CN105092491A - 一种快速筛选酿酒酵母菌抗菌剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境污染检测技术领域，公开了一种快速筛选酿酒酵母菌抗菌剂的测定方法，该方法包括以下步骤：(1)复苏菌种并传代：(2)制备测试菌种：取步骤(1)制得的斜面传代菌种培养，得到摇瓶菌液；(3)平衡菌液制得工作菌液：(4)加样及检测光密度：在96孔板中，将步骤(3)制得的工作菌液加入到含有高倍液体培养基及化合物和无菌水共160μL的污染液中培养，然后测其OD₆₂₀值。本发明方法具有便捷、精度高的特点。

Description

一种快速筛选酿酒酵母菌抗菌剂的方法

技术领域

本发明属于环境污染检测技术领域，涉及一种快速筛选酿酒酵母菌抗菌剂的方法。

背景技术

随着现代工业的迅速发展，有毒化合物的种类和数量与日俱增，进入环境中的化合物也引起了人们的广泛关注。由于环境中污染物大都具有低浓度、复合型等特点。因此，以往仪器的灵敏度不高导致很多低浓度的污染物被忽略，其中包含某些毒性较强的污染物，例如POPs(PersistentOrganicPollutants)，它是一类具有持久性、生物累积性、远距离迁移性和高毒性的有机污染物，会对生物的免疫系统、内分泌系统、生殖和发育等造成不可逆转的危害。因此，人们迫切需要了解有机污染物对环境中各种生物的毒性影响，有机污染物对于原核生物(细菌、藻等)的毒性数据已有大量的报道^[1,2]，然而有机污染物对环境中另外重要的一大类微生物—真核微生物的毒性，数据却显得相对缺乏。酵母菌是一群单细胞真菌的总称，是人类文明史中被应用的最早的微生物，在自然界中分布广泛，可在缺氧环境中生存。因酵母菌属于简单的单细胞真核生物，作为一种模式生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学、现代工业以及废水生物处理的研究中。本发明就是利用酵母菌作为模式生物，来检测污染物对酵母菌的毒性大小。

目前，很多方法都是通过观察抑菌圈，以能使抑菌圈中分辨出单个菌落的最小样品浓度为该样品对酵母菌的最小产生清晰抑菌圈浓度C_mix ^[3]，通过最小抑菌圈浓度来定量描述毒性的大小。但是，此方法存在一些不足之处，如，实验过程中会出现抑菌圈边缘模糊，甚至双圈等现象，会导致实验结果不准确。

发明内容

本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷而提供一种快速筛选酿酒酵母菌抗菌剂的测定方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明中用96孔板培养样品，用LB940酶标仪620nm波长下来测定光密度(OD)值，通过计算EC₅₀来定量描述化合物的毒性大小。由德国伯托公司生产的LB940酶标仪，内置超灵敏的发光检测模块，配备极高灵敏度的单光子计数模式(singlephotoncounting)光电倍增管(检出限<3zmolluciferase/well)，专门优化的光路设计，可高效、快速地获得更准确的实验数据。另外，酶标板根据其孔数可以分为6,12,24,48,96及384孔，一般常用的为96孔，这要根据酶标仪进行选择。所以，采用其他孔数的酶标板也可以实现本发明。

一种快速筛选酿酒酵母菌抗菌剂的方法，该方法包括以下步骤：

(1)复苏菌种并传代；

(2)制备测试菌种：取步骤(1)制得的斜面传代菌种培养，得到摇瓶菌液；

(3)平衡菌液制得工作菌液；

(4)加样及检测光密度(OD)；

(5)采用双交错对照法计算样品的抑制率。

所述的步骤(1)，复苏菌种并传代，将酵母菌的冻干粉溶解，接种到固体原倍培养基的斜面上并传代3次后得到斜面三代菌种备用，传代3次的酵母菌活性高且稳定，适于实验，传代次数不宜太多，否则其生化指标会改变。

所述的步骤(2)，制备测试菌种为用接种环取2～3环步骤(1)制备的斜面传代菌种接入5mL原倍液体培养基中，28℃，培养至对数生长期(12h～18h)成为摇瓶菌液；其中，所述的原倍液体培养基成分为：1％葡萄糖，1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸膏。

所述的液体原倍培养基为：1％葡萄糖，1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸膏。所用固体原倍培养基为：在液体原倍培养基基础上添加2％琼脂。

所述的步骤(3)，取摇瓶菌液200μL到40mL无菌水中，维持菌群密度为10⁷～10⁸个/mL，磁力搅拌40min制得工作菌液。

所述的步骤(4)为：在96孔细胞培养板(简称96孔板)中，将40μL步骤(3)得到的工作菌液加入到含有高倍液体培养基及化合物和无菌水共160μL的污染液中，其中高倍液体培养基的用量是80μL，化合物和无菌水的用量是80μL，加样后将96孔板放入恒温培养箱中，振荡培养24h，使用酶标仪在620nm波长下测定其光密度(OD₆₂₀)；

所述的高倍液体培养基(2.5倍)成分为：2.5％葡萄糖，2.5％胰蛋白胨，1.25％酵母浸膏。

所述的步骤(4)中，往96孔板中加样的操作方式为：采取间隔设置空白的方法，避免由于菌体测定过程中光密度的变化导致的测定误差。

步骤(5)中计算样品的抑制率要用到酶标仪测定的OD₆₂₀值；抑制率与OD₆₂₀值的计算关系是：

抑制率(％)＝100％×(对照组的OD₆₂₀值－样品组的OD₆₂₀值)/对照组的OD₆₂₀值

其中对照组的OD₆₂₀值指是样品前后的对照组的平均OD₆₂₀值，即双交错对照法。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、本发明方法测定的酵母菌抗菌剂毒性结果数据稳定、重现性好；同时由于采用了最新的酶标仪，检出限范围比原有技术更广。

2、适用范围广，无需复杂的检测设备，不造成试验和环境污染。

3、本发明方法同采用动物、植物毒性测定方法(周期长、费用高)相比，在建立和完善污染物毒性数据库方面，具有耗时短、费用低廉、灵敏度高的特点。

4、本发明方法可对酵母菌抗菌剂进行有效筛选及生态毒理进行准确评价。

附图说明

图1为本发明实施例采用直线法对测定结果拟合得到EC₅₀ ¹标准曲线图。

图2为本发明实施例采用直线法对测定结果拟合得到EC₅₀ ²标准曲线图。

图3为本发明实施例采用直线法对测定结果拟合得到EC₅₀ ³标准曲线图。

图4为本发明实施例采用直线法对测定结果拟合得到EC₅₀ ⁴标准曲线图。

具体实施方式

以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。

所用仪器：酶标仪、恒温培养箱、混匀小精灵、10通道排枪、单通道(100μL、200μL、和1000μL)移液枪、高压蒸汽灭菌锅、精密电子天平、电热恒温鼓吹干燥箱。

所用菌种：酿酒酵母菌冻干粉，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

原倍液体培养基配方：1％葡萄糖，1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸膏。

原倍固体培养基配方：在原倍液体培养基的基础上添加2％琼脂。

高倍液体培养基(2.5倍)配方：2.5％葡萄糖，2.5％胰蛋白胨，1.25％酵母浸膏，

实施步骤：

(1)菌种的复苏：

将-20℃保存的S.cerevisiae冻干粉与已灭菌原倍液体培养基溶液置于4℃冰箱内10～15min，用酒精棉球擦拭外周消毒后，在超净工作台中砂轮切开安瓿瓶，加入2mL已灭菌原倍液体培养基溶液，轻微振荡，复苏2～3min后，用接种环接2～3环菌液至原倍固体培养基平板划线。28℃恒温培养24h左右，再转接第二代斜面。24h后转接第三代斜面，将培养好的第三代斜面置于4℃冰箱中保存；

(2)测试菌种的制备：

在无菌操作台中，用灭菌后接种环挑取2～3环斜面三代菌种接入5mL原倍液体培养基，在28℃恒温条件下培养至对数生长期(12～18h)成为摇瓶菌液；

(3)菌液的平衡：

取摇瓶菌液200μL到40mL无菌水中，维持菌群密度为10⁷～10⁸个/mL，磁力搅拌40min以调节酿酒酵母菌生长基本同步，制成工作菌液；

(4)加样及光密度(OD)检测：

在96孔板中进行加样，首先根据所设置的浓度梯度加入不同体积的化合物和无菌水共80μL，然后加入高倍(2.5倍)液体培养基80μL，最后加入40μL同步后的菌液，每个浓度梯度做3组平行，加样时板面最外圈空出，消除边缘效应对实验结果的影响。加样后，将96孔板放入恒温培养箱中，振荡培养24h，通过酶标仪测其OD₆₂₀值。

(5)采用双交错对照法计算样品的抑制率

所谓双交错对照法，是针对在传统的发光菌毒性测定方法中，由于外界条件的改变对样品测定的影响，导致毒性测定结果的可重现性差的缺陷而专门设计的一种方法。将此方法应用于酿酒酵母菌的毒性测定中，具体操作为：采取间隔设置空白的方法，在空白组(即不加污染物)后的每个样品组必须同时设置一组空白对照组，每个样品设置三个平行，加样时板面最外圈空出，消除边缘效应对实验结果的影响。

通常用微生物抑制的50％的受试化合物浓度来表征其毒性效应(EC₅₀)，将计算的抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析，根据所得回归方程可求出相应的EC值(effectiveconcentration，有效浓度)。

实施例1

测定苯乙醇对酿酒酵母菌的毒性

采用本方法，用无菌水配置10.84、14.45、16.60、19.05、21.88、25.12mmol/L的苯乙醇溶液，按上述方法加入到测定体系，按这一浓度梯度重复四次。由下面的图1、图2、图3、图4的回归方程计算可得EC₅₀值，依次为3.9439mmol/L、4.2975mmol/L、3.7925mmol/L、3.9194mmol/L。可见，EC₅₀值的平行性比较好，此方法可行。具体结果如下：

A)第一次试验结果及抑制率列于表1中。

表1

浓度(mmol/L)	lgC	抑制率(％)
			10.84	1.04	26

14.45	1.16	34
			16.60	1.22	78
19.05	1.28	94
			21.88	1.34	100
25.12	1.40	102

采用直线法对测定结果拟合得到标准曲线，如图1示。

图1，横坐标为苯乙醇浓度(mmol/L)的对数(lgC)，纵坐标为双交错法计算的抑制率，R²(相关系数)表明两者有很好的线性关系，经计算，苯乙醇EC₅₀ ¹＝3.9439mmol/L。

B)第二次试验结果及抑制率列于表2中。

表2

浓度(mmol/L)	lgC	抑制率(％)
			10.84	1.04	17
14.45	1.16	39
			16.60	1.22	76
19.05	1.28	94
			21.88	1.34	100
25.12	1.40	102

利用直线法得到标准曲线后求解EC₅₀ ²，如图2所示。经计算，苯乙醇EC₅₀ ²＝4.2975mmol/L；

C)第三次试验结果及抑制率列于表3中。

表3

浓度(mmol/L)	lgC	抑制率(％)
			10.84	1.04	9
14.45	1.16	37
			16.60	1.22	67
19.05	1.28	92
			21.88	1.34	98

对测定体系结果直线拟合，得到计算曲线如图3所示。经计算，苯乙醇EC₅₀ ³＝3.7925mmol/L；

D)第三次试验结果及抑制率列于表4中。

表4

浓度(mmol/L)	lgC	抑制率(％)
			10.84	1.04	10
14.45	1.16	36
			16.60	1.22	77
19.05	1.28	90
			21.88	1.34	98

对测定体系结果直线拟合，得到计算曲线如图4所示。经计算，苯乙醇EC₅₀ ⁴＝3.9194mmol/L；

由EC₅₀ ¹、EC₅₀ ²、EC₅₀ ³、EC₅₀ ⁴可知，采用本专利测定的结果之间的差异相对来说比较小，由此可知，本发明所建立的方法稳定、可靠，其可能原因1)本发明采用的检测仪器先进；2)双交错法试验设计与计算增加了实验的稳定性；因而，本发明在环境领域的科研、污染物监测、检疫等部门有较好的应用前景。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

参考文献

[1]BlumDJWetal.EcotoxicolandEnvironSaf,1991,22(2):197。

[2]张育红等.科学通报,1994,33(9):806。

[3]廖宜勇,周玳等.环境科学学报,1996,16(3):350。

Claims (10)

1.一种快速筛选酿酒酵母菌抗菌剂的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)复苏菌种并传代；

(2)制备测试菌种：取步骤(1)制得的斜面传代菌种培养，得到摇瓶菌液；

(3)平衡菌液制得工作菌液；

(4)加样及检测光密度；

(5)采用双交错对照法计算样品的抑制率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(1)，复苏菌种并传代，将酵母菌的冻干粉溶解，接种到固体原倍培养基的斜面上并传代3次后得到斜面三代菌种备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(2)，制备测试菌种为用接种环取2～3环步骤(1)制备的斜面传代菌种接入5mL原倍液体培养基中，28℃，培养至对数生长期成为摇瓶菌液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的原倍液体培养基成分为：1％葡萄糖，1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸膏。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所用固体原倍培养基为：在液体原倍培养基基础上添加2％琼脂。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(3)，取摇瓶菌液200μL到40mL无菌水中，维持菌群密度为10⁷～10⁸个/mL，磁力搅拌40min制得工作菌液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)为：在96孔细胞培养板中，将40μL步骤(3)得到的工作菌液加入到含有高倍液体培养基及化合物和无菌水共160μL的污染液中，其中高倍液体培养基的用量是80μL，化合物和无菌水的用量是80μL，加样后将96孔板放入恒温培养箱中，振荡培养24h，使用酶标仪在620nm波长下测定其光密度OD₆₂₀。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：其中所述的高倍液体培养基成分为：2.5％葡萄糖，2.5％胰蛋白胨，1.25％酵母浸膏。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，往96孔细胞培养板中加样的操作方式为：采取间隔设置空白的方法，避免由于菌体测定过程中光密度的变化导致的测定误差。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中计算样品的抑制率要用到酶标仪测定的OD₆₂₀值；抑制率与OD₆₂₀值的计算关系是：

抑制率(％)＝100％×(对照组的OD₆₂₀值－样品组的OD₆₂₀值)/对照组的OD₆₂₀值

其中对照组的OD₆₂₀值指是样品前后的对照组的平均OD₆₂₀值，即双交错对照法。