CN113884413A - 一种汽油车尾气颗粒物对水生生物毒性效应的试验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种汽油车尾气颗粒物对水生生物毒性效应的试验方法，包括尾气颗粒物的提取、测试液的配置和毒性试验三个步骤；具体步骤如下：尾气颗粒物提取：将采集的含尾气颗粒物的滤膜用水洗脱得洗脱液；依据预试验结果确定滤膜数为5‑20张，对应的颗粒物质量为2‑10mg，定容至10‑20ml；测试液的配置：将洗脱液配置成各浓度测试液；毒性试验：选择水生微生物发光菌、浮游动物大型溞或鲤科鱼类进行毒性试验，毒性试验包括预试验和正式试验。本发明有别与采用哺乳动物等检测的人体健康风险技术，具有环境水生态风险代表性强、敏感性高、科学适用性好等显著优势。
Description
技术领域
本发明涉及汽车尾气污染领域，更具体的说是涉及一种汽油车尾气颗粒物对水生生物毒性效应的试验方法。
背景技术
近几年来，随着汽车排放尾气导致的环境污染问题日益严峻，世界各国不断完善汽车尾气排放标准，但至今汽车尾气排放标准的制定和修订大多关注人体健康问题，而未充分考虑其对生态环境的影响，也尚未提出比较科学的汽车尾气颗粒物对水生态环境影响评估的试验方法。蓝天、碧水、净土行动是我国现阶段需打赢的三大环境污染防治攻坚战，由于环境污染源较为复杂，直接研究汽车尾气对水生态环境的影响较为困难。生物是生态环境的重要组成部分，尤其水生生物的毒理学效应是评价污染物质对生态系统暴露风险及体现生态环境质量的重要指标之一，目前尚未见汽油车尾气颗粒物对生态环境系统中水生生物暴露风险影响的测试方法。因此，研发提供一种科学的研究汽油车尾气颗粒物对水生生物毒性风险效应的试验方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种研究汽油车尾气颗粒物对水生生物毒性效应测试的方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种汽油车尾气颗粒物对水生生物毒性效应的试验方法，包括尾气颗粒物的提取、测试液的配置和毒性试验三个步骤；具体步骤如下：
(1)尾气颗粒物提取：将采集的含尾气颗粒物的滤膜用水洗脱得洗脱液；依据预试验结果确定滤膜数为5-20张，对应的颗粒物质量为2-10mg，定容至10-20ml；
(2)测试液的配置：将洗脱液配置成各浓度测试液；
(3)毒性试验：选择水生微生物发光菌、浮游动物大型溞或鲤科鱼类进行毒性试验，毒性试验包括预试验和正式试验。
优选的，水生微生物发光菌的正式试验包括以下步骤：
1)吸取0.5-1.0ml的20-30mg/ml氯化钠溶液注入2～5℃含有0.2-0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶中，充分混匀，放入2～5℃下复苏20-30min，得到复苏菌液；
2)采用发光菌生物发光计，预热5-10min，加入含1-2ml氯化钠溶液及复苏发光菌液10-20μL测量，调零备用；
3)将洗脱液配置好的各浓度测试液分别加入10μl复苏菌液，加盖混匀，并避光保存，10-15min后采用发光菌生物发光计测量读出各组的发光量；
4)每个浓度做三次重复实验，并以1-3ml浓度为20-30g/ml的氯化钠为对照；
5)根据试验结果以发光菌相对发光度为纵坐标，尾气颗粒物浓度为横坐标绘制剂量效应曲线，根据剂量效应方程求得发光菌的半数抑制浓度EC50。
优选的，在上述水生微生物发光菌的正式试验中，测试液的配置方法为：将洗脱液与20-30mg/ml的氯化钠按不同比例配比。
优选的，鲤科鱼类的正式试验包括以下步骤：
1)选用体长为20±3.5mm，体重为0.3-0.5±0.05g，2-4月龄的斑马鱼作为试验用鱼；
2)将洗脱液配置好的各浓度测试液设置平行和空白对照组，每组放置同等数量的斑马鱼，试验采用静态暴露法，试验开始及结束时测量测试液的pH、水温、电导率及溶解氧，试验期定时观察并记录鱼的存活情况；
3)以斑马鱼96h的死亡率为纵坐标，尾气颗粒物浓度为横坐标绘制剂量效应曲线，根据剂量-效应关系方程求得尾气颗粒物对斑马鱼96h的半致死浓度LC50。
优选的，在上述鲤科鱼类的正式试验中，将洗脱液与曝气8-12h以上的试验水按不同比例混合，配置成系列浓度梯度的测试液。
优选的，在上述鲤科鱼类的正式试验中，毒性试验前将斑马鱼在连续曝气的稀释水中驯养一周，驯养时的死亡率控制在5-10％以内，试验前24h停止喂饲。
优选的，在上述鲤科鱼类的正式试验中，鲤科鱼类的预试验步骤为：将有机物浓缩液和重金属提取液分别稀释5-500倍，设3-5个浓度，每个浓度放置5-10条鱼，设置空白对照，为正式试验确定浓度范围。
进一步的，在对汽油车尾气颗粒物进行化学试验时，尾气颗粒物的提取还包括有机物成分的提取和无机物成分的提取；重金属的提取采用电热板消解法提取，得到重金属提取液；有机物的提取采用索氏法提取，得到有机物提取液。
进一步的，所述有机物成分的提取方法具体步骤为：将采集的含尾气颗粒物的滤膜剪碎放入索氏提取筒中，用有机溶剂在60-80℃条件下提取12-24h，依据预试验结果确定用于有机物提取的滤膜数为5-20张，对应的颗粒物质量为2-10mg，定容至10-20ml。
进一步的，所述重金属成分的提取方法具体步骤为：将采集的滤膜剪碎放入锥形瓶中，用盐酸、硝酸、高氯酸或硫酸(1：1：0.5-1)的混合液浸泡8-12h，先100-120℃消解1-2h，150-180℃消解至近干，加入10-20ml的1％硝酸消解至2-5ml，冷却后将消解液经过0.45μm滤膜，再用2-5ml 1％硝酸溶液洗涤消解液，过滤膜后一并移入容量瓶中进行定容，用氢氧化钠溶液中和消解液至pH到6.5～8.5；依据预试验结果确定用于重金属提取的滤膜数为5-20张，对应的颗粒物质量为2-10mg，定容至10-20ml。
进一步的，对所述有机物提取液进行浓缩，条件为：浓缩气压1.2-2.0PSI，温度25-35℃，浓缩至1-2mL，浓缩液转换溶剂为二甲亚砜，移入2-10mL容量瓶中，用去离子水进行定容。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：，本发明创造性采用环境水生态系统中的典型水生态营养级物种如水生微生物发光菌(luminescent bacteria)、浮游动物大型溞(Daphnia magna)、鲤科鱼类斑马鱼(zebrafish)等的毒性试验终点作为评价汽油车尾气颗粒物对生态环境毒性风险效应指标，有别与采用哺乳动物等检测的人体健康风险技术，具有环境水生态风险代表性强、敏感性高、科学适用性好等显著优势。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
开展轿车、SUV多功能车、轻型卡车三种车型汽油车尾气颗粒物有机物提取液对发光菌的毒性试验，包括尾气颗粒物的提取、测试液的配置和毒性试验三个步骤；具体步骤如下：
(1)尾气颗粒物提取：将采集的含尾气颗粒物的滤膜用水洗脱得洗脱液；依据预试验结果确定滤膜数为5-20张，对应的颗粒物质量为2-10mg，定容至10-20ml；
(2)测试液的配置：将洗脱液与20-30mg/ml的氯化钠按不同比例配比，稀释倍数和对应浓度见表1；
表1发光菌毒性试验稀释倍数和对应浓度
(表中“浓度”是根据汽车尾气颗粒物质量进行计算)
(3)毒性试验：选择水生微生物发光菌进行毒性试验，毒性试验包括预试验和正式试验，正式试验包括以下步骤：
1)吸取0.5-1.0ml的20-30mg/ml氯化钠溶液注入2～5℃含有0.2-0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶中，充分混匀，放入2～5℃下复苏20-30min，得到复苏菌液；
2)采用发光菌生物发光计，预热5-10min，加入含1-2ml氯化钠溶液及复苏发光菌液10-20μL测量；
3)将配置好的各浓度测试液分别加入10-20μl复苏菌液，加盖混匀，并避光保存，10-15min后采用发光菌生物发光计测量读出各组的发光量；
4)每个浓度做三次重复实验，并以1-3ml浓度为20-30g/ml的氯化钠为对照；
5)根据试验结果以发光菌相对发光度为纵坐标，尾气颗粒物浓度为横坐标绘制剂量效应曲线，根据剂量效应方程求得发光菌的半数抑制浓度EC50。
实施例2
开展轿车、SUV多功能车、轻型卡车三种车型汽油车尾气颗粒物有机物提取液对斑马鱼的毒性试验，包括尾气颗粒物的提取、测试液的配置和毒性试验三个步骤；具体步骤如下：
(1)尾气颗粒物提取：将采集的含尾气颗粒物的滤膜用水洗脱得洗脱液；依据预试验结果确定滤膜数为5-20张，对应的颗粒物质量为2-10mg，定容至10-20ml；
(2)测试液的配置：将有机物浓缩液和重金属提取液分别与曝气8-12h以上的试验水按不同比例混合，配置成系列浓度梯度的测试液，稀释倍数和对应浓度见表2：
表2斑马鱼毒性试验稀释倍数和对应浓度
(表中“浓度”是根据汽车尾气颗粒物质量进行计算)
(3)毒性试验：选择鲤科鱼类进行毒性试验，毒性试验包括预试验和正式试验；
预试验
将有机物浓缩液和重金属提取液分别稀释5-500倍，设3-5个浓度，每个浓度放置5-10条鱼，设置空白对照，为正式试验确定浓度范围；
正式试验包括以下步骤：
1)选用体长为20±3.5mm，体重为0.3-0.5±0.05g，2-4月龄的斑马鱼作为试验用鱼，试验前将斑马鱼在连续曝气的稀释水中驯养一周，驯养时的死亡率控制在5-10％以内，试验前24h停止喂饲；
2)将配置好的各浓度测试液设置平行和空白对照组，每组放置同等数量的斑马鱼，试验采用静态暴露法，试验开始及结束时测量测试液的pH、水温、电导率及溶解氧，试验期定时观察并记录鱼的存活情况；
3)以斑马鱼96h的死亡率为纵坐标，尾气颗粒物浓度为横坐标绘制剂量效应曲线，根据剂量-效应关系方程求得尾气颗粒物对斑马鱼96h的半致死浓度LC50。
开展浮游动物大型溞毒性试验过程类似斑马鱼毒性试验，一般采用16-24h孵化的正常大型溞试验，观测48h的半数致死浓度LC50。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种汽油车尾气颗粒物对水生生物毒性效应的试验方法，其特征在于，包括尾气颗粒物的提取、测试液的配置和毒性试验三个步骤；具体步骤如下：
(1)尾气颗粒物提取：将采集的含尾气颗粒物的滤膜用水洗脱得洗脱液；依据预试验结果确定滤膜数为5-20张，对应的颗粒物质量为2-10mg，定容至10-20ml；
(2)测试液的配置：将洗脱液配置成各浓度测试液；
(3)毒性试验：选择水生微生物发光菌、浮游动物大型溞或鲤科鱼类进行毒性试验，毒性试验包括预试验和正式试验。
2.根据权利要求1所述的试验方法，其特征在于，水生微生物发光菌的正式试验包括以下步骤：
1)吸取0.5-1.0ml的20-30mg/ml氯化钠溶液注入2～5℃含有0.2-0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶中，充分混匀，放入2～5℃下复苏20-30min，得到复苏菌液；
2)采用发光菌生物发光计，预热5-10min，加入含1-2ml氯化钠溶液及复苏发光菌液10-20μL测量，调零备用；
3)将洗脱液配置好的各浓度测试液分别加入10μl复苏菌液，加盖混匀，并避光保存，10-15min后采用发光菌生物发光计测量读出各组的发光量；
4)每个浓度做三次重复实验，并以1-3ml浓度为20-30g/ml的氯化钠为对照；
5)根据试验结果以发光菌相对发光度为纵坐标，尾气颗粒物浓度为横坐标绘制剂量效应曲线，根据剂量效应方程求得发光菌的半数抑制浓度EC50。
3.根据权利要求2所述的试验方法，其特征在于，测试液的配置方法为：将洗脱液与20-30mg/ml的氯化钠按不同比例配比。
4.根据权利要求1所述的试验方法，其特征在于，鲤科鱼类的正式试验包括以下步骤：
1)选用体长为20±3.5mm，体重为0.3-0.5±0.05g，2-4月龄的斑马鱼作为试验用鱼；
2)将洗脱液配置好的各浓度测试液设置平行和空白对照组，每组放置同等数量的斑马鱼，试验采用静态暴露法，试验开始及结束时测量测试液的pH、水温、电导率及溶解氧，试验期定时观察并记录鱼的存活情况；
3)以斑马鱼96h的死亡率为纵坐标，尾气颗粒物浓度为横坐标绘制剂量效应曲线，根据剂量-效应关系方程求得尾气颗粒物对斑马鱼96h的半致死浓度LC50。
5.根据权利要求4所述的试验方法，其特征在于，将洗脱液与曝气8-12h以上的试验水按不同比例混合，配置成系列浓度梯度的测试液。
6.根据权利要求4所述的试验方法，其特征在于，毒性试验前将斑马鱼在连续曝气的稀释水中驯养一周，驯养时的死亡率控制在5-10％以内，试验前24h停止喂饲。
7.根据权利要求4所述的试验方法，其特征在于，鲤科鱼类的预试验步骤为：将有机物浓缩液和重金属提取液分别稀释5-500倍，设3-5个浓度，每个浓度放置5-10条鱼，设置空白对照，为正式试验确定浓度范围。
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| CN202110983273.2A CN113884413A (zh) | 2021-08-25 | 2021-08-25 | 一种汽油车尾气颗粒物对水生生物毒性效应的试验方法 |
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN114788498A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-07-26 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种用于污染物气体暴露舱实验的尾气发生装置 |
| CN115222290A (zh) * | 2022-08-09 | 2022-10-21 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种水生态系统中金属针对水生物危害的评价方法 |
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2021
- 2021-08-25 CN CN202110983273.2A patent/CN113884413A/zh active Pending
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