图解示例。与量化单波长吸光度的降低的其它酶标仪相比，系统100跟踪通过RGB值的光谱的反射光的变化。
在一些情况下，测量模块134可以确定从终点反应的稀释系列收集的RGB值的表达式，并选择给出具有最佳线性的结果的函数。这样的函数可以被表示为增加的通道值的和与减少的通道值的和的比率。通常，系列稀释是用于将分析物浓度降低至较宽浓度范围的一系列连续稀释。通常，系列稀释由用户准备，并且用户可以通过用户界面108手动输入浓度。通常，系列稀释可用于确定分析物浓度和颜色输出之间的相关性，其中颜色输出用于确定未知浓度。奇异值分解可用于绘制从终点反应的稀释系列收集的已知浓度数据样本，以便确定未知样本。在一些情况下，测量模块134可以使用与已知时间序列反应数据训练的机器学习模型，以找到显示随时间的一致增加并为最终点给出最佳线性的函数。
在一实例中，机器学习模型可用于确定反应的初始颜色和最终颜色，其可由控制器102用来确定输出。在一些情况下，可以使用监督的机器学习模型来分类不同的反应。这种模型的输入可以是ROI的RGB值和形状，并且这种模型的输出可以是生物相关信息。在进一步的情况下，机器学习模型也可以用于针对为流行病学信息所收集的数据。
在框210，输出模块136输出由测量模块134确定的浓度的测量。输出可以包括，例如，通过用户界面108在用户显示器上显示，存储在数据库118中，或者通过网络接口118输出到另一个系统，例如通过网络的云计算存储器。在一些情况下，输出可以包括测量浓度的可视化，例如图表。
在一些实施例中，由系统100执行的方法可以包括从多个孔接收化验的图像数据，该图像数据包括用于每个孔的至少两个颜色通道；为每个孔确定跨颜色通道的信号变化的比率；使用校准曲线将每个孔的信号变化的比率转换成化验的浓度测量，其中所述校准曲线由具有已知浓度的校准化验的图像数据确定；以及输出每个孔的浓度测量值。
在其它情况下，系统100可以执行图像分析，包括用于单个时间点读取和时程反应的吸光度、荧光和发光照明读取模式。在一些情况下，用户可以在协议建立期间确定发光的类型。对于一个反应，用户可以设置不同的光照设置来读取(即，如果需要，可以在每个时间点进行顺序的吸光度和荧光读取)。
时程读数是在时间上收集的多个终点读数，其间具有预设的时间间隔。终点读数是单个数据集(即，一个图像)，其中该数据集包含初始(背景，没有分析物)和最终数据点(具有分析物)。基于与相对读数相比的已知物理量化(即浓度或稀释因子)来分析终点读数。同时，基于与时间相比的相对读数来分析时程读数。
在另一方面，如图48所示，系统100可以包含在单个设备中。该装置可以包括以下中的一个或多个：用于比色化验的具有均匀强度的宽带光源；用于荧光化验的窄带激发光和带通滤光器；产生用于发光化验的黑暗环境的可控光源；用于收集RGB通道值的照相机；将样本保持在适当位置的适配器；可提供环境培养的热组件；用于帮助系统对准酶标仪的标记系统；促进反应的辅助组件、气源和电动托盘；连接到控制器处理单元进行计算；接收输入并允许用户引导操作的显示单元；以及将组件封装在一起并阻挡环境光的外壳。适配器可以具有标准的或定制的格式。热组件可以具有至少两种形式：(1)在装置内提供热传递的培养器，和(2)具有直接对管/板进行现场培养的孔的铝块。图48示出了使用铝块作为用于分析的96个管(具有四个角部标记)的适配器的示例。
在进一步的情况下，上述设备可以包括基于界标的方法，该方法产生图像的自动对准：自动地将图像与多孔板的数字模板对准；识别(可重复使用的)放置在多孔板的四个角上的标记。这种方法可以在图像采集过程之前或之后执行，允许所采集的图像被自动分割成用于每个孔的光学数据集。然后可以收集各个感兴趣区域(ROI)中的每个的RGB值以用于如本文所述的分析。
在其它情况下，不透明膜可用于增强图像的自动对准。不透明膜可用于阻挡来自板的空孔的不希望的光。膜可以与板和照相机直接或不直接接触使用。不透明膜的位置可以在化验板的顶部或底部，但是应该在照相机的前面。阻挡不希望的光可以避免通常存在于数字摄影中的过曝光问题。空孔可以具有强光强度，通过该强光强度将重新调整数字照相机的白平衡，这可能在具有反应的孔中导致不能识别的颜色变化。直接或非直接接触意味着阻挡可以直接接触板或者不接触板。阻挡膜可以施加到板的底部，但仍然在照相机的前面。由于板的底部可以是透明的，因此可以将膜施加在板的顶部或底部下方。
为了确定感兴趣区域(ROI)，要用于RGB值的像素的分界可以是静态的或动态的。在某些情况下，动态识别可以使用图案识别；例如，在凝胶化验中识别多个条带。静态识别在某些情况下可以使用映射对准，例如，使用预定义的ROI集合来分析板的图像。可以针对每个多孔板形式来调整感兴趣区域。ROI的位置可以位于孔的圆周内的任何位置，以便从每个孔收集最高质量的数据。ROI不需要被限制为像素的数量，并且可以在从一个到大得多的值的范围内。系统100可以用作酶标仪和凝胶成像器，将酶标仪和凝胶成像器功能结合到单个仪器中。系统100使得可编程平台能够收集光学数据。函数可以通过任何合适的方法、或方法的组合来确定，例如：通过创建从终点反应的稀释系列收集的RGB值的所有可能的代数表达式，并且选择给出具有最佳线性的输出的函数；通过将该函数表示为增加的通道值的和与减少的通道值的和的比率；通过使用奇异值分解来映射从终点反应的稀释系列收集的已知浓度数据样本并确定未知样本；或者通过随时间序列反应数据训练人工智能模型/算法，该时间序列反应数据可以被用于找到显示随着时间的一致增加并且为最终点给出了最佳的线性度的函数。通过用时间序列反应数据训练人工智能模型来确定函数，其中人工智能可用于自动确定信号变化的比率，所述函数具有随时间的一致增加并且在时间上为最终点提供最佳线性。人工智能模型可以使用先前收集的数据来确定最佳的颜色组合，以传递与酶标仪或凝胶成像器等效的结果。人工智能模型也可用于估计最佳精确浓度和实验结果，并可用于基于随时间或终点结果所收集的数据曲线来估计病毒载量或量化。
遵循加色混合理论，系统100可以执行对赋予输出最佳线性度的函数的选择。具有值变化的颜色通道被归类为增加的值和减少的值。然后，创建函数作为颜色的增值颜色通道与减值颜色通道的比率。在一些情况下，可以使用RGB通道的加法、减法和乘法的组合。因此，可以产生校准曲线以确定给出已知浓度和函数输出之间的最佳拟合(高R平方值)的函数。
图49至图53示出了系统100的另一实施例。在该实施例中，包括多个盒402，用于每个保持化验的样本。该实施例还包括电路422，其中电路422包括控制器102。每个盒402包括安装到电路的样本收集容器403，该电路被配置成执行由验证模块130、捕获模块134和/或测量模块134所执行的一个或多个功能。外壳404包括盖406和通气孔408。还包括触摸屏410以用作用户界面。该实施例包括装有自闭合销的盒保持器412。还包括提供照明的光盒414。加热源129包括局部过热保护装置416、风扇418和加热器420。
作为一示例，本发明人进行了示例性实验以将本实施方案与使用二辛可宁酸(BCA)的朗伯比尔定律进行比较。在该化验中，原始青绿色空白样本随蛋白质(工作范围25-2000μg/mL)按比例的添加变成紫色。对于紫色转变，图13示出了校准浓度化验和待确定的化验(未知样本)。图8示出了根据另一方法使用系统100(称为PLUM)和酶标仪的BCA化验中蛋白质滴定的示例性实验分析。系统100使用原色(RGB)的偏移来量化反应，而另一个酶标仪依靠朗伯比尔定律通过在562nm处的透射率的降低来量化吸光度，其是可见光谱中的绿光。如图8所示，当青色变成紫色时，红色通道值增加，而绿色通道值降低。在根据其它方法的酶标仪中，测量562nm波长的BCA的透射率，其对应于照相机中的绿色通道，如图8所示。示例性实验通过使用由系统100收集的RGB数据产生的校准曲线来确定三个样本的浓度，并用信号计算器分析该数据。将这些结果与使用校准曲线计算的浓度进行比较，其中校准曲线使用商业BiotekTM酶标仪而生成，BiotekTM酶标仪使用562nm吸光度监测化验。在实施例实验的化验中，将一系列BSA蛋白浓度标准加入多孔板中的BCA溶液中，并使用酶标仪根据其它方法和通过系统100测量。在酶标仪中，在562nm的单波长处的透光率被转换为吸光度测量值(如图14的图表所示)。
对于本系统100(称为PLUM)，测试了两种分析方法。第一种方法通过监测绿光降低的-log10值(在图15的图表中示出)将绿色通道值转换为吸光度读数。在这种情况下，使用空白BCA读数将绿色通道读数标准化，并绘制-log10值以将透射率的降低转化为吸光度的增加。第二种方法使用这里描述的信号计算器，其确定红色/绿色比率以绘制校准曲线(在图16的图表中示出)。在这种情况下，用红色相对于绿色的值来表示蛋白质浓度和颜色变化之间的比例关系。然后使用三条校准曲线中的每条分别计算具有已知蛋白质浓度的三个测试样本。如表1和图16所示，当R平方值用作相关性度量时，信号计算器具有最高的线性度。此外，当基于预期浓度比较测量精度时，信号计算器显示这三种技术中的最佳结果。
表1中所示的结果表明，系统100采用的信号计算器可用BCA化验精确地化验蛋白质浓度。表1示出使用系统100和商业BiotekTM酶标仪的不同测量方法的比较结果。已知的分析物浓度(280、1450和1700μg/mL)通过商业读数器中的信号计算器和朗伯比尔定律进行分析。以一式三份的方式进行实验。使用信号计算器的系统100显示出较高的R平方值、较小的采样偏差和较高的精确度。
表1
Figure BDA0003909011430000251
表2示出了用于示例实验的在BCA化验中的化验读数和计算实验。校准样本(125μg/mL至2000μg/mL)和三个未知样本在双辛可宁酸化验中的原始数据读数。从酶标仪(562nm吸光度)和系统100(红色、绿色、蓝色强度)收集数据。计算比较使用1)用于酶标仪读数的朗伯比尔定律，2)使用系统100(称为PLUM)的绿色通道读数，以及3)使用系统100(称为PLUM)的使用反射光(红色/绿色)的信号计算器方法。
表2
Figure BDA0003909011430000261
在进一步的示例性实验中，为了进一步验证系统100的方法，本发明人使用本文所述的朗伯比尔方法和信号计算器进行孔雀绿化验。孔雀绿化验在磷酸盐存在时产生从绿色到紫色的颜色变化(如图17的实施例所示)。根据本系统100中的其它方法和信号计算器和朗伯比尔方法，在酶标仪中使用朗伯比尔方法，使用磷酸盐浓度(4μm至40μm)的滴定来产生用于分析的校准曲线。在酶标仪中监测620nm波长的吸光度，得到R平方值等于0.9916的校准曲线(如图18的图表所示)。对于系统100，由于620nm的波长落入红色通道灵敏度的峰值，基于朗伯比尔定律绘制红色通道强度的降低。使用信号计算器，系统100产生用于磷酸盐样本的滴定的R平方值0.9956(如图19的图表所示)。使用具有PLUM测量的朗伯比尔方法导致0.9691的R平方值(如图20的图表所示)。信号计算器被显示出具有与酶标仪可比的R平方值，同时具有最佳线性。
在进一步的示例性实验中，为了进一步验证系统100的方法，本发明人使用铵化验。铵化验是用于氨/铵定量的简单比色化验的另一实例。该化验基于被称为贝特洛(Berthelot)反应的次氯酸苯酚化验，其中基于溶液中铵的存在而形成蓝色靛酚物质(如图21的实施例所示)。该化验可用于植物组织中的内铵量化，以及用于患者肝功能障碍的筛查的临床使用。使用0.05mM至1mM的铵滴定，由常规酶标仪产生的校准曲线具有0.9983的R平方值(如图22的图表所示)，该R平方值用于测量635nm波长的化验中的铵滴定。由系统100使用信号计算器产生的用于使用蓝色/(红色+绿色)值测量铵滴定的校准曲线具有0.9933的R平方值(如图23的图表所示)。在该示例性实验中的信号计算器使用蓝色相对于红色和绿色的叠加的值来表示从黄色到蓝色的色移。因此，两条校准曲线具有可比较的R平方值。
在进一步的示例性实验中，为了进一步验证系统100的方法，本发明人使用布拉德福化验来量化蛋白质。该化验使用考马斯染(Coomassie dye)，其随着蛋白质的存在以线性方式从棕色变为蓝色(如图24的实施例所示)。蛋白质浓度的滴定(5μg/mL至2000μg/mL)显示出根据其它方法使用酶标仪与595nm处的吸光度成比例的关系。利用使用信号计算器的系统100以及指示测量中小变化的来自两个设备的R平方值，发现了类似的结果。图25显示了在酶标仪中使用595nm吸光度测量蛋白质浓度的图表，图26显示了根据系统100的信号计算器使用蓝色/(红色+绿色)值来测量蛋白质浓度的图表。
在进一步的示例性实验中，为了进一步验证系统100的方法，本发明人使用称为酶联免疫吸附化验(ELISA)的免疫化验类型。该技术使用抗体特异性标记(例如酶联抗体)来提供靶分析物的浓度依赖性检测(如图37的实施例所示)。在这些实施例实验中，进行ELISA检测3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，并使用商业酶标仪(如图38的实施例所示)和使用系统100(如图39的实施例所示)测量所得信号。
在进一步的示例性实验中，为了进一步验证系统100的方法，本发明人使用纸基化验来部署系统。在这些实施例实验中，使用合成的兹卡(Zika)病毒RNA现场进行反应。该化验使用从黄色到紫色的颜色偏移来指示目标RNA的存在。为了表示这种颜色变化，信号计算器使用反射光读数，该读数使用绿色通道值相对蓝色通道值来跟踪化验反应随时间的进展。系统100在整个板内显示出一致的读数，而与孔的位置无关，如图27所示，示出了来自三个不同国家(巴西，厄瓜多尔和哥伦比亚)的现场读数。为了测试系统100中的照明均匀性，将五对反应置于384孔板中。四个反应位于接近拐角处，而第五个反应位于中间。对于每对反应，顶部三组反应是阴性的，而底部组反应是阳性的。通过识别初始捕获的板图像中的四个角标记，系统100生成ROI(感兴趣区域)映射，其中孔位置被圈出作为感兴趣区域，如图28所示。在3小时内监测整个板上的颜色变化，在此期间阳性反应变为紫色并且阴性反应保持黄色，如图29所示。反应的标识由用户通过用户界面108定义。然后自动地将用户定义的映射与所记录的颜色变化相结合，以生成如图30所示的量化报告。预先设定的阈值用虚线表示，以帮助用户区分阳性和阴性反应。然后输出结果。
在进一步的示例性实验中，为了进一步验证系统100的方法，本发明人使用ATTO520染料。该技术使用100至0.01微摩尔浓度的荧光染料稀释液以提供荧光染料浓度的检测(如图42的实施例所示)。在这些示例性实验中，使用商用酶标仪(如图43的示例所示)和使用系统100(如图44的示例所示)测量ATTO 520信号。
在进一步的示例性实验中，为了进一步验证系统100的方法，本发明人使用ATTO550染料。该技术使用100至0.01微摩尔浓度的荧光染料稀释液以提供荧光染料浓度的检测(如图45的实施例所示)。在这些示例性实验中，使用商用酶标仪(如图46的示例所示)和使用系统100(如图47的示例所示)测量ATTO 550信号。
在一些实施例中，系统100可以作为比色、荧光和发光模式的凝胶成像系统来应用。本发明人进行了示例性实验以将系统100的性能与商业成像器(Bio-RadTM的ChemiDoc-ITTM凝胶成像系统)进行比较。
SDS-PAGE是一种分析生化技术，其使用通过丙烯酰胺凝胶的电泳来根据分子量分离蛋白质。该技术通常用于可视化和检测目的蛋白的表达。实施例实验使用在SDS-PAGE中运行的含有增强的黄色荧光蛋白(eYFP)的爱丽丝(ALICE)无细胞溶液。如图31所示，将系统100(称为PLUM)与来自商用成像器的输出进行比较。如箭头所示，系统100可用于使感兴趣的带可视化。使用能够对蛋白质进行可视化的EZBlueTM凝胶染色试剂来染色凝胶。在系统100中，使用广谱白光来照射凝胶托盘，并且不需要使用滤光器。
琼脂糖凝胶电泳用于分离DNA/RNA片段并帮助科学家检测或纯化目标寡核苷酸。实施例实验使用具有孔的琼脂糖凝胶，其中孔含有4.2ng、10ng、17.4ng，40ng和100ng的DNA的系列滴定。这由系统100利用有色LED和专用滤光器的组合来成像。染色溶液具有波长在419nm和513nm之间的可见的激发，并且具有540nm的发射波长。使用具有在440nm至460nm的窄峰带的宝蓝色LED在系统100中实现荧光染料的激发。使用截止波长515nm的长通滤光器来阻挡背景光，仅将发射波长透射到照相机。如图32的比较所示，系统100可以检测每泳道大于17.4ng的DNA浓度。这低于每泳道承载50ng DNA的典型实践，意味着系统100可以为许多DNA凝胶成像应用提供实际支持。
免疫印迹技术可用于对SDS-PAGE凝胶中蛋白质混合物中的目标蛋白质的检测。可以使用对目标蛋白质特异的适当的第一抗体和对第一抗体特异并携带化学发光报告酶的第二抗体来可视化目标蛋白。在实施例实验中使用的化学发光底物一旦被结合到第二抗体的酶激活就发射蓝光/绿光。使用绿色荧光蛋白(GFP)滴定(每孔10ng至30μg)到SDS-PAGE凝胶的孔中并电泳，使用系统100进行免疫印迹和成像。如图33的比较所示，结果表明系统100可记录低至至少224ng/孔的目标蛋白的免疫荧光条带。
在示例性实验中，系统100用于进行患者现场试验以检测兹卡病毒。收集268个患者样本并用系统100检查。如上所述，系统100用于量化由纸基反应中的立足开关(toeholdswitches)产生的颜色变化(黄色到紫色)。将实施例实验与qRT-PCR检测进行比较以提供与工业标准的比较。
为了确定灵敏度，使用qRT-PCR和系统100监测兹卡病毒立足开关无细胞反应，平行测试兹卡病毒的系列稀释。所有样本在加入无细胞反应之前都用NASBA扩增。在qRT-PCR化验中，105-101PFU/mL之间的兹卡病毒滴度确定为阳性，其中阈值设定为Ct(阈值循环数)38。在系统100中，立足开关反应的读数开始在50分钟左右显示了清晰的分离，如图34所示。到兹卡传感器读数的终点(240分钟)，所有qPCR阳性样本都变成紫色(阳性)，而所有qPCR阴性样本都保持黄色(阴性)。考虑从三个独立的立足开关/PLUM实验获得的类似结果，系统100的检测灵敏度被确定为101PFU/mL，这相当于qRT-PCR的灵敏度。
基于上述灵敏度数据，确定用于测量来自患者血清样本的基于兹卡病毒立足开关的传感器的诊断性能的阈值。使用通过qRT-PCR和系统100确认的兹卡阳性和兹卡阴性数据进行逻辑斯蒂测试。一式三份的反应被认为是增加到样本大小以用于更精确的分析的单独数据点。通过减去每次运行中的NASBA阴性值来规范化所有样本数据。通过运行逻辑斯蒂测试，兹卡阳性样本和兹卡阴性样本的蓝色/绿色值之间的差异在70分钟和之后变得统计地显著。在每个时间点，阳性样本的值超过可归类为ZIKV+的阈值。如图35所示，在不同的时间点，阈值波动，但允许从灵敏度测试中清楚区分的阳性和阴性样本。在从70分钟至130分钟的十三个时间点上进行逻辑斯蒂分析，并且值在从0.1183366至0.1668622的范围内。随着ZIKV+样本的蓝色/绿色读数的增加，阈值相应增加，如图36所示。
使用确定的阈值，使用268个患者样本进行患者样本的兹卡病毒状态分析。对于每个实验，包括几个阳性和阴性样本。在PLUM和qPCR实验中收回ZIKV+或ZIKV-样本的原始状态，使得本发明人不知道样本身份以去除任何偏差。在分析268个患者样本的情况下，相对于从70分钟时间点到130分钟时间点的每个阈值分析RNA传感器和PLUM的诊断性能。75分钟后，诊断准确率达98％以上。基于从75分钟到130分钟(除了在105分钟)的阈值，在qPCR和系统100中都有69个具有ZIKV阳性读数的样本(称为真阳性)，在qPCR和系统100中都有195个具有ZIKV阴性读数的样本(称为真阴性)。在qPCR测试中确定4个患者样本是阳性的，但不是由系统100使用当前阈值识别的。基于该实验，可以使用基于立足开关的传感器和系统100在75分钟时确定对兹卡患者样本的诊断。真阳性比率和真阴性比率分别为94％和100％。
在进一步的实施例中，由系统100输出的数据可以被用于样本的成像检测，并且被传递到经过训练的机器学习模型，以提高检测的准确性。
尽管要求很高，但是成本仍然是限制访问酶标仪和成像器以进行光学测量和表征的重要因素。本实施例有利地提供了一种基于照相机的多模式电子读取器，作为低成本实现，以提供可负担的系统。如示例性实验中所示，使用本发明的吸光度测量方法的系统100尤其适用于目前受成本而限制访问酶标仪功能的应用。作为实例，当前系统的实施方案花费约400加元，而商业酶标仪(BioTekTMNeo2)花费约70,000加元。
在一些情况下，用户可以容易地建立新的代码层，以根据他们自己的需要定制系统100。这包括化验设置的定制和数据分析。这使得用户能够快速响应对特定化验的紧急增加的需求，并且可以允许研究人员或临床医生具有更多的带宽来处理实验的需求。
在一些情况下，系统100的输出可以被输出到云计算存储器。在这种情况下，例如，输出可以用作科学教室的交互式教育工具。在这种情况下，例如，输出可以用作协作科学平台，以便通过提供对数据的更容易的访问来促进位于不同区域的组之间的协作。在一些情况下，车载控制器102允许通过远程登录到系统100以便于维护，这样可以更快速地进行故障排除，并提供更好的客户服务。
除了这里所描述的应用之外，应当理解，对于系统100存在并可以存在许多其它合适的应用。作为实例，系统100可用于：监测基于量化等温扩增的诊断；用于pH测量的数字替代物；小物体的跟踪、检测和量化(例如，用于工业的螺纹尺寸、长度和数量的光学螺旋分类)等等。
有利的是，本公开的实施例允许使用普通LED和普通照相机/成像传感器，而不是通常在酶标仪和凝胶成像器中使用的昂贵的专门的单波长光发射器和传感器。同样有利的是，本公开的实施例允许通过使用不同LED的多个照明来检测分子的存在，其中所述不同LED与照相机前面的合适的滤光器相耦合，以便实现荧光测量。这些测量的色阶的比率(RGB通道色阶随时间的偏移，以及通道之间的偏移)可以用于通过将测量的色阶与校准曲线进行比较来实现等效的吸收测量。这与使用单个光源的单个或多个照明来测量吸收或荧光的其它方法相反，其通常提供较低的精确度。
尽管已经参考某些特定实施例描述了上述内容，但是在不脱离如所附权利要求书所概述的本发明的精神和范围的情况下，对本领域技术人员来说，其各种修改将是显而易见的。上述所有参考文献的全部公开内容通过引用结合到本文中。

Claims (20)

1.一种用于表征来自化验外壳上的多个感兴趣区域(ROI)的化验的系统，所述系统包括：
照明源，用于照明所述ROI；
照相机，用于从所述多个ROI接收所述化验的图像数据，所述图像数据包括用于每个ROI的至少两个颜色通道；以及
控制器，包括一个或多个处理器和存储器，所述一个或多个处理器被配置为执行：
测量模块确定每个ROI的颜色通道上的信号变化的比率，并且使用校准曲线将所述信号变化的比率转换为所述化验的浓度确定，所述校准曲线由具有已知浓度的校准化验的图像数据确定；以及
输出模块输出用于每个ROI的浓度确定。
2.如权利要求1所述的系统，其中，所述照明源包括用于比色化验的具有均匀强度的宽带光源。
3.如权利要求1所述的系统，其中，所述照明源包括与用于荧光化验的发射滤光器相结合的窄带激发光源。
4.如权利要求1所述的系统，其中，所述浓度确定是通过比较终点读数处的校准曲线浓度或比较随时间进程反应的校准曲线浓度来确定的。
5.如权利要求1所述的系统，其中，从所述多个ROI接收所述化验的图像数据包括吸光度、荧光或发光读数中的至少一个。
6.根据权利要求1所述的系统，其中，所述系统执行酶标仪和凝胶成像器中的至少一个的功能。
7.如权利要求1所述的系统，还包括用于使用热对流、传导或辐射而进行现场培养的热元件。
8.如权利要求1所述的系统，还包括与所述化验外壳相关联的界标，用于由所述控制器进行ROI位置识别。
9.如权利要求7所述的系统，其中，所述界标包括位于所述化验壳体的板载体上或所述化验壳体的多孔板的四个角上的标记，并且其中所述控制器识别所述界标并将所述界标与多孔板的数字模板图像对准以确定所述多个ROI的位置。
10.如权利要求1所述的系统，其中，还包括与所述化验外壳相关联的条形码，以通过所述控制器确定样本类型和分析协议。
11.如权利要求1所述的系统，其中，还包括位于所述照相机前面的不透明膜，以阻挡不希望的光。
12.如权利要求1所述的系统，其中，所述图像数据中的所述多个ROI可被动态地定义。
13.一种用于表征来自多个感兴趣区域(ROI)的化验的方法，所述方法包括：
在照明期间从所述多个ROI接收所述化验的图像数据，所述图像数据包括用于每个ROI的至少两个颜色通道；确定每个ROI跨越所述颜色通道的信号变化的比率；使用校准曲线将每个ROI的信号变化的比率转换为所述化验的浓度确定，所述校准曲线由具有已知浓度的校准化验的图像数据确定；以及
输出每个ROI的所述浓度确定。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述照明包括用于比色化验的具有均匀强度的宽带光源。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述照明源包括与用于荧光化验的发射滤光器相结合的窄带激发光源。
16.如权利要求13所述的方法，其中，所述浓度确定是通过比较终点读数处的校准曲线浓度或比较随时间进程反应的校准曲线浓度来确定的。
17.根据权利要求13所述的方法，其中，从所述多个ROI接收所述化验的图像数据包括吸光度、荧光或发光读数中的至少一个。
18.如权利要求13所述的方法，其中，所述信号变化的比率包括增加的通道值的和与减小的通道值的和的比率。
19.根据权利要求13所述的方法，其中，将每个ROI的所述信号变化的比率转换为所述浓度确定包括使用奇异值分解来映射从终点反应的稀释系列收集的已知浓度数据样本以确定未知样本。
20.如权利要求13所述的方法，其中，确定所述信号变化的比率包括用时间序列反应数据训练人工智能模型以确定具有随时间的一致增加并在时间上为最终点提供最佳线性的函数。
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