JP4883501B2 - 総発光量測定基準容器および測定方法 - Google Patents
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Seliger et.ai.,Archives of Biochemistry and Biophysics,88,136−141(1960) 彼らは、外径1インチで底面がフラットなシリンダー型の容器を用い、シリンダー型の容器内の液量を変化させて光量を測定し、液量ゼロの点に外挿した値と点光源近似を用いた薄膜に対する計算の比較によって、総発光量を求めようとしていた。しかし、この方法では、液量が少なくなるにつれて表面張力によって中央部よりも周囲の液量が多くなることが考慮されていなかった。その後、Lieらは、同様の容器を用いる場合でも容器内の溶液と検出器までの空気層の屈折率の違いによる補正が必要になると指摘してはいたが、彼らもSeligerらと同様に点光源近似を続け、点光源近似を用いたことによる不確かさが考慮されていなかった。それ以降は、発光測定において基準となる容器は提案されていない。
最良な形の総発光量測定基準容器6を図1に示した。総発光量測定基準容器はセル1とマスク板2から構成される。セル1は、厚さt1mmの2枚の可視光を透過する薄板3、5と、厚さt0mmの薄板のスペーサー4から成る。マスク板2は、直径dmmの円形状のくり抜かれた面積Sの窓を中央部に有し、反射が起こらないように全ての面が黒色に処理されていて、薄板3または5に重ねるか、薄板と平行至近に設置して使用する。またマスク板2と薄板とは一体化させて構成させても良い。また、マスク板2の窓は円形である必要はなく、窓の面積を正確に求められるのであれば窓の形状は問わない。マスク板2の窓の大きさは、発光測定にもちいる測定容器9の窓とほぼ同じであることが必要である。
ここで、NAは、アイリス7の直径aとアイリスまでの距離rとにより規定される開口数NA=sinθ(ただしtanθ=a/2r)である。光の屈折により、内部の開口数NAiはNAi=NA/niとなり、これが有効な開口数となり(2)式が得られる。
1)図4の測定系に総発光量測定基準容器6を設置したときの集光効率η(基準容器)を(2)式で求め、マスク板2の窓に対応するセル1の内部容積V0を求める。
2)比較用発光溶液を調製する。
3)総発光量測定基準容器6に比較用発光溶液を注入し、図4の測定系に総発光量測定基準容器6を設置し、X1秒の発光量Nrを実測する。
4)図4の測定系に測定容器9を設置し、測定容器に実試料測定の際の液量Vと同量の比較用発光溶液を注入し、X2秒の発光量Nsを実測する。
5)3)4)から測定容器9の相対的集光効率η(ratio)を(4)式で求める。
6)測定容器9の集光効率ηは5式で決定される。
η=η(基準容器)×η(ratio) −−−−(5)
図1に示した総発光量測定基準容器6は、セル1はガラス製で、寸法d=4.5(mm),t0=0.5(mm),t1=0、9(mm),D=30(mm)のものを用いた。マスク板2は厚さ1mmのアルミ製で黒アルマイト処理したものを用いた。このマスク板の窓に対応するセル1の内部容積は8.0μLである。図4に示した集光光学系14は、ミラー11を省略した図3として表すことができ、本実施例においてアイリス7はr=73.5mm、a=20mmとなるように配置した。比較用発光溶液の屈折率は1.33だから、η(基準容器)は0.258(%)と計算される。
比較用発光溶液は長時間にわたり発光量が安定していることが好ましいので、本実施例では、ホタルの発光基質であり発光の半減期が7.5時間と長いピッカジーンLT−7.5(市販品、東洋ビーネット社製)と北米産ホタルから抽出精製したルシフェラーゼ(市販品、SIGMA社製)を用いた。6×107Mのルシフェラーゼ3μLをピッカジーン1mLに混合した溶液は25℃において、30分から2時間は一定の発光値を示すことを確認できたので、これを比較用発光溶液とした。
図4の微弱絶対光量計測装置13は、絶対光量である光子数として計測できるものが好ましいが、測定容器の集光効率を求めることが主であれば、発光量を数値化できるだけでよく、ここでは冷却CCDカメラを使用した。測定容器は、底部がフラットな内径4mm、高さ20mmの透明アクリル管状のもの(アクリルセル)、1個のウェルサイズが3.5×3.5×10.4mm3の市販384マイクロプレートで透明なもの(透明プレートセル)、384マイクロプレートで白色及び黒色のもの(白プレートセル、黒プレートセル)を準備した。これらの測定容器に100μLの発光標準溶液を注入し、アクリルセルはセル底部から、3種類のプレートセルはセル上部から発光量を計測した。その結果から求めた相対的集光効率η(ratio)と集光効率ηを表1に示した。
2 マスク板
3 薄板
4 スペーサー
5 薄板
6 総発光量測定基準容器
7 アイリス
8 集光レンズ
9 測定容器
10 測定容器の窓
11 ミラー
12 入射ポート
13 微弱絶対光量計測装置
14 集光光学系
15 総発光量測定装置
Claims (4)
- 測定容器中の試料が発する総発光量を測定するための総発光量測定基準容器であり、総発光量測定基準容器は溶液注入部が1箇所以上ある扁平な直方体型であり、平行に相対した面の少なくともひとつの面は中央部に窓があり、その面においては窓以外の部分は透過および反射しないようにマスクされていて、単位容積あたりの発光量を計算できる総発光量測定容器。
- 請求項1記載の総発光量測定基準容器の窓から放射される光のうち光検出器に入射する光の割合を幾何学的に求められる総発光量測定装置と比較用発光溶液とを用いて、総発光量測定基準容器と測定容器からの発光量を実測し、総発光量測定基準容器の集光効率と測定容器の相対的集光効率とから総発光量を求め、発光測定を標準化する方法。
- 請求項1記載の総発光量測定基準容器の集光効率が幾何学的に求められる集光光学系と微弱絶対光量計測装置から構成された総発光量測定基準容器および測定容器の発光量が計測できる総発光量測定装置。
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