CN108588170A - 用于筛选检定黄曲霉毒素b1降解菌的培养基及筛选检定方法 - Google Patents

用于筛选检定黄曲霉毒素b1降解菌的培养基及筛选检定方法 Download PDF

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孙杰
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Abstract

本发明属于微生物菌株筛选技术领域，涉及一种用于筛选检定黄曲霉毒素B1降解菌的培养基及筛选检定方法。筛选检定方法，包括培养和鉴定两个步骤，培养以香豆素为唯一碳源，经初选和纯化后得到初筛菌株，然后加入AFB1标准品对AFB1进行降解；鉴定采用HPLC进行测定，对土壤中是否含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株进行检定；该方法以香豆素为唯一碳源，对原料无污染、具有高度专一性；能够高效、简易、准确的确定土壤中是否含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株，降低筛选成本；同时，筛选出的菌株能够有效去除黄曲霉毒素，且避免毒素重新产生，是一种高效、安全的去毒方法。

Description

用于筛选检定黄曲霉毒素B1降解菌的培养基及筛选检定方法
技术领域
本发明属于微生物菌株筛选技术领域，涉及一种用于筛选检定黄曲霉毒素B1降解菌的培养基及筛选检定方法。
背景技术
黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉、寄生曲霉、集蜂曲霉、溜曲霉等真菌产生的次级代谢物，该类毒素是由二呋喃环和香豆素组成的结构类似物，具有强肝毒性、致突变性、致癌性和致畸性。黄曲霉毒素污染的范围较泛，如花生、玉米、干果、牛奶等食品，因其毒性强，越来越受到关注。我国是花生出口贸易大国，黄曲霉毒素超标是影响我国花生出口的主要问题。现在已鉴定出二十多种黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)分布范围最广，并且毒性最强。目前世界上约有一百多个国家对食品中黄曲霉毒素提出了限量要求，我国规定花生和玉米中AFB1的最大限量为20μg/kg，欧盟所有成员国严格规定花生等食品中AFB1的含量低于2μg/kg，黄曲霉毒素总量小于4μg/kg。因此，寻找能有效脱除花生等农产品中黄曲霉毒素的方法对保障食品安全具有重要的意义。
国内外去除AFB1的方法主要有辐照、热处理、吸附剂脱毒等物理法，及强碱、强酸、氧化剂处理等化学法，但这些理化方法不仅成本高、效率低，且部分方法还伴有毒性物质产生。微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物去除食品中污染的AFB1，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，因此是一种高效、安全的去毒方法。
发明内容
本发明解决的技术问题之一是，提供一种用于筛选检定黄曲霉毒素B1降解菌的培养基。
本发明解决的技术问题之二是，提供一种用于降解黄曲霉毒素B1的菌株的筛选检定方法，从而高效、简易、准确的确定土壤中是否含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株，降低筛选成本。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种用于筛选检定黄曲霉毒素B1降解菌的培养基，所述培养基为香豆素液体培养基和/或香豆素固体培养基，香豆素液体培养基的成分为：KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、KNO3 0.5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、CaCl2 0.005g/L、FeCl3·6H2O 0.003g/L、pH7.0；121℃高压灭菌20min后加入已消毒杀菌的香豆素溶液至1g/L；香豆素固体培养基的成分为：在香豆素液体培养基的基础上加入20g/L琼脂。
一种用于降解黄曲霉毒素B1的菌株的筛选检定方法，包括培养和鉴定两个步骤，培养以香豆素为唯一碳源，经初选和纯化后得到初筛菌株，然后加入AFB1标准品对AFB1进行降解；鉴定采用HPLC进行测定，对土壤中是否含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株进行检定；
所述初筛菌株的培养过程包括：
步骤一：采集花生主产区的土壤样品保存备用；
步骤二：将采集到的土壤样品用无菌水混匀稀释，接种到香豆素液体培养基上培养；菌液浑浊后涂布在香豆素固体培养基上培养；
步骤三：挑选单菌落在LB固体培养基上多次划线纯化培养；
步骤四：纯化后的菌株在LB液体培养基上培养；
所述鉴定方法包括：
(1)纯化后的初筛菌株接种于发酵培养基，向发酵菌液中加入AFB1标准品后培养；
(2)对AFB1的降解率采用HPLC进行测定，从而检定土壤中是否含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株。
进一步地，若土壤中含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株，则对该菌株进行形态及生理生化鉴定。
进一步地，所述形态鉴定方法为将菌株接种在LB固体培养基，37℃培养2d后观察菌落颜色、形态，进行革兰氏染色；所述生理生化鉴定方法为使用API20NE试剂盒分析菌株的生理生化特征。
进一步地，所述LB液体培养基的成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、pH 7.0；LB固体培养基的成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L、pH 7.0。
进一步地，所述发酵培养基的成分为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、NaCl 10g/L、KH2PO4 1g/L、葡萄糖1g/L、pH 7.0。
进一步地，所述步骤二中：香豆素液体培养基上的培养条件为：150rmp、37℃培养10～15d；香豆素固体培养基上的培养条件为：37℃培养箱中培养。
进一步地，所述步骤四中：LB液体培养基上的培养条件为：37℃培养10～15d。
进一步地，所述步骤(1)中：AFB1标准品的加入方法为：980μL发酵菌液加入20μL、5mg/kg的AFB1标准品，使发酵液中AFB1终浓度为100μg/kg。
进一步地，所述步骤(2)中：HPLC检测条件为：Agilentl 260高效液相色谱仪，C-18色谱柱，流动相为甲醇：水＝1:1(V/V)，流速0.8mL/min，荧光检测器激发波长为360nm，发射波长为440nm。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种用于筛选检定黄曲霉毒素B1降解菌的培养基以及一种用于降解黄曲霉毒素B1的菌株的筛选检定方法，该方法以香豆素为唯一碳源，对原料无污染、具有高度专一性；能够高效、简易、准确的确定土壤中是否含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株，降低筛选成本；同时，筛选出的菌株能够有效去除黄曲霉毒素，且避免毒素重新产生，是一种高效、安全的去毒方法。
附图说明
图1为各菌株降解AFB1的降解率。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1
1、材料与方法
1.1土壤中AFB1样品采集
1.1.1土壤样品来源
土壤样品分别采自花生主产区的山东省青岛莱西市、山东省青岛平度市、河北省大名县和河南省内黄县，均于9月中下旬，当地花生收获后采集0-20cm土壤样品。
1.1.2土壤样品采集方法
分别采用5点式“S”型采样方法，以获得具代表性的混合土壤样品。多点式采样方法获得土壤样品后，首先放入编号为1-4的干净自封袋中，再置于冰盒中保存带回室内后放入-80℃超低温冰箱中备用。
1.2培养基
1.2.1 LB液体培养基：
胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.0。
1.2.2 LB固体培养基：
胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L、pH 7.0。
1.2.3发酵培养基：
蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、NaCl 10g/L、KH2PO4 1g/L、葡萄糖1g/L、pH 7.0。
1.2.4香豆素液体培养基：
KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、KNO3 0.5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、CaCl20.005g/L、FeCl3·6H2O 0.003g/L、pH 7.0；121℃高压灭菌20min后加入已消毒杀菌的香豆素溶液至1g/L。
1.2.5香豆素固体培养基
在香豆素液体培养基的基础上加入20g/L琼脂。
1.3土壤中AFB1降解菌初选与纯化
(1)土壤样品均以10倍无菌水混匀稀释，稀释液按1/20接种量分别接种到香豆素液体培养基，150rmp、37℃培养10～15d。菌液浑浊后分别涂布在香豆素固体培养基上，置于37℃培养箱中培养。
(2)根据各培养基上生长的菌落形态、颜色等挑选单菌落，分别在LB固体培养基上多次划线纯化培养。
(3)纯化的菌株分别在LB液体培养基上培养，37℃、10～15d后，加入20％甘油，-20℃冰箱保存。
1.4土壤中AFB1降解菌复筛
将上述各土壤样品中纯化后的AFB1降解菌的初筛菌株分别接种于发酵培养基，37℃培养48h。避光条件下，980μL发酵菌液加入20μL、5mg/kg的AFB1标准品，使发酵液中AFB1终浓度为100μg/kg，无菌发酵培养基作为空白对照，37℃避光培养72h。
1.5AFB1检测
采用HPLC进行测定，HPLC检测条件为：Agilentl 260高效液相色谱仪，C-18色谱柱(4.6mm×15cm×5μm)，进样量为20μL，流动相为甲醇：水＝1:1(V/V)，流速0.8mL/min，荧光检测器激发波长为360nm，发射波长为440nm。
1.6菌株的鉴定
通过以上筛选过程，分别挑选出一株降解AFB1效率最高的细菌，依次编号为H1、H2、H3、H4。
1.6.1细菌形态鉴定
分别接菌在LB固体培养基，37℃培养2d后观察菌落颜色、形态，进行革兰氏染色。
1.6.2生理生化鉴定
使用法国梅里埃公司的API20NE试剂盒分析H1、H2、H3、H4的生理生化特征。
2、结果与分析
2.1菌株初筛与复筛
通过以香豆素为唯一碳源的初筛，获得4株菌株H1、H2、H3、H4，复筛后发现这四株菌都能不同程度地降解AFB1，如图1所示，菌株H1、H2、H3、H4的降解率分别为50.6％、84.7％、61.1％和46.3％，其中菌株H2的降解率最高。
2.2菌株的鉴定
形态及生理生化鉴定：菌株H1、H2、H3、H4在LB固体培养基上均为淡黄色的圆形菌落，菌落边缘整齐，显微镜下细菌形态为杆状，革兰氏染色呈阴性。如表1所示，生理生化试验结果表明，菌株H1、H2、H3、H4的精氨酸双水解酶和尿素酶反应为阳性，β-葡萄糖苷酶、明胶蛋白酶、β-半乳糖苷酶反应为阴性；能有效吸收利用阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、癸酸、己二酸、柠檬酸、苯乙酸等碳源。参照《伯杰细菌鉴定手册》和相关文献表明，菌株H1、H2、H3、H4为假单胞菌。
表1菌株H1、H2、H3、H4的生理生化特征
3、结论
花生是黄曲霉毒素污染的主要作物之一，本发明以香豆素为唯一碳源从种植花生的土壤中筛选出4株能降解AFB1的菌株，H1、H2、H3、H4的降解率分别为50.6％、84.7％、61.1％和46.3％，其中菌株H2降解AFB1的能力最强。通过细菌形态、理化形状等鉴定菌株H1、H2、H3和H4均为假单胞菌属。该实验结果进一步表明，利用香豆素培养基进行花生田土壤黄曲霉毒素降解菌株的筛选检定方法是可行的。

Claims (10)

1.一种用于筛选检定黄曲霉毒素B1降解菌的培养基，其特征在于，所述培养基为香豆素液体培养基和/或香豆素固体培养基，香豆素液体培养基的成分为：KH2PO4 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、KNO3 0.5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、CaCl2 0.005g/L、FeCl3·6H2O0.003g/L、pH 7.0；121℃高压灭菌20min后加入已消毒杀菌的香豆素溶液至1g/L；香豆素固体培养基的成分为：在香豆素液体培养基的基础上加入20g/L琼脂。
2.一种用于降解黄曲霉毒素B1的菌株的筛选检定方法，其特征在于，包括培养和鉴定两个步骤，培养以香豆素为唯一碳源，经初选和纯化后得到初筛菌株，然后加入AFB1标准品对AFB1进行降解；鉴定采用HPLC进行测定，对土壤中是否含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株进行检定；
所述初筛菌株的培养过程包括：
步骤一：采集花生主产区的土壤样品保存备用；
步骤二：将采集到的土壤样品用无菌水混匀稀释，接种到香豆素液体培养基上培养；菌液浑浊后涂布在香豆素固体培养基上培养；
步骤三：挑选单菌落在LB固体培养基上多次划线纯化培养；
步骤四：纯化后的菌株在LB液体培养基上培养；
所述鉴定方法包括：
(1)纯化后的初筛菌株接种于发酵培养基，向发酵菌液中加入AFB1标准品后培养；
(2)对AFB1的降解率采用HPLC进行测定，从而检定土壤中是否含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株。
3.根据权利要求2所述的筛选检定方法，其特征在于，若土壤中含有用于降解黄曲霉毒素B1的菌株，则对该菌株进行形态及生理生化鉴定。
4.根据权利要求3所述的筛选检定方法，其特征在于，所述形态鉴定方法为将菌株接种在LB固体培养基，37℃培养2d后观察菌落颜色、形态，进行革兰氏染色；所述生理生化鉴定方法为使用API20NE试剂盒分析菌株的生理生化特征。
5.根据权利要求2、3或4所述的筛选检定方法，其特征在于，所述LB液体培养基的成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.0；LB固体培养基的成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L、pH 7.0。
6.根据权利要求2、3或4所述的筛选检定方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、NaCl 10g/L、KH2PO4 1g/L、葡萄糖1g/L、pH 7.0。
7.根据权利要求2、3或4所述的筛选检定方法，其特征在于，所述步骤二中：香豆素液体培养基上的培养条件为：150rmp、37℃培养10～15d；香豆素固体培养基上的培养条件为：37℃培养箱中培养。
8.根据权利要求2、3或4所述的筛选检定方法，其特征在于，所述步骤四中：LB液体培养基上的培养条件为：37℃培养10～15d。
9.根据权利要求2、3或4所述的筛选检定方法，其特征在于，所述步骤(1)中：AFB1标准品的加入方法为：980μL发酵菌液加入20μL、5mg/kg的AFB1标准品，使发酵液中AFB1终浓度为100μg/kg。
10.根据权利要求2、3或4所述的筛选检定方法，其特征在于，所述步骤(2)中：HPLC检测条件为：Agilentl 260高效液相色谱仪，C-18色谱柱，流动相为甲醇：水＝1:1(V/V)，流速0.8mL/min，荧光检测器激发波长为360nm，发射波长为440nm。
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