CN110376146A - 一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法。以磺胺类抗生素为研究对象，以斜生栅藻为测试生物，以96孔微孔板为载体，通过96孔微孔板加样分析方法，加样96h后采用多功能酶标仪测试681nm处斜生栅藻的吸光值，利用实验组与对照组的吸光值来计算斜生栅藻的生长抑制率，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC₅₀值的负对数pEC₅₀，以pEC₅₀值为毒性指标判断磺胺类抗生素的毒性大小。本发明方法操作简单，方便快捷，重现性好，能够广泛适用于测试磺胺类抗生素的毒性。

Description

一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法

技术领域

本发明属于磺胺类抗生素生物毒性检测领域，特别涉及一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法。

背景技术

抗生素是一类能在低微浓度情况下抑制或影响生物机能的化学物质，在医疗及动、植物病虫害防治方面发挥了巨大的作用。抗生素按使用对象，可分为人用抗生素和兽用抗生素，磺胺类药物是一类人工合成的抗菌剂，自20世纪40年代磺胺类药物被合成成功以来，超过150种磺胺类药物和其衍生物被应用于人体疾病的治疗或作为兽药应用于动物饲养。由于这类药物在动物体内很难被完全吸收，大部分以母体或代谢产物的形式通过粪尿排出体外进入环境，导致药物在环境中的大量残留。目前磺胺类抗生素生物毒性的检测方法有：发光菌毒性试验、藻类毒性试验、溞类毒性试验和鱼类毒性试验等。

在所有水生生物中，藻类对磺胺类抗生素的毒性作用反应最为敏感，而藻类构成了食物链的基础，其种群数量的减少将直接影响整个水生生态系统的平衡。研究表明，几乎所有磺胺类药物均能对藻类产生毒性作用。藻类与周围环境形成统一的整体并且互相影响，因其个体微小（小于200μm）、生长周期短、对有毒物质反应灵敏、容易培养等特点，在较短的时间内可得到毒物对藻类许多世代及种群水平上的影响评价，自1980年以来就被看作是理想的实验材料。藻类作为磺胺类抗生素毒性检验的指示生物，具有快速简便，重现性好的优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法。

具体步骤为：

（1）将磺胺类抗生素标准品按照溶解度配成标准溶液，将标准溶液置于4℃冰箱保存待用。

（2）培养斜生栅藻使其达到对数生长期，用血球计数板在显微镜下计数，当藻密度为5×10⁵个/mL时，将其作为工作藻液。

（3）将步骤（1）配制的标准溶液加入到白色透明96孔微孔板中，设置好微孔板中磺胺类抗生素浓度梯度，然后向白色透明96孔微孔板中加入步骤（2）得到的工作藻液，制作磺胺类抗生素和工作藻液的反应体系，为防止产生边缘效应，周边孔每孔加入300μL超纯水，实验组每孔含100μL工作藻液和100μL不同浓度的磺胺类抗生素，空白对照组每孔含100μL工作藻液和100μL超纯水，每孔总体积为200μL；相同条件下，每个磺胺类抗生素浓度进行9次重复实验，并取平均值；采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的0h吸光值RLU；然后将96孔微孔板置于光照3000lux、温度22℃的光照培养箱中培养96h，再采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的吸光值RLU。

（4）利用实验组与空白对照组的吸光值来计算斜生栅藻的生长抑制率，以磺胺类抗生素的不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的生长抑制率为纵坐标，利用基于Matlab自编的Logistic函数对不同浓度磺胺类抗生素与生长抑制率E进行非线性拟合：

；

式中：I₀为空白对照组的RLU平均值，I为实验组各浓度9次平行样的RLU平均值；最后，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC₅₀值的负对数pEC₅₀，以pEC₅₀作为毒性指标，判断磺胺类抗生素的毒性大小，pEC₅₀的数值越大，毒性越大。

本发明的有益效果是：

1）该方法测试过程中所用试剂少，使用量少，环境友好。

2）该方法利用微板法对磺胺类抗生素的毒性进行检测分析，通过计算斜生栅藻的生长抑制率，利用于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC₅₀值的负对数pEC₅₀，判断磺胺类抗生素的综合毒性大小。

3）该方法操作简单，方便快捷，重现性好，能够广泛适用于测试磺胺类抗生素的毒性。

附图说明

图1为本发明实施例中磺胺吡啶对斜生栅藻的浓度-效应曲线。

图2为本发明实施例中磺胺甲基嘧啶对斜生栅藻的浓度-效应曲线。

图3为本发明实施例中磺胺二甲嘧啶对斜生栅藻的浓度-效应曲线。

图4为本发明实施例中磺胺甲氧哒嗪对斜生栅藻的浓度-效应曲线。

图5为本发明实施例中磺胺甲恶唑对斜生栅藻的浓度-效应曲线。

图6为本发明实施例中磺胺喹噁啉对斜生栅藻的浓度-效应曲线。

图7为本发明实施例中磺胺-6-甲氧嘧啶对斜生栅藻的浓度-效应曲线。

图8为本发明实施例中磺胺氯吡嗪钠对斜生栅藻的浓度-效应曲线。

图9为本发明实施例中使用的96孔微孔板的加样设计图，其中，b为对照组，含100μL超纯+100μL藻液；C₁-C₁₂依次为磺胺类抗生素从高到低的12个浓度梯度。

具体实施方式

实施例：

本实施例中受试的8种磺胺类抗生素标准品均购自美国Cato Research ChemicalsInc，对磺胺类抗生素的标准品进行如下试验：

（1）将磺胺类抗生素标准品按照溶解度配成标准溶液，将标准溶液置于4℃冰箱保存待用。

（2）培养斜生栅藻使其达到对数生长期，将其作为工作藻液，具体操作如下：

培养基储备液配方为(mg·L^-1，通常情况都为此，特别说明除外)：NaNO₃ 1500，MgSO₄·7H₂O 75，K₂HPO₄ 40，CaCl₂·2H₂O 36，Na₂CO₃ 20，Citric acid 6，Ferric ammonium citrate6，EDTANa₂ 1，其中A₅溶液配方为：在蒸馏水中加入286mg H₃BO₃、186mg MnCl₂·4H₂O、22mgZnSO₄·7H₂O、8mg CuSO₄·5H₂O、39mg Na₂MoO₄·2H₂O、5mg Co(NO₃)₂·6H₂O，溶解后定容至100mL。

培养基配方为：先在250mL烧杯中加入大约50-100mL超纯水，再取NaNO₃、MgSO₄·7H₂O、K₂HPO₄、Na₂CO₃、Citric acid、EDTANa₂储备液各10mL，A₅溶液1mL到250mL烧杯中混合，将烧杯中的混合液体到入1L容量瓶中，润洗烧杯3次并将润洗后的液体也倒入容量瓶，当溶液体积差不多为容量瓶体积一半时取10mL CaCl₂·2H₂O加入到容量瓶中，这是为了防止一开始就混合会出现Ca₂CO₃沉淀，加入CaCl₂·2H₂O后定容至1L，最后加入3滴1 mol/L的盐酸。将培养基经灭菌锅121℃、101KPa灭菌30min，冷却后再加入10mL Ferric ammoniumcitrate储备液，静置12小时后调pH为7左右，4℃冷藏备用。

藻种复苏：藻种转接前放于人工光照培养箱中静置12h。实验所用到的锥形瓶、枪头等经高温高压灭菌后放于净化工作台进行紫外灭菌10~15分钟，取出人工光照培养箱中（温度22°C、光暗比12h:12h、光照3000~3500lux）密封试管的原始藻种，移液枪移取一定量的培养基于250mL三角瓶中，然后按藻种：培养基为1:5的比例用移液枪移出密封试管中的原始藻种进行稀释，接种到锥形瓶中，恒温培养箱中培养7~10天，记为F1。为保证藻液的稳定生长，每天摇动藻液三次（早中晚各一次）。

藻液的传代：F1代置于人工光照培养箱内培养至对数生长期，并进一步扩大培养。当培养至F3代时，镜检观察藻细胞的形态和生长状况是否正常，在藻细胞形态正常并生长良好的情况下，转接处于对数生长期的藻种至新鲜培养基中进行培养，1d后可进行实验。

（3）将工作藻液加入到预先设置好磺胺类抗生素浓度梯度的白色透明96孔微孔板中，制作磺胺类抗生素和工作藻液的反应体系，为防止产生边缘效应，周边孔每孔加入300μL超纯水，实验孔每孔含100μL工作藻液和100μL不同浓度的磺胺类抗生素，空白对照孔每孔含100μL工作藻液和100μL超纯水，每孔总体积为200μL。相同条件下，每个磺胺类抗生素浓度进行9次重复实验，并取平均值；采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的0h的吸光值RLU。然后将微孔板置于光照3000lux、温度22℃的光照培养箱中，由此开始记录暴露时间。

（4）按步骤（3）条件培养96h后，采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的吸光值RLU，利用实验组与对照组的吸光值来计算斜生栅藻的生长抑制率，以磺胺类抗生素的不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的生长抑制率为纵坐标，利用基于Matlab自编的Logistic函数对不同浓度磺胺类抗生素与生长抑制率E进行非线性拟合；

；

式中：I₀为空白对照样的RLU平均值，I为实验组各浓度9次平行样的RLU平均值。最后，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC₅₀值的负对数PEC₅₀，以pEC₅₀作为毒性指标，判断磺胺类抗生素的毒性大小，pEC₅₀的数值越大，毒性越大。

8种磺胺类抗生素对斜生栅藻的浓度-效应数据均可通过Logit函数拟合，其拟合模型参数(回归参数α和β值，统计参数R ² 和RMSE)见表1，表中8种磺胺类抗生素的R ²值均大于0.94且所有RMSE值均小于0.03，这表示了拟合质量的可靠性。图1-图8则显示了这8种磺胺类抗生素的浓度-效应数拟合曲线(CRCs)，呈经典S型。毒性最大的是 SQ，最小的是 SMR。以pEC₅₀作为毒性指标，pEC₅₀的数值越大，毒性越大，则8种磺胺类抗生素对斜生栅藻的毒性顺序为：SQ(pEC50=5.31)＞SPY(pEC50=3.76)＞SMZ(pEC50=3.75)＞SMP(pEC50=3.68)＞SMM(pEC50=3.66)SM2(pEC50=3.09)＞2-SPZ(pEC50=2.98)＞SMR(pEC50=2.60)。

表1 8种磺胺类抗生素理化性质及浓度-效应拟合曲线参数

磺胺类抗生素	CAS号	相对分子量	储备液/(mol·L<sup>-1</sup>)	<i>α</i>	<i>β</i>	<i>R</i><sup>2</sup>	<i>RMSE</i>	pEC<sub>50</sub>
									磺胺吡啶(SPY)	144-83-2	249.29	2.246E-04	8.14	2.26	0.985	0.014	3.76
磺胺甲基嘧啶(SMR)	127-79-7	264.30	5.371E-04	1.79	0.69	0.985	0.010	2.60
									磺胺二甲嘧啶(SM2)	57-68-1	278.33	3.305E-04	2.47	0.92	0.944	0.021	3.09
磺胺甲氧哒嗪(SMP)	80-35-3	280.30	4.852E-04	6.16	1.67	0.988	0.019	3.68
									磺胺甲恶唑(SMZ)	723-46-6	253.28	4.343E-04	5.44	1.55	0.997	0.008	3.75
磺胺喹噁啉(SQ)	59-40-5	300.34	2.664E-05	9.70	1.83	0.997	0.013	5.31
									磺胺-6-甲氧嘧啶(SMM)	1220-83-3	280.30	1.284E-04	2.80	0.86	0.971	0.017	3.66
磺胺氯吡嗪钠(2-SPZ)	102-65-8	284.72	7.024E-03	3.32	1.11	0.968	0.032	2.98

注：α、β为拟合参数；R ² 、RMSE为模型统计量；EC ₅₀为半数效应浓度；pEC ₅₀ 为半数效应浓度的负对数

本实施例显示出显著的测试效果：运用指示生物斜生栅藻测试磺胺类抗生素的毒性，通过计算不同浓度磺胺类抗生素对斜生栅藻的生长抑制率的大小，并绘制浓度-效应数拟合曲线，通过基于Matlab自编的Logit函数拟合获取磺胺类抗生素的毒性指标pEC₅₀，从而可以有效、快速、准确地判断磺胺类抗生素的综合毒性大小。

Claims (1)

1.一种应用斜生栅藻测试磺胺类抗生素生物毒性的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）将磺胺类抗生素标准品按照溶解度配成标准溶液，将标准溶液置于4℃冰箱保存待用；

（2）培养斜生栅藻使其达到对数生长期，用血球计数板在显微镜下计数，当藻密度为5×10⁵个/mL时，将其作为工作藻液；

（3）将步骤（1）配制的标准溶液加入到白色透明96孔微孔板中，设置好微孔板中磺胺类抗生素浓度梯度，然后向白色透明96孔微孔板中加入步骤（2）得到的工作藻液，制作磺胺类抗生素和工作藻液的反应体系，为防止产生边缘效应，周边孔每孔加入300μL超纯水，实验组每孔含100μL工作藻液和100μL不同浓度的磺胺类抗生素，空白对照组每孔含100μL工作藻液和100μL超纯水，每孔总体积为200μL；相同条件下，每个磺胺类抗生素浓度进行9次重复实验，并取平均值；采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的0h吸光值RLU；然后将96孔微孔板置于光照3000lux、温度22℃的光照培养箱中培养96h，再采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的吸光值RLU；

（4）利用实验组与空白对照组的吸光值来计算斜生栅藻的生长抑制率，以磺胺类抗生素的不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的生长抑制率为纵坐标，利用基于Matlab自编的Logistic函数对不同浓度磺胺类抗生素与生长抑制率E进行非线性拟合：

；

式中：I₀为空白对照组的RLU平均值，I为实验组各浓度9次平行样的RLU平均值；最后，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC₅₀值的负对数pEC₅₀，以pEC₅₀作为毒性指标，判断磺胺类抗生素的毒性大小，pEC₅₀的数值越大，毒性越大。