CN101967473A - 一种提取鱼类基因组dna的方法 - Google Patents

Abstract

一种提取鱼类基因组DNA的方法，它涉及一种提取基因组DNA的方法。它解决了目前鱼类普通PCR反应模板提取工作量大、时间长的问题。本发明方法：一、鱼类采集样品制备；二、鱼类基因组DNA提取；三、PCR扩增。本发明方法可用于鱼类基因组DNA的提取。

Description

一种提取鱼类基因组DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种提取基因组DNA的方法。

背景技术

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好和易自动化等特点，目前已成为生物学研究领域不可或缺的研究方法。在水产鱼类生物学研究中，PCR方法是进行核酸检测的首先方法。

目前基因组DNA提取主要采用蛋白酶K的方法。首先应用蛋白酶K将样品消化后，采用酚/氯仿进行2～3次抽提，去除杂蛋白，如果盐离子浓度较高，须透析，然后加入2倍体积无水乙醇沉淀、75％酒精洗涤，待干燥后，加入1/10TE溶解，该过程耗时长，工作量较大。特别对于鱼类生物学研究，样品数量多，因此基因组DNA提取的工作量无疑将是更大的，而且提取样品中盐离子浓度的高低直接影响提取DNA的质量和PCR扩增效率。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前鱼类普通PCR反应模板提取工作量大、时间长的问题，而提供一种提取鱼类基因组DNA的方法。

提取鱼类基因组DNA的方法按以下步骤实现：一、鱼类采集样品制备；二、鱼类基因组DNA提取；三、PCR扩增；步骤二是将碱性反应液加入装有鱼类采集样品的试管并没过鱼类采集样品，然后置于95±2℃的环境中作用30～90min，再冰浴，加入与碱性反应液等体积的中和反应液并震荡2～3min，然后离心保留离心上清液，即得到鱼类基因组DNA模板；步骤二中碱性反应液由乙二胺四乙酸二钠溶液和氢氧化钠溶液组成，碱性反应液中乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.2mmol/L、氢氧化钠的浓度为25mmol/L；步骤二中中和反应液是浓度是40mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCL；步骤三PCR扩增反应体系为15μL由1.5μL的10×PCRbuffer、0.3μL浓度为10mmol/L的dNTP、0.6U的TaqDNA聚合酶、1μL鱼类基因组DNA模板、1μL浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL浓度为0.1μmol/L的下游引物和余量的灭菌双蒸水组成。

本发明方法提取鱼类基因组DNA所用的时间为蛋白酶K提取鱼类基因组DNA方法的1/5～1/10，而且只需要EDTA、NaOH和Tris-HCL(pH 8.0)三种普通试剂，不需要蛋白酶K等特殊试剂，大大降低了反应成本。

由于本发明方法在鱼类基因组提取过程中不发生样品上清液转移、沉淀等多步操作，确保了样品在制作过程中没有丢失，从而保证了实验过程中样品的数目，尤其是对于较珍贵的鱼类样品。同时，本发明方法所需样品数量较少，尤其对于鱼类受精卵和刚孵化鱼苗均适用，因此本发明方法能够克服样品基因组DNA量较少的问题，从而使反应实验顺利进行。

附图说明

图1是具体实施方式六中利用引物HLJ058对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

图2是具体实施方式六中利用引物HLJ328对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

图3是具体实施方式六中利用引物HLJ360对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

图4是具体实施方式六中利用引物HLJ379对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

图5是具体实施方式六中利用引物HLJ383对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

图6是具体实施方式六中利用引物HLJ041对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

图7是具体实施方式六中利用引物HLJ044对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

图8是具体实施方式六中利用引物HLJ046对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

图9是具体实施方式六中利用引物HLJ693对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

图10是具体实施方式六中利用引物HLJ809对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式提取鱼类基因组DNA的方法按以下步骤实现：一、鱼类采集样品制备；二、鱼类基因组DNA提取；三、PCR扩增；步骤二是将碱性反应液加入装有鱼类采集样品的试管并没过鱼类采集样品，然后置于95±2℃的环境中作用30～90min，再冰浴，加入与碱性反应液等体积的中和反应液并震荡2～3min，然后离心保留离心上清液，即得到鱼类基因组DNA模板；步骤二中碱性反应液由乙二胺四乙酸二钠溶液和氢氧化钠溶液组成，碱性反应液中乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.2mmol/L、氢氧化钠的浓度为25mmol/L；步骤二中中和反应液是浓度为40mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCL；步骤三PCR扩增反应体系为15μL由1.5μL的10×PCR buffer、0.3μL浓度为10mmol/L的dNTP、0.6U的TaqDNA聚合酶、1μL鱼类基因组DNA模板、1μL浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL浓度为0.1μmol/L的下游引物和余量的灭菌双蒸水组成。

本实施方式方法对PCR模板的制备具有快速、高效的优点，尤其是在鱼类样品数量较大的情况下，即可大大减少财力和工作量，又保证了实验质量而提高工作效率。

本实施方式方法特别适用于目的片段大小为100～500bp的PCR。

可以根据PCR扩增引物确定步骤三PCR退火温度和时间，以及PCR反应参数。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三中PCR扩增循环数为25～27。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤一将鱼厚度小于1mm的软鳍割下，取小于2.5mmx2.5mm的组织块并将表层粘液刮掉，即得到鱼类采集样品；或者取刚孵化体高、体厚均小于2mm的未开口鱼苗、卵径为0.8～1.2mm未孵化受精卵或大卵径受精卵的动物极作为鱼类采集样品。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。

对于未形成硬鳍的鱼可以直接取其软鳍，对于硬鳍的鱼可以直接取较薄较嫩部位软鳍，如尾鳍尖端。

本实施方式采用软鳍则在去掉表层粘液后尽量破碎。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点是：步骤一中将鱼类采集样品保存于体积浓度为75％的酒精中，DNA提取前先用蒸馏水将酒精洗净。其它步骤及参数与实施方式一、二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一、二、三或四的不同点是：步骤三中将步骤二得到的鱼类基因组DNA模板用灭菌蒸馏水稀释10～50倍后使用。其它步骤及参数与实施方式一、二、三或四相同。

具体实施方式六：本实施方式提取鱼类基因组DNA的方法按以下步骤实现：一、鱼类采集样品制备；二、鱼类基因组DNA提取；三、PCR扩增。其中步骤二是将碱性反应液加入装有鱼类采集样品的试管并没过样品，然后置于95℃±2℃的环境中作用30～90min，再冰浴，加入与碱性反应液等体积的中和反应液并震荡2～3min，然后离心保留离心上清液，即得到鱼类基因组DNA模板；步骤二中碱性反应液由乙二胺四乙酸二钠溶液和氢氧化钠溶液组成，碱性反应液中乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.2mmol/L、氢氧化钠的浓度为25mmol/L；步骤二中中和反应液是浓度为40mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCL；步骤三PCR扩增反应体系为15μL由1.5μL的10×PCR buffer、0.3μL浓度为10mmol/L的dNTP、0.6U的TaqDNA聚合酶、1μL鱼类基因组DNA模板、1μL浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL浓度为0.1μmol/L的下游引物和余量的灭菌双蒸水组成。

步骤一将鱼厚度小于1mm的软鳍割下，取小于2.5mmx2.5mm的组织块并将表层粘液刮掉，即得到鱼类采集样品；或者取刚孵化体高、体厚均小于2mm的未开口鱼苗、卵径为0.8～1.2mm未孵化受精卵或大卵径受精卵的动物极作为鱼类采集样品。

利用引物HLJ058、HLJ328、HLJ360、HLJ379、HLJ383、HLJ041、HLJ044、HLJ046、HLJ693和HLJ809采用本实施方式提取鱼类基因组DNA(引物序列及退火温度如表1所示)。

表1

引物	上游引物	下游引物	退火温度℃
				HLJ058	CAGATGGCAGACAGGTAA	GAGCAAGTGAGGGAACAG	59.0
HLJ328	CCTGACACCTGCCGTTCT	TCCTCTGTTCTGCCTCCC	53.0
				HLJ360	ATGATTTCACTGCTGCTTG	GTCTGTCGCTCTGTCTGG	60.0

HLJ379	GGGGAGACGAGAAGTGCA	AGCAGGTCTGTGGGCAAG	59.4
				HLJ383	GGCTCCTCCTCATCCTCT	GCACTTCTGCACCTTTCA	59.4
HLJ041	AGACCACCGCAGTAACAA	GACTCACTCAGCACCAGA	60.0
				HLJ044	GTACAGCGTGACAGCATT	AAGTTCATCGGTGTCCTC	60.0
HLJ046	AACCCTGAACTCACAAAC	CACGGAAACTGAGAAGAC	60.0
				HLJ693	GAGACCGCATGACTTCAA	TAGCCATCTGTCCTAAACGA	53.0
HLJ809	ATCATCACAGCCAAAGAAGT	TACGGACATAGTGCAGACAA	57.0

本实施方式方法步骤三PCR扩增反应条件为95℃变性5min，95℃变性30s，退火温度下30s，72℃延伸30s，共27个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。

本实施方式方法提取鱼类基因组DNA所用的时间为蛋白酶K提取鱼类基因组DNA方法的1/7～1/10，而且成本降低了50％以上。

采用本实施方式方法利用引物HLJ058对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图1所示。采用本实施方式方法利用引物HLJ328对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图2所示。采用本实施方式方法利用引物HLJ360对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图3所示。采用本实施方式方法利用引物HLJ379对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图4所示。采用本实施方式方法利用引物HLJ383对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图5所示。采用本实施方式方法利用引物HLJ041对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图6所示。采用本实施方式方法利用引物HLJ044对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图7所示。采用本实施方式方法利用引物HLJ046对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图8所示。采用本实施方式方法利用引物HLJ693对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图9所示。采用本实施方式方法利用引物HLJ809对鲤鱼进行PCR扩增，得到的扩增图谱如图10所示。

本实施方式方法与用蛋白酶K提取鱼类基因组DNA方法相比，获得的DNA条带具有长度准确，明亮清晰，背景较低，稳定性好的优点。

Claims (5)

1.一种提取鱼类基因组DNA的方法，提取鱼类基因组DNA的方法按以下步骤实现：一、鱼类采集样品制备；二、鱼类基因组DNA提取；三、PCR扩增；其特征在于步骤二是将碱性反应液加入装有鱼类采集样品的试管并没过鱼类采集样品，然后置于95±2℃的环境中作用30～90min，再冰浴，加入与碱性反应液等体积的中和反应液并震荡2～3min，然后离心保留离心上清液，即得到鱼类基因组DNA模板；步骤二中碱性反应液由乙二胺四乙酸二钠溶液和氢氧化钠溶液组成，碱性反应液中乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.2mmol/L、氢氧化钠的浓度为25mmol/L；步骤二中中和反应液是浓度是40mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCL；步骤三PCR扩增反应体系为15μL由1.5μL的10×PCR buffer、0.3μL浓度为10mmol/L的dNTP、0.6U的TaqDNA聚合酶、1μL鱼类基因组DNA模板、1μL浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL浓度为0.1μmol/L的下游引物和余量的灭菌双蒸水组成。

2.根据权利要求1所述的一种提取鱼类基因组DNA的方法，其特征在于步骤三中PCR扩增循环数为25～27。

3.根据权利要求1或2所述的一种提取鱼类基因组DNA的方法，其特征在于步骤一将鱼厚度小于1mm的软鳍割下，取小于2.5mmx2.5mm的组织块并将表层粘液刮掉，即得到鱼类采集样品；或者取刚孵化体高、体厚均小于2mm的未开口鱼苗、卵径为0.8～1.2mm未孵化受精卵或大卵径受精卵的动物极作为鱼类采集样品。

4.根据权利要求3所述的一种提取鱼类基因组DNA的方法，其特征在于步骤一中将鱼类采集样品保存于体积浓度为75％的酒精中，DNA提取前先用蒸馏水将酒精洗净。

5.根据权利要求4所述的一种提取鱼类基因组DNA的方法，其特征在于步骤三中将步骤二得到的鱼类基因组DNA模板用灭菌蒸馏水稀释10～50倍后使用。

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