CN108728580A - 一种用细菌发光速测肝脏疾病的试剂盒及其用法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发光细菌对人体感染病毒检测的试剂领域，具体涉及一种用细菌发光速测肝脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括提纯防干扰液，发光细菌，发光细菌培养液，效果稳定剂，所述提纯防干扰液由乙醇和十二烷基硫酸钠构成，所述发光细菌为青海弧菌Q67，所述发光细菌培养液由酵母浸出液0.8 g、胰蛋白胨0.8 g、甘油0.3 g、NaCl 3 g、Na2HPO4 0.8 g、KH2PO4 0.8g和蒸馏水100 mL构成，所述效果稳定剂为含有1.8 wt%NaCl溶液，本发明试剂盒适应于窗口期检测，在肝脏检测领域具有重大的先进意义。

Description

一种用细菌发光速测肝脏疾病的试剂盒及其用法

技术领域

本发明涉及发光细菌的综合感染病毒检测试剂领域，具体涉及一种用细菌发光速测肝脏疾病的试剂盒和该试剂盒的用法。

背景技术

2015 年3 月在土耳其伊斯坦布尔召开的亚太肝脏病年会上发布了首个慢性乙型肝炎( CHB) 的预防、关怀和治疗指南( 以下简称WHO 乙型肝炎防治指南) 。与已有的欧洲肝病学会( EASL ) 、亚太肝病学会( APASL ) 、美国肝病学会( AASLD) 乙型肝炎防治指南不同的是，WHO 乙型肝炎防治指南更关注中低收入国家的指南执行能力WHO， 乙型肝炎防治指南推荐医疗机构在判读APＲI 结果时使用APＲI ＞ 2 的单一高值作为肝硬化的诊断依据。但是采用这样的判读标准只能有效诊断约1/3 的肝硬化患者，

HBV 酶联免疫试剂是目前诊断乙肝的主要手段。乙肝“两对半”酶联免疫试剂目前已经普遍用于临床，急诊，血液筛查等各个领域。但是，酶联免疫方法作为一种间接滞后的检测方法，他所检测的目标是人体内产生的抗体而不是病原体本身。因此，虽然酶联免疫方法经过几代的改良和进化，在灵敏度、特异性、精确度和稳定性等方面有了巨大的提高。但是任然不能消除对“窗口期”标本的漏检。所谓“窗口期”，是指从感染病原体开始，直至用酶联免疫学检测方法能够检测到该病原体存在为止的这一段时间。乙肝的“窗口期”比较长，大约为59 天，因此，HBV 酶联免疫试剂容易造成漏检，不利于乙肝的早期诊断。近年来

核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较免疫诊断技术具有灵敏度高、特异性强、诊断快速等优点。血清中的HBV DNA 是病毒复制和肝炎进程的确切标志，所以血清中HBV DNA 的检测，已成为诊断乙肝的“金标准”方法。近几年来，通过荧光定量PCR 方法直接检测HBV DNA 已经成为一种通用乙肝医学检测方法，大大提高了乙肝的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，但是该种检测只是可接近“窗口期”的临近。无法再整个窗口期内适用，同时，也无法对感染程度和发展等级精细准确的检测和预判，也无法为患者提供治疗防御的医学检测基础。

目前，国内已有多种其它检测技术应用于临床中，如色谱类技术、化学发光法、比色法、免疫色谱法等；有些则通过多种检测结果的联合作用效果反映肝脏感染病毒的情况。但这些方法都需要昂贵的检测仪器和复杂的前处理，并且由于仪器测定条件变化与检测结果密切相关，需要非常专业的分析测试人员操作。因此，只有专业分析测试机构和研究机构的中心实验室才具备测试条件，需根据检测病例发展到一定的周期才能检测出结果，检测过程复杂，检测成本较高，不适合医疗中快速和预防治疗疾病的需要。

发明内容

在发明内容部分中引入了一系列简化形式的概念，这将在具体实施方式部分中进一步详细说明。本发明的发明内容部分并不意味着要试图限定出所要求保护的技术方案的关键特征和必要技术特征，更不意味着试图确定所要求保护的技术方案的保护范围，下文在说明技术方案方法步骤为例对本发明进行描述。

为了解决上述之一问题，本发明提供了一种用细菌发光速测肝脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括提纯防干扰液，发光细菌，发光细菌培养液，效果稳定剂，所述提纯防干扰液由乙醇和十二烷基硫酸钠构成，所述发光细菌为青海弧菌Q67，所述发光细菌培养液由酵母浸出液0 .8 g、胰蛋白胨0 .8 g、甘油0 .3 g、NaCl 3 g、Na2HPO4 0 .8 g、KH2PO4 0 .8g和蒸馏水100 mL构成，所述效果稳定剂为含有1.8 wt %NaCl溶液。

本发明的另一个目的为提供一种使用该试剂盒的方法，包括如下步骤：

步骤一.取试剂盒待测的血清样品进行预处理：在待检测血清区域中采用随机多点取样法选取采样点，采集中上层血清内的血样后，将血样混合均匀，置于血清袋后在室温下阴凉处降温，去除表层血脂，排空气后于室温避光保存备用；

步骤二.用所述提纯防干扰液对步骤一中的样品进行提纯防干扰处理：称取步骤一制备的血样，过滤膜后用乙醇索氏提取，离心旋转沉淀，加入十二烷基硫酸钠后将该混合物继续离心沉淀备用；

步骤三.对提纯防干扰处理后的样品用发光细菌进行感染病毒检测：取加入发光细菌后的发光细菌培养液，加入步骤二中的样品、1.8 wt .%NaCl溶液和纯净水，混匀后静置，测定发光强度衰减；

步骤四.样品感染病毒的结果算法：测量步骤三静置后混合液的发光强度衰减算出样品的感染程度。

进一步地，所述步骤一选取8个采样点。

进一步地，所述步骤二中称取3~8g步骤一制备的血样，过2 mm滤膜后用乙醇索氏提取16 h，离心旋转沉淀至8 mL，加入3~8 mL十二烷基硫酸钠，然后将混合物继续离心沉淀至8 mL备用。

进一步地，所述步骤三培养后的发光细菌培养液、样品提纯防干扰液、1.8 wt .%NaCl溶液和纯净水的体积比为1：2：4：13。

进一步地，所述步骤三取80 μL培养后的发光细菌培养液，加入100 μL样品提纯防干扰液、200 μL 1.8 wt .% NaCl和680 μL纯净水。

进一步地，所述步骤三中培养后的发光细菌培养液的制备过程如下：取发光细菌培养液和蒸馏水100 mL混合均匀，调节p H值至6 .8~7 .0；第一代斜面菌种在20℃温度下培养24 h后，立即接入第二代斜面培养12h后备用；将上述菌龄满12 h的新鲜斜面菌体接入盛有80 mL培养液的三角瓶中，接种量不超过1环，20 ℃、210 r/min振荡培养，每2 h测定1次培养液发光强度衰减。

进一步地，所述步骤三中取培养16~18 h后的发光细菌培养液。

进一步地，所述步骤三中混匀后静置1.8 min。

进一步地，所述步骤四中通过HQ-51型生物感染病毒测试仪检处理后测待的样品对对发光细菌的发光强度衰减。

本发明的有益效果：1 .本发明采用发光细菌检测试剂盒，构成简单、成本低廉，使用容易，对病毒感染检测速度与传统毒理学方法相比较快，适应整个窗口期的检测精细预判，无需根据检测病例发展到一定的周期才能检测出结果，能实现早诊断早治疗，并能进行综合感染的评价，与色谱检测技术相比，发光细菌法是建立在细菌发光生物传感技术基础上的感染病毒检测技术，具有检测快速、灵敏度高、适应性强以及重复性好等优点，能够适应样品量小的物质的综合感染病毒检测；生物发光是发光细菌生理状况的一个反映,发光细菌在生长对数期发光能力最强。当环境条件不良或有毒物质存在时,因细菌荧光素酶活性或细胞呼吸受到抑制,其发光能力受到影响或减弱,减弱的程度与环境有毒物质感染病毒的大小正相关。因此本方法完全能够用于血清综合感染病毒检测。

2 .选择乙醇/十二烷基硫酸钠作为提纯防干扰液对样品中的感染病毒物质进行提纯防干扰，先用对感染病毒物质具有很好提纯防干扰效果的乙醇对样品液进行提纯防干扰。由于，乙醇对发光细菌具有强测试影响，因此无法对感染病毒物质提取液直接进行发光度检测。需要再用对发光细菌低毒的十二烷基硫酸钠对感染病毒物质进行萃取，然后用十二烷基硫酸钠最终提取液进行发光度检测。

3.本试剂盒及其用法利用发光细菌试剂盒进行检测，样品与发光细菌的反应时间短，能够迅速获得检测结果，适应大批量样品的快速检测，大大缩短了综合感染病毒的检测时间，提高了检测效率和准确度。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：本发明实施方式的下列附图在此作为本发明的一部分用于理解本发明。附图中示出了本发明的实施方式及其描述，用来解释本发明的原理。在附图中，

图1为本发明所述试剂盒使用方法流程图；

图2为实施例所述样品综合感染病毒检测结果柱状图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细的说明。为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明实施方式可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明实施方式发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。为了彻底了解本发明实施方式，将在下列的描述中提出详细的细节。显然，本发明实施方式的施行并不限定于本领域的技术人员所熟习的特殊细节。本发明的较佳实施方式详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本发明还可以具有其他实施方式。

实施例

一种用细菌发光速测肝脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括提纯防干扰液，发光细菌，发光细菌培养液，效果稳定剂，所述提纯防干扰液由乙醇和十二烷基硫酸钠构成，所述发光细菌为青海弧菌Q67，所述发光细菌培养液由酵母浸出液0 .8 g、胰蛋白胨0 .8 g、甘油0 .3 g、NaCl 3 g、Na2HPO4 0 .8 g、KH2PO4 0 .8g和蒸馏水100 mL构成，所述效果稳定剂为含有1.8 wt .%NaCl溶液。

下文详细说明本发明的一种用细菌发光速测肝脏疾病的试剂盒的使用方法，参照图1，所述方法包括以下步骤：

(1)取试剂盒待测的血清样品进行预处理：严格按照环境血清质量监测规范等相关规范流程，利用吸血器在选定的区域内采用随机多点取样法选取8个采样点，采集大于0、小于等于20cm范围内的中上层血清，将血样混合均匀，置于专用血清袋，防止样品中感染病毒物质的损失；

样品经室温下阴凉处降温，去除表层血脂，排空气，以保障血清样品感染病毒物质测试结果稳定准确性和保证样品在提纯防干扰过程中和提纯防干扰液充分接触，排空气后于室温避光保存备用。

(2)用所述提纯防干扰液对步骤一中的样品进行提纯防干扰处理：称8 .0g血样，过2mm滤膜。用乙醇索氏提取16h，用其对污染血清进行提取后，再在提取物中加入对发光细菌低毒的十二烷基硫酸钠，然后通过旋转蒸发去除乙醇，以获得血清乙醇提取物的十二烷基硫酸钠溶液，提纯防干扰出血清样品中的感染病毒物质。对照处理用水代替十二烷基硫酸钠，其余条件不变。

由于血清中的感染物多为溶解性能不稳定的物质或存在检测干扰地物质，因此本发明利用有机溶剂对感染病毒物质进行抽提。以蒸馏水为对照，分别测定了乙醇、十二烷基硫酸钠、二氯甲烷对发光细菌的生物感染性，乙醇对发光细菌具有强感染性，而十二烷基硫酸钠的感染性较小，但乙醇对血清中感染病毒物质的抽提效率较十二烷基硫酸钠高，因此本发明首先采用乙醇对血清进行抽提，然后在乙醇提取物中加入对发光细菌低毒的十二烷基硫酸钠，最后通过旋转蒸发去除乙醇，以获得血清乙醇提取物的十二烷基硫酸钠溶液作为血清生物测定所需的最终提纯防干扰液的物质。

(3)对提纯防干扰处理后的样品用发光细菌进行感染病毒检测:利用发光细菌法测定感染物生物感染病毒时可选用发光细菌冻干粉或新鲜细菌培养液。但由于发光细菌冻干粉价格昂贵(进口冻干粉约为80美元/支)，

因此本实施例使用发光细菌的新鲜培养液。发光细菌培养液制备如下：取培养基含酵母浸出液0 .8g、胰蛋白胨0 .8g、甘油0 .3g、NaCl 3g、Na2HPO4 0 .8g、KH2PO4 0 .8g和蒸馏水100mL混合均匀，调节pH值至6 .8～7 .0。第一代斜面菌种20℃培养24h后，立即接第二代斜面培养12h备用。将上述菌龄满12h的新鲜斜面菌体接入盛有80mL培养液的三角瓶中，接种量不超过1环，20℃、210r/min振荡培养，每2h测定1次培养液发光强度衰减。具体测定方法为，取80μL培养液，加入200μL 1.8wt .％NaCl、780μL纯净水，混匀放置1.8min，利用HQ-51型生物感染病毒测试仪测定发光强度衰减。

在本实施例培养条件下，发光细菌在前10h的培养阶段处于延滞期，不发光。进入对数生长期后发光强度衰减迅速增加，培养20h时其发光强度衰减趋于稳定。因此本试验采用培养16～18h的新鲜菌液进行感染病毒试验。

取80μL培养16h的发光细菌培养液，加入100μL样品提纯防干扰液、200μL1.8wt.％NaCl和680μL纯净水，混匀后静置1.8min，利用HQ-51型生物感染病毒测试仪测定发光强度衰减，平行测定3次，相对偏差不超过10％，结果取3次测定的平均值。

(4)样品感染病毒的结果算法：发光强度衰减记为A,A＝(对照组发光强度衰减-样品发光强度衰减)/对照组强度×100％，通过发光强度衰减，来表征血清的综合感染病毒水平。发光强度衰减越大，样品提纯防干扰液的感染病毒越大，发光强度衰减越小，样品提纯防干扰液的感染病毒越小。样品的发光强度衰减与感染病毒发展等级的关系见表1。

如下表1是样品的发光强度衰减与感染病毒发展等级的关系，也进一步和现有技术相比体现本发明的先进性。

由上表的检测结果分析关系可知，本发明对病毒感染检测结果与传统毒理学测试剂相比（现有的用试剂盒检测的技术是检测肝脏感染的期限是临近窗口期，没法对整个窗口期进行检测，也不能能实现如上述窗口期病毒感染检测的精细分析与等级预判），由此跟进一步体现验证了本发明的效果和先进性，其适应整个窗口期的检测精细预判，无需根据检测病例发展到一定的周期才能检测出结果，能实现早诊断早治疗，并能进行综合感染的评价，在肝脏检测领域具有重大的实践意义。

根据步骤(3)测定的发光强度衰减，计算出3次平行测定的发光强度衰减，计算结果参照图2，三次测定结果分别为23 .8％、2 4.5％和24 .6％ ，其最终的发光强度衰减测定结果为24 .3％，发展等级为Ⅰ级，感染程度为窗口前期。此期为感染的早早期，测检测结果对肝脏预防和治疗具有重大的意义。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种用细菌发光速测肝脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括提纯防干扰液、发光细菌、发光细菌培养液、效果稳定剂，所述提纯防干扰液由乙醇和十二烷基硫酸钠构成，所述发光细菌为青海弧菌Q67，所述发光细菌培养液由酵母浸出液0 .8 g、胰蛋白胨0.8 g、甘油0 .3 g、NaCl 3 g、Na2HPO4 0 .8 g、KH2PO4 0 .8g和蒸馏水100 mL构成，所述效果稳定剂为含有1.8 wt .%NaCl溶液。

2.一种权利要求1所述的用细菌发光速测肝脏疾病的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一.取试剂盒待测的血清样品进行预处理：在待检测血清区域中采用随机多点取样法选取采样点，采集中上层血清内的血样后，将血样混合均匀，置于血清袋后在室温下阴凉处降温，去除表层血脂，排空气后于室温避光保存备用；

步骤二.用所述提纯防干扰液对步骤一中的样品进行提纯防干扰处理：称取步骤一制备的血样，过滤膜后用乙醇索氏提取，离心旋转沉淀，加入十二烷基硫酸钠后将该混合物继续离心沉淀备用；

步骤三.对提纯防干扰处理后的样品用所述发光细菌进行感染病毒检测：取加入发光细菌后的发光细菌培养液，加入步骤二中的样品、1.8 wt .%NaCl溶液和纯净水，混匀后静置，测定发光强度衰减；

步骤四.样品感染病毒的结果算法：测量步骤三静置后混合液的发光强度衰减算出样品的感染程度。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤一选取8个采样点。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤二中称取3~8g步骤一制备的血样，过2 mm滤膜后用乙醇索氏提取16 h，离心旋转沉淀至8 mL，加入3~8 mL十二烷基硫酸钠，然后将混合物继续离心沉淀至8 mL备用。

5.根据权利要求2所述的法，其特征在于，所述步骤三培养后的发光细菌培养液、样品提纯防干扰液、1.8 wt .%NaCl溶液和纯净水的体积比为1：2：4：13。

6.根据权利要求5所述的的方法，其特征在于，所述步骤三取80 μL培养后的发光细菌培养液，加入100 μL样品提纯防干扰液、200 μL 1.8 wt .% NaCl和680 μL纯净水。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤三中培养后的发光细菌培养液的制备过程如下：取发光细菌培养液和蒸馏水100 mL混合均匀，调节p H值至6 .8~7 .0；第一代斜面菌种在20℃温度下培养24 h后，立即接入第二代斜面培养12h后备用；将上述菌龄满12 h的新鲜斜面菌体接入盛有80 mL培养液的三角瓶中，接种量不超过1环，20 ℃、210 r/min振荡培养，每2 h测定1次培养液发光强度衰减。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤三中取培养16~18 h后的发光细菌培养液。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤三中混匀后静置1.8 min。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤四中通过HQ-51型生物感染病毒测试仪检处理后测待的样品对对发光细菌的发光强度衰减。