CN102634578A - 伤寒沙门菌的逆转录荧光pcr检测用引物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物，其包括5’-GACTTGCCTTTAAAAGATACCA-3’和5’-AGAGTGCGTTTGAACACTT-3’。本发明还提供含有所述引物的用于检测伤寒沙门菌的试剂盒。本发明是针对伤寒沙门菌STY1381基因设计的特异性引物，用于检测该靶基因的逆转录荧光PCR反应中，利用该方法检测64株伤寒沙门菌均呈阳性，其余34种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌扩增结果均为阴性，说明该方法的特异性、敏感性均较高，逆转录荧光PCR的最低检测限为5pg/反应。

Description

伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物
技术领域
本发明涉及伤寒沙门菌的检测，具体地说，涉及伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物。
背景技术
伤寒沙门菌(S.Typhi)是肠道传染病中最常见的病原菌之一，对伤寒沙门菌的快速、准确检定是控制伤寒流行的重要手段。目前实验室中标准的检测伤寒方法为血培养，该检测方法不但费时(3-5天)、费力，且检出率易受病程，采血量及患者是否服用抗生素等因素的影响。分离培养难以满足快速、准确的要求，血清学诊断存在特异性低、准确性差的问题，临床上，单凭症状难以区分伤寒和副伤寒。因此有必要开发一种灵敏的早期检测方法。目前，由于抗生素的广泛应用且受到病原体本身耐药、变异等诸多因素的影响，近年来伤寒的复发率具有增高趋势，临床表现很不典型，给早期临床诊断和治疗带来很大的困难，因此，有必要建立伤寒沙门菌的快速、准确的分子生物学检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物。
本发明的另一目的是提供含有所述逆转录荧光PCR引物的用于检测伤寒沙门菌的试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明的一种伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物，其包括：
正向引物：5’-GACTTGCCTTTAAAAGATACCA-3’和
反向引物：5’-AGAGTGCGTTTGAACACTT-3’。
本发明进一步提供含有上述引物的用于检测伤寒沙门菌的试剂盒。
本发明针对伤寒沙门菌STY1381基因设计特异性引物，建立检测该靶基因的逆转录荧光PCR方法，利用35个血清型的纯培养伤寒和非伤寒沙门菌菌株、常见非沙门致腹泻病原菌以及发热为主要症状的8种常见病原菌RNA来评价该方法的特异性及敏感性，同时对伤寒沙门菌全血模拟标本进行检测下限确定。结果表明，利用该方法检测64株伤寒沙门菌均呈阳性，其余34种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌扩增结果均为阴性，说明该方法的特异性、敏感性均较高，达100％。在对纯菌总RNA检测中，逆转录荧光PCR的最低检测限为5pg/反应，约为1800个拷贝/反应。在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中，最低检测限达70cfu/mL。
附图说明
图1为本发明逆转录荧光PCR扩增产物凝胶电泳图；其中，泳道1为阴性对照，2-17为伤寒沙门菌样品，18为空白对照，19为伤寒沙门菌阳性对照，20-23为甲型副伤寒菌，24-25为乙型副伤寒菌，26为丙型副伤寒菌，27为猪霍乱沙门菌，28-32为鼠伤寒沙门菌，33-37为肠炎沙门菌，38为德尔卑沙门菌，39为汤姆逊沙门菌，40为山夫登堡沙门菌，41为韦太夫雷登沙门菌，42为阿贡纳沙门菌，43为阿伯丁沙门菌，44为鸭沙门菌，45为O1群霍乱弧菌，46为O139群霍乱弧菌，47为副溶血弧菌，48为痢疾志贺菌，49为金黄色葡萄球菌，50为致泻性大肠埃希氏菌。
图2为本发明逆转录荧光PCR检测纯菌RNA扩增曲线图；其中，a～e对应的模板浓度为，a：0.5×103Pg/反应；b：0.5×102Pg/反应；c：0.5×101Pg/反应；d：0.5Pg/反应；e：0.5×10-1Pg/反应；NC：阴性对照。
图3为本发明逆转录荧光PCR检测血模拟标本扩增曲线图；其中，a～e对应的模板浓度为，a：7×104cfu/ml；b：7×103cfu/ml；c：7×102cfu/ml；d：7×10cfu/ml；e：7×100cfu/ml；NC：阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例  伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物的设计及检测方法
1材料与方法
1.1实验用菌株
本实施例中使用的伤寒沙门菌64株，甲型、乙型和丙型副伤寒沙门菌以及其他31种非伤寒沙门菌血清型共57株(表1)，所有血清型均使用沙门菌抗血清(购自Statens Serum Institut，SSI，丹麦)进行血清型鉴定。另外，其他肠道常见病原菌及引起发热并可在血液标本中分离到的肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、立克次体、布鲁氏菌等菌株(表1)用于特异性及敏感性评价，上述菌株均来自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。
1.2引物设计
根据GenBank中STY1381基因的序列设计引物97-4F：5’-GACTTGCCTTTAAAAGATACCA-3’和97-4R：5’-AGAGTGCGTTTGAACACTT-3’，用于逆转录荧光PCR反应。
1.3血模拟标本的制备及RNA提取
取新鲜培养4-6小时的伤寒沙门菌(最终菌落计数为305×108cfu/ml)，进行十倍梯度系列稀释，取各稀释度菌液3.3ml分别与同体积新鲜人抗凝血混匀，室温放置30分钟后，作为全血模拟标本。利用QIAamp UCP PurePathogen Blood fieldtest Kit(QIAGEN公司)对上述模拟标本进行伤寒沙门菌RNA的提取，具体操作步骤严格按照说明书进行。同时以不加菌的血液作为阴性对照平行进行RNA提取。最终提取的RNA溶解到50μl不含RNase的无菌纯水中，取其中5μl作模板，进行逆转录荧光PCR反应。同时，取系列稀释菌液进行菌落计数，测定模拟标本中准确细菌含量。
1.4纯培养细菌RNA提取
纯菌RNA提取使用RNeasy Minikit(QIAGEN公司)，操作步骤均严格按照说明书进行。
1.5逆转录荧光PCR
使用One Step SYBR Primerscript RT-PCR Kit II(TaKaRa)进行逆转录荧光PCR反应，以提取的病原菌RNA为模板，取5μl加入反应体系中，两条引物各5pmol/L，使用CFX96荧光PCR仪，扩增条件为42℃30分钟；94℃30秒，60℃15秒，共45个循环。绘制溶解曲线，Ct值≤35的扩增结果判定为阳性。
2结果
2.1伤寒沙门菌逆转录荧光PCR的特异性及敏感性检测
本实施例中一共对48种152株细菌进行了逆转录荧光PCR检测(见表1)，其中64株伤寒沙门菌均呈阳性。沙门菌属其他34种血清型扩增结果均为阴性。对其他常见腹泻病原(霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌)扩增结果亦为阴性。而且，临床其他常见发热病原菌包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟氏菌、立克次体、布鲁氏菌扩增结果均为阴性，表明本发明的逆转录荧光PCR引物具有较高的菌种和血清型特异性及敏感性，特异性及敏感性均达100％。
逆转录荧光PCR反应后的凝胶电泳图如图1所示，阳性扩增产物大小为196bp。
表1  伤寒沙门菌逆转录荧光PCR特异性及敏感性检测
Figure BDA0000147300130000041
*括号内数字为测试菌株数量。
2.2伤寒沙门菌逆转录荧光PCR反应检测下限
2.2.1纯菌样本检测下限
提取新鲜培养4-6小时的伤寒沙门菌标准株CT18培养物(最终菌落计数为3.5×108cfu/ml)的总RNA作为阳性模板，对模板进行十倍梯度系列稀释，检测反应的灵敏性，结果(图2)表明，该逆转录荧光PCR反应最低可检测5pg/反应，约为1800拷贝/反应。获得标准曲线方程为y＝-3.271x+44.594，R2＝0.9992，说明引物扩增效率较高。共进行了三次独立重复实验，结果相同。
2.2.2血模拟标本检测下限
以血模拟标本中提取的RNA为模板进行逆转录荧光PCR检测，结果(图3)显示荧光PCR对血液样本的最低检测限度相当于70cfu/ml。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000147300210000011

Claims (2)

1.伤寒沙门菌(Salmonella Typhi)的逆转录荧光PCR检测用引物，其特征在于，包括：
正向引物：5’-GACTTGCCTTTAAAAGATACCA-3’和
反向引物：5’-AGAGTGCGTTTGAACACTT-3’。
2.含有权利要求1所述引物的用于检测伤寒沙门菌(S.Typhi)的试剂盒。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101705281A (zh) * 2009-11-19 2010-05-12 浙江省疾病预防控制中心 检测沙门氏菌的实时荧光pcr试剂盒及检测方法

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