CN109580897A - 一种不同淡水环境中铜离子对斜生栅藻毒性效应的确定方法及应用 - Google Patents

一种不同淡水环境中铜离子对斜生栅藻毒性效应的确定方法及应用 Download PDF

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徐潇
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Abstract

本发明提供了一种不同淡水环境中铜离子对斜生栅藻毒性效应的确定方法及应用，本发明综合考虑了铜的形态和浓度、竞争性阳离子和pH对斜生栅藻毒性的影响，所获的毒性预测模型在实验中得到了验证，在pH>7的弱碱性淡水中具有很好的准确性。

Description

一种不同淡水环境中铜离子对斜生栅藻毒性效应的确定方法 及应用
(一)技术领域
本发明属生态重金属毒性预测领域，更具体地说，涉及一种不同淡水环境中铜离子对斜生栅藻毒性效应的确定方法及应用，是一种考虑了水中阳离子与重金属离子在生物膜配体上竞争性、阳离子的形态、溶解性有机质、温度、硬度、碱度和pH值来计算生物毒性的方法。
(二)背景技术
铜是所有动物和植物的必需元素，存在于生物体的所有器官和组织之中，通常能与蛋白质及一些有机物结合。生物体新陈代谢的过程中很多关键酶，都需要铜的参与和活化，才能维持其正常生理机能。另一方面，过量铜的摄入则会产生铜中毒，对人的表现为胃部不适、恶心、呕吐和腹泻等症状。铜对自然界的其他生物也存在类似的生理现象。而对于环境水体而言，我们不仅要考虑人，更要考虑其他生物，如鱼类，水溞和藻类。整个生态系统由低级到高级组成了一个完整的生物链，相互依存，不可分割。如果某一个部分受到危害，会对其他部分产生影响，从而使生态系统遭到破坏，人类将不可避免的成为最后的受害者。
自然水体中铜的标准应该如何确定？早期，人们将不同种类的水生生物暴露在不同浓度的硫酸铜溶液中，观察这些生物的生殖和生理变化及死亡情况，并在所得到的实验毒性数据基础上建立最早的铜水质标准，以铜的总浓度作为指标。后来，在不同实验室的不同实验条件的重复下，发现铜的毒性不仅与浓度有关，而且还与水的硬度、碱度、水中有机物含量、水中其他离子和pH值有关。后来更多的实验工作表明实验室得到的结果与实际情况差别很大。例如，在美国发现一些湖泊河流的铜的浓度远远超过铜水质标准所规定的上限，但水生生物依然能正常生长发育。这说明以铜的总浓度为制定铜水质标准的指标有很大的缺陷，铜的浓度大并不能说明一定对生物的毒性大。
研究工作一个重要发现是证明了铜对水生生物的毒性与水环境有关，不同的水质会使铜对水生生物表现出不同的毒性。本发明主要探究水质中可与铜产生竞争作用的阳离子对铜在水环境中对斜生栅藻毒性的影响，并在此基础上构建不同水质下预测铜对斜生栅藻毒性的模型。
近年来随着研究不断深入，人们在形态分析和生物效应关系的基础上提出了预测铜毒性的数学模型。其中在水环境中用的最为广泛的为生物配体模型。尽管以往文献中有关于一些重金属对藻类毒性的预测方法，但重金属在不同淡水环境水域中，水生生物对重金属的毒性的反应并不完全相同，预测方程和参数不能套用，因此需要针对性的建立毒性预测方程和毒性参数。
Biotic Ligand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序由Windward环境公司开发，用于预测水环境中金属形态、生物有效性和毒性，并将其他竞争离子的拮抗效应纳入计算之中。该程序中包含了CHESS模型中关于计算不同水环境中铜形态的方法和WHAM模型中计算铜与溶解性有机碳络合物的方法。
美国环保署已推荐将生物配体模型用于淡水系统中铜水质标准的制定。BioticLigand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序由已能够预测淡水中铜、锌、镉和银对虹鳟鱼、黑头呆鱼、蚤状溞、模糊网纹溞和大型溞的生物急性毒性。该程序还有适用于其他生物物种的方法。即通过金属对某一生物的急性毒性试验，获得一定水质条件下金属对生物的LC50或者EC50。在确定各个阳离子的稳定常数后，利用该程序中“Speciation”功能，计算出有毒形态金属与生物配体形成配合物的浓度，各个配合物之和就是该生物的LA50。得到某一生物的LA50，就可以应用该程序中“User-defined”功能预测不同水质中金属对该生物的LC50或EC50。
(三)发明内容
针对现有淡水环境中重金属对藻类毒性评估方法稀少、适应性差问题，本发明提供一种铜离子对淡水环境中斜生栅藻毒性的预测方法及其应用。在淡水环境中，较为常见的大量阳离子主要有Ca2+、Mg2+、Na+、K+和H+，同时铜离子在淡水环境中可能产生毒性的形态主要为Cu2+、CuOH+。其中，确定各阳离子对Cu2+的生物毒性的抑制作用的影响是建立铜离子对淡水环境中斜生栅藻毒性的预测方法的关键。
本发明基于生物配体模型，采用Biotic Ligand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序计算不同实验条件下各离子活度，通过各阳离子活度与铜对斜生栅藻72h-EC50值的线性关系来确定各阳离子Ci与生物配体BL的稳定常数KCiBL、铜离子与生物配体BL的稳定常数KCuBL、KCuOHBL，确定稳定常数后，利用“Speciation”功能确定斜生栅藻的LA50，根据所获得的稳定稳定常数KCiBL、KCuBL、KCuOHBL、LA50输入Biotic LigandModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序，利用“Toxicity”模式的预测功能实现铜离子对淡水环境中斜生栅藻毒性的预测。
本发明的技术方案如下：
一种不同淡水环境中铜离子对斜生栅藻毒性效应的确定方法，包括以下步骤：
(1)生物毒性实验设计：
对斜生栅藻进行急性毒性实验，在BG11培养基中分别外加CaCl2、MgSO4、NaCl、KCl、HCl、NaOH和生物缓冲液MOPS并采用控制变量法，在只改变某个实验条件的同时控制其他实验条件不变的情况下，对斜生栅藻进行急性毒性实验，藻体预培养在3L锥形瓶中进行，急性毒性实验在250mL锥形瓶中进行，测试媒介为一般地表水水质；
为了确定斜生栅藻毒性实验初始密度，在吸光度和细胞与细胞密度之间作线性关系，此有利于批量毒性实验中的斜生栅藻初始密度的确定及测定；确定72h急性毒性实验的初始藻密度，利用吸光光度值指示斜生栅藻细胞量的前提是找到合适的波长，采用了不同浓度梯度的斜生栅藻进行波长范围扫描，确定最佳波长，毒性实验斜生栅藻0、24、48、72h生长情况的测定均是基于最佳波长吸光度；
毒性测试实验为处于对数生长期的藻种，相关实验方法参照国家标准和OECD标准；本发明总共进行了32组铜对斜生栅藻的72h时急性毒性实验，以空白的BG11培养基为对照组(每组6个铜浓度水平，铜梯度范围均覆盖半抑制生长的铜浓度值)，分别执行不同单因子(Ca、Mg、Na、K、pH)的变化，旨在定量得出不同水化学特征下铜对斜生栅藻的急性毒性效果；
(2)确定斜生栅藻毒性参数并计算溶液中各离子活度：
毒性实验结束后，计算各组实验生长抑制率，计算方程为：
其中，I为斜生栅藻的生长抑制率，Ac代表对照组的吸光度，As代表实验组的吸光度；
得到I值后，用SPSS软件拟合得到EC50，选择Logit模型；
各阳离子的自由态离子活度通过输入水质参数和EC50到Biotic Ligand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序中“Speciation”模式形态分布功能计算得到(由于与生物配体络合金属量比重较小，所以金属与有机配体的常数对其结果的影响忽略不计)；
(3)构建毒性预测模型：
根据生物配体模型中基于淡水中阳离子会在生物配体上发生竞争作用，可将生物配体络合容量表达为：
CCBL＝∑i[CiBL]+[BL-] (2)
其中，CCBL为生物配体的络合容量，[CiBL]表示溶液中各阳离子与生物配体的络合物的浓度，[BL-]表示未与阳离子发生络合作用的生物配体的浓度；
阳离子和生物配体的络合物的稳定常数的表达式为：
其中，KCuBL表示铜离子与生物配体的络合物的稳定常数，CuBL+表示铜离子与生物配体的络合物的浓度，(Cu2+)表示铜离子活度，[BL-]表示未与阳离子发生络合作用的生物配体的浓度；
联立(2)、(3)方程式可将铜离子与生物配体的络合物的浓度表示为：
[CuBL+]＝[KCuBL·(Cu2+)]/[1+∑iKCiBL·(Ci)]·CCBL (4)
其中，i表示与铜离子在生物配体上产生竞争作用的阳离子的个数，KCiBL表示该离子的稳定常数，(Ci)表示该离子活度；
假设生物配体络合容量不随水质参数而改变，可将铜离子与生物配体的络合物占生物配体络合容量比表达为：
fCuBL＝[CuBL+]/CCBL＝[KCuBL·(Cu2+)]/[1+∑iKCiBL·(Ci)] (5)
根据生物配体模型，可假设半数抑制浓度时，生物配体络合容量占比为常数，则可将方程式(5)表达为：
其中，EC50(Cu2+)表示斜生栅藻72h急性毒性的半数抑制浓度；
在生物配体模型中，如将(CuOH+)毒性考虑其中，可将方程(5)转化为：
fCuBL＝[KCuBL·(Cu2+)+KCuOHBL·(CuOH+)]/[1+∑iKCiBL·(Ci)] (7)
并可将方程(6)转化为：
由方程式(6)可知，确定其他阳离子活度不变，只改变i离子活度的情况下以，(Ci)与EC50(Cu2+)为线性关系，可得方程式(9)、(10)：
其中Ii表示该线性方程的截距，Si代表该线性方程的斜率；
由方程(9)、(10)可得斜率与截距比为：
通过上述急性毒性试验和Biotic Ligand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序计算不同实验条件下各离子活度可得到EC50(Cu2+)和(Ci)的线性关系表达式；
通过线性关系分析得知，(K+)的变化不影响EC50(Cu2+)的变化，(Na+)、(Mg2+)、(Ca2 +)、(H+)与EC50(Cu2+)呈线性关系，据此，可由方程(12)得到一个矩阵表达式：
其中，(Mg2+)Ca、(Na+)Ca、(H+)Ca表示以Ca浓度为变量实验组中(Mg2+)、(Na+)、(H+)的平均值，其他组别表达相同；
考虑到pH组别的特殊性，预测时分别假设：
a：EC50(Cu2+)与pH的线性关系全部归因于质子竞争；
b：EC50(Cu2+)与pH的线性关系与质子竞争无关，与产生的CuOH+有关(去掉该矩阵表达式的最后一列)；
使用方程(12)所计算出的假设a和假设b稳定常数，将假设a和假设b的结果与文献中已有值进行比较，确定logKCaBL、logKMgBL、logKNaBL和logKHBL；
根据方程(3)计算KCuBL并对铜的形态进行分离测定：生物积累实验选取处于对数生长中后期的藻2×106cells·mL-1，将藻液导入50mL离心管中，离心(3200r·min-1，4min)后倒掉上清液，再反复2次MOPS缓冲液清洗，使藻悬浮后重新离心并弃掉上清液，然后加入缓冲液至50mL用于生物积累实验；暴露溶液中Cu的浓度范围为3.2μg·L-1到640.6μg·L-1，暴露溶液体积为50mL；根据设定浓度，计算出所需母液的含量，进行配制；浓度范围的选取既要保证对藻较低的抑制率，同样还要能够获得足够的金属累积量以便于测量，另外还要考虑到容器壁的吸附及人为操作误差等因素；暴露时间为120min，于t＝120min时取样；取30mL于离心管中，然后将样品离心(3200r·min-1，4min)，取5mL的上清液于离心管中用于测定溶解铜浓度，然后倒掉上清液(每组实验做三次平行样)；分别测定总铜浓度Cut、溶解态铜浓度Cud和细胞内铜浓度Cui，计算细胞外与生物配体络合态铜CuBL，测定方法如下：
取藻悬液，3500r/min离心4min后取出5mL上清液测定溶解态铜浓度Cud，然后将样品用MOPS缓冲液清洗2到3次，加入20mL EDTA/MOPS溶液重新悬浮10min，3500r/min离心4min后取上清液用于测定细胞外与生物配体络合态铜CuBL，将底层沉淀转移至烧杯50mL烧杯中，加入2mL浓硝酸90℃硝化至滤膜完全溶解，后加超纯水稀释至25mL用于测定细胞内Cui，用ICP-MS分别对细胞内铜Cui和细胞外与生物配体络合态铜CuBL进行测定；
由方程(3)可知：
KBL＝CuBL/{Cud·([BL-]-CuBL)} (13)
将上式重组可得：
Cud/CuBL＝Cud/[BL-]+1/KBL·[BL-] (14)
由Cud/CuBL对Cud作图，其斜率的倒数为络合容量[BL-]，截距为络合容量和络合常数乘积的倒数；
可根据线性关系的斜率和截距通过表达式(14)计算得出相应的KCuBL值；
当金属与斜生栅藻之间的作用常数(logKCaBL、logKMgBL、logKNaBL、logKKBL、logKCuOHBL、logKHBL、logKCuBL)确立后，建立了斜生栅藻新的数据(.dat)文件，在无溶解有机质参与的情况下，通过生物配体模型的铜形态分布功能"Speciation"推算斜生栅藻的半数致死积累量LA50值；
斜生栅藻的LA50值确立后修改(.dat)文件中LA50值，建立斜生栅藻生物配体模型，通过"Toxicity"模式的预测功能，预测实验条件下斜生栅藻的EC50值；
通过预测结果与实测结果对比分析EC50与实际EC50在误差在0.5-2倍之间，则通过本方法建立的毒性预测模型可行。
本发明建立的毒性预测模型可应用于淡水环境重金属毒性评估，具体的，所述应用的方法为：
第一步：测定特定淡水环境中水化学特性
在特定水质中取样分别测定温度、pH和DOC、Ca2+、Mg2+、Na+、K+、SO4 2-、Cl-、DIC、S2-相关参数的浓度；
第二步：预测该水质条件下的EC50
将上述所测参数代入本发明建立的预测模型中，通过"Toxicity"模式的预测功能，预测该水质条件下Cu对斜生栅藻EC50；
第三步：对该水质条件下的Cu进行风险评估
将上述所得Cu对斜生栅藻EC50与相关文献和标准进行对比，判断铜在该水质条件的风险大小。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明解决了淡水环境中Cu2+对斜生栅藻毒性无法准确预测的问题，在考虑了Cu2+的毒性和竞争性阳离子的基础上，同时确定了Cu2+与斜生栅藻的稳定常数和LA50，确定各阳离子与斜生栅藻的稳定常数，创建了淡水环境中Cu2+对斜生栅藻毒性的确定方法，获得的结果可用于淡水环境下Cu2+对斜生栅藻毒性的预测，为土壤重金属生态风险评价和淡水环境污染治理提供参考。
(2)本发明的优势在于建立了Biotic Ligand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序中第一个斜生栅藻的预测方法，这一方法建立过程同样适用于其他藻类，可以在此方法上通过其他藻类的毒性实验建立其他藻类的预测方法。
(3)本发明的创新点在于综合考虑了铜的形态和浓度、竞争性阳离子和pH对斜生栅藻毒性的影响。
(4)本发明提供的方法在淡水环境中应用简便，预测所需的参数阴阳离子浓度、pH、碱度、温度DOC和S2-浓度均简单易测，为淡水环境中斜生栅藻的预测提供了方便快捷的方法。
(5)本发明所获的毒性预测模型在实验中得到了验证，在pH>7的弱碱性淡水中具有很好的准确性。
(四)附图说明
图1为本发明中各阳离子对72小时Cu2+斜生栅藻毒性的EC50的影响图，其中各图分别代指阳离子如下：Ca2+(a)、Mg2+(b)、Na+(c)、K+(d)、H+(e)、pH(f)；各图纵坐标表示72小时Cu2+斜生栅藻毒性EC50，横坐标表示溶液中各阳离子的活度，并作线性分析，误差代表95％置信区间；
图2为本发明中Cu2+生物积累实验中溶解态铜浓度Cud对溶解态铜浓度和生物配体络合态铜比值Cud/CuBL的影响，并作线性分析；
图3为本发明中预测值与实测值关系图，虚线范围内为误差在0.5-2倍之间，坐标轴为Log-Log坐标轴。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1
本发明总共进行了32组铜对斜生栅藻的72h时急性毒性实验(每组6个铜浓度水平，铜梯度范围均覆盖半抑制生长的铜浓度值)，分别执行不同单因子(Ca、Mg、Na、K、pH)的变化，旨在定量得出不同水化学特征下铜对斜生栅藻的急性毒性效果。斜生栅藻藻种购于中国科学院武汉水生生物。以BG11培养基为基础，分别外加CaCl2、MgSO4、NaCl、KCl、HCl、NaOH和生物缓冲液MOPS并采用控制变量法，在只改变某个实验条件的同时控制其他实验条件不变的情况下，对斜生栅藻进行急性毒性实验。藻体预培养在3L锥形瓶中进行，使用BG11培养基。急性毒性实验在250ml锥形瓶中进行，测试媒介为一般地表水水质。
为了确定斜生栅藻毒性实验初始密度，特在吸光度和细胞与细胞密度之间做线性关系，此有利于批量毒性实验中的斜生栅藻初始密度的确定及测定。72h急性毒性实验的初始藻密度确定为30000cell/mL左右，利用吸光光度值指示斜生栅藻细胞量的前提是找到合适的波长。采用了不同浓度梯度的斜生栅藻进行450-750nm波长范围扫描，可知687nm为适合波长。毒性实验斜生栅藻0、24、48、72h生长情况的测定均是基于687nm的吸光度。毒性测试实验为处于对数生长期的藻种，相关实验方法参照【国家标准】GBT21805-2008化学品藻类生长抑制试验标准。
本发明总共进行了32组铜对斜生栅藻的72h时急性毒性实验(每组6个铜浓度水平，铜梯度范围均覆盖半抑制生长的铜浓度值)，分别执行不同单因子(Ca、Mg、Na、K、pH)的变化，旨在定量得出不同水化学特征下铜对斜生栅藻的急性毒性效果。各实验组水质参数如表1所示。
通过线性关系分析得知，(K+)的变化不影响EC50(Cu2+)的变化，(Na+)、(Mg2+)、(Ca2 +)、(H+)与EC50(Cu2+)呈线性关系，线性关系表达式分别为：
EC50(Cu2+)＝15.42356(Na+)+53.45287
EC50(Cu2+)＝205.23552(Mg2+)+87.85358
EC50(Cu2+)＝42.65249(Ca2+)+96.94443
EC50(Cu2+)＝4.58E+06(H+)+8.74397
考虑到pH组别的特殊性，预测时分别假设：
a：EC50(Cu2+)与pH的线性关系全部归因于质子竞争；
b：EC50(Cu2+)与pH的线性关系与质子竞争无关，与产生的CuOH-有关。
利用线性关系的斜率和截距结合方程(12)计算出的结果如表2所示。
观察比较后发现通过假设a结果计算出的logKHBL明显高于理论值，通过与其他文献logKHBL比较，假设logKHBL＝5.4，其他稳定常数去假设b所得数据来进行下一步预测毒性模拟。
然后进行Cu2+对斜生栅藻的生物积累实验，得到线性关系表达式：
Cud/CuBL＝229851.9944Cud+0.28819
根据线性关系的斜率和截距通过表达式(14)计算得出KCuBL＝5.90。确定各稳定常数后输入BioticLigand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序，建立了斜生栅藻新的数据〔.dat)文件，并利用表1所示水质参数计算得到铜对斜生栅藻的LA50＝1.738nmol/gw。将LA50＝1.738nmol/gw输入斜生栅藻新的数据〔.dat)文件中，然后利用表1所示水质参数“Toxicity”功能预测斜生栅藻EC50。预测值与实测值如表3所示，预测值与实测值之间的对比关系如图3所示。
通过预测结果与实测结果对比分析我们可以发现，本发明所建立的模型所预测绝大部分实验组的EC50与实际EC50的误差在0.5-2倍之间，符合本领域对预测模型准确性的要求，当pH<7时，该模型的预测准确性较差。因此，本实验所确定的毒性预测模型可在绝大多数pH>7的天然水体环境中对斜生栅藻的毒性进行预测。
表1：各实验组水质参数
表2.两种假设拟合得到的稳定常数的结果
表3.各组别EC50实测值与预测值
组别 实测值(ug/L) 预测值(ug/L)
Ca-set 1 21.69 35.42
Ca-set 2 22.96 36.27
Ca-set 3 24.86 38.44
Ca-set 4 28.58 43.33
Ca-set 5 32.72 46.77
Ca-set 6 35.10 50.64
Mg-set 1 23.15 34.68
Mg-set 2 29.71 40.32
Mg-set 3 34.88 49.72
Mg-set 4 62.94 67.44
Mg-set 5 80.45 100.53
Mg-set 6 107.45 113.14
Na-set 1 21.33 34.98
Na-set 2 22.74 37.09
Na-set 3 24.72 39.57
Na-set 4 26.76 44.46
Na-set 5 33.68 55.75
K-set 1 21.51 34.99
K-set 2 20.81 35.11
K-set 3 22.12 34.78
K-set 4 21.49 33.95
K-set 5 21.21 33.40
pH-set 1 165.8 44.70
pH-set 2 120.91 49.51
pH-set 3 129.91 51.3
pH-set 4 78.04 47.67
pH-set 5 50.41 43.12
pH-set 6 54.42 40.81
pH-set 7 66.03 37.27
pH-set 8 51.55 36.40
pH-set 9 41.51 35.41
pH-set 10 30.02 34.25

Claims (3)

1.一种不同淡水环境中铜离子对斜生栅藻毒性效应的确定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)生物毒性实验设计：
对斜生栅藻进行急性毒性实验，在BG11培养基中分别外加CaCl2、MgSO4、NaCl、KCl、HCl、NaOH和生物缓冲液MOPS并采用控制变量法，在只改变某个实验条件的同时控制其他实验条件不变的情况下，对斜生栅藻进行急性毒性实验，测试媒介为一般地表水水质；
(2)确定斜生栅藻毒性参数并计算溶液中各离子活度：
毒性实验结束后，计算各组实验生长抑制率，计算方程为：
其中，I为斜生栅藻的生长抑制率，Ac代表对照组的吸光度，As代表实验组的吸光度；
得到I值后，用SPSS软件拟合得到EC50，选择Logit模型；
各阳离子的自由态离子活度通过输入水质参数和EC50到Biotic Ligand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序中“Speciation”模式形态分布功能计算得到；
(3)构建毒性预测模型：
根据生物配体模型中基于淡水中阳离子会在生物配体上发生竞争作用，可将生物配体络合容量表达为：
CCBL＝∑i[CiBL]+[BL-] (2)
其中，CCBL为生物配体的络合容量，[CiBL]表示溶液中各阳离子与生物配体的络合物的浓度，[BL-]表示未与阳离子发生络合作用的生物配体的浓度；
阳离子和生物配体的络合物的稳定常数的表达式为：
其中，KCuBL表示铜离子与生物配体的络合物的稳定常数，CuBL+表示铜离子与生物配体的络合物的浓度，(Cu2+)表示铜离子活度，[BL-]表示未与阳离子发生络合作用的生物配体的浓度；
联立(2)、(3)方程式可将铜离子与生物配体的络合物的浓度表示为：
[CuBL+]＝[KCuBL·(Cu2+)]/[1+∑iKCiBL·(Ci)]·CCBL (4)
其中，i表示与铜离子在生物配体上产生竞争作用的阳离子的个数，KCiBL表示该离子的稳定常数，(Ci)表示该离子活度；
假设生物配体络合容量不随水质参数而改变，可将铜离子与生物配体的络合物占生物配体络合容量比表达为：
fCuBL＝[CuBL+]/CCBL＝[KCuBL·(Cu2+)]/[1+∑iKCiBL·(Ci)] (5)
根据生物配体模型，可假设半数抑制浓度时，生物配体络合容量占比为常数，则可将方程式(5)表达为：
其中，EC50(Cu2+)表示斜生栅藻72h急性毒性的半数抑制浓度；
在生物配体模型中，如将(CuOH+)毒性考虑其中，可将方程(5)转化为：
fCuBL＝[KCuBL·(Cu2+)+KCuOHBL·(CuOH+)]/[1+∑iKCiBL·(Ci)] (7)
并可将方程(6)转化为：
由方程式(6)可知，确定其他阳离子活度不变，只改变i离子活度的情况下以，(Ci)与EC50(Cu2+)为线性关系，可得方程式(9)、(10)：
其中Ii表示该线性方程的截距，Si代表该线性方程的斜率；
由方程(9)、(10)可得斜率与截距比为：
通过上述急性毒性试验和Biotic Ligand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序计算不同实验条件下各离子活度可得到EC50(Cu2+)和(Ci)的线性关系表达式；
通过线性关系分析得知，(K+)的变化不影响EC50(Cu2+)的变化，(Na+)、(Mg2+)、(Ca2+)、(H+)与EC50(Cu2+)呈线性关系，据此，可由方程(12)得到一个矩阵表达式：
其中，(Mg2+)Ca、(Na+)Ca、(H+)Ca表示以Ca浓度为变量实验组中(Mg2+)、(Na+)、(H+)的平均值，其他组别表达相同；
考虑到pH组别的特殊性，预测时分别假设：
a：EC50(Cu2+)与pH的线性关系全部归因于质子竞争；
b：EC50(Cu2+)与pH的线性关系与质子竞争无关，与产生的CuOH+有关，去掉该矩阵表达式的最后一列；
使用方程(12)所计算出的假设a和假设b稳定常数，将假设a和假设b的结果与文献中已有值进行比较，确定logKCaBL、logKMgBL、logKNaBL和logKHBL；
根据方程(3)计算KCuBL并对铜的形态进行分离测定：生物积累实验选取处于对数生长中后期的藻2×106cells·mL-1，将藻液导入50mL离心管中，3200r/min离心4min后倒掉上清液，再反复2次MOPS缓冲液清洗，使藻悬浮后重新离心并弃掉上清液，然后加入缓冲液至50mL用于生物积累实验；暴露溶液中Cu的浓度范围为3.2μg·L-1到640.6μg·L-1，暴露溶液体积为50mL；根据设定浓度，计算出所需母液的含量，进行配制；暴露时间为120min，于t＝120min时取样；取30mL于离心管中，然后将样品3200r/min离心4min，取5mL的上清液于离心管中用于测定溶解铜浓度，然后倒掉上清液，每组实验做三次平行样；分别测定总铜浓度Cut、溶解态铜浓度Cud和细胞内铜浓度Cui，计算细胞外与生物配体络合态铜CuBL，测定方法如下：
取藻悬液，3500r/min离心4min后取出5mL上清液测定溶解态铜浓度Cud，然后将样品用MOPS缓冲液清洗2到3次，加入20mL EDTA/MOPS溶液重新悬浮10min，3500r/min离心4min后取上清液用于测定细胞外与生物配体络合态铜CuBL，将底层沉淀转移至烧杯50mL烧杯中，加入2mL浓硝酸90℃硝化至滤膜完全溶解，后加超纯水稀释至25mL用于测定细胞内Cui，用ICP-MS分别对细胞内铜Cui和细胞外与生物配体络合态铜CuBL进行测定；
由方程(3)可知：
KBL＝CuBL/{Cud·([BL-]-CuBL)} (13)
将上式重组可得：
Cud/CuBL＝Cud/[BL-]+1/KBL·[BL-] (14)
由Cud/CuBL对Cud作图，其斜率的倒数为络合容量[BL-]，截距为络合容量和络合常数乘积的倒数；
可根据线性关系的斜率和截距通过表达式(14)计算得出相应的KCuBL值；
当金属与斜生栅藻之间的作用常数logKCaBL、logKMgBL、logKNaBL、logKKBL、logKCuOHBL、logKHBL、logKCuBL确立后，建立了斜生栅藻新的数据(.dat)文件，在无溶解有机质参与的情况下，通过生物配体模型的铜形态分布功能"Speciation"推算斜生栅藻的半数致死积累量LA50值；
斜生栅藻的LA50值确立后修改(.dat)文件中LA50值，建立斜生栅藻生物配体模型，通过"Toxicity"模式的预测功能，预测实验条件下斜生栅藻的EC50值。
2.如权利要求1所述的方法在淡水环境重金属毒性评估中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：
第一步：测定特定淡水环境中水化学特性
在特定水质中取样分别测定温度、pH和DOC、Ca2+、Mg2+、Na+、K+、SO4 2-、Cl-、DIC、S2-相关参数的浓度；
第二步：预测该水质条件下的EC50
将上述所测参数代入建立的毒性预测模型中，通过"Toxicity"模式的预测功能，预测该水质条件下Cu对斜生栅藻EC50；
第三步：对该水质条件下的Cu进行风险评估
将上述所得Cu对斜生栅藻EC50与相关文献和标准进行对比，判断铜在该水质条件的风险大小。
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