JP3585439B2 - 発光測定方法及び発光測定装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は発光関連物質の発光測定方法及びその装置にかかる。発光とは発光物質と発光に関与する酵素と補因子との反応によって起こる現象であり、ここでは発光物質と酵素と補因子とを発光関連物質として説明する。発光現象には化学発光と生物発光とあり今、例えばホタルなど生物によって起こる生物発光においては発光物質はルシフェリンであり、酵素はルシフェラーゼ、補因子はＡＴＰ、マグネシュウムである。
【０００２】
【従来の技術】
これら発光関連物質は濃度によって発光量が変わり、また、これを定量するには光センサとして光電子倍増管やＣＣＤ等を用いた発光測定装置が利用されているが、これら発光測定装置は一般に発光関連物質の溶液の発光量を相対的な光強度値に変換するだけであって、同じ発光量でっても得られる相対発光強度値は装置間で全く異なっていた。従って発光関連物質を定量するには当該発光関連物質の濃度の異なる溶液を多数調製し、個々の濃度における相対発光強度を測定後、これらの値を濃度に対してプロットした濃度校正曲線を作成しなければならなかった。溶液量を変える場合もこの濃度校正曲線は作り直す必要があった。複数の測定装置を使用する場合は装置毎に濃度校正曲線の作成が必要であり、この発光測定における定量作業の効率の悪いことが従来の大きな欠点であった。
【０００３】
また、従来の発光測定装置には、光子を測定する形式の発光測定装置があったが、これは発光測定物質のセンサに入射した光子の一部が計測されるだけで、総光子数を計測することはできなかった。従ってこの光子の一部計測の場合も同様に濃度校正曲線を作成する必要があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明では相対発光強度の計測の代わりに光子数計測を用い、濃度校正曲線を作成しなくてもよい発光測定方法及び発光測定装置を提起するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明による発光測定方法は、上記目的を達成するため、発光標準物質が発する発光量を総光子数として計測するために光子数計測装置を準備し、該計測の標準となる発光標準物質の溶液を作り、該発光標準物質溶液が単位容積、単位時間、単位濃度当たりに放射する総光子数を上記光子数計測装置で先ず実測しておき、該発光標準物質溶液を用いて発光測定装置の相対的発光強度を光子数に変換し、発光関連物質の総光子数を定量することを特徴とする。
【０００６】
本発明による発光測定装置は、上記目的を達成するため、発光標準物質が発する発光量を総光子数として計測するために光子数計測装置を準備し、該計測の標準となる発光標準物質の溶液を作り、該発光標準物質溶液が単位容積、単位時間、単位濃度当たりに放射する総光子数を上記光子数計測装置で先ず実測しておき、該発光標準物質溶液を用いて発光測定装置の相対的発光強度を光子数に変換し、発光関連物質の総光子数を定量するように構成され、前記光子数計測装置は、発光標準物質溶液試料固定用ステージ、該試料観察用レンズ、ＣＣＤカメラとから構成し、この試料観察用レンズに光ファイバでカップリングされたレーザ光を導入し、ＣＣＤカメラでは光ファイバ端の像を観察し、ＡＤ変換によって相対的な光強度として数値化する光子数計測装置であることを特徴とする。
【０００７】
【発明の効果】
本発明によれば、標準発光物質があればこれまで使用されてきたすべての従来型発光測定装置の相対発光強度値を光子数に変換でき、世界共通の数値に基づく比較が実現できる。従来は濃度校正曲線の作成に複数の標準溶液を用意せねばならなかったが、本発明によれば一種類の発光標準物質溶液の測定ですみ作業性が向上する。また過去に単位時間、単位容量当たりの光子数が報告された測定対象試料はその値を調べるだけで簡単に定量できる様になる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を具体的に説明する。本発明の上記課題を解決する手段は次の各段階よりなるが以下に分説する。
標準光子数を与える発光標準物質溶液の準備。
発光標準物質溶液としてはホタルの発光のように既知の発光反応に寄与している物質が利用できるが、この溶液は従来の様に定量する物質と同じ物質を含む必要はなく、ただ発光波長が同じであれば利用できる。しかもこれも発光測定装置に使用されている光電子倍増管等の光検出器の波長に対する量子効率が既知であれば発光波長が違っていてもよい。
【０００９】
光子数計測装置の準備。
発光標準物質溶液が決まればその発光量を光子単位で実測する。そこで本発明においては発光標準物質溶液とその単位容量、単位時間当たりの発光量を光子数として測定できる光子数計測装置を作らねばならないがこの光子数換算のできる光子数計測装置は、試料固定用ステージ、試料観察用レンズ、ＣＣＤカメラとから構成する。この光子数計測装置の試料観察用レンズに光ファイバでカップリングされたレーザ光を導入し、この光のエネルギ強度はパワーメータで測定しておく。ＣＣＤカメラでは光ファイバ端の像が観察でき、暗所では光ファイバ端のエネルギ強度に比例した明るさの像となる。この明部はＡＤ変換によって相対的な光強度として数値化される。
【００１０】
ここで得られる相対値が相対発光強度値であり、その１単位当たりの光子数は次式により求めることが出来る。
今、波長λをオングストロームで表すと光子１個のエネルギＥは：
Ｅ＝ｈν＝ｈｃ／λ＝１２３９８／λ［ｅＶ］
但し、ｈ；プランクの定数、ν；振動数、ｃ；光速
パワーメータで測定できる基準光源のエネルギ単位Ｗは：
Ｗ＝Ｊ／sec
１ｅＶ＝１．６×１０^-19 Ｊ から基準光源の光子数Ｐは：
Ｐ＝Ｗ_s ／（１．６×１０^-19 ×Ｅ）［光子／sec ］
但し、Ｗ_s ；基準光源のパワーメータによるエネルギー実測値。
以上から検出器１単位当たりの光子数（Ｐ_F ）は：
Ｐ_F ＝Ｐ／１秒間の相対発光強度値
と求められる。
【００１１】
ＣＣＤは波長によりシグナルへの変換効率が異なる為、複数の波長での測定が必要な場合は、波長毎に量子効率が分かっているＣＣＤを用いるか、夫々の波長の基準光源から光子数変換を行う。
【００１２】
発光標準物質溶液の発光量計測。
次に上記で準備した光子数計測装置を用いてこの発光標準物質溶液の光子数計測をするが、発光標準物質溶液の単位容積、単位時間当たりの発光量を次のように求める。発光標準物質溶液の液滴を試料ステージにとり、この発光をＣＣＤカメラで観察し、この明部をＡＤ変換し数値化する。この時に得られる数値は既に光子数に変換可能であるから観察用レンズを透過した光子数を求めることができる。液滴から全方位に放射される光のうち観察用レンズを透過する光子の割合（効率η）は次式で求められる。：
η＝｛１−（１−siｎ² θ）^1/2 ｝／２
但し、θ；液滴から見て光軸とレンズ有効径とのなす角。
単位容積、単位時間の発光量（Ｐ）は：
Ｐ＝Ｐ_F ×相対発光強度値／（ｎ×液滴容量×観察時間）
で与えられる。
さらに液滴中に含まれる発光関連物質濃度がわかる場合は、単位濃度当たりの発光量を求めることができる。
【００１３】
発光測定装置の校正。
従来の発光測定装置は光子数は測定できず相対発光強度しか測定できないが、ここで発光標準物質溶液を用い、従来の相対発光強度発光測定装置の光子数変換係数を次のように求める。容器に一定量の発光標準物質溶液をとり単位時間当たりの相対発光強度値を測定する。ただし相対発光強度は恒常的に発生するノイズは差し引いた値とする。この溶液から出る単位時間、単位容量当たりの光子数はＰであるから単位時間の相対発光強度（Ｉ_R ）当たりの光子数変換係数（Ｆ_PS）が求められる。
Ｆ_PS＝Ｐ_A ／Ｉ_R ＝（Ｐ×容量）／Ｉ_R
但し、Ｐ_A ；溶液が単位時間に出す総光子数 （Ｐ_A ＝Ｐ×容量）
更に必要があれば発光標準物質溶液の容量を変えて光子数変換係数を求めておく。
【００１４】
ここまでの処理で相対発光強度を絶対的な単位である光子数に変換できる様になり複数の装置間の値の比較がはじめて可能となる。測定装置の波長毎の量子効率が既知であれば、次式によりその波長に応じた光子数換算ができる。
波長λ₁ における光子数変換係数（Ｆ_P λ₁ ）は：
Ｆ_P λ₁ ＝Ｆ_PS×（Ｑ_S ／Ｑλ₁ ）＝（Ｐ×容量×Ｑ_S ）／（Ｉ_R ×Ｑλ₁ ）
但し、Ｑ_S ；発光標準物質溶液の発光波長における量子効率
Ｑλ₁ ；波長λ₁ における量子効率
と求めることができる。
【００１５】
未知試料の計測。
本発明による発光関連物質の光子数の定量では発光標準物質溶液に定量したい物質が含まれる場合と含まれない場合とがある。
前者の場合は相対発光強度を求めるだけでよい。発光標準物質溶液中に含まれる発光関連物質の分子数をＮ_S とすると、
１分子が単位時間に出す光子数Ｐ₁ は： Ｐ₁ ＝Ｐ_A ／Ｎ_S 、
従って未知試料溶液中の発光関連物質の分子数Ｎは：
Ｎ＝（Ｉ_R ×Ｆ_PS）／Ｐ₁ となる。
後者の場合は測定しようとする発光関連物質を一定量含む溶液を調製し、図１に示した装置で１分子が出す単位時間の光子数を求める。また、発光関連物質の発光波長λ₁ における光子数変換係数Ｆ_P λ₁ を求め、次式により未知試料溶液中の発光関連物質の分子数Ｎを求める。
Ｎ＝（Ｉ_R ×Ｆ_P λ₁ ）／Ｐ₁
【００１６】
光子数計測装置の組立・校正。
本発明方法によるホタルの発光関連物質であるルシフェラーゼを定量するに用いる光子数計測装置の実施例を図１、図２に示す。この装置は有効径４０ｍｍのレンズ２を取り付けた冷却ＣＣＤカメラ１を暗所に設置し、該レンズ２から３３０ｍｍの位置に試料を設置できるようにした。標準光源５は５ｍＷのＨｅＮｅレーザ６３３ｎｍを用い、ニュートラルフィルタで１／１０⁹ に減光し、ファイバカップリング装置を用いてマルチモードファイバ４をつなぎ、ファイバ４の一方の端の光を冷却ＣＣＤカメラ１に１秒間蓄積した。この時のファイバ端のエネルギは３×１０^-12 Ｗであり、この像から相対的な数値１単位当たり７３光子という値を得た。
【００１７】
発光標準物質溶液の調製。
発光標準物質溶液であるホタルルシフェラーゼの調製のため、ホタルルシフェラーゼを２５ｍＭグリシルグリシン、１５ｍＭ硫酸マグネシウム（ＰＨ7.8 水酸化ナトリウムで調整）に溶解した。この２マイクロリットルにはルシフェラーゼ２００ナノグラムが含まれており、これに０．５ｍＭルシフェリン２マイクロリットルを添加した時に起こる発光をＣＣＤカメラで１０秒間測定し、３２１５７０／１０sec という相対発光強度値を得た。ルシフェラーゼは５５０ｎｍに発光極大波長をもつ発光酵素である。この５５０ｎｍにおけるＣＣＤの量子効率は上記した６３３ｎｍに比較し、１．３８倍高いことから相対発光強度値１単位は５３光子に相当する。
【００１８】
レンズ有効径４０ｍｍとレンズと試料との距離３３０ｍｍからレンズを透過する光子の割合は η＝９．２×１０^-4、
従って総光子数Ｐ_A は３２１５７０×５３／η≒１．８×１０¹⁰［光子／１０sec ］。
今、ルシフェラーゼの分子量を５００００とすると２００ｎｇの分子数は
６．０２×１０²³×２００×１０^-9／（５×１０⁴ ）＝２．４×１０¹²、
１分子が１秒間に出す光子数は、
１．８×１０⁹ ／（２．４×１０¹²）≒０．０００８
と求められる。尚、光子数は小数では表せないが、ここでは計算上小数を有効とする。
【００１９】
発光測定装置の校正。
この発光試薬を発光標準物質溶液として、ルシフェラーゼ２００ｎｇの発光量を相対発光強度しか測定できない従来発光測定装置で計測したところ、
２．６×１０⁷ ／sec の相対発光強度値が得られた。
この装置の相対発光強度値１単位は、
１．８×１０⁹ ／（２．６×１０⁷ ）≒６９［光子／相対発光強度値１］
と計算できる。
【００２０】
未知試料の計測。
この値に基づき未知試料を測定すると相対カウント値からルシフェラーゼ量を容易に決定することができる。ルシフェラーゼの濃度がわからない試料の１秒間の相対発光強度は３９２であった。その光子数は、
６９×３９２＝２７０４８［光子］。
ルシフェラーゼ量は、
２７０４８／０．０００８＝３．４×１０⁷ ［分子］ ＝３．４×１０⁷ ／（６．０２×１０²³）＝５．６７×１０^-17 ［ｍｏｌ］
と求めることができた。
【００２１】
以上説明した実施の形態によれば、標準発光物質があればこれまで使用されてきたすべての従来型発光測定装置の相対発光強度値を光子数に変換でき、世界共通の数値に基づく比較が実現できる。従来は濃度校正曲線の作成に複数の標準溶液を用意せねばならなかったが、本発明によれば一種類の発光標準物質溶液の測定ですみ作業性が向上する。また過去に単位時間、単位容量当たりの光子数が報告された測定対象試料はその値を調べるだけで簡単に定量できる様になる。この単位時間、単位容量当たりの光子数は吸収光度分析における吸光度に相当する。顕微鏡下での発光測定においてもこれまでは相対的な発光量の増減しか分からなかったが対物レンズを透過する光子の割合（効率η）は、
η＝｛１−（１−ＮＡ² ）^1/2 ｝／２ 但し、ＮＡ：開口数
と求めることができるので、個々の細胞に局在する発光関連物質量も測定することが可能である。
【００２２】
ある特定の遺伝子の転写活性を知りたい場合、その遺伝子の転写活性調節領域をクローニングし、ＣＡＴやルシフェラーゼ遺伝子等の遺伝子発現検出用ベクタに挿入、特定の細胞に遺伝子導入することで転写活性量を測定できる。この場合、ルシフェラーゼ遺伝子を用いると発光量を測定することで転写活性量が定量化可能である。本発明によれば顕微鏡下で個々の細胞毎に転写活性を定量化できるようになる。即ち細胞毎の転写活性を測定するにあたり、顕微鏡下では従来技術のように濃度校正曲線を作成することは甚だ困難であったが、本発明による光子数計測を用いれば転写活性の定量化が初めて達成出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法達成に使用する光子数計測装置の原理を示す概略図である。
【図２】図１の観察用レンズと試料ステージとの位置関係の詳細を示す図である。
【符号の説明】
１・・・ＣＣＤ カメラ
２・・・観察用レンズ
３・・・試料ステージ
４・・・光フアイバ
５・・・基準光源

Claims (2)

1. 発光標準物質が発する発光量を総光子数として計測するために光子数計測装置を準備し、該計測の標準となる発光標準物質の溶液を作り、該発光標準物質溶液が単位容積、単位時間、単位濃度当たりに放射する総光子数を上記光子数計測装置で先ず実測しておき、該発光標準物質溶液を用いて発光測定装置の相対的発光強度を光子数に変換し、発光関連物質の総光子数を定量することを特徴とする発光測定方法。
2. 発光標準物質が発する発光量を総光子数として計測するために光子数計測装置を準備し、該計測の標準となる発光標準物質の溶液を作り、該発光標準物質溶液が単位容積、単位時間、単位濃度当たりに放射する総光子数を上記光子数計測装置で先ず実測しておき、該発光標準物質溶液を用いて発光測定装置の相対的発光強度を光子数に変換し、発光関連物質の総光子数を定量するように構成され、
   前記光子数計測装置は、発光標準物質溶液試料固定用ステージ、該試料観察用レンズ、ＣＣＤカメラとから構成し、この試料観察用レンズに光ファイバでカップリングされたレーザ光を導入し、ＣＣＤカメラでは光ファイバ端の像を観察し、ＡＤ変換によって相対的な光強度として数値化する光子数計測装置であることを特徴とする発光測定装置。

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