TWI660044B - 用於檢測棗屬植物的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭示用於檢測棗屬植物的核酸分子。本發明亦揭示使用該等核酸分子來檢測存在於一樣品中的棗屬植物的檢驗套組、生物晶片以及方法。

Description

用於檢測棗屬植物的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法

本發明是有關於用於檢測棗屬植物(plant of Ziziphusgenus)的核酸分子。本發明亦有關於使用該等核酸分子來檢測存在於一樣品中的棗屬植物的檢驗套組(diagnostic kit)、生物晶片(biochip)以及方法。

棗屬( Ziziphus)是被子植物(Angiosperms)(又稱為開花植物)、真雙子葉植物(Eudicots)、薔薇目(Rosales)、鼠李科(Rhamnaceae)下的一個屬，該屬約有170種植物，通常為落葉或常綠灌木或喬木植物，主要分布在熱帶以及亞熱帶地區。棗屬植物(plant of Ziziphusgenus)的果實含有豐富的維生素以及礦物質，因而廣泛地被使用作為天然保健食品與中藥材的原料，其中較常用於食品或中藥材的棗屬植物包括：酸棗( Ziziphus jujubaMill.)、滇刺棗( Ziziphus mauritianaLam.)、山棗( Ziziphus montana)、毛果棗( Ziziphus attopensis)、球棗( Ziziphus laui)、大果棗( Ziziphus mairei)以及小果棗( Ziziphus oenopolia)等。

酸棗(拉丁學名： Ziziphus jujubaMill.；英文俗名：Spine Date或Sour Eelgrass；漢語拼音：Suanzao；中文別名：棘、野棗以及葛針等)是鼠李科(Rhamnaceae)棗屬( Ziziphus)的多年生落葉喬木；老枝褐色，幼枝綠色，於分枝基部處具刺1對，1為針形刺，另1為反曲刺；單葉互生，葉片長圓狀卵形至卵狀披針形；花瓣為黃綠色，與萼片互生；核果近球形，熟時暗紅色；種子呈扁圓形或扁橢圓形，平滑而有光澤，平坦面有隆起縱線紋。產區主要分布於中國大陸。

酸棗的主要利用部位為種子(俗稱酸棗仁)，在民俗醫學上，酸棗仁具有養肝、寧心、安神以及斂汗之功效。此外，酸棗仁已被證實還具有神經保護(neuroprotection)以及免疫調節(immunomodulation)等效用。由於酸棗仁具有優異的治療效用且價格較為昂貴，因此在市售的酸棗仁產品或中藥材中，常會出現以價格較為便宜的滇刺棗仁來混充酸棗仁的問題。為了鑑定食品或中藥材中確實含有所欲的棗屬物種，傳統上，大多是使用中草藥基原鑑定(identification of Chinese herbal medicine)、薄層層析法(thin layer chromatography, TLC)、超效能液相層析(ultra performance liquid chromatography, UPLC)、傅立葉變換紅外光光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)以及高效能毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis, HPCE)等方法來偵測棗屬植物所具有的指標成份[例如，酸棗仁皂甙A (jujuboside A)、酸棗仁皂甙B (jujuboside B)、斯皮諾素(spinosin)、樺木醇(botulin)以及酸棗仁鹼(sanjoinine)等]，並藉由所測得的成份和/或含量來作為判斷所屬物種之依據。然而，棗屬植物會因為栽種環境或條件的不同而影響其指標成份的含量，且酸棗與其他棗屬植物所具有的指標成份在含量上沒有明顯的差異性，因此利用傳統的檢測方式來鑑定或檢測棗屬植物時，所得到的分析結果的可信度與精確性並不高。

近年來，本技術領域的研究人員已將各種分子生物學方法應用於檢測棗屬植物上，這些生物學方法包括：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)、巢式聚合酶鏈反應(nested PCR)、脈衝電場凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis, PFGE)、多重聚合酶鏈反應(multiplex polymerase chain reaction)(以下簡稱“多重PCR”)、隨機擴增的多型性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、限制片段長度多型性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、免疫分析法(Immunoassay method)、DNA探針分析法(DNA probe method)以及生物晶片(biochip)等。

內部轉錄間隔(internal transcribed spacers, ITS)是一段位於真核的rRNA基因的序列，其包括介於18S rRNA與5.8S rRNA之間的內部轉錄間隔1 (internal transcribed spacer 1, ITS1)以及介於5.8S rRNA與26S rRNA之間的內部轉錄間隔2 (internal transcribed spacer 2, ITS2)。對於開花植物物種(flowering plant species)而言，在其核rRNA基因(nuclear rRNA gene)之ITS1的中心區域(central region)中存在有一高度守恆(highly conserved)的序列，即GGCRY-(4至7 n)-GYGYCAAGGAA (其中n為A、T、C或G；Y為C或T；以及R為G或A)。此高度守恆模體(highly conserved motif)的鑑定可有助於譜系分析(phylogenetic analysis)的序列比對。已有研究顯示，ITS可被用來分析酸棗與滇刺棗的屬內親緣關係(intrageneric phylogenetic relationships)。例如，在Islam M.B. and Simmons M.P. (2006), Syst. Bot., 31(4):826-842中，Islam M.B.等人將酸棗以及滇刺棗的核的ITS核苷酸序列拿來進行序列比對分析，接著，依據簡約摺刀法分析[parsimony jackknife (JK) analyses]以及最大概似分析(maximum likelihood analyses)所得到的簡約JK數值(parsimony JK values)以及概似JK數值(likelihood JK values)而繪製出一簡約JK樹狀圖(parsimony JK tree)，而從該簡約JK樹狀圖可見，酸棗與滇刺棗之間的親緣關係並不相近。

已有研究將ITS應用在酸棗以及滇刺棗的檢測上，例如，在李蕙君等人(2012)，“利用Nested PCR-DNA定序方法鑑定酸棗仁藥材及其製劑”，食品藥物研究年報，3：336-341中，李蕙君等人以酸棗以及滇刺棗的ITS序列作為標的基因而分別設計出1組針對酸棗的物種-特異性引子對ZjsF1/ZjsR1以及1組針對滇刺棗的物種-特異性引子對ZmF1/ZmR1，接著以市售酸棗仁藥材以及含有酸棗仁的製劑作為檢體並使用這2組物種-特異性引子對來進行多重PCR，其中製劑檢體在進行多重PCR之前有先使用1組通用引子對(universal primer) ZjF1/28R來進行巢式聚合酶鏈反應。而實驗結果顯示：當使用這2組物種-特異性引子對來進行多重PCR時，無論是藥材檢體或製劑檢體皆可以有效地檢測出酸棗以及滇刺棗，這表示引子對ZjsF1/ZjsR1以及引子對ZmF1/ZmR1分別對於酸棗以及滇刺棗具有檢測專一性。

雖然已存在有上述文獻報導，本技藝中仍然存在有一需要去篩選出對於棗屬植物具有高度專一性與靈敏度的核酸分子以供快速檢測或鑑定之用。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於檢測一棗屬植物的核酸分子試劑，其包含有一用於檢測棗屬物種的核酸分子，該核酸分子具有一選自於如序列辨識編號：1、序列辨識編號：2以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列。

依據本發明，該核酸分子試劑可進一步包含有一用於檢測酸棗的核酸分子，該核酸分子具有一選自於如序列辨識編號：3、序列辨識編號：4以及序列辨識編號：14所示的核苷酸序列。

上述的核酸分子對於所欲偵測的標的棗屬植物皆具有高度的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)，因而可供用來檢測存在於一樣品中的棗屬植物。因此，在第二個方面，本發明提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一棗屬植物的方法，其包括： 令該樣品進行一種使用一核酸分子試劑的DNA擴增反應，其中該核酸分子試劑包含有一用於檢測棗屬物種的引子對，該引子對包含一具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：2所示的核苷酸序列之反向引子；以及 檢測是否有一藉由使用該引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該引子對的棗屬物種之存在。

依據本發明，該核酸分子試劑進一步包含有一用於檢測酸棗的引子對，該引子對包含一具有一如序列辨識編號：3所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之反向引子。

依據本發明的核酸分子亦被預期可作為探針。因此，在第三個方面，本發明提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一棗屬植物的方法，其包括： 令該樣品進行一種使用一核酸分子試劑的雜交反應，其中該核酸分子試劑包含有一用於檢測棗屬物種的探針，該探針具有一選自於如序列辨識編號：1、序列辨識編號：2以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列；以及 檢測是否有一藉由使用該探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該探針的棗屬物種之存在。

依據本發明，該核酸分子試劑進一步包含有一用於檢測酸棗的探針，該探針具有一選自於如序列辨識編號：3、序列辨識編號：4以及序列辨識編號：14所示的核苷酸序列。

在第四個方面，本發明提供一種用於檢測一棗屬植物的檢驗套組，其包含有一如上所述的核酸分子試劑。

在第五個方面，本發明提供一種用於檢測一棗屬植物的生物晶片，其包含有一如上所述的核酸分子試劑。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物(artificial chemical mimics)。如本文中所用的，“核酸”此術語可與“基因”、“DNA”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。

如本文中所用的，術語“核酸片段”與“DNA片段”可被互換地使用，並且意指一種DNA聚合物(DNA polymer)，該DNA聚合物是呈一獨立節段(separate segment)的形式或者是作為一較大的DNA建構物(DNA construct)的一組分(component)，其可以是衍生自經分離的DNA (isolated DNA)或是藉由本技術領域中所熟知的方法而被化學地或酵素地合成。

除非另有指明，一核酸序列除了於本文中所揭示的特定序列外，亦涵蓋其互補序列(complementary sequences)，以及它們的守恆性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體和/或合成的非天然存在的類似物。

如本文中所用的，“雜交(hybridization)”與“黏合(annealing)”等術語可被相互交換使用，並且意指2個單股核苷酸序列藉由依據華特生-克里克規則(Watson-Crick rules)而經由它們的嘌呤(purine)和/或嘧啶(pyrimidine)鹼基之氫鍵結(hydrogen bonding)來彼此序列專一性地結合，藉此而形成一雜交物(hybrid)。該雜交物是一個具有穩定的核酸結構的雙螺旋核酸複合物(duplex nucleic acid complex)，其包括RNA:RNA、RNA:DNA或DNA:DNA雙螺旋分子。

傳統上通常是使用偵測棗屬植物所具有的指標成份和/或含量的方法來鑑別或檢測棗屬植物，但是指標成份的含量會受到栽種環境或條件的影響，並且酸棗與其他棗屬植物所具有的指標成份在含量上沒有明顯的差異性，因此此種檢測方式具有分析結果不精確的缺點。於是，如何能快速且精確地檢測出存在於食品或中藥材中的棗屬植物，已成為食品業與中藥材產業努力的目標。分子生物學方法[諸如，聚合酶鏈反應(PCR)以及生物晶片技術等]具有速度快、分析結果的可信度與精確性高等之優點，因此，申請人致力於研發這方面的快速檢測方法。

對開花植物物種而言，在其核rRNA基因之ITS1的中心區域中存在有一高度守恆的序列，其可供用於譜系分析以及物種的檢測。因此，申請人嘗試從酸棗以及滇刺棗的ITS序列中分別設計出對於這些棗屬植物具有高度專一性與靈敏度的核酸分子以供快速檢測或鑑定之用。

於本發明中，申請人依據GenBank登錄編號FJ593183.1 [酸棗( Ziziphus jujuba)的18S核糖體RNA基因的部分序列(partial sequence)，內部轉錄間隔1 (internal transcribed spacer 1, ITS1)、5.8S核糖體RNA基因以及內部轉錄間隔2 (internal transcribed spacer 2, ITS2)的完整序列(complete sequence)，以及26S核糖體RNA基因的部分序列]以及GenBank登錄編號KY379958.1 [滇刺棗( Ziziphus mauritiana)的小單元核糖體RNA基因的部分序列，內部轉錄間隔1 (ITS1)、5.8S核糖體RNA基因以及內部轉錄間隔2 (ITS2)的完整序列，以及大單元核糖體RNA基因的部分序列]當中所示的核苷酸序列，而設計出一組針對棗屬的屬-特異性引子對ZizF/ZizR (它所具有的核苷酸序列分別被彙整於表3中)以及一種針對棗屬的屬-特異性探針(下稱探針1)(它所具有的核苷酸序列被彙整於表7中)。另外，依據GenBank登錄編號FJ593183.1 [酸棗( Ziziphus jujuba)的18S核糖體RNA基因的部分序列(partial sequence)，內部轉錄間隔1 (internal transcribed spacer 1, ITS1)、5.8S核糖體RNA基因以及內部轉錄間隔2 (internal transcribed spacer 2, ITS2)的完整序列(complete sequence)，以及26S核糖體RNA基因的部分序列]當中所示的核苷酸序列，而設計出一組針對酸棗的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR (它所具有的核苷酸序列分別被彙整於表4中)以及一種針對酸棗的物種-特異性探針(下稱探針2)(它所具有的核苷酸序列被彙整於表8中)。

為了評估依據本發明的引子對和/或探針對於棗屬植物的檢測專一性以及靈敏度，申請人以得自於不同來源(包括食品以及中藥材)的棗屬植物與非棗屬植物的基因組DNA作為模版，並分別使用本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR以及物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR來進行PCR反應，或者是使用一由引子對ZizF/ZizR以及ZjMF/ZjMR所構成的引子組合來進行多重PCR (multiplex PCR)。經由PCR或多重PCR所得到的PCR擴增產物在藉由瓊脂糖凝膠電泳分析後發現：依據本發明的引子對對於所欲檢測的標的棗屬植物皆具有優異的專一性(specificity)。

此外，申請人進一步以上述的棗屬植物與非棗屬植物的基因組DNA作為模版，並分別使用一由本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR與探針1所構成的核酸分子組合以及一由本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR與探針2所構成的核酸分子組合來進行即時聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction)。經由即時聚合酶鏈反應時所測得的循環閾值[cycle threshold ( C _t) value]顯示：依據本發明的核酸分子組合對於所欲檢測的標的棗屬植物皆具有優異的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)。

基於以上所述，依據本發明的引子對以及探針被預期可供用於快速地檢測存在於一樣品中的棗屬植物。於是，本發明提供一種用於檢測一棗屬植物的核酸分子試劑，其包含有一用於檢測棗屬物種的核酸分子，該核酸分子具有一選自於如序列辨識編號：1、序列辨識編號：2以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列。

依據本發明，該核酸分子試劑可進一步包含有一用於檢測酸棗的核酸分子，該核酸分子具有一選自於如序列辨識編號：3、序列辨識編號：4以及序列辨識編號：14所示的核苷酸序列。

依據本發明的核酸分子可進一步使用一具有本技藝中的通常技術者所熟知的標準技術而被附接或結合至一個可偵測的標記(detectable label)以容許檢測或定量該等棗屬植物。適用於本發明之可偵測的標記包括，但不限於：半抗原標記(hapten labels)[例如，生物素(biotin)以及地高辛(digoxigenin, Dig)]、化學螢光標記(chemiluminescent labels)、螢光標記(fluorescent labels)[例如，螢光素(fluorescein)、玫瑰紅(rhodamine)、NH ₂-花青基苷5 (NH ₂-cyanin 5, Cy5)以及NH ₂-花青基苷3 (NH ₂-cyanin 3, Cy3)]、酵素標記、放射性標記(例如， ³²P)、顆粒標記(particle labels)[例如，金膠體(gold colloids)]以及比色標記(colorimetric labels)[例如，染劑以及有色的玻璃或塑膠珠粒(colored glass or plastic beads)]。

依據本發明，當該等核酸分子被使用作為探針時，在它們的5’端和/或3’端上可加入或刪除至少一個核苷酸殘基，而使其所具有的長度是落在大約21至23個核苷酸殘基之範圍內。此外，在該等核酸分子的5’端和/或3’端上可加入至少一個胸苷(thymidine)以使得它們在被點佈(spotted)於生物晶片的表面上時可具有較佳的固定性(immobilization)，並且增強它們在進行雜交反應時所獲得的偵測訊號。而這些都是熟習此項技術者所詳知且慣用的技術。較佳地，在該等核酸分子的5’端和/或3’端上所加入之胸苷的數目是落在大約1至3個的範圍內。

本發明亦提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一棗屬植物的方法，其包括： 令該樣品進行一種使用一核酸分子試劑的DNA擴增反應，其中該核酸分子試劑包含有一用於檢測棗屬物種的引子對，該引子對包含一具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：2所示的核苷酸序列之反向引子；以及 檢測是否有一藉由使用該引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該引子對的棗屬物種之存在。

依據本發明，該核酸分子試劑可進一步包含有一用於檢測酸棗的引子對，該引子對包含一具有一如序列辨識編號：3所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之反向引子。

依據本發明，在進行該DNA擴增反應之前，從該樣品中萃取出總基因組DNA以作為模版。

依據本發明，該DNA擴增反應是藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)、即時聚合酶鏈反應(real-time PCR)、巢式聚合酶鏈反應(nested PCR)、熱啟動聚合酶鏈反應(hot-start PCR)、原位聚合酶鏈反應(in-situ PCR)、微聚合酶鏈反應(micro PCR)、多重聚合酶鏈反應(multiplex PCR)、轉錄-調節的擴增反應(transcription-mediated amplification, TMA)、環媒介等溫擴增反應(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)以及滾環擴增反應(rolling circle amplification, RCA)。有關這些方法學的操作條件的設定是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該DNA擴增反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。

依據本發明，該DNA片段的檢測可以藉由一種使用一探針的雜交反應而被進行，其中： (a) 當使用該用於檢測棗屬物種的引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號:1、序列辨識編號:2以及序列辨識編號:13所示的核苷酸序列；以及 (b) 當使用該用於檢測酸棗的引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號:1、序列辨識編號:2、序列辨識編號:3、序列辨識編號:4、序列辨識編號:13以及序列辨識編號:14所示的核苷酸序列。

在本發明的一個較佳具體例中，當使用該用於檢測棗屬物種的引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一如序列辨識編號:13所示的核苷酸序列；以及當使用該用於檢測酸棗的引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一如序列辨識編號: 14所示的核苷酸序列。

依據本發明，該雜交反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。

依據本發明，該樣品可以選自於下列所構成的群組：食品樣品以及生物樣品(biological sample)。

依據本發明，該食品樣品可以是，但不限於：飲料(beverages)；乳製品(dairy products)，例如優酪乳(yogurt)、冰淇淋(ice cream)以及乳酪(cream cheeses)；烤焙物(baked goods)，例如麵包(bread)以及酥餅(cookies)；麵包塗醬(spreads for bread)；水果產品(fruit products)，例如蜜餞(preserves)、果醬(jams)以及果凍(jellies)；蔬菜食品(vegetable products)，例如蔬菜汁(vegetable juices)以及蔬菜漿(vegetable pulp)；穀類食品(cereals)，例如燕麥片(granola)以及穀類混合料(cereal mixtures)；動物飼料(animal feeds)；罐頭食品(canned foods)；發酵食品(fermented foods)；健康食品(health foods)；膳食補充品(dietary supplements)；以及草藥(herbal)。

如此處所用的，術語“生物樣品”意指一得自於一生物體(organism)(諸如，人類、動物或植物)或該生物體的組分(components)(諸如，細胞以及組織)的樣品。

較佳地，得自於人類或動物的生物樣品包括，但不限於：血液(blood)、血漿(plasma)、血清(serum)、尿液(urine)、唾液(saliva)以及糞便(feces)。

較佳地，得自於植物的生物樣品包括，但不限於：葉(leaf)、種子(seed)、根(root)、莖(stem)、樹幹(trunk)、枝條(branch)、樹皮(bark)、花(flower)以及果實(fruit)的組織。

依據本發明的核酸分子可被使用作為探針並直接被拿來與上述樣品進行雜交反應。因此，本發明進一步提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一棗屬植物的方法，其包括： 令該樣品進行一種使用一核酸分子試劑的雜交反應，其中該核酸分子試劑包含有一用於檢測棗屬物種的探針，該探針具有一選自於如序列辨識編號：1、序列辨識編號：2以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列；以及 檢測是否有一藉由使用該探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該探針的棗屬物種之存在。

依據本發明，該核酸分子試劑進一步包含有一用於檢測酸棗的探針，該探針具有一選自於如序列辨識編號：3、序列辨識編號：4以及序列辨識編號：14所示的核苷酸序列。

可瞭解到的是，該雜交反應的操作條件會進一步隨著所使用的儀器設備、該樣品的種類與預處理的方式以及所使用的反應內容物的用量比例等因素而被變動，以便達致最佳的檢測效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。

依據本發明，該雜交反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。

依據本發明的核酸分子可被應用於製備一種用於檢測一棗屬植物的檢驗套組。而除了該等核酸分子之外，該檢驗套組可進一步包含一用於監控DNA擴增產物的核酸染劑。較佳地，該核酸染劑是選自於下列所構成的群組：溴化乙錠(ethidium bromide, EtBr)、SYBR GREEN I、SYBR GREEN II、SYBR Orange、SYBR Gold、碘化丙錠(Phopidium Iodide, PI)、SYTOX Blue、SYPRO Ruby以及考馬斯藍(Coomassie Blue)。

依據本發明的核酸分子亦被預期可供應用於生物晶片，俾以快速地檢測存在於一樣品中的棗屬植物。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1. 在下面實施例中所使用的酸棗( Ziziphus jujubaMill.)以及滇刺棗( Ziziphus mauritianaLam.)的來源與形態被顯示於下面表1中。 表1. 酸棗以及滇刺棗的來源與形態 種類與編號 來源 形態 酸棗1 天一藥廠 顆粒 酸棗2 科達製藥股份有限公司 顆粒 酸棗3 宏興製藥廠 粉末 酸棗4 誠元藥行 顆粒 酸棗5 康普森貿易有限公司 粉末 酸棗6 科達製藥股份有限公司 粉末 酸棗7 港香蘭藥廠股份有限公司 粉末 酸棗8 宏興製藥廠 顆粒 滇刺棗1 天一藥廠 顆粒 滇刺棗2 宏興製藥廠 顆粒 2. 在下面實施例中所使用的非棗屬植物的來源與形態被顯示於下面表2中。 表2. 非棗屬植物的來源與形態 種類 來源 形態 黃豆 日正食品工業股份有限公司 顆粒 玉米 台灣通用磨坊股份有限公司 顆粒 花生 成偉食品股份有限公司 顆粒 大麥 統一企業股份有限公司 顆粒 小麥 統一企業股份有限公司 顆粒 黑芝麻 百鄴企業有限公司 粉末 3. 在下面實施例中所使用的引子對以及探針皆是由波仕特生物科技股份有限公司所合成。 一般實驗方法： 1. 基因組DNA的萃取(extraction of genomic DNA)：

在上面“一般實驗材料”的第1項與第2項當中所述的酸棗、滇刺棗以及非棗屬植物被拿來進行基因組DNA的萃取，其中呈顆粒狀的酸棗、滇刺棗以及非棗屬植物在進行實驗之前被研磨成粉末備用。有關基因組DNA的萃取是使用DNeasy ^®mericon ^®食品套組(DNeasy ^®mericon ^®Food Kit)(Qiagen)並且依據製造商的操作指南而被進行。首先，對酸棗、滇刺棗以及非棗屬植物的粉末樣品各取200 mg並分別置於一微量離心管(microcentrifuge tubes)中，繼而加入2.5 μL的蛋白酶K (proteinase K)以及1 mL的食品溶解緩衝液(food lysis buffer)並予以震盪混合，繼而置於60℃水浴下反應歷時30分鐘，然後置於冰上進行冷卻。接著，以2,500 xg來進行離心歷時5分鐘，之後，將所形成的上澄液收集至一添加有500 mL的氯仿(chloroform)的微量離心管中並予以震盪混合，繼而以14,000 xg來進行離心歷時15分鐘，然後收集上澄液。接著，將1 mL的緩衝液PB (buffer PB)加入至一新的微量離心管中，繼而將250 μL的上澄液加入至該微量離心管中並予以震盪混合。接著，將一離心管柱(spin column)放入至一個收集管(collection tube)中，並將所得到的混合物移至該管柱中，繼而以17,900 xg來進行離心歷時1分鐘。在移除洗出物(eluate)之後，將該管柱放回該收集管內並將500 mL的緩衝液AW2 (buffer AW2)加入至該管柱中，繼而以17,900 xg來進行離心歷時1分鐘。最後，將該管柱放入至一個新的微量離心管中，繼而將100 mL的緩衝液EB (buffer EB)加入至該管柱的中心處並靜置歷時1分鐘，然後以17,900 xg來進行離心歷時1分鐘以洗提出酸棗、滇刺棗或非棗屬植物的基因組DNA。由此而得到的基因組DNA被儲存於-80℃下備用。 實施例 1. 用於偵測棗屬物種 ( Ziziphus spp. ) 的引子對 (primer pairs) 的設計 實驗方法： A. 針對 棗屬的 屬 - 特異性引子對 (genus-specific primer pair) 的設計 ：

依據GenBank登錄編號FJ593183.1 [酸棗( Ziziphus jujuba)的18S核糖體RNA基因的部分序列(partial sequence)，內部轉錄間隔1 (internal transcribed spacer 1, ITS1)、5.8S核糖體RNA基因以及內部轉錄間隔2 (internal transcribed spacer 2, ITS2)的完整序列(complete sequence)，以及26S核糖體RNA基因的部分序列]以及GenBank登錄編號KY379958.1 [滇刺棗( Ziziphus mauritiana)的小單元核糖體RNA基因的部分序列，內部轉錄間隔1 (ITS1)、5.8S核糖體RNA基因以及內部轉錄間隔2 (ITS2)的完整序列，以及大單元核糖體RNA基因的部分序列]當中所示的核苷酸序列，申請人從酸棗以及滇刺棗的ITS1基因當中挑選出具有高度守恆性(high conservativeness)的區域，並據此來設計出1組針對酸棗以及滇刺棗的引子對ZizF/ZizR。該引子對ZizF/ZizR利用NCBI網站所提供的Gene Blast軟體來分別與NCBI網站的基因資料庫中的所有基因序列進行比對分析，而分析結果顯示該引子對ZizF/ZizR對於棗屬物種的植物具有屬-特異性。

為表清楚，依據本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR的相關資訊(包括：核苷酸序列、所擴增出的PCR產物大小以及對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表3中。 滇刺棗 酸棗 標的物種 表3. 被設計用於偵測棗屬物種的屬-特異性引子對 ITS1 (GenBank登錄編號KY379958.1) ITS1 (GenBank登錄編號FJ593183.1) 標的基因 357-342 262-278 264-249 169-185 對應於標的基因內的核苷酸殘基位置 ZizR ZizF ZizR ZizF 引子 caccccgaccgcacac (序列辨識編號:2) cggccgcacaaacgaac (序列辨識編號:1) caccccgaccgcacac (序列辨識編號:2) cggccgcacaaacgaac (序列辨識編號:1) 核苷酸序列(5’→3’) 96 96 PCR產物大小(bp) 本發明 本發明 出處 B. 針 對 酸 棗的 物種 - 特異性引子對 (species-specific primer pair) 的設計：

申請人依據GenBank登錄編號FJ593183.1 [酸棗( Ziziphus jujuba)的18S核糖體RNA基因的部分序列(partial sequence)，內部轉錄間隔1 (internal transcribed spacer 1, ITS1)、5.8S核糖體RNA基因以及內部轉錄間隔2 (internal transcribed spacer 2, ITS2)的完整序列(complete sequence)，以及26S核糖體RNA基因的部分序列]當中所示的核苷酸序列而設計出1組針對酸棗的引子對ZjMF/ZjMR。該引子對ZjMF/ZjMR利用NCBI網站所提供的Gene Blast軟體來分別與NCBI網站的基因資料庫中的所有基因序列進行比對分析，而分析結果顯示該引子對ZjMF/ZjMR對於酸棗具有物種-特異性。

另外，習知所揭示的1組針對酸棗的物種-特異性引子對ZjsF1/ZjsR1以及1組針對滇刺棗的物種-特異性引子對ZmF1/ZmR1亦被用於後續的實驗中。為表清楚，習知所揭示的2組物種-特異性引子對ZjsF1/ZjsR1與ZmF1/ZmR1以及依據本發明的1組物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR的相關資訊(包括：核苷酸序列、所擴增出的PCR產物大小以及對應於標的區域的所在位置等)已被整合於下面表4中。 滇刺棗 酸棗 酸棗 標的物種 表4. 被設計用於偵測棗屬物種的物種-特異性引子對 ITS (GenBank登錄編號KY379958.1) ITS (GenBank登錄編號FJ593183.1) ITS (GenBank登錄編號FJ593183.1) 標的區域 584-567 216-233 667-650 99-116 665-649 124-140 對應於標的區域內的核苷酸殘基位置 ZmR1 ZmF1 ZjsR1 ZjsF1 ZjMR ZjMF 引子 ctcttcccttccgaggcg (序列辨識編號:8) ggttgcatcccacgcatc (序列辨識編號:7) gagacgccgcattggcag (序列辨識編號:6) tcccggagccttccttgg (序列辨識編號:5) gacgccgcattggcagc (序列辨識編號:4) tctgcacctcgcgcctc (序列辨識編號:3) 核苷酸序列(5’→3’) 369 569 542 PCR產物大小(bp) 李蕙君等人(2012)，食品藥物研究年報，3:336-341 李蕙君等人(2012)，食品藥物研究年報，3:336-341 本發明 出處 實施例 2. 本發明的引子對對於棗屬物種的檢測能力的評估

為了評估依據本發明所設計出的1組屬-特異性引子對與1組物種-特異性引子對以及習知所揭示的2組物種-特異性引子對對於市售的酸棗與滇刺棗的檢測專一性(specificity)，下面的實驗被進行。 實驗方法 ： A. 本發明的引子對在聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction, PCR) 上的檢測效用：

依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述方法而得到的8種酸棗、2種滇刺棗以及6種非棗屬植物的基因組DNA被用來作為模版(template)，並分別使用屬-特異性引子對ZizF/ZizR以及物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR來進行PCR，而PCR的反應條件是如下面表5中所示者。至於負對照組(negative control)是含有所有PCR組份但不含有DNA模版者。 表5. PCR的反應條件 內容物 體積(µL) 基因組DNA (100 ng/µL) 0.4 前向引子(25 µM) 0.2 反向引子(25 µM) 0.2 Fast-Run™ 2X Taq Master混合套組 (Fast-Run™ 2X Taq Master Mix Kit)(Cat. No. PT-TMM228，Protech) 10 無菌水 9.2 操作條件：在94℃下進行變性反應(denaturation)歷時2分鐘；接而進行30個循環如下：在94℃下進行變性反應歷時30秒、在58℃下進行引子黏合(primer annealing)歷時30秒、在72℃下進行延伸反應(extension)歷時30秒；最後，在72℃下進行延長反應(elongation)歷時5分鐘。

於完成PCR之後，所得到的32個PCR擴增產物分別被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，俾以確認是否可得到一如表3與表4中所示之既定大小的PCR產物。 B. 本發明的引子對在多重聚合酶鏈反應 (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR) 上的檢測效用：

依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述方法而得到的8種酸棗及2種滇刺棗的基因組DNA被用來作為模版，並使用一由引子對ZizF/ZizR以及ZjMF/ZjMR所構成的引子組合來進行多重PCR，而多重PCR的反應條件是如下面表6中所示者。至於負對照組是含有所有PCR組份但不含有DNA模版者。

另外，為供比較，一由習知引子對ZjsF1/ZjsR1以及ZmF1/ZmR1所構成的引子組合亦參照上面所述步驟及表6中所示反應條件來進行多重PCR。 表6. 多重PCR的反應條件 內容物 體積(µL) 基因組DNA (100 ng/µL) 0.4 前向引子 ZizF引子(25 µM) 0.1 ZjMF引子(25 µM) 0.1 反向引子 ZizR引子(25 µM) 0.1 ZjMR引子(25 µM) 0.1 Fast-Run™ 2X Taq Master混合套組 (Fast-Run™ 2X Taq Master Mix Kit)(Cat. No. PT-TMM228，Protech) 10 無菌水 9.2 操作條件：在94℃下進行變性反應歷時2分鐘；接而進行30個循環如下：在94℃下進行變性反應歷時30秒、在58℃下進行引子黏合歷時30秒、在72℃下進行延伸反應歷時30秒；最後，在72℃下進行延長反應歷時5分鐘。

於完成多重PCR之後，所得到20個PCR擴增產物分別被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，俾以確認是否可得到一如表3與表4中所示之既定大小的PCR產物。 結果 ： A. 本發明 的引子對在聚合酶鏈反應上的檢測效用：

圖1是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1至8以及滇刺棗1至2的基因組DNA作為模版並分別使用本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記(DNA ladder marker)，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1至徑8分別表示酸棗1至8的基因組DNA，而徑9與徑10分別表示滇刺棗1與2的基因組DNA。從圖1可見，當使用本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR來進行PCR時，無論是酸棗1至8或滇刺棗1至2，皆有得到一大小約為96 bp的PCR擴增產物(它具有一如序列辨識編號:9所示的核苷酸序列)。

圖2是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1、滇刺棗1以及6種非棗屬植物的基因組DNA作為模版並分別使用本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1表示酸棗1的基因組DNA，徑2表示滇刺棗1的基因組DNA，而徑3至徑8分別表示黃豆、玉米、花生、大麥、小麥以及黑芝麻的基因組DNA。從圖2可見，當使用本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR來進行PCR時，酸棗1與滇刺棗1皆有得到一大小約為96 bp的PCR擴增產物，至於其他6種非棗屬植物則無得到PCR擴增產物。

圖3是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1至8以及滇刺棗1至2的基因組DNA作為模版並分別使用本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1至徑8分別表示酸棗1至8的基因組DNA，而徑9與徑10分別表示滇刺棗1與2的基因組DNA。從圖3可見，當使用本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR來進行PCR時，酸棗1至8皆有得到一大小約為542 bp的PCR擴增產物(它具有一如序列辨識編號:10所示的核苷酸序列)，至於滇刺棗1至2則無得到PCR擴增產物。

圖4是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1、滇刺棗1以及6種非棗屬植物的基因組DNA作為模版並分別使用本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1表示酸棗1的基因組DNA，徑2表示滇刺棗1的基因組DNA，而徑3至徑8分別表示黃豆、玉米、花生、大麥、小麥以及黑芝麻的基因組DNA。從圖4可見，當使用本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR來進行PCR時，只有酸棗1有得到一大小約為542 bp的PCR擴增產物，至於滇刺棗1與其他6種非棗屬植物則皆無得到PCR擴增產物。

上面的實驗結果證實：依據本發明之針對棗屬的屬-特異性引子對ZizF/ZizR以及針對酸棗的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR對於所欲檢測的標的棗屬植物(plant of Ziziphusgenus)皆具有專一性。 B. 本發明的引子對在多重聚合酶鏈反應上的檢測效用：

圖5是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1至8以及滇刺棗1至2的基因組DNA作為模版並分別使用一由本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR以及物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR所構成的引子組合來進行多重PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1至徑8分別表示酸棗1至8的基因組DNA，而徑9與徑10分別表示滇刺棗1與2的基因組DNA。從圖5可見，當使用本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR以及物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR來進行多重PCR時，酸棗1至8皆有得到2個PCR擴增產物(分別為一大小約為96 bp的PCR擴增產物以及一大小約為542 bp的PCR擴增產物)，至於滇刺棗1至2則只有得到一大小約為96 bp的PCR擴增產物。

圖6是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1至8以及滇刺棗1至2的基因組DNA作為模版並分別使用一由習知所揭示的2組物種-特異性引子對ZjsF1/ZjsR1以及ZmF1/ZmR1所構成的引子組合來進行多重PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1至徑8分別表示酸棗1至8的基因組DNA，而徑9與徑10分別表示滇刺棗1與2的基因組DNA。從圖6可見，當使用習知所揭示的物種-特異性引子對ZjsF1/ZjsR1與ZmF1/ZmR1來進行多重PCR時，滇刺棗1至2皆有得到一大小約為369 bp的PCR擴增產物(它具有一如序列辨識編號:11所示的核苷酸序列)，酸棗1、2、4以及6至8皆有得到一大小約為569 bp的PCR擴增產物(它具有一如序列辨識編號:12所示的核苷酸序列)，而酸棗3有得到2個PCR擴增產物(分別為一大小約為569 bp的PCR擴增產物以及一大小約為369 bp的PCR擴增產物)，至於酸棗5則無得到PCR擴增產物。這表示習知所揭示的2組物種-特異性引子對ZjsF1/ZjsR1以及ZmF1/ZmR1對於所欲檢測的標的棗屬植物不具有專一性。

上面的實驗結果證實：一由本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR以及物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR所構成的引子組合可供用於多重PCR，並且對於所欲檢測的標的棗屬植物能展現出優異的專一性。 實施例 3. 用於偵測棗屬物種的探針 (probe) 的設計 實驗方法： A. 針對 棗屬的 屬 - 特異性 探針 (genus-specific probe ) 的設計

依據GenBank登錄編號FJ593183.1 [酸棗( Ziziphus jujuba)的18S核糖體RNA基因的部分序列(partial sequence)，內部轉錄間隔1 (internal transcribed spacer 1, ITS1)、5.8S核糖體RNA基因以及內部轉錄間隔2 (internal transcribed spacer 2, ITS2)的完整序列(complete sequence)，以及26S核糖體RNA基因的部分序列]以及GenBank登錄編號KY379958.1 [滇刺棗( Ziziphus mauritiana)的小單元核糖體RNA基因的部分序列，內部轉錄間隔1 (ITS1)、5.8S核糖體RNA基因以及內部轉錄間隔2 (ITS2)的完整序列，以及大單元核糖體RNA基因的部分序列]當中所示的核苷酸序列，申請人從酸棗以及滇刺棗的ITS1基因當中挑選出具有高度守恆性的區域，並據此來設計出1種針對酸棗以及滇刺棗的探針(下稱探針1)。該探針1利用NCBI網站所提供的Gene Blast軟體來分別與NCBI網站的基因資料庫中的所有基因序列進行比對分析，而分析結果顯示該探針1對於棗屬物種的植物具有屬-特異性。

為表清楚，依據本發明的屬-特異性探針1的相關資訊(包括：核苷酸序列以及對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表7中。 1 探針編號 滇刺棗 酸棗 標的物種 表7. 被設計用於偵測棗屬物種的屬-特異性探針 ITS1 (GenBank登錄編號KY379958.1) ITS1 (GenBank登錄編號FJ593183.1) 標的基因 296-318 203-225 對應於標的基因內的核苷酸殘基位置 caaggaacacctaacgaattggc (序列辨識編號:13) caaggaacacctaacgaattggc (序列辨識編號:13) 核苷酸序列(5’→3’) 本發明 本發明 出處 B. 針對酸棗的 物種 - 特異性 探針 (species-specific probe ) 的設計

申請人依據GenBank登錄編號FJ593183.1 [酸棗( Ziziphus jujuba)的18S核糖體RNA基因的部分序列(partial sequence)，內部轉錄間隔1 (internal transcribed spacer 1, ITS1)、5.8S核糖體RNA基因以及內部轉錄間隔2 (internal transcribed spacer 2, ITS2)的完整序列(complete sequence)，以及26S核糖體RNA基因的部分序列]當中所示的核苷酸序列而設計出1種針對酸棗的探針(下稱探針2)。該探針2利用NCBI網站所提供的Gene Blast軟體來分別與NCBI網站的基因資料庫中的所有基因序列進行比對分析，而分析結果顯示該探針2對於酸棗具有物種-特異性。

為表清楚，依據本發明的物種-特異性探針2的相關資訊(包括：核苷酸序列以及對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表8中。 2 探針編號 酸棗 標的物種 表8. 被設計用於偵測棗屬物種的物種-特異性探針 ITS2 (GenBank登錄編號FJ593183.1) 標的基因 468-487 對應於標的基因內的核苷酸殘基位置 atcccaacctcgacctcgag (序列辨識編號:14) 核苷酸序列(5’→3’) 本發明 出處 實施例 4. 藉由 即時聚合酶鏈反應 (Real-time polymerase chain reaction) 來偵測 棗屬植物

為了評估一由本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR與探針1所構成的核酸分子組合以及一由本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR與探針2所構成的核酸分子組合在即時聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction)(以下簡稱“即時PCR”)上的檢測效用，下面的實驗被進行。 實驗方法 ： A. 即時 PCR 的專一性試驗：

首先，為了讓依據本發明的探針1與探針2在進行即時PCR時能夠釋放螢光訊號，該2種探針的5’端以及3’端分別被附接以一螢光報導基團(fluorescent reporter group)(亦即，FAM™染劑)以及一螢光淬火基團(fluorescent quencher group)[亦即，結合至非螢光淬火體的小溝結合子(minor groove binder binding nonfluorescent quencher, MGB-NFQ)]。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述方法而得到的8種酸棗、2種滇刺棗以及6種非棗屬植物的基因組DNA被用來作為模版，並分別使用一由屬-特異性引子對ZizF/ZizR與探針1所構成的核酸分子組合1以及一由物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR與探針2所構成的核酸分子組合2來進行即時PCR。至於負對照組是含有所有即時PCR組份但不含有DNA模版者。

即時PCR是使用一7500 Fast即時PCR系統(7500 Fast Real-time PCR system)(Applied Biosystems)並依據製造商的操作指引來執行，而有關即時PCR的操作條件與反應條件被顯示於下面的表9中。 表9. 即時PCR的反應條件 內容物 體積(µL) 基因組DNA (100 ng/µL) 5 前向引子(5 µM) 1.3 反向引子(5 µM) 1.3 探針(3.3 µM) 1.7 TaqMan® Universal PCR Master Mix預混合試劑 (Applied Biosystems) 12.5 無菌水 3.2 操作條件：在50℃下進行熱活化反應(heat activation)歷時2分鐘以及在95℃下進行變性反應歷時2分鐘；接而進行35個循環如下：在95℃下進行變性反應歷時15秒、在60℃下進行引子黏合以及延伸反應歷時60秒。

在即時PCR反應的期間，當探針雜交至引子對所擴增出的PCR產物時，DNA聚合□(DNA polymerase)會切割位於探針的5’端上的螢光報導基團，此時呈游離狀態的螢光報導基團即會放射出螢光訊號。每次PCR循環所偵測到的螢光訊號會被記錄下來，藉此可得到一擴增曲線(amplification curve)。之後，依據所得到的擴增曲線與一預設的閾值(threshold)來計算出各個PCR產物的循環閾值[cycle threshold ( C _t) value]。 B. 即時 PCR 的靈敏度試驗：

將依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述方法而得到的酸棗1的基因組DNA以無菌水來調整濃度，藉此而得到具有不同濃度[0.1、1、10、50以及100% (v/v)]的DNA樣品。接著，將各個DNA樣品分別拿來進行上面第A項當中所述的即時PCR，而有關即時PCR的操作條件與反應條件是如上面表9中所示。 結果 ： A. 即時 PCR 的專一性試驗：

下面表10顯示以酸棗1至8、滇刺棗1至2以及6種非棗屬植物的基因組DNA作為模版並分別使用本發明的核酸分子組合1以及核酸分子組合2來進行即時PCR時所測得的循環閾值( C _t)。從表10可見，當使用核酸分子組合1來進行即時PCR時，無論是酸棗1至8或滇刺棗1至2，皆可以得到一循環閾值( C _t)，至於其他6種非棗屬植物(包括黃豆、玉米、花生、大麥、小麥以及黑芝麻)則無得到循環閾值( C _t)，這表示一由本發明的引子對ZizF/ZizR與探針1所構成的組合對於棗屬植物具有檢測專一性。另外，當使用核酸分子組合2來進行即時PCR時，只有酸棗1至8有得到一循環閾值( C _t)，而滇刺棗1至2與其他6種非棗屬植物則無得到循環閾值( C _t)，這表示一由本發明的引子對ZjMF/ZjMR與探針2所構成的組合對於酸棗具有檢測專一性。

這個實驗結果證實：一由本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR與探針1所構成的組合以及一由本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR與探針2所構成的組合可供用於即時PCR，藉此可專一性地偵測出標的棗屬植物。 表10. 依據本發明的核酸分子組合1與2在即時PCR上的檢測專一性 樣品 循環閾值(Ct) 核酸分子組合1 核酸分子組合2 酸棗1 19.30 15.63 酸棗2 16.84 14.85 酸棗3 14.76 12.24 酸棗4 15.54 13.49 酸棗5 33.86 33.53 酸棗6 17.27 15.72 酸棗7 15.49 12.74 酸棗8 18.71 19.52 滇刺棗1 15.29 - 滇刺棗2 15.79 - 黃豆 - - 玉米 - - 花生 - - 大麥 - - 小麥 - - 黑芝麻 - - 負對照組 - - B. 即時 PCR 的靈敏度試驗：

下面表11顯示以不同濃度[0.1、1、10、50以及100% (v/v)]的酸棗1的DNA樣品作為模版並分別使用本發明的核酸分子組合1以及核酸分子組合2來進行即時PCR時所測得的循環閾值( C _t)。從表11可見，無論是使用核酸分子組合1或核酸分子組合2來進行即時PCR時，各個濃度的DNA樣品皆可以得到一循環閾值( C _t)，特別地，當以具有一濃度為0.1% (v/v)的DNA樣品作為模版並分別使用本發明的核酸分子組合1以及核酸分子組合2來進行即時PCR時，可分別得到一為26.92以及25.65的循環閾值( C _t)，這表示本發明的核酸分子組合1以及核酸分子組合2對於酸棗的檢測靈敏度皆可以達到0.1% (v/v)。

依據這個實驗結果，申請人認為一由本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR與探針1所構成的組合以及一由本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR與探針2所構成的組合可供用於即時PCR，並且對於所欲檢測的標的棗屬植物能展現出優異的靈敏度。 表11. 依據本發明的核酸分子組合1與2在即時PCR上的檢測靈敏度 樣品 DNA的濃度(%) 循環閾值(Ct) 核酸分子組合1 核酸分子組合2 酸棗1 0.1 26.92 25.65 1 24.48 23.58 10 20.53 19.14 50 17.83 16.60 100 15.50 15.51 負對照組 - - -

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中： 圖1是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1至8以及滇刺棗1至2的基因組DNA作為模版並分別使用本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記(DNA ladder marker)，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1至徑8分別表示酸棗1至8的基因組DNA，而徑9與徑10分別表示滇刺棗1與2的基因組DNA； 圖2是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1、滇刺棗1以及6種非棗屬植物的基因組DNA作為模版並分別使用本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1表示酸棗1的基因組DNA，徑2表示滇刺棗1的基因組DNA，而徑3至徑8分別表示黃豆、玉米、花生、大麥、小麥以及黑芝麻的基因組DNA； 圖3是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1至8以及滇刺棗1至2的基因組DNA作為模版並分別使用本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1至徑8分別表示酸棗1至8的基因組DNA，而徑9與徑10分別表示滇刺棗1與2的基因組DNA； 圖4是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1、滇刺棗1以及6種非棗屬植物的基因組DNA作為模版並分別使用本發明的物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR來進行PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1表示酸棗1的基因組DNA，徑2表示滇刺棗1的基因組DNA，而徑3至徑8分別表示黃豆、玉米、花生、大麥、小麥以及黑芝麻的基因組DNA； 圖5是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1至8以及滇刺棗1至2的基因組DNA作為模版並分別使用一由本發明的屬-特異性引子對ZizF/ZizR以及物種-特異性引子對ZjMF/ZjMR所構成的引子組合來進行多重PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1至徑8分別表示酸棗1至8的基因組DNA，而徑9與徑10分別表示滇刺棗1與2的基因組DNA；以及 圖6是一電泳膠片圖，它顯示以得自於酸棗1至8以及滇刺棗1至2的基因組DNA作為模版並分別使用一由習知所揭示的2組物種-特異性引子對ZjsF1/ZjsR1以及ZmF1/ZmR1所構成的引子組合來進行多重PCR時所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中徑M表示DNA階梯標記，徑NC表示負對照組(不含任何DNA模版)，徑1至徑8分別表示酸棗1至8的基因組DNA，而徑9與徑10分別表示滇刺棗1與2的基因組DNA。

＜110＞ 統一企業股份有限公司 ＜120＞ 用於檢測棗屬植物的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法 ＜130＞ 用於檢測棗屬植物的核酸分子 ＜160＞ 14 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測棗屬物種的ZizF引子 ＜400＞ 1 cggccgcaca aacgaac 17 ＜210＞ 2 ＜211＞ 16 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測棗屬物種的ZizR引子 ＜400＞ 2 caccccgacc gcacac 16 ＜210＞ 3 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測酸棗的ZjMF引子 ＜400＞ 3 tctgcacctc gcgcctc 17 ＜210＞ 4 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測酸棗的ZjMR引子 ＜400＞ 4 gacgccgcat tggcagc 17 ＜210＞ 5 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測酸棗的ZjsF1引子 ＜400＞ 5 tcccggagcc ttccttgg 18 ＜210＞ 6 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測酸棗的ZjsR1引子 ＜400＞ 6 gagacgccgc attggcag 18 ＜210＞ 7 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測滇刺棗的ZmF1引子 ＜400＞ 7 ggttgcatcc cacgcatc 18 ＜210＞ 8 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測滇刺棗的ZmR1引子 ＜400＞ 8 ctcttccctt ccgaggcg 18 ＜210＞ 9 ＜211＞ 96 ＜212＞ DNA ＜213＞ 棗屬物種 ＜400＞ 9 cggccgcaca aacgaacccc ggcgcaaacc gcgccaagga acacctaacg aattggcatt 60 caccccccgc cccggagacg gtgtgcggtc ggggtg 96 ＜210＞ 10 ＜211＞ 542 ＜212＞ DNA ＜213＞ 酸棗 ＜400＞ 10 tctgcacctc gcgcctcgcc cgtcgatgcg cggttgcagc cttcccggcc gcacaaacga 60 accccggcgc aaaccgcgcc aaggaacacc taacgaattg gcattcaccc cccgccccgg 120 agacggtgtg cggtcggggt gtgcgtcgta ttctctattg taatgtcaaa acgactctcg 180 gcaacggata tctcggctct cgcatcgatg aagaacgtag cgaaatgcga tacttggtgt 240 gaattgcaga atcccgtgaa ccatcgagtt tttgaacgca agttgcgccc gaagccatta 300 ggccgagggc acgtctgcct gggcgtcaca caacgttgcc ccccatccca acctcgacct 360 cgaggcgaag agggggcgga tgctggcctc ccgtgtgcca cggtccgcgg ctggccgaaa 420 tacgggtccc cggcgacgag tgccgcagca atcggtggtt gtccaaccct cggctccctg 480 ctgcgtgcgc ggatcgctgt cgcggcccta cagagacccc aatgcgctgc caatgcggcg 540 tc 542 ＜210＞ 11 ＜211＞ 369 ＜212＞ DNA ＜213＞ 滇刺棗 ＜400＞ 11 ggttgcatcc cacgcatcgc ccgtcgatgc acggttgcag ccttctcggc cgcacaaacg 60 aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ctaacgaatt ggcattcacc ccccgcccca 120 gagatggtgt gcggtcgggg tgcgcgtcgt attctgtctt atatgtcaaa acgactctcg 180 gcaacggata tctcggctct cgcatcgatg aagaacgtag cgaaatgcga tacttggtgt 240 gaattgcaga atcccgtgaa ccatcgagtc tttgaacgca agttgcgccc gaagccatta 300 ggccgagggc acgtctgcct gggcgtcaca caacgttgcc cccccaacct ccgcctcgga 360 agggaagag 369 ＜210＞ 12 ＜211＞ 569 ＜212＞ DNA ＜213＞ 酸棗 ＜400＞ 12 tcccggagcc ttccttggtc gggggtctgc acctcgcgcc tcgcccgtcg atgcgcggtt 60 gcagccttcc cggccgcaca aacgaacccc ggcgcaaacc gcgccaagga acacctaacg 120 aattggcatt caccccccgc cccggagacg gtgtgcggtc ggggtgtgcg tcgtattctc 180 tattgtaatg tcaaaacgac tctcggcaac ggatatctcg gctctcgcat cgatgaagaa 240 cgtagcgaaa tgcgatactt ggtgtgaatt gcagaatccc gtgaaccatc gagtttttga 300 acgcaagttg cgcccgaagc cattaggccg agggcacgtc tgcctgggcg tcacacaacg 360 ttgcccccca tcccaacctc gacctcgagg cgaagagggg gcggatgctg gcctcccgtg 420 tgccacggtc cgcggctggc cgaaatacgg gtccccggcg acgagtgccg cagcaatcgg 480 tggttgtcca accctcggct ccctgctgcg tgcgcggatc gctgtcgcgg ccctacagag 540 accccaatgc gctgccaatg cggcgtctc 569 ＜210＞ 13 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測棗屬物種的探針1 ＜400＞ 13 caaggaacac ctaacgaatt ggc 23 ＜210＞ 14 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測酸棗的探針2 ＜400＞ 14 caaggaacac ctaacgaatt ggc 23

Claims (17)

1. 一種用於檢測一棗屬植物的核酸分子試劑，其包含有一用於檢測棗屬物種的核酸分子，該核酸分子具有一選自於如序列辨識編號：1、序列辨識編號：2以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列。
2. 如請求項1的核酸分子試劑，其進一步包含有一用於檢測酸棗的核酸分子，該核酸分子具有一選自於如序列辨識編號：3、序列辨識編號：4以及序列辨識編號：14所示的核苷酸序列。
3. 一種用於檢測一樣品中是否存在有一棗屬植物的方法，其包括： 令該樣品進行一種使用一核酸分子試劑的DNA擴增反應，其中該核酸分子試劑包含有一用於檢測棗屬物種的引子對，該引子對包含一具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：2所示的核苷酸序列之反向引子；以及 檢測是否有一藉由使用該引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該引子對的棗屬物種之存在。
4. 如請求項3的方法，其中該核酸分子試劑進一步包含有一用於檢測酸棗的引子對，該引子對包含一具有一如序列辨識編號：3所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之反向引子。
5. 如請求項3或4的方法，其中該樣品是選自於下列所構成的群組：食品樣品以及生物樣品。
6. 如請求項3或4的方法，其中在進行該DNA擴增反應之前，從該樣品中萃取出總基因組DNA以作為模版。
7. 如請求項3或4的方法，其中該DNA擴增反應是藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應、即時聚合酶鏈反應、巢式聚合酶鏈反應、熱啟動聚合酶鏈反應、原位聚合酶鏈反應、微聚合酶鏈反應、多重聚合酶鏈反應、轉錄-調節的擴增反應、環媒介等溫擴增反應以及滾環擴增反應。
8. 如請求項4的方法，其中該DNA片段的檢測是藉由一種使用一探針的雜交反應而被進行。
9. 如請求項8的方法，其中： (a) 當使用該用於檢測棗屬物種的引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號:1、序列辨識編號:2以及序列辨識編號:13所示的核苷酸序列；以及 (b) 當使用該用於檢測酸棗的引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一選自於如序列辨識編號:1、序列辨識編號:2、序列辨識編號:3、序列辨識編號:4、序列辨識編號:13以及序列辨識編號:14所示的核苷酸序列。
10. 如請求項9的方法，其中： (a) 當使用該用於檢測棗屬物種的引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一如序列辨識編號:13所示的核苷酸序列；以及 (b) 當使用該用於檢測酸棗的引子對來進行該DNA擴增反應時，該探針具有一如序列辨識編號: 14所示的核苷酸序列。
11. 如請求項8的方法，其中該雜交反應是在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片以及晶片實驗室。
12. 一種用於檢測一樣品中是否存在有一棗屬植物的方法，其包括： 令該樣品進行一種使用一核酸分子試劑的雜交反應，其中該核酸分子試劑包含有一用於檢測棗屬物種的探針，該探針具有一選自於如序列辨識編號：1、序列辨識編號：2以及序列辨識編號：13所示的核苷酸序列；以及 檢測是否有一藉由使用該探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該探針的棗屬物種之存在。
13. 如請求項12的方法，其中該核酸分子試劑進一步包含有一用於檢測酸棗的探針，該探針具有一選自於如序列辨識編號：3、序列辨識編號：4以及序列辨識編號：14所示的核苷酸序列。
14. 如請求項12或13的方法，其中該樣品是選自於下列所構成的群組：食品樣品以及生物樣品。
15. 如請求項12或13的方法，其中該雜交反應是在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片以及晶片實驗室。
16. 一種用於檢測一棗屬植物的檢驗套組，其包含有一如請求項1或2的核酸分子試劑。
17. 一種用於檢測一棗屬植物的生物晶片，其包含有一如請求項1或2的核酸分子試劑。