JP2002181712A - 発光関連物質の発光定量方法及びその装置。 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明では相対発光強度の計測のかわりに光
子数計測を用いる定量法を新たに提起し、従来の煩わし
い濃度校正曲線の作成を排除しようとするものである。 【解決手段】 発光量を光子数として計測できる光子数
計測装置を準備し、該計測の基準となる発光基準物質の
溶液を作り、該発光基準物質溶液が単位容積、単位時
間、単位濃度当りに放射する総光子数を上記光子数計測
装置で先ず実測しておき、該発光基準物質溶液を用いて
発光測定装置の相対的発光強度を光子数に変換し、測定
しようとする試料である発光関連物質の光子数を決定す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】本発明は発光関連物質の発光
測定方法及びその装置にかかる。発光とは発光物質と発
光に関与する酵素と補因子との反応によって起こる現象
であり、ここでは発光物質と酵素と補因子とを発光関連
物質として説明する。発光現象には化学発光と生物発光
とあり今、例えばホタルなど生物によって起こる生物発
光においては発光物質はルシフェリンであり、酵素はル
シフェラーゼ、補因子はＡＴＰ、マグネシュウムであ
る。

【従来の技術】これら発光関連物質は濃度によって発光
量が変わり、また、これを定量するには光センサとして
光電子倍増管やＣＣＤ等を用いた発光測定装置が利用さ
れているが、これら発光測定装置は一般に発光関連物質
の溶液の発光量を相対的な光強度値に変換するだけであ
って、同じ発光量であっても得られる相対発光強度値は
装置間で全く異なっていた。従って発光関連物質を定量
するには当該発光関連物質の濃度の異なる溶液を多数調
製し、個々の濃度における相対発光強度を測定後、これ
らの値を濃度に対してプロットした濃度校正曲線を作成
しなければならなかった。溶液量を変える場合もこの濃
度校正曲線は作り直す必要があった。複数の測定装置を
使用する場合は装置毎に濃度校正曲線の作成が必要であ
り、この発光測定における定量作業の効率の悪いことが
従来の大きな欠点であった。

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明では相対
発光強度の計測の代わりに光子数計測を用い、濃度校正
曲線を作成しなくてよい測定方法及びその装置を提起す
るものである。

【課題を解決するための手段】本発明の上記課題を解決
する手段は次の各段階よりなるが以下に分説する。 標準光子数を与える発光標準物質溶液の準備。 発光標準物質溶液としてはホタルの発光のように既知の
発光反応に寄与している物質が利用できるが、この溶液
は従来の様に定量する物質と同じ物質を含む必要はな
く、ただ発光波長が同じであれば利用できる。しかもこ
れも発光測定装置に使用されている光電子倍増管等の光
検出器の波長に対する量子効率が既知であれば発光波長
が違っていてもよい。 光子数計測装置の準備。 発光標準物質溶液が決まればその発光量を光子単位で実
測する。そこで本発明においては発光標準物質溶液とそ
の単位容量、単位時間当りの発光量を光子数として測定
できる光子数計測装置を作らねばならないがこの光子数
換算のできる光子数計測装置は、試料固定用ステージ、
試料観察用レンズ、ＣＣＤカメラとから構成する。この
光子数計測装置の試料観察用レンズに光フアイバでカッ
プリングされたレーザ光を導入し、この光のエネルギ強
度はパワーメータで測定しておく。ＣＣＤカメラでは光
フアイバ端の像が観察でき、暗所では光フアイバ端のエ
ネルギ強度に比例した明るさの像となる。この明部はＡ
Ｄ変換によって相対的な光強度として数値化される。こ
こで得られる相対値が相対発光強度値であり、その１単
位当たりの光子数は次式により求めることが出来る。
今、波長をオングストロームで表すと光子１個のエネル
ギＥは： Ｅ＝ｈν＝ｈｃ／λ＝１２３９８／λ［ｅＶ］ 但し、ｈ；プランクの定数、ν；振動数、Ｃ；光速 パワーメータで測定できる基準光源のエネルギ単位Ｗ
は： Ｗ＝Ｊ／ｓｅｃ １ｅＶ＝１．６×１０^−１９Ｊから基準光源の光子数Ｐ
は： Ｐ＝Ｗ_ｓ／（１．６×１０^−１９×Ｅ）［光子／ｓｅ
ｃ］ 但し、 Ｗ_ｓ；基準光源のパワメータによるエネルギー
実測値。以上から検出器１単位当りの光子数（Ｐ_Ｆ）
は： Ｐ_Ｆ＝Ｐ／１秒間の相対発光強度値 と求められる。ＣＣＤは波長によりシグナルへの変換効
率が異なる為、複数の波長での測定が必要な場合は、波
長毎に量子効率が分かっているＣＣＤを用いるか、夫々
の波長の基準光源から光子数変換を行う。 発光標準物質溶液の発光量計測。 次に上記で準備した光子数計測装置を用いてこの発光標
準物質溶液の光子数計測をするが、発光標準物質溶液の
単位容積、単位時間当たりの発光量を次のように求め
る。発光標準物質溶液の液滴を試料ステージにとり、こ
の発光をＣＣＤカメラで観察し、この明部をＡＤ変換し
数値化する。この時に得られる数値は既に光子数に変換
可能であるから観察用レンズを透過した光子数を求める
ことができる。液滴から全方位に放射される光のうち観
察用レンズを透過する光子の割合（効率η）は次式で求
められる。： 但し、 θ：液滴から見て光軸とレンズ有効径とのなす
角。単位容積、単位時間の発光量（Ｐ）は： Ｐ＝Ｐ_Ｆ×相対発光強度値／（η×液滴容量×観察時
間） で与えられる。さらに液滴中に含まれる発光関連物質濃
度がわかる場合は、単位濃度当りの発光量を求めること
ができる。 発光測定装置の校正。 従来の発光測定装置は光子数は測定できず相対発光強度
しか測定できないが、ここで発光標準物質溶液を用い、
従来の相対発光強度発光測定装置の光子数変換係数を次
のように求める。容器に一定量の発光標準物質溶液をと
り単位時間当りの相対発光強度値を測定する。ただし相
対発光強度は恒常的に発生するノイズは差し引いた値と
する。この溶液から出る単位時間、単位容量当りの光子
数はＰであるから単位時間の相対発光強度（Ｉ_Ｒ）当り
の光子数変換係数（Ｆ_ＰＳ）が求められる。 Ｆ_ＰＳ＝Ｐ_Ａ／Ｉ_Ｒ＝（Ｐ×容量）／Ｉ_Ｒ 但し、Ｐ_Ａ；溶液が単位時間に出す総光子数 （Ｐ_Ａ＝
Ｐ×容量） 更に必要があれば発光標準物質溶液の容量を変えて光子
数変換係数を求めておく。ここまでの処理で相対発光強
度を絶対的な単位である光子数に変換できる様になり複
数の装置間の値の比較がはじめて可能となる。測定装置
の波長毎の量子効率が既知であれば、次式によりその波
長に応じた光子数換算ができる。波長λ１における光子
数変換係数（Ｆ_Ｐλ１）は： Ｆ_Ｐλ１＝Ｆ_ＰＳ×（Ｑ_Ｓ／Ｑ_λ１）＝（Ｐ×容量×Ｑ
_Ｓ）／（Ｉ_Ｒ×Ｑ_λ１） 但し、 Ｑ_Ｓ ；発光標準物質溶液の発光波長における
量子効率 Ｑ_λ１；波長_λ１における量子効率 と求めることができる。 未知試料の計測。 本発明による発光関連物質の光子数の定量では発光標準
物質溶液に定量したい物質が含まれる場合と含まれない
場合とがある。前者の場合は相対発光強度を求めるだけ
でよい。発光標準物質溶液中に含まれる発光関連物質の
分子数をＮ_Ｓとすると、 １分子が単位時間に出す光子数Ｐ_１は： Ｐ_１＝Ｐ_Ａ
／Ｎ_Ｓ、 従って未知試料溶液中の発光関連物質の分子数Ｎは： Ｎ＝（Ｉ_Ｒ×Ｆ_ＰＳ）／Ｐ_１となる。後者の場合は測定
しようとする発光関連物質を一定量含む溶液を調製し、
図１に示した装置で１分子が出す単位時間の光子数を求
める。また、発光関連物質の発光波長λ１における光子
数変換係数Ｆ_{Ｐ １}を求め、次式により未知試料溶液中
の発光関連物質の分子数Ｎを求める。 Ｎ＝（Ｉ_Ｒ×Ｆ_Ｐλ１）／Ｐ_１

【実施の形態】光子数計測装置の組立・校正。 本発明方法によるホタルの発光関連物質であるルシフェ
ラーゼを定量するに用いる光子数計測装置の実施例を図
１、図２に示す。この装置は有効径４０ｍｍのレンズ２
を取り付けた冷却ＣＣＤカメラ１を暗所に設置し、該レ
ンズ２から３３０ｍｍの位置に試料を設置出来る様にし
た。基準光源５は５ｍＷのＨｅＮｅレーザ６３３ｎｍを
用い、ニユートラルフイルタで１／１０^９に減光し、フ
アイバカップリング装置を用いてマルチモードフアイバ
４をつなぎ、フアイバ４の一方の端の光を冷却ＣＣＤカ
メラ１に１秒間蓄積した。この時のフアイバ端のエネル
ギは３×１０^−１２Ｗであり、この像から相対的な数値
１単位当たり７３光子という値を得た。 発光標準物質溶液の調製。 発光標準物質溶液であるホタルルシフエラーゼの調製の
ため、ホタルルシフエラーゼを２５ｍＭグリシルグリシ
ン、１５ｍＭ硫酸マグネシウム（ＰＨ７．８水酸化ナト
リウムで調整）に溶解した。この２マイクロリットルに
はルシフエラーゼ２００ナノグラムが含まれており、こ
れに０．５ｍＭルシフェリン２マイクロリットルを添加
した時に起こる発光をＣＣＤカメラで１０秒間測定し、
３２１５７０／１０ｓｅｃという相対発光強度値を得
た。ルシフエラーゼは５５０ｎｍに発光極大波長をもつ
発光酵素である。この５５０ｎｍにおけるＣＣＤの量子
効率は上記した６３３ｎｍに比較し１．３８倍高いこと
から相対発光強度値１単位は５３光子に相当する。レン
ズ有効径４０ｍｍとレンズと試料との距離３３０ｍｍか
らレンズを透過する光子の割合は η＝９．２×１０
^−４、従って総光子数Ｐ_Ａは３２１５７０×５３／η：
≒１．８×１０^１０［光子／１０ｓｅｃ］。今、ルシフ
エラーゼの分子量を５００００とすると２００ｎｇの分
子数は ６．０２×１０^２３×２００×１０^−９／（５×１
０^４）＝２．４×１０^１２、 １分子が１秒間に出す光子数は、 １．８×１０^９／（２．４×１０^１２）≒０．０００８ と求められる。尚、光子数は小数では表せないが、ここ
では計算上小数を有効とする。 発光測定装置の校正。 この発光試薬を発光標準物質溶液として、ルシフエラー
ゼ２００ｎｇの発光量を相対発光強度しか測定できない
従来発光測定装置で計測したところ、２．６×１０^７／
ｓｅｃの相対発光強度値が得られた。この装置の相対発
光強度値１単位は、 １．８×１０^９／（２．６×１０^７）≒６９［光子／相
対発光強度値ｌ］ と計算出来る。 未知試料の計測。 この値に基づき未知試料を測定すると相対カウント値か
らルシフエラーゼ量を容易に決定することができる。ル
シフエラーゼの濃度がわからない試料の１秒間の相対発
光強度は３９２であった。その光子数は、 ６９×３９２＝２７０４８［光子］。 ルシフエラーゼ量は ２７０４８／０．０００８＝３．４×１０^７［分子］＝
３．４×１０^７／（６．０２×１０^２３）＝５．６７×
１０^−１７［ｍｏｌ］ と求めることができた。

【発明の効果】標準発光物質があればこれまで使用され
てきたすべての従来型発光測定装置の相対発光強度値を
光子数に変換でき、世界共通の数値に基づく比較が実現
できる。 従来は濃度校正曲線の作成に複数の標準溶液
を用意せねばならなかったが本発明によれば一種類の発
光標準物質溶液の測定ですみ作業性が向上する。また過
去に単位時間、単位容量当りの光子数が報告された測定
対象試料はその値を調べるだけで簡単に定量できる様に
なる。この単位時間、単位容量当りの光子数は吸収光度
分析における吸光度に相当する。顕微鏡下での発光測定
においてもこれまでは相対的な発光量の増減しか分から
なかったが対物レンズを透過する光子の割合（効率η）
は、 と求めることができるので、個々の細胞に局在する発光
関連物質量も測定することが可能である。ある特定の遺
伝子の転写活性を知りたい場合、その遺伝子の転写活性
調節領域をクローニングし、ＣＡＴやルシフェラーゼ遺
伝子等の遺伝子発現検出用ベクタに挿入、特定の細胞に
遺伝子導入することで転写活性量を測定できる。この場
合、ルシフェラーゼ遺伝子を用いると発光量を測定する
ことで転写活性量が定量化可能である。本発明によれば
顕微鏡下で個々の細胞毎に転写活性を定量化できるよう
になる。即ち細胞毎の転写活性を測定するにあたり、顕
微鏡下では従来技術のように濃度校正曲線を作成するこ
とは甚だ困難であったが、本発明による光子数計測を用
いれば転写活性の定量化が初めて達成出来る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法達成に使用する光子数計測装置の原
理を示す概略図である。

【図２】図１の観察用レンズと試料ステージとの位置関
係の詳細を示す図である。

【符号の説明】

１・・・ＣＣＤ カメラ ２・・・観察用レンズ ３・・・試料ステージ ４・・・光フアイバ ５・・・基準光源

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北林 延夫 東京都文京区本郷１丁目25番23号 アトー 株式会社内 (72)発明者 久保田 英博 東京都文京区本郷１丁目25番23号 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA40 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA80 FA11 FA12 FA16 FA19 FA23 FA40 FB01 FB13 FB20 GC15 GC22 GC30 HA03 HA09 HA20 JA01 JA02 JA07 2G054 AA06 AB03 AB07 AB10 CA21 CA23 CA28 CE01 CE08 EA02 EB01 EB02 FA16 FA17 FB02 FB03 GA05 GB10 JA01 JA07 JA08 4B029 AA07 BB16 FA13

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 発光量を光子数として計測できる光子数
   計測装置を準備し、該計測の標準となる発光標準物質の
   溶液を作り、該発光標準物質溶液が単位容積、単位時
   間、単位濃度当りに放射する総光子数を上記光子数計測
   装置で先ず実測しておき、該発光標準物質溶液を用いて
   発光測定装置の相対的発光強度を光子数に変換し、発光
   関連物質の光子数を定量することを特徴とする発光測定
   方法。
2. 【請求項２】 発光量を光子数として計測できる光子数
   計測装置を準備し、該計測の標準となる発光標準物質の
   溶液を作り、該発光標準物質溶液が単位容積、単位時
   間、単位濃度当りに放射する総光子数を先ず実測してお
   き、該発光標準物質溶液を用いて発光測定装置の相対的
   発光強度を光子数に変換し、発光関連物質の光子数を定
   量することを特徴とする発光測定装置。
3. 【請求項３】 発光標準物質溶液が単位容積、単位時
   間、単位濃度当りに放射する総光子数を先ず実測する上
   記装置は、発光標準物質溶液試料固定用ステージ、該試
   料観察用レンズ、ＣＣＤカメラとから構成し、この試料
   観察用レンズに光フアイバでカップリングされたレーザ
   光を導入し、ＣＣＤカメラでは光フアイバ端の像を観察
   し、ＡＤ変換によって相対的な光強度として数値化する
   光子数計測装置であることを特徴とする請求項２に記載
   の発光測定装置。